Procedimiento de enriquecimiento de biomasa de microalgas en acidos grasos poliinsaturados
SECTOR DE LA TECNICA
La presente invención se refiere a un procedimiento para el enriquecimiento de biomasa de microalgas en acidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Mas concretamente, se refiere a microalgas del genero Nannochloropsis. Tambien se refiere a los productos obtenidos mediante ese procedimiento y sus usos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las especies del genero Nannochloropsis pertenecen a la Division Eustigmatophyta, Clase Eustigmatophyceae, Orden Eustigmatales, Familia Monodopsiadaceae (Hibberd, 1981, Bot J Linnean Society 82:93-119) . La clase se separo de las Xantophyceae en base a su estructura, citologfa y posteriormente por su composición de pigmentos, al carecer de clorofila b (Hibberd & Leedale, 1972, Annals of Botany 36:49-71; Whittle & Casselton, 1975, British Phycological Journal 10:179-191) .
Las celulas de Nannochloropsis son cocoides, con un diametro aproximado de 2-4 pm, carecen de flagelos y no presentan estados moviles. Presentan color verde-amarillo, por lo que pueden ser confundidas con las Chlorophyta (Santos, 1996, Beiheft Nova Hedwigia 112:391-405) lo que ha llevado a que existan diversas publicaciones en las que se denomina Chlorella marina a las especies de Nannochloropsis (Maruyama et al., 1986, Jap. J. Phycol.
34:319-325; Watanabe et al. 1983, Aquaculture 34:115-143) . Ademas de las diferencias morfologicas y en la composición de pigmentos, ya que las Chlorophyta presentan clorofilas a y b, mientras que las Eustigmatophyceae presentan solamente clorofila a, ademas de diversos carotenoides, que pueden ser utilizados como caracter taxonomico (Jeffrey & Vesk, 1997, Phytoplankton pigments in oceanography. S.W. Jeffrey, R.F.C. Mantoura, S.W: Wright (eds) . UNESCO Publishing Paris, pp 37-84; Lubian & Establier, 1982, Investigación Pesquera 46:379-389) , ambos grupos presentan importantes diferencias en el perfil de acidos grasos, ya que mientras que las clorofitas no contienen acidos grasos de mas de 18 atomos de carbono, las especies del genero Nanochloropsis presentan un elevado porcentaje del acido graso poliinsaturado de la serie omega-3 eicosapentaenoico (20:5 n-3, EPA) (Ferreira et al. 2009. Mar Biotechnol 11:585-595; Sukenik et al. 1993, Cohen, Z. (Ed.) , Chemicals from Microalgae. Taylor and Francis, London, p 41-56) que puede llegar a representar el 25 % de los acidos grasos de este grupo y que ademas de ser esencial para su aplicación en acuicultura, posee diversas propiedades funcionales en animales y humanos (Siriwardhana et al. 2012, Se-Kwon Kim, Editor (s) , Advances in Food and Nutrition Research, Academic Press, 2012, Volume 65, Pages 211-222) , lo que hace importante este genero desde el punto de vista biotecnologico y farmacologico. La mayor parte de las especies descritas pertenecen a habitats marinos o salobres, describiendose la primera especie de agua dulce, Nannochloropsis limnetica en el ano 2000 (Krienitz et al., 2000, Phycologia 39:219 227) . La composición de acidos grasos de N. limnetica es similar a las de las especies marinas, con un contenido de EPA que pueda alcanzar el 24 % del total de acidos grasos (Freire et al. 2013, Aquaculture Conference 2013: Celebrating 40 Years of Aquaculture - Noviembre, 2013, Gran Canaria (Espana) ; Krienitz et al. 2006; Phycologia 39:219-227) .
Diversas especies marinas del genero Nannochloropsis son cultivadas en todo el mundo para ser utilizadas en la cadena de alimento vivo para el cultivo larvario de peces marinos, siendo de las especies mas comunmente utilizadas en maricultura. La principal aplicación de las especies marinas del genero Nannocloropsis es el cultivo de rotiferos del genero Brachionus que son utilizados como alimento vivo para las larvas de peces marinos. El cultivo de rotiferos es un proceso que requiere elevadas cantidades de microalgas, ya que estas constituyen la unica dieta que permite producciones sostenidas y estables en cultivo continuo, con densidades elevadas (Yoshimura et al. 2003, Aquaculture 227:165-172; Bentley et al. 2008, J World Aquac Soc 39:625-635) . Ademas, las microalgas del genero Nannochloropsis producen un mejor crecimiento y composición bioqmmica del rotífero que la levadura Saccharomyces cerevisiae, que puede tambien utilizarse como alimento para el rotifero (Luzbens et al., 1995, Aquaculture 133:295-309) o que otras dietas artificiales (Aragao et al., 2004, Aquaculture 234: 429-445; Srivastava et al. 2006, Aquaculture 254:534-543; Koiso et al. 2009, Nippon Suisan Gakk 75:828-833) . El elevado contenido en acidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFAs) , especialmente en EPA, de las especies del genero Nannochloropsis ha sido identificado como la causa de su elevado valor nutritivo para acuicultura, tanto en el caso del rotifero Brachionus plicatilis alimentado con especies marinas de este genero (Watanabe et al. 1983, Aquaculture 34:115-143) , como en el caso del mejillon cebra (Dreissena polymorpha) , la pulga de agua Daphnia magna o la almeja de agua dulce Corbicula fluminea alimentados con al especie de agua dulce Nannochloropsis limnetica (Wacker & von Elert 2003, Oecologia 135:332-338; Wacker et al., 2002, Limnol. Oceanogr. 47:1242-1248; Basen et al., 2012, Oecologia 170:57-64; Wacker & Martin-Creuzburg, 2007, Functional ecology 21:738-747) . Recientemente se ha descrito que la especie de agua dulce Nannochloropsis limnetica puede ser utilizada con excelentes resultados para el cultivo de Brachionus plicatilis en agua de mar (Freire et al., 2013, Aquaculture Conference 2013: Celebrating 40 Years of Aquaculture - Noviembre, 2013, Gran Canaria (Espana) ) .
Concentrados de la microalga de agua dulce Chlorella tambien se estan utilizando con exito para el mantenimiento de cultivos densos del rotifero Brachionus sp., aunque las especies marinas del genero Nannochloropsis producen asas de crecimiento iguales o mayores (Hirayama & Nakamura, 1976, Aquaculture 8:301-307; Maruyama et al., 1997; Kobayashi et al., 2008) . Debido a que la biomasa de Chlorella producida industrialmente en condiciones mixotroficas o heterotroficas es deficiente en vitamina B12, indispensable para el crecimiento del rotífero, los productos comerciales de esta microalga de agua dulce para su uso en acuicultura estan enriquecidos en esta vitamina, que generalmente es anadida directamente en el medio de cultivo (Maruyama et al, 1989, Nippon Suisan Gakkaishi 55:1785-1790; Maruyama & Hirayama, 1993, Journal of the World Aquaculture Society 24:194-198) . En el caso de las especies marinas de Nannochloropsis, que son cultivadas autotroficamente, no es necesaria la adición de esta vitamina en el medio de cultivo ni su enriquecimiento posterior para la obtención de tasas maximas de crecimiento en el rotífero. Ademas, la principal ventaja de Nannochloropsis sobre otras especies de algas unicelulares, y mas espedficamente sobre las especies de Chlorella, es su elevado contenido en acido Eicosapentaenoico (EPA, 20:5 (n-3) ) , que es transferido a traves de los rotiferos a las larvas de peces, para cuyo desarrollo es esencial, estando ausente en las especies del genero Chlorella. Actualmente, existen distintos productos comerciales refrigerados, congelados, condensados o liofilizados basados en especies marinas de Nannochloropsis que producen buenos resultados para el crecimiento del rotífero (Luzbens et al., 1995, Aquaculture 133:295-309; Navarro et al., 2001, Hydrobiologia 452: 69-77) . Estos productos compiten con un producto comercial denominado Chlorella SV-12 (Pacific Tading Co., Ltd, Chlorella Industr y Co., Ltd. http://www.pacifictrading.co.jp/en/product/01-2.html) que consiste en un concentrado de Chlorella (aprox 13, 5 % de peso seco) que ha sido enriquecido artificialmente para contener un 17 % del acido graso de cadena larga docosahexaenoico (22:6 (n-3) , DHA) . Segun reporta el prospecto técnico de este producto que se adjunta, esta biomasa contiene solamente un 2 % de EPA (relación EPA:DHA 1:8, 5) .
El procedimiento de enriquecimiento de Chlorella en DHA ha sido descrito con anterioridad para su utilización en el cultivo de rotíferos (Hayashi et al., 2001, Blosci. Biotechnol. Blochem. 65:202-204) . Las celulas de Chlorella fueron cultivadas heterotroficamente con glucosa anadiendose aceite de atun (0, 5 %) con un contenido del 26, 8 % de DHA o acidos grasos libres obtenidos del hidrolizado del mismo aceite durante 24 horas. Estos autores no pudieron conseguir enriquecimiento utilizando aceites y solo mediante la utilización de acidos grasos libres pudieron conseguir el enriquecimiento de distintas especies de Chlorella, alcanzando un 16, 9 % del total de acidos grasos (Hayashi et al. 2001, Blosci. Biotechnol. Blochem. 65:202-204) , no siendo efectiva la utilización de aceites no hidrolizados. Un procedimiento similar fue aplicado para la producción de un extracto lipfdico de Chlorella enriquecido en DHA que contuvo un 20 % de DHA (Sugimoto et al 2002. Biol. Pharm. Bull 25:1090-1092) . En este caso el porcentaje de EPA fue ligeramente superior al 3 %. Este procedimiento, asociado al ya descrito para el enriquecimiento en vitamina B12 es la base utilizada para el producto comercial SUPER FRESH CHLORELLA SV-12 de Pacific Trading Co. Ltd.,
Las familias de patentes que describen el enriquecimiento de Chlorella en acidos grasos poliinsaturados, que utilizan en todos los casos acidos grasos libres o sus sales correspondientes, son:
- KR2005015233-A; KR768757-B1: Proceso para la producción de Chlorella que contiene acidos grasos omega-3, incluidos los acidos eicosapentaenoico (EPA) y Docosahexaenoico (DHA) , que comprende la adición de monogliceridos de EPA y DHA al medio de cultivo al final de la fermentación.
- JP10276684-A; KR98080312-A; JP3096654-B2; KR428732-B; KR423876-B. Producción de Chlorella que contiene acidos grasos altamente insaturados- comprende el cultivo de Chlorella en medio con DHA y otros acidos grasos altamente insaturados en forma de acido libre o su correspondiente sal.
Por otra parte, existe una unica referencia, hasta donde el solicitante tiene conocimiento, en la que se describe el enriquecimiento de una especie de Nannochloropsis en DHA (Wacker et al., 2002, Limnol. Oceanogr. 47:1242 1248) . En esta referencia la especie de agua dulce N. limnetica fue enriquecida con EPA o DHA puros por separado o con un extracto de la microalga Isocrhysis aff. galbana (Clon T-ISO) rico en DHA. Esta ultima especie contiene valores elevados de DHA, que sin embargo fueron transferidos con poca eficiencia a N. limnetica, con una relación final de 1 parte de DHA por cada 40 partes de EPA (relación peso:peso) en la biomasa enriquecida. Estos autores demuestran ademas claramente los beneficios del enriquecimiento de DHA para la dieta del mejillon D. polymorpha, a pesar de los bajos niveles de enriquecimiento logrados con su metodologfa (Wacker et al., 2002, Limnol. Oceanogr. 47:1242-1248) .
El papel crucial de los acidos grasos poliinsaturados de cadena larga para el cultivo de diversas especies marinas ha sido documentado de forma extensiva (Watanabe et al. 1983, Aquaculture 34:115-143, Izquierdo, 1996. Aquaculture Nutrition, 2: 183-191; Tocher, 2010, Aquaculture research 41:717-732) , aunque tambien en los ambientes dulceacrncolas la presencia de estos acidos grasos ha sido identificada como un factor fundamental que controla las interacciones en la cadena nutricional (Muller-Navarra et al. 2000, Nature 403, 74-77) .
Ademas de las aplicaciones en acuicultura, especies del genero Nannochloropsis han sido estudiadas de forma extensiva como fuente de EPA para aplicaciones nutricionales humanas y animales (Sukenik 1998, Cohen, Z. (Ed.) , Chemicals from Microalgae. Taylor and Francis, London, p 41-56; Chini Zitelli et al., 1999, Journal of Biotechnology 70: 299-312) y mas recientemente, han centrado un gran interes debido al potencial de estas especies para la producción de biodiesel (Rodolfi et al., 2008, Journal of Biotechnology 70: 299-312; Doan, et al., 2011, Biomass and Bioenergy 35: 2534-2544; San Pedro et al. 2013, Bioresource Technology 134:353-361) .
Ademas de las aplicaciones en acuicultura, las diversas propiedades del EPA lo convierten en un compuesto de elevado interes biotecnologico y farmacologico, de ah el interes de la utilización de la biomasa de especies del genera Nannochloropsis, ricas en este acido graso insaturado, en el campo de la nutrición humana y animal. Se ha demostrado que los acidos grasos poliinsaturados de la serie n-3 EPA y DHA presentan una serie de beneficios para la salud, siendo efectivos en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, incluyendo efectos bien documentados hipo-triglicemicos y anti-inflamatorios. Asf mismo, varios estudios indican efectos prometedores antihipertensivos, anticancengeno, anti-depresion, antienvejecimiento y anti-artriticos. Tambien se ha descrito efecto antiinflamatorio y sensibilizador a la insulina en desordenes metabolicos. De forma mas espedfica, diversos estudios indican que el EPA puede ser beneficioso en procesos de inflamación, esquizofrenia, depresion, srndrome de fatiga cronica, disfunción hepatica, srndrome de atención deficiente e hiperactividad, etc., ademas de mejorar la eficiencia de la quimioterapia en procesos cancengenos (Siriwardhana et al. 2012, Se-Kwon Kim, Editor (s) , Advances in Food and Nutrition Research, Academic Press, 2012, Volume 65, Pages 211-222) . En sistemas de experimentación animal se ha demostrado que la inclusion de biomasa de Nannochloropsis rica en EPA produce una mayor proporción de DHA en los lfpidos cerebrales de la progenie de ratas y tambien un mejor aspecto y contenido en DHA de huevos de gallinas alimentados con la biomasa de esta especie (Sukenik, 1999, Cohen, Z. (Ed.) , Chemicals from Microalgae. Taylor and Francis, London, p 41-56) .
Ademas, el enorme interes de la biomasa microalgal rica en EPA para su aplicación en el campo de la acuicultura, cna animal y tratamiento de enfermedades en humanos, derivado de las propiedades antes citadas, reviste aun mayor interes la obtención de biomasa enriquecida tambien en DHA. El DHA es uno de los componentes principales del aceite de pescado y ademas de ser fundamental en el desarrollo de especies marinas, es muy abundante en los fosfolfpidos del cerebro de los mairnferos. Se ha sugerido que el DHA es necesario para el desarrollo neuronal y la plasticidad sinaptica. El contenido de DHA en los fosfolfpidos cerebrales tambien es menor en pacientes con Alzheimer. Ademas, el elevado contenido de DHA en la leche materna humana ha sido relacionado con el desarrollo del sistema nervioso central en ninos, llevando a la recomendación de la suplementación de las leches maternizadas en este compuesto. Otras posibles aplicaciones del DHA incluyen actividad anticancengena, psoriasis, etc. Existen ademas numerosos estudios que sugieren que el DHA es un componente importante para el mantenimiento y mejora de las funciones cerebrales en animales envejecidos (Sugimoto et al., 2002, Biol. Pharm. Bull 25:1090-1092) . Comercialmente el DHA para uso en nutrición humana se produce a partir de aceite de pescado o del dinoflagelado heterotrofo Cr y pthecodinium cohnii (Mendes et al., 2008, Journal of Applied Phycology 21:199-214) . La utilización de DHA de C. cohnii para el enriquecimiento de alimento, particularmente en el campo de la acuicultura, esta divulgado en la patente (Gladue et al., 2002, US 6372460 B1) . Aunque existen microalgas ricas en DHA, presentando un contenido que puede variar entre el 10 y el 20 % (Volkman et al. 1989, Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 128: 219-240) , las especies que presentan un elevado contenido de este acido graso presentan bajos niveles de EPA.
Por lo tanto, tanto en el campo de la acuicultura como en el campo de la nutrición animal y humana, es de gran interes la disponibilidad de biomasa microalgal enriquecida simultaneamente en EPA y DHA. Un producto con estas caractensticas no ha sido descrito en la bibliografia ni se encuentra en el mercado, por lo que continua siendo un reto la obtención de una microalga enriquecida simultaneamente en EPA y DHA.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado un procedimiento de enriquecimiento que permite obtener biomasa de microalgas con un elevado contenido simultaneo en acido eicosapentaenoico (20:5n-3) (EPA) y acido docosahexaenoico (22:6n-3) (DHA) . En particular, la biomasa de microalgas pertenece al genero Nannochloropsis. Una ventaja de la invención es que la relación entre EPA y DHA es superior a 0, 5 partes de DHA por cada 10 partes de EPA, pudiendose alcanzar una relación de 2, 4 partes de DHA por 1 parte de e Pa , y siendo el porcentaje de EPA al menos un 10 % del total de los acidos grasos de la biomasa.
Una ventaja adicional de la invención es que la biomasa de microalgas obtenida tiene ademas un contenido elevado en otros acidos poliinsaturados, como por ejemplo el acido poliinsaturado 22:5 como se muestra en las figuras 5 y 6, que supera el 10 % en peso respecto al peso del concentrado de biomasa.
Como se puede comprobar en los ejemplos y figuras, la relación de EPA y DHA obtenida al aplicar el procedimiento de esta invención es muy superior a cualquier otra descrita previamente, y así los autores de la presente invención obtuvieron una relación de hasta 2, 4 partes de DHA por cada parte de EPA en presencia del emulsionante y 0, 6 partes de DHA por cada parte de EPA en ausencia del mismo.
Asf, en un aspecto la invención se dirige a un procedimiento para el enriquecimiento de biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis en acidos poliinsaturados, que comprende:
a) mezclar i) una suspension de biomasa de microalgas vivas del genero Nannochloropsis en la que la relación de peso seco de microalgas es de entre el 0, 1 % y el 20 % con respecto al volumen total de la suspension, con ii) una solución o emulsion de acidos grasos que comprende una cantidad de acido docosahexaenoico superior al 5 % en peso respecto al total de acidos grasos, y
b) mantener la mezcla resultante durante al menos 24 horas.
En otro aspecto, la invención se dirige a una biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis, caracterizada porque comprende acido eicosapentaenoico (20:5n-3) (EPA) y acido docosahexaenoico (22:6n-3) (DHA) en una relación en peso de DHA igual o superior a 1 parte de DHA por cada 10 partes de EPA y contiene una proporción de acido eicosapentaenoico (20:5n-3) (EPA) de al menos un 10 % respecto al total de los acidos grasos de la biomasa. En otro aspecto, la invención se dirige a una biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis, obtenible mediante el procedimiento descrito anteriormente.
En otro aspecto, la invención se dirige al uso de la biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis descrita anteriormente, que tiene aplicación en la acuicultura, en la cffa animal para la mejora de perfil de acidos grasos de productos de consumo (carne, huevos, leche, etc.) y en el sector de la cosmetica.
En otro aspecto la invención se dirige al uso de la biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis descrita anteriormente para la preparación de un nutraceutico. En particular, el nutraceutico de la presente invención es de aplicación en casos de infertilidad, enfermedades del sistema nervioso y enfermedades del sistema circulatorio, ademas de servir como complemento alimenticio.
Caracteriza a la presente invención el hecho de emplear en el procedimiento una biomasa concentrada en vez de cultivos diluidos, los tiempos y condiciones de exposición de la biomasa, la posibilidad de utilización de emulsionante, la modificación de la relación de biomasa y concentración de ffpidos, así como el empleo de un aceite como fuente de acidos grasos.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Para complementar la descripción que se esta realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprension de las caracteffsticas de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización practica de la misma, se acompana como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con caracter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente.
La Figura 1 muestra el perfil de acidos grasos, medido mediante cromatograffa de gases, de un concentrado celular de la microalga de agua dulce N. limnetica (concentración de biomasa 10 % peso/volumen) enriquecida con una emulsion de DHA puro (2, 5 mg/mL) durante 6 horas en el EJEMPLO 1. Estas condiciones, que asemejan a las descritas en la bibliograffa (Wacker et al., 2002) no permitieron el enriquecimiento de la biomasa en DHA, ya que se observa claramente el pico de EPA en el minuto 45, presente en la biomasa de todas las especies de Nannochloropsis, mientras que el pico de DHA, que aparece en el minuto 51, es practicamente inapreciable. Tampoco se logro enriquecimiento con el aceite rico en d Ha en ninguna de las concentraciones probadas.
La Figura 2 muestra el perfil de acidos grasos, medido mediante cromatograffa de gases, de un concentrado de N. limnetica (concentración de biomasa 1 % peso seco/volumen) no enriquecido, procedente del experimento descrito en el EJEMPLO 2, en el que solo aparece el pico de EPA caracteffstico de las especies de Nannochloropsis.
La Figura 3 muestra el perfil de acidos grasos, medido mediante cromatograffa de gases, de un concentrado de N. limnetica (concentración de biomasa 1 % peso seco/volumen) enriquecida con una emulsion de DHA puro (2., 5 mg/mL) durante 24 horas procedente del experimento descrito en el EJEMPLO 2. Se observa claramente la existencia del pico correspondiente al DHA en el minuto 51, que en este caso es superior al pico del EPA, que aparece en el minuto 45.
La Figura 4 muestra cromatograma de enriquecimiento de Nannochloropsis limnetica en las mismas condiciones que la Figura 3, en el que el enriquecimiento se realiza utilizando un aceite rico en DHA (contenido mayor del 10 %) en el que se observa el pico correspondiente al DHA en el minuto 51, ademas de oros picos entre el e Pa (minuto 45) y el DHA que corresponden a la incorporación de otros acidos grasos poliinsaturados, entre los que se encuentra el 22:5. La Figura 5 muestra el % de acidos grasos del total en concentrados de N. limnetica enriquecida durante 24 horas con DHA puro o con aceite rico en DHA, ambos a una concentración de 2, 5 mg/mL y en presencia de emulsionante, siguiendo el procedimiento descrito en el EJEMPLO 2.
La Figura 6 muestra el % de acidos grasos respecto del total en concentrados de N. limnetica enriquecida con aceite rico en DHA a una concentración de 2, 5 mg/mL durante 24 horas en presencia de emulsionante y en ausencia del mismo, siguiendo el procedimiento descrito en el EJEMPLO 2.
La Figura 7 muestra un cromatograma del perfil de acidos grasos de la microalga marina Nannochloropsis gaditana no enriquecida (control) , correspondiente al experimento descrito en el EJEMPLO 3, en el que se observa el pico de EPA a los 45 minutos caracteffstico de todas las especies de este genero. Como era de esperar en una biomasa no enriquecida, no se aprecia pico alguno en el tiempo de retención 51 minutos, correspondiente al DHA.
La Figura 8 muestra un cromatograma del perfil de acidos grasos de la microalga marina Nannochloropsis gaditana enriquecida con una emulsion de aceite rico en DHA, (EPADHAX, que contiene un porcentaje de este acido graso del 10-18 %) , correspondiente al experimento descrito en el EJEMPLO 3. La biomasa se enriquecio durante 24 horas en presencia de luz con una concentración de aceite de 2, 5 mg/mL. Se observa la aparición de un pico en el minuto 51 que corresponde al DHA incorporado por la microalga.
La Figura 9 muestra un cromatograma del perfil de acidos grasos de la microalga marina Nannochloropsis gaditana enriquecida con una emulsion de aceite rico en DHA, (Menhaden Oil, Sigma, CAS 8002/50/4, que contiene un porcentaje de este acido graso del 11, 9 %) , correspondiente al experimento descrito en el EJEMPLO 3. La biomasa se enriquecio durante 24 horas en presencia de luz con una concentración de aceite de 2, 5 mg/mL. Se observa la aparición de un pico en el minuto 51 que corresponde al DHA incorporado por la microalga.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Algunas realizaciones representan los antecedentes de la invención en algunos aspectos y se dirigen a un procedimiento para el enriquecimiento de biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis en acidos poliinsaturados, que comprende:
a) mezclar i) una suspension de biomasa de microalgas vivas del genero Nannochloropsis en la que la relación de peso seco de microalgas es de entre el 0, 1 % y el 20 % con respecto al volumen total de la suspension, con ii) una solución o emulsion de acidos grasos que comprende una cantidad de acido docosahexaenoico superior al 5 % en peso respecto al total de acidos grasos, y
b) mantener la mezcla resultante durante al menos 24 horas.
Las microalgas del genero Nannochloropsis comprenden tanto especies de agua dulce, como por ejemplo Nannochloropsis limnetica, como especies de agua marina, como por ejemplo Nannochloropsis gaditana, ademas tambien comprende las especies del mismo genero como por ejemplo Nannochloropsis atomus, N. coccoides, N. maculata, N. oculata, N. granulata, N. oceanica y N. salina.
En otra realización particular, la solución o emulsion de acidos grasos de la etapa a) tiene una concentración de entre 10 mg/mL y 100 mg/mL. Mas en particular, tiene una concentración de 50 mg/mL.
En una realización particular, el procedimiento comprende ademas añadir en la etapa a) una solución de emulsionante.
En una realización mas particular, el emulsionante se selecciona de entre albumina de suero bovino, dodecil sulfato de sodio, alcoholes grasos polietoxilados, sales alqrnlicas de amonio cuaternarias, alquil-betamas, lecitinas de soja y huevo, goma guar, goma garrofrn, alginatos, acido fosforico, sales de fosfato, citrato de sodio, sales de fosfato, pectina, esteres de sacarosa, esteres de sorbitano, celulosa y sus derivados, polientilenglicol, y mezclas de los mismos.
En otra realización particular, la solución de emulsionante tiene una concentración de entre 10 mg/mL y 100 mg/mL. Mas en particular, tiene una concentración de 50 mg/mL.
En otra realización particular, la relación volumetrica entre la solución de acidos grasos de la etapa a) ii) y la solución del emulsionante esta entre 1:1 y 1:4. En otra realización particular, la relación es 1:2.
En otra realización particular, la relación de peso seco de microalgas de la etapa a) es de entre el 0, 8 % y el 15 %. En otra realización particular, la suspension de biomasa de microalgas y la solución o emulsion de acidos grasos se mezclan en la etapa a) en una proporción de entre 1:1 y 10:1. Mas en particular la proporción es de 6:1 (volumen:volumen) .
En otra realización particular, la invención con respecto a los antecedentes de la invención, en la etapa b) comprende un ciclo de al menos 12 horas de luz.
Como se ha comentado anteriormente, la invención se refiere a un procedimiento para el enriquecimiento de biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis en distintos acidos grasos poliinsaturados, principalmente acido docosahexaenoico (22:6n-3, DHA) . Para ello se emplea una suspension o emulsion de acidos grasos. Dicha suspension o emulsion puede ser un aceite. Asf en una realización particular, la suspension o emulsion de acidos grasos de la etapa a) es una suspension o emulsion de un aceite o de una mezcla de aceites.
Para la presente invención se entiende por "aceite" un lfquido que comprende una mezcla de trigliceridos y acidos grasos libres, de manera que el peso total de acidos grasos libres es inferior al 10 %.
En el procedimiento de la presente invención, el enriquecimiento de la biomasa de microalgas del genera Nannochloropsis se puede llevar a cabo por medio de cualquier aceite o extracto rico en acidos grasos poliinsaturados de cadena larga, de origen animal o microbiano.
En una realización particular, el aceite se selecciona de entre aceites con un porcentaje de DHA superior al 5 % en peso respecto al total de acidos grasos, como por ejemplo aceite de pescado, como por ejemplo el aceite de arenque, aceite de hffgado de bacalao o derivados hidrolizados. En una realización particular, el aceite se selecciona de aceites obtenidos de microalgas marinas con un contenido de DHA superior al 5 %.
En una realización particular, el aceite se selecciona de entre aceite de arenque, aceite de tngado de bacalao, aceite obtenido de microalgas marinas, o mezclas de los mismos.
En una realización particular, la invención se refiere a un procedimiento para el enriquecimiento de biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis en acidos poliinsaturados, que comprende:
a) mezclar i) una suspension de biomasa de microalgas vivas del genero Nannochloropsis en la que la relación de peso seco de microalgas es de entre el 0, 1 % y el 20 % con respecto al volumen total de la suspension, con ii) una solución o emulsion de aceite que comprende una cantidad de acido docosahexaenoico superior al 5 % en peso respecto al total de acidos grasos, y con iii) una solución de emulsionante, y
b) mantener la mezcla resultante durante al menos 24 horas.
La invención, de acuerdo con las reivindicaciones, se refiere a un procedimiento para el enriquecimiento de biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis en acidos poliinsaturados, que comprende:
a) mezclar i) una suspension de biomasa de microalgas vivas del genero Nannochloropsis en la que la relación de peso seco de microalgas es de entre el 0, 1 % y el 20 % con respecto al volumen total de la suspension, con ii) una solución o emulsion de aceite que comprende una cantidad de acido docosahexaenoico superior al 5 % en peso respecto al total de acidos grasos, a una concentración de entre 10 mg/mL y 100 mg/mL, y con iii) una solución de emulsionante a una concentración de entre 10 mg/mL y 100 mg/mL, con la condición de que la solución o emulsion ii) y la solución iii) estan en una proporción de entre 1:1 y 1:10, y
b) mantener la mezcla resultante durante al menos 24 horas, en las que al menos 12 horas son de iluminación. En una realización particular, las emulsiones, soluciones y suspensiones del procedimiento se preparan empleando agua, disolventes alcoholicos, disolventes glicolicos, o mezclas de los mismos. En una realización particular, se emplea etanol.
La biomasa de microalgas de Nannochloropsis una vez enriquecida puede tener diferentes formas de presentaciones: concentrado refrigerado o congelado, biomasa seca, liofilizada o preservada por cualquier otro metodo, así como los extractos derivados.
Asf, en una realización particular la invención se dirige a una solución, composición o liofilizado que comprende la biomasa de la invención.
Las aplicaciones de la biomasa de Nannochloropsis enriquecida en DHA y otros acidos grasos poliinsaturados, preferentemente EPA son: nutrición animal en el campo de la acuicultura y otros como avicultura, ganado bovino, ovino, porcino, etc. sin restringirse a estos, así como suplemento nutritivo en piensos para animales de comparna, ademas de tener aplicaciones en el sector de la cosmetica.
En otro aspecto la invención se refiere a un complemento nutricional o ingrediente funcional que comprende la biomasa de la presente invención.
Con el procedimiento objeto de la invención se mejoran los indices de enriquecimiento de DHA establecidos para Chlorella y N. limnetica, manteniendo un elevado enriquecimiento en EPA. Para el establecimiento de la metodologfa se estudiaron las siguientes variables:
- Utilización de biomasa concentrada en vez de los cultivos diluidos utilizados en otras metodologfas. En los ejemplos de enriquecimiento exitoso que se muestran se utilizan concentrados microalgales de 1 % de relación peso/volumen, mientras que en la bibliograffa el concentrado utilizado para el enriquecimiento con acidos grasos puros es 50 veces mas diluido (0, 01 % de peso de carbono, lo que equivaldna a 0, 02 % peso/volumen, (Wacker et al. 2002, Limnol. Oceanogr. 47:1242-1248) .
- Modificación del tiempo y condiciones de exposición de la biomasa. En la presente invención se expone la mezcla durante un mmimo de 24 horas en condiciones de iluminación, siendo la presencia de iluminación un factor clave para el enriquecimiento, mientras que en la bibliograffa el tiempo de exposición es de 4 horas sin especificar la presencia o no de iluminación.
- Modificación de la relación concentrado/dilución lipfdica en etanol. En la invención se utilizan relaciones concentrado acuoso/ffpido en solución etanolica de 6:1 (una parte de solución etanolica por cada seis de oncentrado microalgal acuoso) , mientras que en la bibliograffa se utilizan proporciones de solución etanolica mucho menores (100:1, es decir, 1 parte de etanol por cada 100 partes de concentrado microalgal acuoso)
- Modificación de la relación biomasa de microalga: concentración de lfpidos. Se obtienen enriquecimientos con una concentración de aceite de 2.5 mg por mililitro de mezcla, mientras que en la bibliograffa se utilizan 0.025 mg de ffpido por mililitro de mezcla (Wacker et al., 2002, Limnol. Oceanogr. 47:1242-1248)
- Modificación de la presencia de emulsionante. En la bibliograffa se utiliza emulsionante en una concentración 0.5 mg por mililitro de la mezcla. En este procedimiento se utiliza una concentración de 5 mg por mililitro de mezcla, consiguiendose tambien enriquecimiento en ausencia del mismo.
- Modificación de la fuente de acido graso utilizada. En la bibliograffa el enriquecimiento significativo se consigue con acidos grasos puros o sus sales (Hayashi et al., 2001, Blosci. Biotechnol. Blochem. 65:202-204; Wacker et al., 2002, Limnol. Oceanogr. 47:1242-1248) mientras que en la presente invención se utilizan aceites.
En una realización preferente de la invención, el procedimiento comprende las etapas de:
- preparación de una solución de lfpidos en etanol o de una emulsion ffpidos junto con el emulsionante, que en el ejemplo que se cita es albumina de suero bovino (BSA) que comprende las etapas de:
- Preparar una solución madre o stock de lfpido con aceite ricos en DHA en etanol,
- Preparar una solución madre o stock de emulsionante en H2O,
- Formar una emulsion mediante mezcla de la solución madre o stock de lfpido y la solución de emulsionante en una proporción 1:2, agitando hasta que se forme una emulsion,
- preparación de la biomasa concentrada mediante centrifugado,
- enriquecimiento de la biomasa concentrada anadiendo la solución etanolica del aceite o su emulsion a la biomasa concentrada,
- dejar la mezcla expuesta durante al menos 24 horas con iluminación.
Gracias al procedimiento descrito se consigue:
• Un enriquecimiento de la biomasa de Nannochloropsis en DHA y otros acidos grasos poliinsaturados utilizando aceites en vez de acidos grasos libres. El enriquecimiento se consigue tambien en ausencia del emulsionante, aunque la presencia del mismo aumenta la efectividad.
• Mejora los indices de enriquecimiento de DHA establecidos para Chlorella, manteniendo un elevado contenido en EPA, ya presente de forma natural en la biomasa de las microalgas del genero Nannochloropsis, modificando variables como concentración de biomasa del concentrado microalgal, tiempo de exposición, relación biomasa:acido graso, suministro de iluminación y relación concentrado microalgal acuoso: solución iipfdica etanolica
• Se obtiene una biomasa enriquecida de forma simultanea en EPA y DHA, a diferencia del procedimiento descrito por Wacker et al., (2002, Limnol. Oceanogr. 47:1242-1248) obteniendo relaciones EPA:DHA mayores de 10:1 (1 parte de DHA por cada 10 partes de EPA) en peso en todos los casos y alcanzandose relaciones 1:2, 4 (2, 4 partes de DHA por cada parte de EPA)
• El proceso de enriquecimiento es viable para especies de Nannochloropsis agua dulce y agua marina
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteffsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteffsticas de la invención se desprenderan en parte de la descripción y en parte de la practica de la invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1. En este ejemplo se probaron condiciones semejantes a las descritas en la bibliograffa para el enriquecimiento de N. limnetica, utilizando DHA puro y un aceite de pescado con elevado contenido en DHA, no consiguiendose enriquecimiento de la biomasa concentrada de la microalga en DHA; lo que demuestra que la modificación simple de las condiciones existentes en la bibliograffa no permite el enriquecimiento.
Para la realización del experimento se preparo un concentrado de la microalga de agua dulce N. limnetica obtenido por centrifugación como se describe en Freire et al. (2013, Aquaculture Conference 2013: Celebrating 40 Years of Aquaculture - Noviembre, 2013, Gran Canaria (Espana) ) . Las celulas se resuspendieron en agua destilada para alcanzar una concentración de aproximadamente de 12, 3x109 celulas/mL y una concentración de carbono de 50 mg/mL (equivalente a 100 mg/mL o 10 % en relación peso/volumen, teniendo en cuenta un contenido de carbono de la biomasa del 50 %) . La biomasa se mezclo con una solución de DHA puro en etanol a dos concentraciones: 250 y 2500 microgramos/mL y aceite de pescado con alto contenido en Omega 3 (DHA 20-26 % EPA 7-12 %) , refinado EPADHAX obtenido de la empresa Epadhax S.L.U (Boiro, A Coruna, http://www.epadhax.eu/epadhax-omega-3-activo.php) a una concentración de 25 y 250 microgramos/mL. En todos los casos los lfpidos se emulsionaron con BSA. Las mezclas se incubaron durante 6 horas con la emulsion lipfdica en agitación a una temperatura de 22 °C. Para la evaluación del grado de enriquecimiento de las pastas, una vez finalizado el periodo de incubación se entrifugo la biomasa y se realizaron dos lavados con agua destilada para eliminar cualquier resto de Kpido emulsionado que no hubiese sido incorporado por las celulas. Los Kpidos totales fueron extrafdos siguiendo el método propuesto por Bligh & Dyer (1959, Can J Biochem Physiol 37: 911-917) . Los acidos grasos fueron analizados mediante transmetilación con HCl y CH3OH (Sato & Murata 1988, Beiheft Nova Hedwigia 112:391-405) . La cuantificación e identificación se realizo mediante cromatograffa de gases.
Los resultados de este primer experimento fueron negativos, no lograndose obtener enriquecimiento en DHA de la biomasa (Figura 1) . En esta figura 1, correspondiente al concentrado incubado con la emulsion de DHA puro a una concentración de 250 microgramos/mL, se observa el pico correspondiente al EPA, que aparece en el cromatrograma a los 45 minutos, y es caractenstico de las especies de Nannochloropsis. Mientras que el pico de DHA, que aparece con tiempo de retención aproximado de 51 minutos, es practicamente inapreciable, no habiendose logrado por lo tanto enriquecimiento.
EJEMPLO 2. En este experimento se variaron factores como concentración de biomasa y tiempo de exposición con respecto a las condiciones descritas en el Ejemplo 1, lograndose la incorporación de DHA, tanto con la utilización de DHA puro como con la utilización del aceite rico en DHA con y sin emulsionante. Para la realización del experimento se utilizo un concentrado microalgal de N. limnetica obtenido por centrifugación tal y como se indica en el Ejemplo 1. En esta ocasion las celulas se resuspendieron en agua destilada para alcanzar una concentración de 10 mg/mL peso/volumen (1 % de relación peso:volumen, equivalente a aprox. 1, 23*109 celulas/mL) . El concentrado de microalgas se mezclo con DHA o con aceite rico en DHA a una concentración de 2, 5 mg de lfpido/mL emulsionados con BSA. La emulsion se preparo mezclando 50 microlitros de una dilución en etanol del lfpido, a una concentración de 50 mg/ml con 100 microlitros de una solución acuosa de BSA a una concentración de 50 mg/mL. La mezcla se agito para formar la emulsion y se anadio a 850 microlitros de concentrado microalgal. En el caso del aceite, se probo tambien la adición directa de la solución de aceite en etanol (50 microlitros) al concentrado, sin la mezcla previa con el emulsionante. La mezcla lfpido/concentrado microalgal se incubo en agitación en presencia de luz durante 24 horas. En el caso del DHA puro, se incubo tambien una mezcla durante 48 horas para comprobar el efecto del enriquecimiento durante periodos aun mas prolongados. Una vez finalizado el periodo de enriquecimiento la biomasa se centrifugo y lavo 2 veces, analizandose por cromatograffa de gases el perfil de acidos grasos del extracto lipfdico, según la metodologfa descrita en el ejemplo 1.
En la Figura 2 se muestra el cromatograma de N. llimnetica no enriquecida (control) , en la que solo aparece EPA, cuyo pico se identifica a los 45 minutos, con ausencia, como era de esperar en este concentrado control, del pico de d Ha . Por el contrario, la adición de 2, 5 mg/mL de la emulsion de DHA puro (Figura 3) o de la emulsion de aceite rico en DHA (Figura 4) produce la incorporación del DHA, con la aparición de un pico caractenstico a los 51 minutos. Ademas, cuando se utiliza el aceite rico en DHA, a mayores de cantidades elevadas de EPA y DHA, se detectan otros picos correspondientes a otros acidos grasos poliinsaturados entre el EPA y el DHA, que no aparecen ni en el control ni en la muestra enriquecida con DHA puro.
Los valores obtenidos como % de los acidos grasos totales y como contenido celular en peso (pg por celula) , con los distintos protocolos de enriquecimiento se muestran en la Tabla 1 que muestra el perfil de acidos grasos de concentrado de N. limnetica enriquecida con DHA puro durante 24 y 48 horas, y con aceite rico en DHA (EPADHAX) con y sin emulsionante (BSA en este ejemplo) durante 24 horas.
Tabla 1. Perfil de acidos grasos de la biomasa de Nannochloropsis limnetica no enriquecida (control) o enriquecida con DHA puro y aceite rico en DHA (EPADHAX) a una concentración de 2, 5 mg/mL, en ambos casos emulsionados con BSA. El enriquecimiento se realizo durante 24 y 48 horas en el caso del DHA, y durante 24 horas en el caso de los enriquecimientos con el aceite. En este ultimo caso se probo tambien el efecto de retirar el BSA como emulsionante (Aceite1-BSA) .
La comparación de los enriquecimientos de 24 horas con DHA puro y con aceite rico en DHA (EPADHAX) (Tabla 1, Figura 5) muestra un mayor porcentaje de DHA cuando este se adiciona puro (56, 6 %) frente al aceite de poliinsaturados (33, 9 %) . Sin embargo, en la muestra enriquecida con el aceite (Tabla 1 Figura 6) se encuentra un elevado porcentaje de otros acidos grasos poliinsaturados, como el acido graso 22:5 (12, 7 %) . Estos valores de contenido de DHA por celula equivalen a 80, 70 microgramos de DHA por mg de peso seco en el caso del enriquecimiento con DHA puro y a 52 microgramos de DHA por miligramo de peso seco en el caso del EPADHAX. Estos valores son significativamente mas altos que los obtenidos por Wacker et al. (Wacker et al. 2012, Limnol. Oceanogr. 47:1242-1248) , que reporta unos 11, 6 microgramos de DHA por miligramo de biomasa. El tiempo de enriquecimiento optimo se establecio en 24 horas, ya que el analisis de las muestras enriquecidas con DHA puro revelo que los enriquecimientos de 48 horas no mejoraron los niveles de EPA o DHA (Tabla 1) .
El analisis del perfil de acidos grasos de las muestras enriquecidas con DHA puro demuestran que este alcanza el 56 % del total de acidos grasos con 24 horas de enriquecimiento, no mejorando este valor con enriquecimiento de 48 horas (Tabla 1) .
La presencia del emulsionante mejora claramente la incorporación del DHA y otros acidos grasos poliinsaturados presentes en el aceite (Tabla 1, Figura 6) , pero aun en ausencia del emulsionante el DHA alcanza el 13, 65 % del total de los acidos grasos, con una relación 1, 66 EPA/DHA (Tabla 1) .
EJEMPLO 3. En este experimento se probo la eficiencia del procedimiento de enriquecimiento con dos especies distintas: la especie de agua dulce Nannochloropsis limnetica y la especie marina Nanochloropsis gaditana. Se prepararon concentrados mediante centrifugación de las celulas mediante la metodologfa descrita en los Ejemplos 1 y 2. Las celulas de N. limnetica y N. gaditana se resuspendieron en agua destilada o agua de mar respectivamente a una concentración del 1 % peso/volumen. El enriquecimiento, siguiendo el procedimiento y concentraciones descritas en el Ejemplo 2, se realizo con una emulsion en BSA de dos tipos de aceites ricos de DHA: aceite EPADHAX, utilizado en el ejemplo 2 (aceite 1) y aceite de arenque (Menhaden Oil, Sigma, CAS 8002/50/4) con una concentración final de 2, 5 mg/mL (aceite 2) . Ambos aceites se caracterizan por poseer porcentajes de DHA del 10 18 % en el caso del EPADHAX y 8-15 % en el caso del aceite de arenque. El contenido de acidos grasos libres en el aceite 1 ronda los 14 mg por gramo de aceite, mientras que los valores descritos en la bibliograffa para el aceite 2 son menores, alrededor de 5, 5 mg por gramo. Es importante hacer notar que debido a el origen natural de estos aceites, la composición de acidos grasos y el porcentaje de acidos grasos libres puede variar entre distintas partidas. Los enriquecimientos se llevaron a cabo por triplicado. Una vez finalizadas las 24 horas de exposición, las celulas se concentraron por centrifugación, se lavaron dos veces con agua destilada y se analizaron mediante la metodologfa descrita en los ejemplos 1 y 2.
El perfil de acidos grasos de las celulas de N. limnetica y N. gaditana no enriquecidas y enriquecidas con los dos aceites ricons en DHA (aceite 1 y aceite 2) se muestran en las Tablas 2 y 3 respectivamente. En este experimento se han logrado alcanzar contenidos de DHA de entre el 1, 5 y el 2, 8 % de los acidos grasos totales de la biomasa, independientemente de la especie y del aceite utilizado. En todos los casos hay una relación minima de 1 parte de DHA por cada 10 partes de EPA. Las figuras 7, 8 y 9 muestran los perfiles cromatograficos de N. gaditana no enriquecida (Figura 7) y enriquecida con los dos tipos de aceites ricos en DHA. En estas dos ultimas figuras se aprecia claramente el pico de DHA a los 51 minutos, resultante de la incorporación de los aceites..
Tabla 2. Perfil de acidos grasos de la especie de agua dulce N. limnetica no enriquecida (Control) y enriquecida durante 24 horas con dos tipos de aceites ricos en acidos grasos poliinsaturados anadidos al concentrado celular en forma de emulsion a una concentración de 2, 5 mg/mL.
Tabla 3. Perfil de acidos grasos de la especie de agua dulce N. gaditana no enriquecida (Control) y enriquecida durante 24 horas con dos tipos de aceites ricos en acidos grasos poliinsaturados anadidos al concentrado celular en forma de emulsion a una concentración de 2, 5 mg/mL.
Como resultado de todas las experimentaciones mostradas, se considera que un procedimiento preferente pero no limitativo de enrequecimiento de biomasa de microalgas del genero Nannochloropsis en distintos acidos grasos, principalmente EPA, y DHA comprende las etapas de:
- Preparación de una suspension etanolica de Kpidos o acidos grasos o de una emulsion lfpidos o acidos grasos + emulsionante (BSA, bovine serum albumin u otro) que comprende a su vez:
- Preparar una solución madre o stock de lfpido (que puede ser preferentemente EpaDhax150 o DHA, Sigma D-2534 u otro aceite rico en DHA) en etanol, a una concentración de 50 pg/pL.
- Preparar una solución madre stock de BSA, que preferentemente puede ser Sigma A4503, u otro emulsionante en H2O destilada, a una concentración de 50 mg/mL.
- preparar una mezcla madre o stock de lfpido / acido graso puro y BSA en una proporción 1:2. Agitar hasta que se forme la emulsion.
- Preparación del concentrado de biomasa mediante centrifugado u otro procedimiento de concentración como por ejemplo sedimentación, floculación, filtración tangencial, etc., para obtener una concentración final de 10 mg/mL o mayor, a la que se añade la emulsion previamente preparada. El procedimiento se puede llevar a cabo con diferentes concentraciones de biomasa
- Enriquecimiento del concentrado de biomasa mediante el anadido directo de la solución madre de lfpidos en etanol o de la emulsion lfpido+ emulsionante (BSA u otro) al concentrado de microalgas
- Dejar la mezcla en agitación constante durante 24 horas en presencia de luz.
En una posible forma de realización se podna añadir 150 pL de emulsion (lfpidos+ emulsionante) a 850 pL de concentrado microalgal, lo que representa una proporción aproximada de 1:6, o cualquier combinación volumetrica que mantenga esa proporción.
En otra posible forma de realización se anadinan 50 pL de una solución lipfdica en etanol a 950 pL de concentrado microalgal, lo que representa una proporción aproximada de 1:20, o cualquier combinación volumetrica que mantenga esa proporción.
El tiempo de agitación constante de la mezcla puede ser con un ciclo de 12h de luz, 12h de oscuridad.
Gracias al procedimiento descrito y a los ensayos realizados se pone de manifiesto que la aplicación de las condiciones descritas en la bibliograffa no resulta efectiva para la obtención de enriquecimiento en las suspensiones concentradas de microalgas, independientemente de la fuente de acido graso utilizada, que solo puede ser conseguido mediante las condiciones y compuestos descritos en la invención.
Descrita suficientemente la naturaleza de la presente invención, así como la manera de ponerla en practica, se hace constar que, dentro de su esencialidad, podra ser llevada a la practica en otras formas de realización que difieran en detalle de la indicada a tftulo de ejemplo, y a las cuales alcanzara igualmente la protección que se recaba, siempre que no altere, cambie o modifique su principio fundamental.
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