Un procedimiento para la producción de ácido 2-hidroxifenilacético utilizando mutantes de la bacteria Pseudomonas putida U así como una cepa recombinante de E. coli en la que se han introducido genes aislados de Pseudomonas putida.
Sector de la técnica
La invención reivindica un procedimiento de biotransformación y por tanto se incluye en el área de Biotecnología y Biología Molecular de Microorganismos. En ella se describe la utilización de genes y enzimas de origen bacteriano para llevar a cabo la conversión, con microorganismos, del ácido fenilacético en ácido 2-hidroxifenilacético que es liberado al medio de cultivo. Este proceso presenta considerables ventajas respecto al procedimiento químico habitual ya que evita la contaminación ambiental generada como consecuencia de la utilización de disolventes y de reactivos que pueden ser tóxicos para los seres vivos.
Estado de la técnica
Las rutas degradativas de ciertos compuestos aromáticos (feniletilamina, estireno, diversos ácidos fenilalcanoicos de cadena par, etc) pueden generar como intermediario catabólico ácido fenilacético (PA) o ciertos derivados hidroxilados (Mohamed M. y Fuchs, G. Arch. Microbiol. 159, 554-562, 1993; Martínez-Blanco, H. Reglero, A. Rodríguez-Aparicio, L. B. y Luengo J. M., J.Biol. Chem. 265, 7084-7090, 1990; Prieto, M. A. y García, J. L. J.Biol. Chem. 269, 22823-22829, 1994). Sin embargo, el catabolismo del ácido fenilacético no ha sido aun totalmente esclarecido. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha demostrado que la bacteria Pseudomonas putida U asimila este compuesto mediante la utilización de una ruta catabólica nueva, constituida por catorce genes, que codifican otras tantas proteínas, y que se encuentran organizados en tres operones contiguos bajo el control de cinco promotores diferentes (Olivera, E. R., Miñambres, B., García, B., Muñiz, C., Moreno, M. A., Ferrández, A. Díaz E., García, J. L y Luengo, J. M. PNAS 95, 6419-6424, 1998). Dentro de este sistema se agrupan 12 genes catabólicos y dos reguladores (Fig1). Las proteínas catabólicas están agrupadas en cinco unidades funcionales diferentes que a continuación se detallan. La primera unidad está constituida por un promotor (P1) y cinco genes estructurales. Los cuatro primeros codifican dos enoil-CoA hidratasas (genes phaA y phaB), una acil-CoA-deshidrogenasa (gen phaC) y una cetotiolasa (gen phaD). El último gen (phaE) codifica una enzima con actividad fenilacétil-CoA ligasica que cataliza el primer paso de la ruta y que rinde como producto fenilacetil-CoA (Martínez-Blanco, H. Reglero, A. Rodríguez-Aparicio, L. B. y Luengo J. M., J.Biol. Chem. 265, 7084-7090, 1990). La segunda unidad se compone de varias proteínas, denominadas complejo de hidroxilación (genes, phaF a phaI), que catalizan la introducción de un grupo hidroxilo en el anillo bencénico del fenilacetil-CoA, generando 2-hidroxifenilacetil-CoA que es hidrolizado a ácido 2-hidroxifenilacético (2-HPA). Todas ellas están bajo el control del promotor P2 y constituyen el segundo operon. La tercera unidad (tercer operon), gobernada por el promotor P3, está integrada por los genes phaJ y phaK, que codifican un sistema de transporte constituido por una permeasa y por una porina y por una tercera proteína (producto del gen phaL) que cataliza la apertura del anillo aromático y su transformación en un derivado acíclico. El producto así generado, es transformado en catabolitos generales por acción de las cuatro enzimas b -oxidativas incluidas en el primer operon. La regulación de la ruta parece estar ejercida por dos genes adicionales (phaM y phaN). El producto del gen phaN actúa como represor interaccionando con el promotor P1, de modo que mutaciones en este gen implican la expresión constitutiva de la ruta y la pérdida del control mediado por represión catabólica. Al producto del gen phaM aún o ha podido serle atribuida ninguna función concreta (Olivera, E. R., Miñambres, B., García, B., Muñiz, C., Moreno, M. A., Ferrández, A. Díaz, E., García, J. L y Luengo, J. M. PNAS 95, 6419-6424, 1998). Las secuencias correspondientes a todos estos genes están depositadas en el GenBank Database con el código de acceso AF029714. A pesar de ser numerosas las descripciones sobre la formación de derivados hidroxilados como consecuencia del catabolismo de compuestos aromáticos (Harayama S. y Timmis K.N. Genetics of Bacterial Diversity. Hopwood, D. A. y Chater, K. F.(eds) pp151-174. Academic Press; Kuge, Y. Mochida K. y Uwajima, T. Agric. Biol. Chem. 55, 1099-1104, 1991), las evidencias sobre existencia de 2-HPA como intermediario catabólico son escasas. Cooper y colbes (Cooper, R. A., Jones, D. C. N. y Parrot S. J.Gen Microbiol. 131, 2753-2757, 1985) pusieron de manifiesto la existencia de 2-HPA en caldos de cultivo de mutantes que habían sido alterados en la ruta degradativa del ácido fenilacético. Otras descripciones corresponden al acúmulo de este mismo compuesto en caldos de fermentación de P. chrysogenum, de Aspergillus nidulans y de otros microorganismos (Sujumaran M.y Vaidyanathan, C. S. FEMS Microbiol. Letters 5, 427-430, 1979; Lein, J. Overproduction of microbial metabolites: Strain improvement and process control strategies. Wanek, Z. y Hostalek, Z.(eds.) Butterworth Publish. 1986; Staudenmayer, H. R, Hauer, B., Ladner, W., Pressler, U. Y Meyer, J. Patente Alemana no. 4232522, 1994; Fernández-Cañón, J. M. y Peñalva, M. A. J. Biol. Chem. 270, 21199-21205, 1995). Sin embargo, la obtención mediante síntesis química de 2-HPA está perfectamente establecida (Vallejos, J.C. y Yani C. Patente francesa no. 2686877, 1993) y se utiliza para la producción de este compuesto.
Parece, por tanto, interesante desarrollar sistemas bacterianos capaces de acumular naturalmente 2-HPA, o bien obtener cepas modificadas mediante ingeniería genética, capaces de catalizar la biotransformación del PA en 2-HPA. Este es el objeto de esta patente.
Descripción de la invención
Breve descripción de la invención
La presente invención describe un procedimiento mediante el cual se pueden obtener cepas productoras de 2-HPA tras mutar alguno de los genes implicados en el catabolismo de ácido fenilacético en la bacteria Pseudomonas putida U. Además, se reivindica la utilización de alguno de esos genes para transformar otras bacterias con el objeto de obtener, por fermentación, 2-HPA a partir de PA o de precursores que conduzcan, por diversas rutas metabólicas, a este compuesto.
Descripción detallada de la invención
Pseudomonas putida U CECT 4848 (que posee resistencia natural a rifampicina) es capaz de asimilar eficientemente el ácido fenilacético cuando se cultiva en medios de cultivo que contienen como única fuente de carbono este compuesto (Martínez-Blanco, H. Reglero, A. Rodríguez-Aparicio, L. B. y Luengo J. M., J. Biol. Chem. 265, 7084-7090, 1990). Se procedió al aislamiento de mutantes de esta cepa incapaces de degradar este compuesto mediante mutagénesis insercional utilizando el transposon Tn5 (Selvaraj, G. Y Iyer, V. N. J. Bacteriol. 156, 1292-1300, 1983; Herrero, M., de Lorenzo, V. y Timmis, K. N. J. Bacteriol. 172, 6557-6567, 1990). Para ello se seleccionaron aquellos transconjugantes que cumplían los siguientes requisitos: (i) poseían la resistencia natural a rifampicina (Rif); (ii) habían adquirido la resistencia a kanamicina (Km) presente en el transposon y (iii) eran incapaces de crecer en medios de composición definida que contenían ácido fenilacético como única fuente de carbono, mientras que si lo hacían en aquellos otros medios que contenían como fuentes de carbono compuestos tales como glucosa, ácido glucónico o ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA). En todos ellos se analizó el punto de inserción del transposón y posteriormente se construyeron diferentes sondas nucleotídicas que permitieron identificar las secuencias de los genes en los que este transposón se había insertado. Siguiendo técnicas habituales de Biología Molecular (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989) se secuenciaron todos los genes necesarios para el catabolismo de PA y se identificaron los distintos marcos abiertos de lectura. Las secuencias obtenidas están depositadas en la Gen Bank/EMBL Data Bank tal y como se indicó anteriormente. Una vez establecidas las secuencias de los distintos genes y proteínas, así como su organización, procedimos al estudio de su análisis por separado, identificando los intermediarios acumulados cuando se expresaban grupos aislados de genes y combinaciones de los mismos. Comprobamos que mutaciones en alguno de los genes que componían el segundo operon, no modificaban el ácido fenilacético cuando esos mutantes se cultivaban en medios de composición definida (Martínez-Blanco, H. Reglero, A. Rodríguez-Aparicio, L. B. y Luengo J. M., J. Biol. Chem. 265, 7084-7090, 1990) que contenían PA (como fuente de posibles intermediarios) y 4-HPA (que soporta el crecimiento celular). Las rutas de degradación de PA y 4-HPA son diferentes (Olivera, E. R., Reglero, A., Martínez-Blanco, H., Fernández-Medarde, A., Moreno, M. A. y Luengo, J. M. Eur. J. Biochem. 221, 375-381, 1994) y por tanto mutaciones en la específica de PA no afectan al crecimiento en 4-HPA. Además, observamos que cuando el PA se substituía por diferentes compuestos tales como los ácidos 6-fenilhexanoico, 8-feniloctanoico o por la feniletilamina se acumulaba en los caldos de cultivo PA, lo que sugería que todos esos componentes eran catabolizados, por diferentes vías, hasta PA. Sin embargo, cuando se utilizaron como fuentes de carbono, ácido benzoico, tirosina, fenilalanina o los ácidos 5-fenilvalérico, 7-fenilheptanoico o 9-fenilnonanoico no se detectó acúmulo extracelular de PA. Aquellos otros mutantes alterados en alguno de los genes del tercer operon, acumulaban 2-HPA cuando se cultivaban en medios mínimos que contenían como fuentes de carbono PA, feniletilamina o ácidos fenilacanoicos que poseían un número par de átomos de carbonos. La mayor cantidad de 2-HPA acumulada se observó cuando se mutó en gen phaL. Comprobamos también que mutaciones en el gen phaE, que codifica la fenilacetil-CoA ligasa, impedía la degradación de feniletilamina pero si permitía el crecimiento de esos mutantes en aquellos medios en los que la fuente de carbono eran ácido 6-fenilhexanoico u 8-feniloctanoico. Estos resultados sugerían que la ligasa era necesaria solo para el catabolismo de aquellos compuestos que conducen a PA mientras que no para aquellos otros que, por alguna vía, llegasen a fenilacetil-CoA. Todos los resultados anteriormente expuestos permitieron concluir (i) que la ruta de PA comienza con la activación de este compuesto a fenilacetil-CoA; (ii) que posteriormente, este compuesto se hidroxila a 2-HPA, y (iii) que finalmente se produce la apertura del anillo bencénico, generando un intermediario acíclico que se transforma en metabolitos generales.
Además, identificamos los genes responsables de la síntesis de 2-HPA, concluyendo que el gen phaE (que codifica la ligasa) y todos los incluidos en el segundo operon (phaF a phaI) eran requeridos para la síntesis de este metabolito.
Descripción de las figuras
Figura 1. Organización genética y mapa de restricción de la ruta catabólica de ácido fenilacético en Pseudomonas putida U. P1-P5, promotores; phaA-phaL, genes catabólicos; phaN, gen regulador; phaM gen sin función conocida. Figura 2. Esquema de las diferentes construcciones genéticas realizadas para lograr la síntesis de ácido 2-hidroxifenilacético en Escherichia coli. pKB y pKB2, plásmidos derivados de pBluescript II KS modificados para facilitar la correcta expresión de genes de Pseudomonas putida U bajo efecto del promotor de la b -galactosidasa. pKBSBLig, construcción realizada en el plásmido de expresión pKB que contiene el gen phaE que codifica la enzima fenilacetil-CoA ligasa. pKB2Ox, construcción realizada en el plásmido pKB2 que contiene los genes que codifican las enzimas implicadas en la oxidación del fenilacetil-CoA a 2-hidroxifenilacetil-CoA. pLOx, construcción realizada en el plásmido pKB2 que contiene los genes que codifican la fenilacetil-CoA ligasa y el complejo enzimático responsable de la oxidación del fenilacetil-CoA. Ejemplos de realización de la invención
En los ejemplos detallados a continuación, se exponen las investigaciones realizadas para desarrollar esta patente.
Ejemplo 1
Secuenciación de la ruta catabólica para ácido fenilacético de Pseudomonas putida U (CECT 4848)
A partir de los distintos mutantes incapaces de degradar el ácido fenilacético por inserción del Tn5 se constituyeron genotecas que nos permitieron la secuenciación ulterior de todos los genes de la ruta. La técnica utilizada se basa en la utilización de oligonucleótidos sintéticos cebadores descrita por Sanger y colbes (Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson A. R. PNAS, 74, 5463-5467, 1977). Para ello se siguieron las instrucciones recomendadas por el fabricante del Taq DNA polymerase iniciated cycle sequencing kit (Applied Biosystem Inc.). Las reacciones de secuencia fueron analizadas en un secuenciador automático, modelo ABI Prism 377 (Applied Biosystem Inc.). La secuencia de los genes que componen la ruta requerida para la degradación de PA se describe en la SEQ ID NO 1 de la siguiente forma:
pha N, secuencia codificante en la cadena complentaria entre el nucleótido 1025-1948, pha M, secuencia codificante en la cadena complentaria entre el nucleótido 2026-2625, pha A, secuencia codificante entre el nucleótido 2869-3750. pha B, secuencia codificante entre el nucleótido 3785-4576. pha C, secuencia codificante entre el nucleótido 4579-6096. pha D, secuencia codificante entre el nucleótido 6249-7742. pha E, secuencia codificante entre el nucleótido 7864-9183. pha F, secuencia codificante entre el nucleótido 9399-10388. pha G, secuencia codificante entre el nucleótido 10703-11461. pha H, secuencia codificante entre el nucleótido 11448-12047. pha I, secuencia codificante entre el nucleótido 12047-12982. pha J, secuencia codificante entre el nucleótido 13457-15019. pha K, secuencia codificante entre el nucleótido 15038-16291. pha L, secuencia codificante entre el nucleótido 16316-18382. Ejemplo 2
Disrupción de gen phaL en P. putida U y análisis del producto acumulado en los caldos de cultivo
A partir de un fragmento interno del gen phaL obtenido mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando dos oligos degenerados (5'-CGCCCGGAATTCGCCGAAGCCGTCGAC-3' y 5'-CAGGTCGAATTCTTCGCTGTCTGG-3' se obtuvo un fragmento ECoRI-EcoRI de 704 pares de bases (SEQ ID NO 2) que se clonó en el plásmido pk18::mob (Schäfer, A., Tauch, A., Jäger, W., Kalinowski, J., Tierbach, G. y Pühler A. Gene 145, 69-73, 1994). Esta construcción fue empleada para disrumpir el gen phaL en P. putida U por recombinación homóloga mediante "mating" triparental (Herrero, M., de Lorenzo, V. y Timmis, K.N. J. Bacteriol. 172, 6557-6567, 1990). Los transconjugantes se seleccionaron en medio complejo (Luria-Bertani) (Sambrook J., Fritsch E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989) al que se suplementaban los antibiéticos Km (25 m g/ml) y Rif (20 m g/ml). Todas aquellas colonias que eran resistentes a ambos antibióticos se replicaron en medio complejo y en medio mínimo (Martínez-Blanco, H. Reglero, A. Rodríguez-Aparicio, L. B. y Luengo J. M., J. Biol. Chem. 265, 7084-7090, 1990) que contenía como fuente de carbono 4-HPA (5mM) y en una tercera placa que contenía el mismo medio mínimo pero en el que el 4-HPA se había substituido por PA (5 nM). Todos los medios llevaban los antibióticos descritos a la concentración indicada. Las colonias que no crecían en el medio que llevaba PA, se analizaron mediante técnicas de ingeniería genética (Sambrook, J., Fritsch E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989) para corroborar que la construcción se había insertado en el lugar correcto. Más del 90 % de las colonias aisladas contenían un gen phaL disrupto por el plásmido pk18::mob. Uno de estos mutantes (P. putida: pk18::mob CECT 5058) fue utilizada para comprobar el intermediario acumulado.
Esta bacteria se cultivó en medio de composición definida (Martínez-Blanco, H. Reglero, A. Rodríguez-Aparicio, L. B. y Luengo J.M., J.Biol. Chem. 265, 7084-7090, 1990) al que se suplementaba ácido fenilacético (5 mM) como precursosr de intermediario y 4-HPA (5 mM) para soportar el crecimiento celular. A los medios se añadieron siempre los antibióticos Km y Rif a las concentraciones indicadas. Los anóculos se realizaron con 1 ml de suspensión bacteriana (DO540nm = 1.0) y se procedió a su incubación en un agitador orbital (200 rpm) a 30ºC, en matraces Erlenmeyer de 500 ml de capacidad que contenían 100 ml del medio requerido. Posteriormente, se procedió a tomar muestras de los caldos de cultivo en distintas etapas de la curva de crecimiento. En estas condiciones la DO540nm alcanzada por el cultivo fue 1,5-1,8 a las 40 h. El análisis de los caldos de cultivo (de los que se habían eliminado las células por centrifugación a 12000 rpm durante 10 min a 4ºC·) reveló la presencia de PA y 2-HPA. La determinación de estos compuesto se realizó mediante cromatografia líquida de alta definición (HPLC) utilizando el equipo y metodología indicado por Olivera y colbes.(Olivera, E. R., Reglero, A., Martínez-Blanco, H., Fernández-Medarde, A., Moreno, M.A. y Luengo, J. M. Eur. J. Biochem. 221, 375-381, 1994) así como por cromatografia en capa fina (TLC) utilizando como revelador vapores de iodo (Sujumaran M. y Vaidyanathan, C. S. FEMS Microbiol. Letters 5, 427-430, 1979). En estas condiciones los hidroxi-derivados del PA adquieren temporalmente una coloración amarilla mientras que no lo hacen aquellos otros derivados de este compuesto que no poseen grupos hidroxilo en el anillo. Para este último método (TLC) utilizamos placas de Silica-Gel (HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60, 10 x 10, Merck) y como sistema de desarrollo eter saturado de H2O (que contenía sulfato amónico 28 % -p/p-) y metanol en proporciones relativas 50:25:5. En estas condiciones los Rfs para 4-HPA, 3-HPA, PA, 2-HPA, 3,4-diH-PA y 2,5-diHPA fueron 0,72, 0,68, 0,67, 0,60, 0,55 y 0,302 respectivamente. El PA, que no se tiñe con vapores de iodo, se identificó tras cromatografiar una muestra marcada con 14C (Sigma). Las cantidades de PA y 2-HPA presentes en los caldos se cuantificaron por HPLC (Olivera, E. R., Reglero, A., Martínez-Blanco, H., Fernández-Medarde, A., Moreno, M.A. y Luengo, J. M. Eur. J. Biochem. 221, 375-381, 1994) frente a patrones comerciales. Observamos que las proporciones de ambos compuestos iban variando a lo largo de la curva de crecimiento. A tiempo cero de cultivo solo había PA mientras que a las 40 h (o a tiempos superiores) más del 70 % del PA se había transformado en 2-HPA. Estos resultados indicaban que la disrupción del gen phaL tenía como consecuencia inmediata la transformación de PA en 2-HPA, producto que se acumulaba en los caldos de cultivo debido a que la bacteria es incapaz de utilizar este compuesto como fuente de carbono. La identidad del 2-HPA fue confirmada mediante espectroscopía de masas utilizando un equipo Q-Mass (Perkin-Elmer) acoplado a un cromatógrafo de gases modelo Autosystem (Perkin-Elmer). Las muestras obtenidas de los sobrenadantes de los cultivos bacterianos, se ajustaron a pH 3.0 con HCl y la disolución resultante se extrajo con un volumen equivalente de acetato de etilo. La fase orgánica se separó y se secó con sulfato sódico anhidro bajo corriente de N2. El residuo obtenido se disolvió en 0,05 ml de piridina suplementada con 3-etilvanillina (a una concentración de 4mg/ml) como patrón interno. Alicuotas de 0.0125 ml de esta solución se tratarons durante 30 min. a 80ºC con 0.020 ml de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida como agente derivatizante. Las muestras así preparadas fueron inmediatamente utilizadas, revelándose la existencia de 2-HPA.
Ejemplo 3
Estudio de la producción de ácido 2-HPA por una cepa de E. coli en la que se han introducido los genes de P. putida U necesarios para la síntesis de este compuesto
3.1. Construcciones genéticas realizadas
Utilizando los oligos degenerados correspondientes a la zona del ATG y del TGA del gen phaE, que a continuación se detallan, se procedió a amplificar, utilizando DNA genómico de Pseudomonas putida, por PCR este gen. Los oligos utilizados fueron:
Oligonucleótido correspondiente a la zona del ATG
5'-ACGAATTCGAGGTGAAGCCATGAACAGGATCCATGATG. Este oligonucleótido lleva la secuencia Shine-Dalgarno GAGG, el ATG del gen y la secuencia modificada que permite generar un corte BamHI. Además, existe una secuencia de corte EcoRI: GAATTC. Todas esas secuencias se han subrayado.
Oligonucleótido correspondiente a la zona del TGA
5'-CGAGAATTCAGCCGAATGAATCAGCTGGCC-3' (tanto las secuencias inversa y complementaria correspondiente al triplete TGA como la secuencia modificada para introducir un coste EcoRI, se han subrayado).
El fragmento amplificado (SEQ ID NO 3), se dirigió con la enzima de restricción EcoRI y se clonó en el plásmido comercial pBluescriptKS (pBSKS) (adquirido de la casa comercial Stratagene). La construcción obtenida fue usada para transformar la bacteria E.coli DH5a '. En esa construcción el gen phaE, que codifica la enzima fenilacetil-CoA ligasa (SEQ ID NO 4), está bajo el control del promotor del gen que codifica la b -galactosidasa. Se comprobó la orientación correcta del gen phaE valorando actividad fenilacetil-CoA ligásica en diversos transformantes (Martínez-Blanco, H. Reglero, A. Rodríguez-Aparicio, L. B. y Luengo J. M., J.Biol. Chem. 265, 7084-7090, 1990) crecidos en medio LB + ampicilina (100 m g/ml). De aquellas cepas que mostraban actividad ligásica, se extrajo plásmido, y una vez comprobada que la construcción era correcta, se utilizó para las etapas siguientes. A este plásmido se le denominó pKSBLig (ver Fig. 2). A continuación, el plásmido pKSBLig se digirió con la enzima Bam HI y se religó (Sambrook, J., Fritsch E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Al plásmido resultante, que ya no contiene el gen phaE, pero que mantiene una secuencia de corte EcoRI la secuencia Shine Dalgarno del gen phaE y la reconocida por la enzima BamHI, se le denominó pKB (Fig. 2). Este se digirió con la enzima SpeI, los extremos cohesivos generados se hicieron extremos romos utilizando el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli (Amersham) y, finalmente, se religó la construcción con la DNA ligasa del fago T4 (Amersham). El plásmido resultante denominado pKB2 (ver Fig. 2) posee: (i) la secuencia Shine-Dalgarno del gen phaE; (ii) el ATG de ese mismo gen y (iii) permite seleccionar colonias con color blanco o azul cuando los transformantes que lo contienen crecen en medios que contienen X-gal (Sambrook J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989) ya que el péptido a de la b -galactosidasa se expresa desde el ATG del gen phaE, utilizando la secuencia Shine-Dalgarno de ese mismo gen. Esta construcción se utilizó posteriormente para clonar, en los sitios de restricción BamHI-XbaI, el producto obtenido por PCR que contiene la información genética requerida en P. putida U para la hidroxilación del anillo bencénico presente en el ácido fenilacético.
Los genes que integran el complejo de hidroxilación que introduce un hidroxilo en la posición 2 del anillo del PA, se obtuvieron por PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos degenerados:
Oligonucleótido correspondiente a la zona de ATG del primer gen
5' CGCATCGGATCCACGCACAGCTAG 3' (que contiene una secuencia de corte BamHI en el oligo degenerado. Ver secuencia subrayada.
Oligonucleótido correspondiente a la zona del TGA del último gen
5' GGTGCCTCTAGAAGCGGGGG 3' (subrayado se indica un corte XbaI).
Se amplificó un fragmento de 3,6 kilopares de bases (kb) (SEQ ID NO 5), que comprende los genes phaF, phaG, phaH y phaI que codifican para las enzimas respectivas (SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 Y SEQ ID NO 9) y este producto se digirió con las enzimas de restricción BamHI y XbaI (Sambrook J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y se clonó en el plásmido pKB2 antes indicado (ver Fig. 2). Esta construcción genética se denominó pKB2Ox.
Por otra parte el plásmido pKSBLig se digirió con la enzima EcoRI y se recuperó el fragmento de 1,3 Kb que contiene el gen phaE. Este ftagmento se clonó en el plásmido pKB2Ox digiriendo previamente este último con EcoRI. El plásmido obtenido se denominó pLOx y contiene el gen phaE y los genes que codifican las enzimas responsables de la hidroxilación en posición 2 del anillo aromático del PA (ver Fig. 2) comprendidos en la SEQ ID NO 10. Con él se transformaron células de E. coli DH5a '. Los distintos transformantes que contenían el gen phaE en la orientación correcta, se identificaron valorando la actividad fenilacetil-CoA ligasica (Martínez-Blanco, H. Reglero, A. Rodríguez-Aparicio, L. B. y Luengo J. M., J.Biol. Chem. 265, 7084-7090, 1990). Estos transformantes se utilizaron posteriormente (ver mas adelante) para estudiar in vivo la biotransformación de PA en 2-HPA.
3.2. Estudio de la producción de 2-HPA por células de E. coli DH5a ' transformadas con el plásmido pLOx
Una suspensión acuosa de E. coli DH5a ' transformada con el plásmido pLOx CECT 5059) (DO540nm= 1) se utilizó para sembrar los distintos medios de cultivo. Un ml de suspensión bacteriana se utilizó para sembrar matraces Erlenmeyer de 500 ml conteniendo 50 ml de los siguientes medios:
Luria-Bertani (Sambrook J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) + Ampicilina (100 m g/ml) + 2.5 mM PA Un medio con la siguiente composición (g/l): glicerol, 5; casaminoácidos (Difco) 1; NaH2PO4, 6; K2HPO4 3; NH4Cl, 2.14; NaCl, 0.5; ZnCl2 0.125 10-3; CoCl2 0.5 10-3; NiCl2 6H2O 0.05 10-3; HBO3 0.75 10-3; MnCl24H2O 0.075 10-3; CuCl2 2H2O 0.025 10-3; NaMoO4 2H2O 0.075 10-3; MgSO4 0.12; ampicilina 1.10-3 y ácido fenilacético 0.34. Las incubaciones se llevaron a cabo en un agitador orbital modelo Gallemkamp, a 250 rpm, a 37ºC, durante diferentes tiempos (0-60 h). A diferentes intervalos se tomaron muestras y se analizaron por HPLC y TLC, cuantificándose por HPLC las cantidades de PA y 2-HPA presentes en los caldos de cultivo. Comprobamos que en los dos medios se producía 2-HPA.
Lista de secuencias
< 110 > UNIVERSIDAD DE LEON, CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS
< 120 > Un procedimiento para la producción de ácido 2-hidroxifenilacético utilizando mutantes de la bacteria Pseudomona putida U así como una cepa recombinante de E. coli en la que se han in- troducido genes a
< 130 > 2-HPA
< 140 > 9802352
< 141 > 1998-11-11
< 160 > 10
< 170 > PatentIn Ver. 2.1
< 210 > 1
< 211 > 20255
< 212 > ADN
< 213 > Pseudomonas putida U
< 220 >
< 221 > gene
< 222 > Complement((1025)..(1948))
< 220 >
< 221 > gene
< 222 > Complement((2026)..(2625))
< 220 >
< 221 > gene
< 222 > (2869)..(3750)
< 220 >
< 221 > gene
< 222 > (3785)..(4576)
< 220 >
< 221 > gene
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< 221 > gene
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< 400 > 10
