- El documento WO-A-92 09891 (National Council of Canada) , 11 de junio de 1992, describe un ensayo espectrofluorimétrico continuo de fosfatasa dependiente de calmodulina, que controla la formación de un 4-metilumbeliferil fosfato fluorescente. Las toxinas diarreicas (ácido okadaico, dinofisistoxina I, II, III y yesotoxinas y pectenotoxinas identificadas recientemente) , actúan inhibiendo potente y selectivamente las fosfatasas citosólicas PP1 y PP2A. Estas fosfatasas se han caracterizado hace varios años y se pueden obtener en grandes cantidades usando fuentes ricas en fosfatasas, tales como músculo esquelético o cerebro. Por lo tanto, ya se ha descrito el estudio in vitro del efecto inhibidor de las toxinas DSP sobre las fosfatasas por medio del uso de marcadores radiactivos, que de ninguna manera podrían usarse para un método de detección debido a los problemas que tiene la radiación de fósforo, así como su corta vida media, su coste y el alto grado de error asociado con este procedimiento.
Las fosfatasas pueden purificarse a partir de un homogeneizado tisular por cromatografía de intercambio iónico (eluyendo la fase móvil con baja presión) y posteriormente por repurificación de las fracciones obtenidas que contienen las fosfatasas.
Este procedimiento puede continuarse hasta la purificación total de cada enzima, aunque es un proceso muy laborioso y delicado. Las fosfatasas obtenidas son activas y pueden conservarse a bajas temperaturas durante un periodo de hasta 6 meses. Este procedimiento de purificación puede acelerarse y mejorarse usando sistemas de alta presión, reduciendo de esta forma el tiempo de separación y aumentando la eficacia de la separación.
Las fosfatasas pueden usarse sin la necesidad de alcanzar una purificación total, ya que mantienen la sensibilidad al efecto inhibidor de las toxinas DSP, pero con un menor esfuerzo y coste de purificación. Las fosfatasas enriquecidas se ponen en una placa de microtitulación, y se realiza el ensayo de inhibición para determinar la presencia o la ausencia de las toxinas incubando en los pocillos de la placa un extracto metanólico al 80% en presencia de una cierta cantidad de enzima. Las toxinas se determinan comparando la actividad de la fosfatasa con patrones conocidos de ácido okadaico (que es la toxina diarreica principal) . La cuantificación de la actividad de la toxina se realiza por cuantificación del color de fosfato libre, de la fluorescencia (en el caso de substratos fluorescentes) o de la luminiscencia (en el caso de substratos luminiscentes) en un espectrofotómetro, fluorímetro o luminómetro, respectivamente, que generan los diferentes tipos de substratos de fosfatasa PP2A.
Las ventajas de esta técnica son:
- No requiere el uso de ratones. - No requiere tiempo de observación. - Corrige la falta de sensibilidad y especificidad del bioensayo. - El tiempo de preparación del ensayo es de 30 minutos. - El tiempo de obtención de resultados es de 5 minutos. - Pueden procesarse simultáneamente varios cientos de muestras. - El coste es inferior al coste de las técnicas actuales. - Puede realizarse por personal que no esté altamente cualificado. - Carece de los inconvenientes de otras técnicas basadas en el uso de marcadores radiactivos o en la detección cromatográfica de las toxinas (alto coste, ausencia de reproducibilidad, riesgo de radiactividad, residuos) . Una manera de realizar la invención es:
La obtención por técnicas cromatográficas de fracciones enriquecidas en fosfatasa PP2A:
Se sacrifica un conejo con una sobredosis de anestesia. Se aíslan los músculos del lomo y de las patas, y se mantienen en frío. Después de cortar el tejido, se homogeneiza en un tampón a pH 7, 4. El homogeneizado se centrifuga a 100.000 g durante 1 hora y se recogen los sobrenadantes.
El sobrenadante se introduce en una columna de DEAE-celulosa, que se había activado previamente, y se eluye con un gradiente de cloruro sódico de 0 a 0, 4 molar, tamponado con Tris HCL 500 mM a pH 7, 4 y con glicerol al 10%.
Los picos obtenidos se detectan en un espectrofotómetro a 600 nm. Se obtienen seis picos de absorbancia principales, de los cuales el segundo y el tercero están enriquecidos en PP2A. La actividad de la fosfatasa se comprueba midiendo el color generado por la fosfatasa liberada del fosfopéptido de serina/treonina. La actividad se comprueba frente a una curva de calibración obtenida con el fosfato libre.
Determinación de la presencia de toxinas DSP en muestras contaminadas.
El desarrollo de esta técnica se realizó usando, independientemente y con resultados similares, las siguientes fuentes de fosfatasa PP2A:
1) La subunidad catalítica de la proteína fosfatasa de tipo 2A (PP2A) de músculo de conejo, y con una pureza superior al 70%, obtenida a partir de una fuente comercial. 2) La proteína fosfatasa de tipo 2A (PP2A) procedente de glóbulos rojos humanos aislada como el heterodímero con las subunidades A (60 kDa) y B (36 kDa) , obtenida a partir de una fuente comercial. 3) Las fracciones cromatográficas enriquecidas en PP2A y obtenidas por purificación parcial a partir de músculo de conejo. El ensayo se realiza en una placa de microtitulación con 96 pocillos, en la que se incuba PP2A con el tampón de reacción (Tris HCL 50 mM, pH 8, 5) a 37 grados centígrados durante 15 minutos en un volumen de 50-80 μl. Después de 15 minutos, se añade una alícuota a diferentes diluciones del extracto metanólico obtenido a partir de moluscos contaminados con DSP (el extracto obtenido se seca y se resuspende en DMSO (dimetilsulfóxido) al 10% antes de su uso) y la mezcla se incuba de nuevo durante unos minutos a 37 grados centígrados. Para medir la actividad de PP2A, se añade el substrato enzimático en un volumen de 150-180 μl en Tris HCL 50 mM, pH 8, 5, para obtener un volumen final de 200 μl. En el caso de una técnica fluorimétrica, para medir la actividad, se añade un substrato fluorescente de la enzima, tal como fosfato de metilumbeliferona 70 μM, o difosfato de fluoresceína 30 μM. Si se usa la técnica colorimétrica, se añade un substrato específico de la enzima, tal como el fosfopéptido de serina/treonina, y después se cuantifica la liberación de fosfato libre en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
La actividad de la fosfatasa PP2A se inhibirá proporcionalmente a la cantidad de toxinas DSP. Para cuantificar las toxinas, se requiere una curva de calibración obtenida con cantidades conocidas de ácido okadaico, donde los datos de fluorescencia o densidad óptica obtenidos a partir de los pocillos con las muestras proporcionan la concentración de toxinas DSP capaz de inhibir la actividad fosfatasa. Dependiendo del substrato, que puede estar coloreado, ser fluorescente o luminiscente debido a la liberación de grupos fosfato, habrá tres tipos de técnicas no radiactivas, particularmente las técnicas espectrofotométrica, luminométrica o fluorimétrica, para detectar toxinas DSP.
Para realizar estas técnicas no radiactivas, es necesario usar compuestos con dos características principales:
1) Que sean buenos substratos de fosfatasa PP2A. 2) Que los disolventes usados para obtener el extracto (metanol) no interfieran con la determinación. Los substratos adecuados que tienen estas dos características, críticas para realizar un ensayo de toxinas DSP rutinario, son los siguientes:
1) fosfato de 4-metilumbeliferona (4-MUP) . Excitación 370/Emisión 430. 2) Difosfato de fluoresceína (FDP) . Excitación 480/Emisión 520. 3) Un fosfopéptido de serina/treonina. La lectura de la densidad óptica debe realizarse en placas de microtitulación a una longitud de onda de 600 nm.
