Enzimas con actividad b -(1,6)-endoglucanasa.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a enzimas con actividad b -(1,6)-endoglucanasa, a construcciones de ADN que codifican para dichas enzimas, a métodos para la producción de dichas enzimas, a preparaciones enzimáticas que contienen dichas enzimas y al empleo de dichas enzimas y preparaciones enzimáticas para la degradación o modificación de materiales que contienen b -(1,6)-glucano.
Antecedentes de la invención
Existen organismos con la capacidad de actuar como agentes de control biológico. Entre estos organismos se encuentran algunas especies de hongos, por ejemplo, del género Trichoderma, útiles como agentes de control biológico frente a diversos fitopatógenos fúngicos. La degradación y posterior asimilación de los hongos fitopatógenos, proceso conocido como micoparasitismo, se ha propuesto como el mecanismo principal para explicar la actividad antagonista de tales hongos frente a patógenos fúngicos. El micoparasitismo es un proceso complejo que comprende varias etapas, entre las que se encuentra la penetración del micoparásito en el micelio del hongo fitopatógeno, lo cual parece que va acompañado de una degradación, al menos parcial, de la pared celular del hongo fitopatógeno.
El estudio de los modelos de expresión de las enzimas que degradan la pared celular de hongos en distintas fuentes nutrientes, y la caracterización bioquímica de estas enzimas son requisitos previos para comprender las bases moleculares de la acción antagonista de los agentes de control biológico frente a hongos fitopatógenos. En base a esto, se ha analizado la producción de quitinasas, b -1,6-glucanasas, b -1,3-glucanasas y proteasas extracelulares por distintos organismos potencialmente útiles como agentes de control biológico cuando se cultivan en condiciones que asemejan dicho antagonismo, tales como la presencia de polisacáridos abundantes en las paredes celulares de los hongos (por ejemplo, quitina), paredes celulares fúngicas purificadas o micelios esterilizados en autoclave como fuentes de nutrientes. Algunas de estas hidrolasas han sido purificadas y se las considera enzimas clave durante las primeras etapas del antagonismo.
Debido a la complejidad de las paredes celulares de los hongos, también son interesantes las actividades hidrolíticas con capacidad para degradar otros polisacáridos no abundantes en la pared celular. Recientes estudios han puesto de manifiesto que el b -1,6-glucano es un polímero clave en la estructura de la pared celular de los hongos ya que está implicado en la unión de los componentes mayoritarios que incluyen b -1,3-glucanos, quitina y manoproteínas. Por tanto, las enzimas que hidrolizan b -1,6-glucanos fúngicos bajo las condiciones previamente mencionadas deberían contribuir, junto con quitinasas y b -1,3-glucanasas, a una ruptura eficaz de las paredes celulares de los hongos (fitopatógenos, patógenos de animales, contaminantes de alimentos, etc.) durante el antagonismo.
Los hongos del género Trichoderma han sido estudiados desde hace mucho tiempo tanto por su actividad celulolítica como por sus propiedades antagonistas de los patógenos fúngicos de las plantas. El mecanismo antifúngico de Trichoderma implica el empleo de enzimas que degradan la pared celular del hongo, entre las que se encuentran quitinasas, b -1,3- y b -1,6-glucanasas y proteasas. Debido a que la quitina y el b -1,3-glucano son los principales componentes estructurales de las paredes celulares fúngicas (excepto de los Oomycetes), se ha propuesto que las quitinasas y las b -1,3-glucanasas sean las enzimas clave en la lisis de las paredes celulares de los hongos fitopatógenos durante la acción antagonista de Trichoderma. Sin embargo, parece que otras enzimas que degradan las paredes celulares, incluyendo aquéllas que hidrolizan los polímeros minoritarios (b -1,6-glucanos, a -1,3-glucanos, etc.) también pueden estar implicadas en la degradación eficaz y completa de las paredes del micelio y de los conidios de hongos fitopatógenos por Trichoderma.
Las b -(1,6)-endoglucanasas (1,6-b -D-glucan glucano-hidrolasas, EC 3.2.1.75) son enzimas que catalizan la ruptura de los enlaces b -(1,6)-glucosídicos presentes en el b -glucano, uno de los componentes de las paredes celulares de numerosos organismos, por ejemplo, hongos y levaduras. Estas enzimas también se denominan pustulanasas debido a su capacidad para degradar el pustulano.
La presencia de una actividad b -(1,6)-glucanasa ha sido detectada en diversos organismos.
Martin et al. [Applied and Environental Microbiology, 1980, 40(6), 1136-1138] describen algunas especies de Bacillus que secretan b -(1,6)-glucanasas.
Schep et al. [Biochem J., 1984, 223, 707-714] describen la purificación y propiedades de una b -(1,6)-glucanasa de Penicillium brefeldianum.
Dubourdieu et al. [Carbohydrate Research, 144, 277-287 (1985)] han descrito una preparación enzimática industrial [NOVOZYM SP-116, de Novo Industri A/S] derivada de una cepa de T. harzianum que, entre otras glucanasas, comprende una b -(1,6)-exoglucanasa.
Pitson et al. [Enzyme Microbiol. Technol., 1993, 15, 178-192] describen que algunos hongos filamentosos tales como Penicillium brefeldianum o Trichoderma harzianum y levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae producen enzimas que exhiben actividad b -(1,6)-endoglucanasa.
Mullenga et al. [Microbios, 1994, 80(234), 143-154] describen el aislamiento y caracterización de una b -(1,6)-glucanasa en una cepa de Saccharomycopsis fibuligera.
Se ha descrito una actividad b -1,6-glucanasa extracelular a partir de una cepa de Trichoderma harzianum, descrita como un eficaz agente de control biológico, que crece sobre quitina como única fuente de carbono [de la Cruz et al., 1993, Arch. Microbiol., 159, 316-322]. Dicha actividad es debida a la presencia de, al menos, dos b -1,6-glucanasas, denominadas BGN16.1 y BGN16.2 [De la Cruz et al., 1995, J. Bacteriol., 177, 1864-1871]. La enzima BGN16.2 y el gen bgn16.2 ya han sido analizados [De la Cruz et al., 1995, J. Bacteriol., 177, 1864-1871; Lora et al., 1995, Mol. Gen. Genet., 247, 639-645]. Sin embargo, la enzima BGN16.1 no ha sido purificada ni caracterizada previamente ni el gen que codifica para dicha enzima, por lo que se desconoce tanto la estructura de dicha enzima como sus relaciones con otras enzimas o las inferencias evolutivas.
La patente norteamericana US 5.770.406 describe una enzima con actividad b -1,6-endoglucanasa derivada de Trichoderma harzianum que se caracteriza porque tiene un peso molecular aparente de 50 kDa determinado por electroforesis en condiciones desnaturalizantes, un pH óptimo de 5, una temperatura óptima comprendida entre 30ºC y 40ºC, una Km de 0,3 % aproximadamente sobre pustulano, un pI aparente de 5,6, una actividad específica de alrededor de 100 U/mg de enzima y un modo de acción endo.
Aunque se han descrito diversas enzimas con actividad b -(1,6)-glucanasa en diferentes organismos (bacterias, hongos, levaduras), la enorme variedad existente en cuanto a los mecanismos de acción, afinidad a sustrato, especificidad, capacidad lítica, etc., hace que siga siendo necesario incrementar el arsenal de enzimas con capacidad para degradar o modificar la pared celular de organismos perjudiciales, por ejemplo, hongos fitopatógenos y saprofíticos, con el fin de poder evitar de forma eficaz las pérdidas causadas por tales hongos.
La invención proporciona una solución a la necesidad existente que comprende la purificación y caracterización de unas enzimas con actividad b -1,6-glucanasa de Trichoderma harzianum, el aislamiento y caracterización de las secuencias de ADN que codifican para dichas enzimas y la clonación de dichas secuencias de ADN.
La invención también proporciona un método para la producción de dichas enzimas, preparaciones enzimáticas que contienen dichas enzimas y el empleo de dichas enzimas y preparaciones enzimáticas para la degradación o modificación de materiales que contienen b -(1,6)-glucano.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una imagen de microscopio óptico (200X de amplificación) en el que se aprecia el efecto antifúngico, determinado por la reducción del tamaño de las hifas del hongo fitopatógeno Penicillium digitatum, producido por la enzima BGN16.3 [Figura 1A] y el efecto de un control negativo [Figura 1B].
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona una enzima con actividad b -(1,6)-glucanasa, en adelante enzima de la invención, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. Nº.: 1, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. Nº.: 2, y una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga y funcionalmente equivalente a las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC. ID. Nº.: 1 o en la SEC. ID. Nº.: 2. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de aminoácidos, de, al menos, un 70 %, preferentemente de, al menos, un 85 %, y, más preferentemente de, al menos, un 95 %.
Asimismo, en el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "funcionalmente equivalente" significa que la proteína en cuestión tiene, al menos, actividad b -(1,6)-glucanasa.
La enzima cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC. ID. Nº.: 1 se relaciona con la enzima denominada BGN16.1, por lo que a dicha enzima se la identificará es esta descripción con la denominación BGN16.1, cuya existencia había sido propuesta previamente [De la Cruz et al., 1995, J. Bacteriol., 177, 1864-1871] aunque no ha sido purificada ni caracterizada con anterioridad ni tampoco la secuencia de ADN que codifica para dicha enzima, debido en gran medida a las dificultades técnicas que plantean los bajísimos niveles de expresión que presenta [determinado por ensayos northern y por el número de clones escrutado para conseguir uno positivo].
La enzima cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC. ID. Nº.: 2 ha sido denominada BGN16.3 en esta descripción y no ha sido descrita previamente.
Las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 presentan las características que se resumen en la Tabla 1.
TABLA 1 Propiedades de BGN16.1 y BGN16.3 | | |
| Parámetro | BGN16.1 | BGN16.3 |
| | |
| Peso molecular (SDS) | 51 kDa | 47,5 kDa |
| pI (IEE) | 7,4 | 4,5 |
| pI (CE) | 7,7 | 4,1 |
| Ta inactivación | 50ºC | 50ºC |
| Glicosilación | No | No |
| Ta óptima | 50ºC | 50ºC |
| Km (pustulano) | 0,08 % | 0,11 % |
| Modo de acción | Endo | |
| Halos de lisis en paredes | No | |
| Actividad específica | 170 U/mg | 185 U/mg |
[SDS: dodecilsulfato sódico; pI: punto isoléctrico; IEE: isoelectroenfoque; CE: cromatoenfoque]
En los Ejemplos que acompañan a esta descripción se describen detalladamente los métodos utilizados para la determinación de dichas propiedades.
La enzima de la invención puede obtenerse a partir de un organismo productor de la misma, tal como un hongo del género Trichoderma, mediante un procedimiento que comprende el cultivo del organismo productor bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha enzima y, posteriormente, recuperar dicha enzima. En una realización particular de esta invención, el hongo utilizado pertenece a la especie Trichoderma harzianum, concretamente a la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 2413.
El cultivo del organismo productor puede hacerse en dos etapas, tal como se menciona en el Ejemplo 1. En una primera etapa se inoculan esporas del hongo en un medio de cultivo suplementado con glucosa como fuente de carbono y, a continuación, se recoge el micelio, se lava y se cultiva en medio mínimo adecuado suplementado con quitina como única fuente de carbono para inducir la BGN16.1. A diferencia de la BGN16.1, la BGN16.3 tiene la particularidad de no inducirse, o de hacerlo en cantidades no detectables, por quitina sino que se induce en presencia de paredes celulares de hongos, por ejemplo, de Botrytis, o en ausencia de fuente de carbono.
La actividad b -(1,6)-glucanasa se puede ensayar mediante el protocolo descrito en el Ejemplo 2.
El aislamiento y la purificación de la enzima de la invención se puede llevar a cabo mediante un procedimiento que comprende la precipitación de la enzima con sulfato amónico, la adsorción-digestión a pustulano, el cromatoenfoque de la solución dializada procedente de la adsorción-digestión a pustulano y la filtración en gel de las fracciones concentradas que presentaron mayor actividad b -(1-6)-glucanasa [véase el Ejemplo 3].
Con la enzima de la invención aislada y purificada se realizaron los ensayos físico-químicos y cinéticos que se mencionan en los Ejemplos 4-11 y cuyos resultados se recogen en la Tabla 1 previamente mostrada. La actividad antifúngica de la enzima de la invención se muestra en el Ejemplo 12.
A partir de la enzima de la invención se puede identificar y aislar la secuencia de ADN que codifica para dicha enzima mediante un procedimiento que comprende:
- la creación de genotecas de ADN genómico (ADNg) o de ADN copia (ADNc) de organismos productores de la enzima de la invención;
- la secuenciación del extremo amino de la enzima de la invención y de fragmentos trípticos de la misma;
- el diseño de oligonucleótidos adecuados para amplificar, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una región del clon genómico de los organismos productores de la enzima de la invención que sirva para obtener sondas destinadas a escrutar dichas genotecas; y
- el análisis y selección de los clones positivos.
Todas estas etapas se describen con más detalle en el Ejemplo 13 donde se ilustra la obtención de las secuencias de ADN que codifican para las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 de T. harzianum.
La extracción del ADNg se puede llevar a cabo mediante un protocolo estándar [Kaiser et al., 1994, Methods in yeast genetics. A Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York] con algunas modificaciones, por ejemplo, la adición de un paso de purificación con fenol [véase el Ejemplo 13.1].
Para la creación de la genoteca de ADNc se extrae el ARN total del organismo productor de la enzima de la invención siguiendo un protocolo estándar [Chomczynski y Sacchi, 1987, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorofom extraction. Anal. Biochem. 162:156-159] con ligeras modificaciones. En una realización particular, el organismo productor de la enzima de la invención es T. harzianum CECT 2413 el cual se cultiva en un medio mínimo con paredes de organismos de la especie Botrytis como única fuente de carbono, aislándose el ARN mensajero (ARNm) mediante cromatografía de afinidad a oligo(dT)celulosa. Posteriormente, se sintetiza el ADNc, por ejemplo, utilizando un kit comercial, se le unen unos adaptadores apropiados, se liga a un vector adecuado y se empaqueta en un hospedador apropiado, por ejemplo, el fago l [véase el Ejemplo 13.2 y 13.3].
La secuenciación del extremo amino de la enzima de la invención y de fragmentos trípticos de la misma se puede realizar mediante cualquier procedimiento convencional, por ejemplo, mediante el método de Edmans Matsudaira [A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing. Academic press, Inc. New York, Edmans Matsudaira (eds.) 1989] [véase el Ejemplo 13.4].
A partir de la información obtenida de la secuencia del extremo amino y de los fragmentos trípticos de la enzima de la invención se procedió a diseñar un conjunto de oligonucleótidos destinados a amplificar una secuencia específica correspondiente a la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención. En una realización particular, los oligonucleótidos directos se diseñaron a partir de las secuencias de los extremos amino de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 mientras que los oligonucleótidos inversos (antisentido) se diseñaron a partir de las secuencias de los fragmentos trípticos de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3. En el Ejemplo 13.4 se describen las secuencias de los extremos amino y de los fragmentos trípticos de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 que sirvieron para diseñar los oligonucleótidos utilizados para la realización de la PCR [véase el Ejemplo 13.5].
Los fragmentos adecuados resultantes de la amplificación mediante PCR se pueden marcar y utilizar como sondas para escrutar una genoteca (de ADNg o de ADNc) con el fin de aislar los clones de interés mediante hibridación in situ [véase el Ejemplo 13.6].
Por tanto, la invención proporciona una construcción de ADN que codifica para la enzima de la invención que comprende:
una secuencia de ADN seleccionada entre la SEC. ID. Nº: 3 y la SEC. ID. Nº: 4; o una secuencia de ADN análoga a la secuencia definida en a) que
es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN definida en a); y/o codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la secuencia de ADN definida en a). La SEC. ID. Nº.: 3 corresponde a la secuencia de nucleótidos que codifica para la BGN16.1 mientras que la SEC. ID. Nº.: 4 corresponde a la secuencia de nucleótidos que codifica para la BGN16.3.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análogo/a" pretende incluir a cualquier secuencia de ADN que codifica para una enzima con actividad b -1,6-endoglucanasa que tiene las propiedades i)-ii) arriba mencionadas. Típicamente, la secuencia de ADN análoga:
- se puede aislar de otro organismo que produce la enzima con actividad b -(1,6)-glucanasa en base a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. Nº: 3 o en la SEC. ID. Nº: 4, o
- se construye en base a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. Nº: 3 o en la SEC. ID. Nº: 4, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas, es decir, que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos de la b -(1,6)-glucanasa codificada por dicha secuencia de ADN mostrada en SEC. ID. Nº.: 3 o en SEC. ID. Nº.: 4, pero que corresponde al empleo de codones del organismo hospedador destinado a la producción de la enzima, o bien mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que dan lugar a una secuencia de aminoácidos diferente y, por tanto, posiblemente, a una estructura proteica diferente que pudiera dar lugar a una b -(1,6)-glucanasa mutante con propiedades diferentes a las de la enzima nativa. Otros ejemplos de posibles modificaciones incluyen la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. Por ejemplo, la secuencia de ADN análogo puede ser una subsecuencia de la secuencia de ADN mostrada en cualquiera de las secuencias mostradas en SEC. ID. Nº.: 3 o SEC. ID. Nº.: 4.
En general, la secuencia de ADN análoga es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN que codifica para una enzima b -(1,6)-glucanasa de la invención, por ejemplo SEC. ID. Nº.: 3 o SEC. ID. Nº.: 4, es decir, presenta una homología a nivel de nucleótidos de, al menos, un 70 %, preferentemente, al menos un 85 %, o más preferentemente, al menos, un 95 % respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas previamente.
La secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención puede proceder no solo de T. harzianum CECT 2413 sino de cualquier otra cepa de Trichoderma o de un organismo hospedador transformado con dicha secuencia de ADN.
Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención, puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier organismo mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos preparados a partir de la información sobre la secuencia de ADN proporcionada en esta descripción, o mediante iniciadores (por PCR).
La secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención, o la construcción que la contiene, puede ser insertada en un vector apropiado. Por tanto, la invención también se refiere a un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia de ADN, o una construcción que la contiene. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha células y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (en los que) se ha integrado.
En el vector proporcionado por esta invención, la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención debe estar conectada operativamente a un promotor y a una secuencia terminadora. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra una actividad transcripcional en la célula hospedadora elegida y puede derivar bien de genes que codifican para proteínas homólogas o heterólogas de la célula hospedadora. Los procedimientos utilizados para ligar la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención al promotor y a la secuencia terminadora, respectivamente, y para insertar dicha construcción en un vector son bien conocidos por los técnicos en la materia y han sido descritos, por ejemplo, por Sambrook et al. [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989].
La invención también proporciona una célula que comprende una secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención, o una construcción de ADN que contiene a dicha secuencia o dicho vector mencionado más arriba. Las células hospedadoras que se pueden transformar con la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención pueden ser células procarióticas o, preferentemente, células eucarióticas, tales como células de tejidos vegetales o células fúngicas, por ejemplo, células de levadura o de hongos filamentosos. La transformación de estas células puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante técnicas que implican la formación de protoplastos y la transformación de los mismos seguido de la regeneración de la pared celular. La transformación de células de tejidos vegetales puede ser muy interesante desde diversos puntos de vista, por ejemplo, para aumentar la resistencia a hongos fitopatógenos.
La invención también proporciona un método para la producción de una enzima de la invención, que comprende cultivar una célula hospedadora adecuada que contiene la secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención bajo condiciones que permiten la producción de la enzima y recuperar la enzima del medio de cultivo.
El medio utilizado para cultivar las células hospedadoras transformadas puede ser cualquier medio adecuado para cultivar las células hospedadoras en cuestión. La b -(1,6)-glucanasa expresada puede ser, ventajosamente, secretada al medio de cultivo y puede ser recuperada mediante un procedimiento como el descrito en el Ejemplo 3 o por cualquier otro procedimiento convencional de aislamiento de proteínas que comprende la separación de las células del medio de cultivo, la precipitación de las proteínas y la separación por métodos cromatográficos.
La invención también proporciona una preparación enzimática útil para la degradación o modificación de materiales que contienen b -(1,6)-glucano, por ejemplo, el material de la pared celular microbiana, que comprende, al menos, una enzima con actividad b -(1,6)-glucanasa de la invención. Dicha preparación enzimática puede contener entre 0,01 % y 100 % en peso de dicha enzima con actividad b -(1,6)-glucanasa de la invención.
En una realización particular, la preparación enzimática proporcionada por esta invención es una preparación enzimática de componente único y contiene mayoritariamente una o más de las enzimas con actividad b -(1,6)-glucanasa de la invención.
En otra realización particular, la preparación enzimática proporcionada por esta invención comprende múltiples actividades enzimáticas, por ejemplo, diferentes actividades enzimáticas requeridas para la modificación o degradación de paredes celulares microbianas. A modo de ejemplo, dicha preparación enzimática puede incluir enzimas líticas, en particular de origen microbiano (fúngico o bacteriano), por ejemplo, derivadas de diversas especies de los géneros Trichoderma, Oerskovia, Arthrobacter, Rhizotocnia, Staphylococcus o Streptomyces. También puede contener una o más enzimas capaces de modificar o degradar paredes celulares, por ejemplo, enzimas con actividad celulolítica, mananolítica, quitinolítica o proteolítica, tales como celulasas, otras b -(1,6)-glucanasas, b -(1,3)-glucanasas, mananasas, endo- o exo- quitinasas, quitosanasas, proteasas, a - o b -manosidasas, mutanasas, etc. Estas enzimas pueden proceder de cualquier organismo productor de las mismas, tales como diversas especies del género Aspergillus o los mencionados más arriba en relación con las enzimas líticas.
La preparación enzimática de la invención puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un granulado. La preparación enzimática puede contener aditivos, por ejemplo, estabilizantes que prolonguen la estabilidad de la misma.
La invención proporciona, además, una composición antifúngica que comprende, al menos, una enzima de la invención junto con, al menos, un fungicida químico. Como fungicida químico puede utilizarse cualquiera de los usados habitualmente, preferentemente, un fungicida químico seleccionado del grupo formado por los fungicidas químicos que afectan a la membrana, los fungicidas químicos que afectan a la síntesis de la pared celular y sus mezclas. Opcionalmente, la composición antifúngica de la invención puede contener, además, al menos, una proteína con actividad enzimática degradadora de la pared celular microbiana. Cualquier enzima con actividad degradadora de la pared celular microbiana puede utilizarse, si se desea, en la composición antifúngica de la invención.
La composición antifúngica de la invención, que puede contener entre 0,01 % y 99,99 % en peso de la enzima de la invención, puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un granulado. La composición antifúngica de la invención también puede contener aditivos, por ejemplo, estabilizantes con el fin de prolongar la estabilidad de la misma.
La enzima de la invención puede ser utilizada para degradar o modificar materiales que contienen b -(1,6)-glucano, por ejemplo, las paredes celulares microbianas. En una realización particular preferida, la enzima de la invención puede ser utilizada como biofungicida frente a diversos organismos perniciosos, por ejemplo, frente a hongos fitopatógenos, hongos que causen daños en cultivos, hongos patógenos de animales, incluido el hombre, por ejemplo Candida spp., responsable de candidiasis en humanos y animales, hongos contaminantes de alimentos, etc.
La enzima de la invención también puede utilizarse para romper o lisar las paredes celulares de diversos microorganismos para recuperar productos de interés producidos por dichos microorganismos. En este sentido, cabe destacar que la BGN16.1 es aproximadamente unas 10 veces más efectiva en la ruptura o lisis de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae que la enzima descrita en la patente norteamericana US 5.770.406.
La preparación enzimática de la invención puede diseñarse a voluntad con una composición específicamente adaptada para la pared celular a romper o lisar. Por ejemplo, si la pared celular a romper contiene un complejo proteína-manano y un glucano, la preparación enzimática podría contener, ventajosamente, una mezcla de actividades proteasa, mananasa, quitinasa y b -glucanasa, con el fin de romper de forma eficiente dicha pared celular.
Otras aplicaciones de la enzima de la invención incluyen, a modo ilustrativo, no limitativo, la extracción de manoproteínas de la capa externa de las paredes celulares de levadura; la producción de protoplastos a partir de levaduras u hongos; la preparación de extractos de levaduras y hongos; la mejora de las operaciones de filtración en procesos para la producción de vinos, mostos y zumos; la elaboración de vinos con propiedades organolépticas alteradas mediante la sobreexpresión del gen en las levaduras vínicas; la elaboración de composiciones para la limpieza de dientes y dentaduras; la elaboración de composiciones para la limpieza de lentes de contacto; la eliminación de hongos sobre recubrimientos; el tratamiento de tejidos, por ejemplo, la retirada del exceso de colorante en los tejidos; la elaboración de composiciones para retirar la placa dental; la elaboración de composiciones para retirar películas biológicas (biofilms) depositadas en superficies, por ejemplo en la superficie de una lente de contacto.
La enzima o la preparación enzimática proporcionadas por esta invención pueden utilizarse en el control de organismos perniciosos, por ejemplo, hongos, patógenos de plantas, animales, incluido el hombre, o contaminantes de cosechas y alimentos. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "controlar" incluye la reducción o paralización del crecimiento y/o de la germinación que puede resultar en la eliminación de dichos organismos perniciosos o en la disminución de los daños causados por éstos.
La composición antifángica de la invención puede ser usada para controlar todo tipo de hongos perniciosos, por ejemplo, patógenos de plantas, animales, incluido el hombre, o contaminantes de cosechas y alimentos, mediante el mecanismo de lucha conocido como control integrado.
La dosificación de la preparación enzimática y de la composición antifúngica proporcionadas por esta invención y sus condiciones de uso pueden ser determinados en base a los métodos conocidos en la técnica.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
Ejemplo 1
Cultivo de T. harzianum
T. harzianum CECT 2413 se obtuvo de la Colección Española de Cultivos Tipo, CECT (Valencia, España) y se mantuvo en un medio de cultivo PPG (puré de patata + glucosa, ambos al 2 %), suplementado con agar al 2 %.
Para la producción y purificación de las enzimas BGN16.l y BGN16.3, así como para la producción de la genoteca de ADNc se cultivó T. harzianum en dos etapas siguiendo protocolos ya descritos por De la Cruz et al. [J. Bacteriol., 1995, Vol. 177, No. 7, 1864-1871].
Brevemente, para la producción de BGN16.1, en una primera etapa se inoculan esporas de T. harzianum a una concentración final de 108 esporas/ml en medio mínimo (MM) [KH2PO4, 15 g/l; (NH4)2SO4, 5 g/l; 1 ml/l de oligoelementos (FeSO4·7H2O, 5 g/l; MnSO4·H2O, 1,6 g/l; ZNSO4·7H2O, 1,4 g/l; CoCl2·6H2O, 3,7 g/l)] suplementado con glucosa al 2 % como fuente de carbono. El pH final del medio de cultivo se ajusta a 5,5 con KOH 1 M. En este medio de preinducción se cultiva T. harzianum durante 48 horas a 28ºC y con agitación orbital a 200 rpm. Posteriormente, se recoge el micelio, se lava sucesivamente con MgCl2 y H2O y se transfiere a MM suplementado con quitina al 1,5 % como fuente de carbono.
Para la producción de BGN16.3 se siguió un proceso similar al descrito para la producción de BGN16.1 pero utilizando medio Czapek [MgSO4·7H2O, 0,5 g/l; FeSO4·7H2O, 0,01 g/l; KCl 0,425 g/l, MgCl2·6H2O, 0,115 g/l; NH4Cl, 2,1 g/l; NaH2PO4, 0,92 g/l] como medio de preinducción y sin añadir quitina al medio de inducción ya que la BGN16.3 tiene la peculiaridad de que no es inducida por quitina (o al menos en cantidades detectables) sino por paredes celulares de hongos o en ausencia de fuente de carbono.
Ejemplo 2
Ensayo de la actividad b -(1,6)-glucanasa
La actividad b -(1,6)-glucanasa se determina mediante un ensayo que consiste en preparar una mezcla de ensayo conteniendo 0,8 ml de solución de pustulano [b -(1,6)-glucano] al 0,5 % (p/v) en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5, y 0,2 ml de la solución enzimática apropiadamente diluida en el mismo tampón. La mezcla de reacción se incuba a 37ºC durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 minutos y 1 hora, deteniendo la reacción calentándola a 100ºC durante 7 minutos. Posteriormente se determina el incremento de azúcares reductores en 0,15 ml de mezcla de reacción por el método de Somogyi [J. Biol. Chem., 1952, 195, 19-23] y Nelson [Methods Enzymol., 1957, 3, 85-86], usando como patrón glucosa a concentraciones comprendidas entre 0 y 1 mg/ml. Se incluyen blancos de enzima y de sustrato.
Se define 1 unidad de actividad b -(1,6)-glucanasa como la cantidad de enzima que libera 1 m mol de equivalentes de azúcares reductores, expresados como glucosa, por minuto, bajo las condiciones ensayadas.
La concentración de proteína se determina mediante el método de Bradford [Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254].
Ejemplo 3
Purificación de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3
Para la purificación de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 se siguió un procedimiento constituido por las siguientes etapas:
a) Precipitación con sulfato amónico
Esta etapa, al igual que todas las demás (salvo que se indique lo contrario) se realizó a 4ºC. Cultivos de T. harzianum incubados durante 48 horas en MM suplementado con quitina al 1,5 % (para la producción de BGN16.1) o en medio Czapek suplementado con paredes celulares de Botrytis al 0,1 % (para la producción de BGN16.3) se filtraron a través de papel Whatman nº 1 y se centrifugaron a 6.000 g durante 10 minutos. A continuación, el sobrenadante (unos 200 ml) se precipitó con sulfato amónico al 80 % de saturación. Tras una noche de incubación, el precipitado se recuperó centrifugando a 12.000 g durante 20 minutos, se resuspendió en el menor volumen posible de agua destilada y se dializó frente a tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5.
b) Adsorción-digestión a pustulano
Para la adsorción a pustulano (Umbilicaria papullosa, Calbiochem) se incuban alícuotas de 3 ml de sobrenadante dializado con 0,6 ml de pustulano particulado con etanol siguiendo el procedimiento descrito por De la Cruz et al. [J. Bacteriol., 1995, Vol. 177, No. 7, 1864-1871]. La incubación se realiza durante 20 minutos con agitación magnética y posteriormente se centrifuga a 12.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante (la fracción no adsorbida a pustulano) se vuelve a incubar con pustulano (este proceso se repite dos veces más). Los precipitados obtenidos tras las sucesivas adsorciones se lavan tres veces con 3 ml de una solución de NaCl 1 M en tampón fosfato-KOH 70 mM, pH 6,0 y, finalmente, se resuspende en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5 con fluoruro de fenilmetil-sulfonilo 1 mM y azida sódica 1 mM. Estas muestras se incuban durante toda la noche a 37ºC. La fracción clarificada fruto de la degradación del pustulano se centrifuga a 12.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante (5-10 ml) se dializa nuevamente frente a tampón imidazol-HCl 25 mM, pH 7,4.
c) Cromatoenfoque
La solución dializada procedente de la etapa b) se somete a cromatoenfoque. Para ello se utiliza una columna de vidrio calibrada, modelo C10/20 (1 cm de diámetro y 20 cm de altura) de Pharmacia (Suecia), que contiene un lecho de 18 ml de Polybuffer Exchanger 94 de la misma marca, limitado en su parte superior por 1 ml de Sephadex G-25 (Pharmacia) y un émbolo AC 10 y se empaqueta siguiendo el procedimiento descrito por el fabricante. La cromatografía se desarrolla a 4ºC. La columna se equilibra con 20 volúmenes de tampón imidazol-HCl. Como eluyente se usó Polybuffer 74 (Pharmacia) diluido en agua en una proporción 1:8. La solución se desgasificó previamente y el pH se ajustó a 4,0. Se aplicó un flujo de 9 ml/h por medio de una bomba peristáltica LKB 10200 conectada a la salida de la columna y se recogieron fracciones de aproximadamente 1,5 ml mediante un colector automático Pharmacia modelo Frac-100. Después de medir el pH de las distintas fracciones, se ensayó la actividad b -1,6-glucanasa. Las fracciones que presentaron mayor actividad se concentraron hasta 0,5 ml aproximadamente con un concentrador Centricon 10 (Amicon, Beverley, Mass.).
d) Filtración en gel
El conjunto de fracciones concentradas de BGN16.1 se aplica a una columna (1,6 x 40 cm) de Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) equilibrada con tampón acetato potásico 100 mM, pH 5,5 con KCl 100 mM y se eluye con el mismo tampón a un flujo de 7 ml/h. Nuevamente, las fracciones se ensayan para evaluar la actividad b -(1,6)-glucanasa, seleccionándose aquéllas que muestran los mayores niveles, las cuales se recogen, se lavan y se concentran en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5 en un concentrador Centricon 10. Las proteínas purificadas se almacenan a 4ºC.
La purificación de la BGN16.3 se realizó por filtración en gel en un FPLC con una columna Protein Pack 125 (Waters). Después de introducir la muestra se aplicó una solución de KCl 0,1 M en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5, a un flujo de 0,2 ml/min. Se recogieron fracciones cada 60 segundos (0,2 ml/fracción). La aparición de la proteína se monitorizó mediante un detector de absorbancia ajustado a 280 nm.
Ejemplo 4
Determinación del peso molecular de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3
El peso molecular de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 se determinó mediante electroforesis analítica en condiciones desnaturalizantes y por cromatografía en filtración en gel.
4.1 SDS-PAGE
La electroforesis de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 en condiciones desnaturalizantes [electroforesis en gel de poli-acrilamida tratado con dodecilsulfato sódico, SDS-PAGE] se realizó según el procedimiento descrito por Weber y Osborn (1975) [The Proteins (Vol. 1), págs. 179-221, Neurath y Hill (eds.), Academic Press, Inc., New York], usando geles al 12 % de acrilamida-bisacrilamida y un aparato Mini-Protean II de Bio-Rad (EEUU) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
El peso molecular aparente de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3, en las condiciones ensayadas, es de 51 kDa y 47,5 kDa, respectivamente.
4.2 Filtración en gel
Se determinó el peso molecular de la enzima BGN16.1 nativa mediante la técnica de filtración en gel en una columna de Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) (1,6 x 40 cm) calibrada con unas proteínas marcadoras, obteniéndose un valor de 20-25 kDa para la BGN16.1.
Ejemplo 5
Determinación del punto isoeléctrico de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3
Para determinar el punto isoeléctrico (pI) de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 se han empleado técnicas de isoelectroenfoque (IEE) y de cromatoenfoque (CE).
El isoelectroenfoque se realizó siguiendo el procedimiento descrito por Robertson et al. [Anal. Biochem., 1987, 167, 290-294]. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie. El valor del pI aparente para las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 se calculó por referencia a proteínas marcadoras convencionales con valores de pI comprendidos entre 3,5 y 9,3 (Amersham-Pharmacia). Los valores de pI aparentes calculados mediante isoelectroenfoque fueron de 7,4 para la BGN16.1 y de 4,5 para la BGN16.3.
Mediante cromatoenfoque ácido se calculó un pI de 4,1 para la BGN16.3 y mediante cromatoenfoque básico un pI de 7,7 para la BGN16.1.
Ejemplo 6
Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3
Para conocer la estabilidad de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 purificadas frente a la temperatura se incubaron las proteínas purificadas durante 30 minutos (BGN16.1) o durante 5 ó 10 minutos (BGN16.3) a temperaturas comprendidas entre 20ºC y 80ºC en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5, y, a continuación, se midió la actividad remanente a 37ºC añadiendo pustulano (5 mg/ml) como sustrato de ensayo. La temperatura de inactivación, que se define como la temperatura en la que la actividad específica se reduce un 50 % en las condiciones descritas, es de 50ºC tanto para la BGN16.1 como para la BNG16.3.
Ejemplo 7
Temperatura óptima
Las temperaturas óptimas de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 se determinaron mediante ensayos convencionales en los que se valoró la actividad enzimática en un intervalo de temperaturas comprendido entre 20ºC y 80ºC. La temperatura óptima obtenida fue de 50ºC, a pH 5,5, para la BGN16.1, es decir, la misma que la temperatura de inactivación, lo que parece sugerir que el pustulano estabiliza a la enzima. Asimismo, la temperatura óptima obtenida para la BGN16.3 fue de 50ºC a pH 5,5.
Ejemplo 8
Especificidad para los sustratos
Para estudiar la especificidad para diferentes sustratos de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 purificadas se han ensayado sus actividades enzimáticas frente a diversos sustratos que tenían enlaces a - o b -glicosídicos a una concentración de 5 mg/ml. Cuando se utilizaron glucanos, los productos de reacción se determinaron mediante los ensayos convencionales descritos previamente. Las actividades quitinasa y quitosanasa se determinaron mediante el procedimiento descrito por De la Cruz [Eur. J. Biochem., 1992, 206, 856-867].
La hidrólisis de los sustratos mediante las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 purificadas se realizó incubando 4 mg de pustulano o 2 mg de gentibiosa (un b -1,6-disacárido) con 2 m g de proteína purificada en 1 ml de agua destilada a diferentes tiempos a 37ºC. Se incluyeron blancos de sustrato en paralelo. Después de la hidrólisis, las reacciones se pararon calentándolas a 100ºC durante 5 minutos y los oligómeros de pustulano se analizaron mediante cromatografía líquida de alta presión [HPLC] utilizando una columna HPX 42-A mantenida a 60ºC. Se utilizó agua como eluyente a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min. Los productos se detectaron en base a su absorbancia a 195 nm y se identificaron por comparación con patrones de glucosa, gentibiosa y oligosacáridos de celulosa (velocidad de oligomerización de 2 a 5).
La Tabla 2 recoge los distintos sustratos ensayados y muestra los resultados obtenidos en porcentaje respecto al máximo de actividad alcanzado en cada caso.
TABLA 2 Especificidad de BGN16.1 y BGN16.3 para distintos sustratos | | | |
| Sustratos | Enlace principal | BGN16.1 | BGN16.3 |
| | | |
| Laminarina | b -1,3:b -1,6(Glc) | 22 | 8 |
| Paquiman | b -1,3(Glc) | 0 | 0 |
| Pustulano | b -1,6(Glc) | 100 | 100 |
| Glucano (S. cerevisiae) | b -1,3:b -1,6(Glc) | 73 | 18 |
| Carboximetilcelulosa | b -1,4(Glc) | 0 | 0 |
| Quitina coloidal | b -1,4(GlcNAc) | 0 | 0 |
| Glicol-quitosano | b -1,4(GlcN) | 0 | NR |
| Nigeran | a -1,3:a -1,4 (Glc) | 0 | 0 |
| Almidón soluble | a 1,4:a -1,6 (Glc) | 0 | 0 |
| Dextrano | a -1,6(Glc) | 0 | NR |
[NR: No realizado]
El pustulano (de Umbilicaria papullosa) y el paquiman (de Poria cocos) eran de Calbiochem (La Jolla, CA). La carboximetil-celulosa, la quitina (de conchas de cangrejo), el dextrano (de Leuconostoc mesenteroides), el glicol-quitosano, la laminarina (de Laminaria digitata), el nigeran (de Aspergillus nidulans) y el almidón soluble fueron adquiridos a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El glucano de levadura se prepara a partir de levadura de panadería según la metodología descrita por Rombouts y Phaff [Eur. J. Biochem., 1976, 63, 109-120].
Como puede apreciarse, la actividad de la enzima BGN16.1 es específica de su sustrato (pustulano) [b -1,6-glucano], actúa en menor medida sobre el glucano de levadura [b -1,3:b -1,6 glucano (4:1)] y muestra una actividad reducida frente a la laminarina, un polisacárido formado fundamentalmente por b -(1,3)-glucano que posee un 15 % aproximadamente de enlaces tipo b -(1,6)-glucosídicos que serían los que se hidrolizarían. No se detectó actividad con los otros sustratos ensayados.
Los resultados mostrados en la Tabla 2 también ponen de manifiesto que la actividad de la enzima BGN16.3 es específica de pustulano (sustrato) y muestra una actividad muy reducida frente al glucano de levadura y frente a la laminarina, no detectándose actividad con los otros sustratos ensayados.
Ejemplo 9
Constantes de Michaelis-Menten
Para estudiar la afinidad de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 para sus sustratos, se realizaron ensayos usando diferentes concentraciones de pustulano. Las constantes de Michaelis-Menten (Km) se determinaron según la representación de Lineweaver-Burk a partir de los datos obtenidos midiendo la velocidad inicial de la hidrólisis de pustulano y utilizando un intervalo de concentraciones de pustulano de 20 a 0,5 mg/ml. Las velocidades iniciales de hidrólisis de pustulano se calcularon midiendo la actividad bajo las condiciones de ensayo descritas antes a diferentes tiempos de 0 a 30 minutos.
Los resultados obtenidos fueron:
BGN16.1
- Km: 0,8 mg de pustulano/ml
- Vmax: 312 m mol de producto/minuto·mg de BGN16.1
BGN16.3
- Km: 1,1 mg de pustulano/ml
- Vmax: 391 pmol de producto/minuto·mg de BGN16.3
Ejemplo 10
Productos de reacción y mecanismos de acción
Para determinar si el mecanismo de acción de la enzima BGN16.1 es de tipo exo o endo-hidrolítico se realizó un ensayo consistente en analizar por HPLC los productos liberados a distintos tiempos de la hidrólisis de pustulano por la enzima BGN16.1 purificada. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la incubación con pustulano de la BGN16.1 purificada genera una serie de oligosacáridos de menor peso molecular que se hidrolizan a oligosacáridos aún menores cuando se incrementa el tiempo de incubación enzimática. En concreto, el análisis revelé una liberación inicial de oligosacáridos largos que se escindieron en sacáridos más pequeños, que oscilan de glucosa (Glc) a gentitetraosa (Glc4) y siendo gentibiosa (Glc2) el producto final mayoritario de la hidrólisis de pustulano por la BGN16.1. Cuando se utilizaba gentibiosa como sustrato, el disacárido no era hidrolizado por la enzima BGN16.1. Por tanto, estos resultados ponen de manifiesto que la BGN16.1 purificada tiene un modo de acción endohidrolítico.
Ejemplo 11
Hidrólisis de paredes celulares fúngicas
Se ha estudiado la capacidad que poseen las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 purificadas para degradar paredes celulares de distintos hongos. Para ello, se incubaron las enzimas (BGN16.1 en unos casos y BGN16.3 en otros) purificadas (0,5 U) con 4 mg de paredes celulares liofilizadas de diferentes hongos en 1 ml de ensayo en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5.
Los hongos ensayados para estudiar la capacidad de BGN16.1 purificada fueron Botrytis cinerea CECT 2100, Giberella fujikuroi IMI 58289, Phytophthora syringae CECT 2351 y Saccharomyces cerevisae (levadura de panadería La Cinta Roja® , España). Las mezclas se incubaron a 37ºC durante 16 horas con agitación ocasional. Las reacciones se pararon mediante centrifugación (10.000 x g, 10 minutos) y la cantidad de azúcares reductores liberados en los sobrenadantes se determinó mediante el método descrito por Somogyi [J. Biol. Chem., 1952, 195, 19-23] y Nelson [Methods Enzymol., 1957, 3, 85-86]. Se incluyen blancos de enzima y de sustrato. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3 y ponen de manifiesto que la BGN16.1 sólo ejerce actividad enzimática sobre las paredes celulares de S. cerevisiae, mientras que BGN16.3 no ejerce actividad enzimática sobre ninguna de las paredes celulares ensayadas.
TABLA 3 Acción lítica sobre paredes celulares de BGN16.1 y BGN16.3 | | |
| Paredes celulares | BGN16.1 (%) | BGN16.3 (%) |
| | |
| B. cinerea CECT 2100 | 0 | 0 |
| G. fujikuroi IMI 58289 | 0 | 0 |
| P. syringae CECT 2351 | 0 | 0 |
| S. cerevisae | 20 | 0 |
La actividad lítica sobre las paredes celulares se determinó igualmente observando los halos de clareamiento en placas de agar que contenían las paredes celulares fúngicas previamente mencionadas (concentración final 1 mg/ml), utilizando el procedimiento descrito por Tanaka y Phaff [J. Bacteriol., 1965, 89, 1570-1580]. Después de 48 horas de incubación a 37ºC se tiñeron las placas según el procedimiento descrito por Grenier et al. [Plant Physiol., 1993, 103, 1277-1283] con 0,005 % (p/v) de azul de anilina y se lavaron con agua. Los halos hidrolíticos se observaron mediante luz ultravioleta y se midieron los radios de los halos de gran longitud. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la BGN16.1 no originó halos de clareamiento sobre las paredes celulares de hongos filamentosos o levaduras. Sin embargo, cuando se combinó BGN16.1 con otras glucanasas [BGN13.1 y BGN16.2] de T. harzianum [De la Cruz, J. Bacteriol., 1995, 177, 1864-1987] se observaron tanto halos de clareamiento como actividad antifúngica frente a hongos fitopatógenos, lo que pone de manifiesto un posible efecto sinérgico en la asociación de enzimas con distintas actividades líticas.
Ejemplo 12
Ensayo de la actividad antifúngica
Para determinar la actividad antifúngica de las enzimas de la invención se realizó el siguiente ensayo. En un pocillo de una microplaca se crecen 3000 esporas de Penicillium digitatum en PDA (Patata Dextrosa Agar, Difco) diluido tres veces respecto a la concentración recomendada por el fabricante, junto con la enzima cuyo efecto antifúngico quiere observarse. Se mantiene 18 horas a 25ºC y posteriormente se observa al microscopio. Como control negativo se realiza un ensayo sólo con PDB y esporas. Se analiza tanto la inhibición de la germinación de las esporas como la disminución del tamaño de las hifas de Penicillium digitatum.
Para la enzima BGN16.3 se ha observado que a una concentración de 70 m g/ml se produce una reducción del tamaño de las hifas del 50 % respecto del control, no observándose efecto de inhibición de la germinación de las esporas.
En la Figura 1A se muestra el efecto antifúngico producido por la enzima BGN16.3, a una concentración de 70 m g/ml (70 ppm), sobre 3000 esporas de Penicillium digitatum tras 18 horas de incubación. En la Figura 1B se muestra el resultado de un control negativo que contenía únicamente PDA y esporas. La Figura 1 pone de manifiesto claramente la reducción del tamaño de las hifas de Penicillium digitatum debido a la acción antifúngica de la enzima BGN16.3.
Ejemplo 13
Clonación de las secuencias de ADN que codifican para las enzimas BGN16.1 y BGN16.3
Para obtener el clon completo de cDNA de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 se siguió una estrategia que comprendía el empleo de PCR. Para ello, se diseñaron oligonucleótidos degenerados a partir de la microsecuenciación del extremo amino y de péptidos trípticos de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3.
Para el diseño de los oligonucleótidos directos se utilizaron las secuencias de los extremos amino de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 mientras que para el diseño de los oligonucleótidos inversos se utilizaron las secuencias de los péptidos internos (fragmentos trípticos).
Con dichos oligonucleótidos y bajo las condiciones experimentales que se describen más adelante [véase el Ejemplo 13.5] se obtuvieron unas bandas específicas de las secuencias codificantes para las enzimas BGN16.1 y BGN16.3 respectivamente que se subclonaron en un vector pGEM-T. La secuenciación de las bandas amplificadas confirmó que se trataba de fragmentos de los clones buscados. A continuación, los fragmentos obtenidos por PCR se marcaron radiactivamente y se utilizaron como sonda para escrutar una genoteca de ADNc de T. harzianum CECT 2413. Del total de clones escrutados se obtuvieron unos clones positivos, cuyos análisis pusieron de manifiesto que portaban unos insertos que englobaban completamente la ORF y algo de las secuencias flanqueantes de las regiones promotora y terminadora.
13.1 Extracción del ADNg
El ADNg de Trichoderma harzianum CECT 2413 se obtuvo según el protocolo descrito por Kaiser et al. (1994) [Methods in yeast genetics. A Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York], con algunas modificaciones, incluyendo la adición de un paso de purificación con fenol. Brevemente, 0,3-0,5 g de micelio liofilizado se resuspende en Tris-HCl 50 mM y EDTA 20 mM, se homogeniza y se añaden 200 ml de dodecilsulfato sódico (SDS) al 10 %. A continuación, se incuba a 65ºC durante 30 minutos, se añade acetato sódico y se incuba otros 30 minutos a 4ºC. Finalmente se centrifuga y el sobrenadante se trata con fenol y se precipita con etanol.
13.2 Extracción del ARN total
El ARN total de T. harzianum CECT 2413 se extrajo utilizando el método del fenol ácido descrito por Chomczynski y Sacchi (1987) [Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156] con ligeras modificaciones.
13.3 Construcción de una genoteca de ADNc
A partir del ARN total de T. harzianum CECT 2413, obtenido tras cultivar dicho hongo en MM con paredes celulares de Botrytis al 0,5 % como fuente de carbono durante 9 horas, se aisló el ARNm. Para ello se utilizó una cromatografía de afinidad a oligo(dt)celulosa (Stratagene, La Jolla, CA). A continuación, se sintetizó el ADNc empleando el kit comercial "ZAP-cDNA synthesis kit" (Stratagene). Al ADNc así obtenido se le unieron los adaptadores Eco RI y Xho I y se ligó al vector Uni-Zap XR (Stratagene). Finalmente, para empaquetar el ADNc ligado al fago l se empleó el kit de empaquetamiento "Gigapack III gold packaging extract" (Stratagene), siguiendo las instrucciones del fabricante.
13.4 Microsecuenciación de proteínas
Para determinar el extremo amino de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3, así como para obtener fragmentos internos que permitieran la clonación del gen correspondiente, se realizó la microsecuenciación siguiendo el método de Edmans Matsudaira [A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing. Academic Press, Inc., New York, Edmans Matsudaira (eds.) 1989].
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
BGN16.1:
Extremo amino: ASSFASSQDGRYQFTAAQAP [SEC. ID. Nº.: 5]
Péptido interno: KVKGKLIGGGRGNNKLNHY [SEC. ID. Nº.: 6]
BGN16.3:
Extremo amino: AAGAQAYASNQAGN [SEC. ID. Nº.: 7]
Péptido interno: GLNSNLQIFGSPW [SEC. ID. Nº.: 8]
13.5 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Para los experimentos de PCR se diseñaron oligonucleótidos degenerados a partir de las secuencias parciales de las enzimas BGN16.1 y BGN16.3.
En el caso de la BGN16.1, los oligonucleótidos directo e inverso fueron los siguientes:
directo: 5'-GATGGNCGNTAYCARTTYACNGC-3' [SEC. ID. Nº.: 9]
inverso: 5'-CCDATNARYTTNCCYTTNACYTT-3' [SEC. ID. Nº.: 10]
donde
N es inosina;
Y es T o C;
R es G o A; y
D es A o G o T
En el caso de la BGN16.3, los oligonucleótidos directo e inverso fueron los siguientes:
directo: 5'-GCTGGNGCNCARGCNTAYGC-3' [SEC. ID. Nº.: 11]
inverso: 5'-CCANGGNCTNCCRAANATYTG-3' [SEC. ID. Nº.: 12]
donde
N es inosina;
Y es T o C;
R es G o A; y
D es A o G o T
Para la realización de las PCR se emplearon los siguientes parámetros:
1 ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto, seguido de 35 ciclos de síntesis compuestos por:
una fase de hibridación a:
55ºC durante 1 minuto (para la secuencia que codifica para la BGN16.1), o 50ºC durante 1 minuto (para la secuencia que codifica para la BGN16.3), una fase de elongación a 72ºC durante 1 minuto, y una fase de desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto; y finalmente 1 ciclo de elongación adicional de 7 minutos a 72ºC para completar los productos inacabados. En todos los casos la PCR se realizó utilizando ADNg como molde y empleando 100 pmoles de cada oligonucleótido, para un volumen total de PCR de 25 m l.
13.6 Escrutinio de la genoteca de ADNc
El escrutinio de la genoteca de ADNc se realizó siguiendo procedimientos convencionales descritos por Sambrook et al. [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989], empleando sondas marcadas radiactivamente con a 32p-dCTP siguiendo el método de cebadores al azar descrito por Feingerg y Vogelstein (1983) en Anal. Biochem., 132: 6. Para ello, se utilizó el kit comercial "Oligolabelling kit" [Pharmacia, Suecia] y se siguieron las instrucciones del fabricante.
13.7 Clonación del ADNc correspondiente a la enzima BGN16.1
Para el diseño del oligonucleótido directo se utilizó la secuencia del extremo amino de BGN16.1 [SEC. ID. Nº.: 5] y para el diseño del oligonucleótido inverso se utilizó la secuencia de un péptido interno [SEC. ID. Nº.: 6].
Con dichos oligonucleótidos y bajo las condiciones experimentales previamente descritas [véase el Ejemplo 13.5] se obtuvo una banda específica de 455 nucleótidos que se subclonó en el vector comercial pGEM-T (Promega, WI). Posteriormente, la secuenciación de esta banda confirmó que se trataba de un fragmento del clon buscado. A continuación, el fragmento obtenido por PCR se marcó radiactivamente y se utilizó como sonda para escrutar una genoteca de l Zap construida a partir de ARN extraído de T. harzianum CECT 2413 tras 48 horas de inducción en MM con paredes de Botrytis. De unos 400.000 clones escrutados se obtuvieron 2 clones positivos (Zbgn1.I y ZBgn1.II). Para el análisis de tales clones, en primer lugar se escindió el fago siguiendo las instrucciones del fabricante, procediendo después a la secuenciación por ambas cadenas de los insertos que portaba. Los dos clones secuenciados portaban clones truncados de 1,4 kpb en los que se encontraba toda la ORF salvo el péptido señal y un fragmento de la región 3' no codificante.
13.8 Clonación del ADNc correspondiente a la enzima BGN16.3
Para el diseño del oligonucleótido directo se utilizó la secuencia del extremo amino de la BGN16.3 [SEC. ID. Nº.: 7] y para el diseño del oligonucleótido inverso se utilizó la secuencia de un péptido interno [SEC. ID. Nº.: 8].
Con dichos oligonucleótidos y bajo las condiciones experimentales previamente descritas [véase el Ejemplo 13.5] se obtuvo una banda específica de 450 nucleótidos que se subclonó en el vector comercial pGEM-T (Promega, WI). Posteriormente, la secuenciación de esta banda confirmó que se trataba de un fragmento del clon buscado. A continuación, el fragmento obtenido por PCR se marcó radiactivamente y se utilizó como sonda para escrutar una genoteca de l Zap construida a partir de ARN extraído de T. harzianum CECT 2413 tras 48 horas de inducción en MM con paredes de Botrytis. De unos 400.000 clones escrutados se obtuvieron 2 clones positivos, identificados como ZBgn3.I y ZBgn3.II. Para el análisis de tales clones, en primer lugar se escindió el fago siguiendo las instrucciones del fabricante, y el fagémido así obtenido se secuenció por ambas cadenas. En los dos casos los vectores eran portadores de un inserto de 1,7 kpb que englobaba completamente la ORF y algo de la secuencia flanqueante de la región promotora y terminadora.
Lista de secuencias
(1) INFORMACION GENERAL:
(i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: NEWBIOTECHNIC, S.A.
(B) CALLE: Zaragoza, 52
(C) CIUDAD: Sevilla
(D) ESTADO: Sevilla
(E) PAIS: ES
(F) CODIGO POSTAL (ZIP): 41001
(G) TELEFONO: 954 502 459
(H) FAX: 954 502 458
(ii) TITULO DE LA INVENCION:
ENZIMAS CON ACTIVIDAD b -(1,6)-ENDOGLUCANASA
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 12
(iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
(A) TIPO DE SOPORTE: Floppy disk
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEP)
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 1:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 452 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS: desconocido
(D) TOPOLOGIA: desconocido
(ii) TIPO DE MOLECULA: Proteína
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 2:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 490 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS: desconocido
(D) TOPOLOGIA: desconocido
(ii) TIPO DE MOLECULA: Proteína
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 3:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1528 bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGIA: desconocido
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 4:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1696 bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 5:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 20 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS: desconocido
(D) TOPOLOGIA: desconocido
(ii) TIPO DE MOLECULA: Péptido
(v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 5:
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 6:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 19 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS: desconocido
(D) TOPOLOGIA: desconocido
(ii) TIPO DE MOLECULA: Péptido
(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 6:
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 7:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 14 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS: desconocido
(D) TOPOLOGIA: desconocido
(ii) TIPO DE MOLECULA: Péptido
(v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 7:
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 8:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 13 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS: desconocido
(D) TOPOLOGIA: desconocido
(ii) TIPO DE MOLECULA: Péptido
(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 8:
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 9:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 23 bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: Otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCION: /desc = "sintético"
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 9:
[N = Inosina]
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 10:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 23 bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: Otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCION: /desc = "sintético",
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 10:
[N = Inosina]
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 11:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 20 bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: Otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCION: /desc = "sintético"
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 11:
[N = Inosina]
(2) INFORMACION DE LA SEC. ID. Nº: 12:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: Otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCION: /desc = "sintético"
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 12:
[N = Inosina]
