Un procedimiento para la biotransformación del ácido fenilacético en ácido 2 - hidroxifenilacético.
Sector de la técnica
La invención que se reivindica es un proceso de biotransformación que se encuadra fundamentalmente dentro del área de Biotecnología. Se trata de la producción de ácido 2-hidroxifenilacético (2HPA) a partir de ácido fenilacético (PA) mediante la expresión de algunos de los marcos de lectura abiertos (ORFs) que codifican enzimas involucradas en el catabolismo de PA en E. coli. Frente a la síntesis química de 2HPA, la síntesis que utiliza organismos vivos presenta las ventajas de la especificidad del proceso, la sencillez, el bajo coste económico y el ser un proceso respetuoso con el medio ambiente.
Estado de la técnica
El PA es un compuesto aromático muy abundante en la naturaleza y constituye un metabolito central en las rutas de degradación de otros compuestos aromáticos algunos de los cuales, como es el caso del estireno, son importantes contaminantes medioambientales (Mohamed M. y Fuchs, G. (1993) Arch. Microbiol. 159, 554-562). Los microorganismos poseen la capacidad de mineralizar una amplia variedad de compuestos aromáticos a través de rutas que convergen en unos pocos catabolitos centrales, uno de los cuales es el PA (Harayama, S. y Timmis, K.N. (1989) Genetics of Bacterial Diversity. Hopwood, D.A. y Chater, K.F. (Eds), pp. 151-174. Academic Press).
Escherichia coli es una bacteria que vive en el tracto intestinal de los mamíferos y en aguas y suelos ricos en materia orgánica de deshecho proveniente de los primeros. En estos dos hábitats E. coli encuentra una gran variedad de compuestos aromáticos derivados de plantas, aminoácidos y ácidos grasos que contienen grupos fenilo como sustituyentes (Ferrández, A., García, J.L. y Díaz, E. (1997) J. Bacteriol. 179, 2573-2581). Aunque la capacidad de E. coli para degradar PA en condiciones aeróbicas se describió por primera vez en 1983 (Burlingame, R., y Chapman, P.J. (1983) J. Bacteriol. 155, 113-121), el mecanismo de dicha degradación se desconoce hasta la fecha. Se ha sugerido que el PA es mineralizado en bacterias a través de su activación inicial a fenilacetil-coenzima A (PA-CoA) (Vitovski, S. (1993) FEMS Microbiol. Lett. 108, 1-6) y la enzima que cataliza dicha activación en Pseudomonas putida U ha sido recientemente caracterizada y el correspondiente gen clonado y secuenciado (Miñambres, B., Martínez-Blanco, H., Olivera, E.R., García, B., Díez, B., Barredo, J.L., Moreno, M.A., Schleissner, C., Salto, F. y Luengo, J.M. (1996) J. Biol. Chem. 271, 33531-33538). Sin embargo, nada se conoce de las etapas enzimáticas posteriores en el catabolismo de PA.
Estudios previos de nuestro grupo habían permitido el aislamiento de un mutante de la cepa E. coli W ATCC11105, la cual se encuentra depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo, incapaz de utilizar PA como única fuente de carbono. Dicho mutante, E. coli W14, se utilizó para la clonación de un fragmento de DNA de 33,3 kilopares de bases (kb) perteneciente al cromosoma de E. coli W y que confería a E. coli W14 la capacidad de utilizar PA como fuente de carbono. El plásmido que contiene el fragmento de DNA de 33,3-kb es un derivado de pBR322 y recibió el nombre de pFA2 (Ferrández, A., Prieto, M.A., García, J.L., y Díaz, E. (1997) FEBS Lett. 406, 23-27).
Es bien conocido que el catabolismo de los compuestos aromáticos en condiciones aeróbicas genera intermediarios hidroxilados (Harayama, S. y Timmis, K.N. (1989) En "Genetics of Bacterial Diversity". Hopwood, D.A. y Chater, K.F. (Eds), pp. 151-174. Academic Press). Por lo tanto, el bloqueo de las rutas catabólicas de compuestos aromáticos puede originar la acumulación de derivados hidroxilados, y representa así una eficaz estrategia para la síntesis de dichos derivados. Mutantes de E. coli K-12 incapaces de crecer en PA como única fuente de carbono acumulan 2HPA en el medio de cultivo (Cooper, R.A., Jones, D.C.N. y Parrott, S. (1985) J. Gen. Microbiol. 131, 2753-2757). Aunque existen procesos para la síntesis química de 2HPA (Vallejos, J.C. y Yani, C. (1993) Process for preparation of ortho-hydroxyphenylacetic acid. Patente Francesa no. 2686877), hasta donde nosotros conocemos sólo se ha descrito una patente para la transformación de PA en 2HPA utilizando organismos vivos (Staudenmaier, H.R., Hauer, B., Ladner, W., Pressler, U. y Meyer, J. (1994) Fermentative manufacture of 2-hydroxyphenylacetic acid. Patente Alemana no 4232522), si bien no se ha descrito hasta la fecha ningún proceso para la biotransformación de PA en 2HPA en bacterias. En esta patente nosotros describimos un proceso para la biotransformación de PA en 2HPA en bacterias recombinantes.
Descripción de la invención
Breve descripción de la invención
La presente invención consiste en el diseño y realización de un procedimiento para producir 2HPA a partir de PA en E. coli, tanto en células recombinantes en crecimiento como con células en suspensión. La rapidez, facilidad y escaso coste de la fermentación de E. coli facilita la producción de 2HPA, y supone una considerable mejora respecto a la síntesis química de este compuesto. La invención reivindica los marcos de lectura abiertos (en lo sucesivo denominados ORF) que codifican la transformación de PA en 2HPA en E. coli, así como los procedimientos para el crecimiento y manipulación de las bacterias recombinantes productoras de 2HPA.
Descripción detallada de la invención
El fragmento de DNA clonado en pFA2 y que confiere al mutante E. coli W14 la capacidad de crecer en PA como única fuente de carbono, se sometió a un análisis con enzimas de restricción para determinar su mapa físico. La subclonación de un fragmento HindIII/PstI de 15,4-kb en el vector de bajo número de copias pCK01 permitió la obtención del plásmido pAAD, el cual seguía confiriendo a E. coli W14 la capacidad de crecimiento en PA. La secuenciación del inserto del plásmido pAAD mostró la existencia de varias ORFs cuya secuencia se ha depositado en el GenBank/EMBL Data Bank con el número de acceso X97452. La interrupción de la ORF que hemos denominado paaZ mediante la inserción del transposón Tn1000 también denominado g d (Guyer, M.S. (1983) Methods Enzymol. 101, 362-369) impide el crecimiento de E. coli W14 (pAAD::Tn1000 mutante 3) en PA como única fuente de carbono y energía. Sin embargo, cuando E. coli W14 (pAAD::Tn1000 #3) se cultiva en medio mínimo M63 (Miller, J.H. (1972) En "Experiments in molecular genetics". Cold Spring Harbor, New York) conteniendo glicerol como fuente de carbono y en presencia de PA, este último se transforma en 2HPA según se detecta en el análisis por cromatografía líquida de alta definición (HPLC) del sobrenadante del cultivo. La biotransformación de PA a 2HPA también se observa con células en suspensión de E. coli W14 (pAAD::Tn1000 #3) incubadas en presencia de PA.
Los estudios realizados mediante la subclonación del fragmento de DNA de 15,4-kb clonado en pAAD mostraron que únicamente se producía 2HPA a partir de PA cuando se expresaban simultáneamente las ORFs paaK y paaABCDE. Así, paaK se clonó bajo el control del promotor Plac en el plásmido pAFK5. Las ORFs paaABCDE se clonaron también, bajo el control del promotor Plac en el vector de bajo número de copias pCK01 generándose el plásmido pAFAF1, el cual es compatible con el plásmido pAFK5. La introducción de los plásmidos pAFK5 y pAFAF1 en E. coli W14 permitió la obtención de una bacteria recombinante, E. coli W14 (pAFK5, pAFAF1), capaz de producir 2HPA cuando se cultivaba en medio mínimo M63 conteniendo glicerol como fuente de carbono y en presencia de PA. El PA se había transformado en 2HPA que se acumulaba en el sobrenadante del cultivo. La biotransformación de PA a 2HPA también se observa con células en suspensión de E. coli W14 (pAFK5, pAFAF1) incubadas en presencia de PA.
Ejemplos de realización de la invención
En los ejemplos que se exponen a continuación se detalla la experimentación necesaria para desarrollar esta patente.
Ejemplo 1
Construcción del plasmido pAAD y crecimiento de las bacterias recombinantes en PA.
El plásmido pFA2 contiene un fragmento de DNA BamHI de 33,3-kb que confiere al mutante E. coli W14 la capacidad de crecer en PA como única fuente de carbono y energía (Ferrández, A., Prieto, M.A., García, J.L., y Díaz, E. (1997) FEBS Lett. 406, 23-27). Cuando el fragmento HindIII/PstI de 15,4-kb y contenido en el fragmento BamHI de 33,3-kb fue clonado en el vector de bajo número de copias pCK01 (Fernández, S., de Lorenzo, V. y Pérez-Martín, J. (1995) Mol. Microbiol. 16, 205-213) digerido con las enzimas de restricción HindIII y PstI, y la mezcla de ligación se transformó en E. coli DH5a (Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York), se obtuvieron transformantes resistentes a 35 (m g/ml de cloranfenicol (Cm) (el marcador de resistencia de pCK01) los cuales contenían un plásmido de 19-kb que se denominó pAAD. Todas las técnicas de manipulación de DNA y transferencia génica por transformación empleadas en este y otros ejemplos de esta patente son de uso generalizado en biología molecular y están descritas en textos generales (p. ej., Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Las enzimas de restricción y la DNA-ligasa del fago T4 utilizadas para las clonaciones fueron adquiridas comercialmente.
El plásmido pAAD se introdujo mediante transformación en células de E. coli W14 (fenotipo PA-), seleccionándose uno de los transformantes resistente a cloranfenicol. Para comprobar si E. coli W14 (pAAD) era capaz de crecer en PA como única fuente de carbono, se inocularon células de esta cepa a una densidad óptica a 600 nm (DO600) de 0,1, en medio mínimo M63 suplementado con vitamina B12 (5 ng/ml), Cm (35 m g/ml) y PA (adquirido de Sigma) (5 mM). Tras incubación durante 16 h a 30 ºC con agitación (300 rpm), el cultivo mostró una DO600 aproximada de 2, indicando que el PA era utilizado por las células como única fuente de carbono y energía. Por lo tanto, estos experimentos demostraban que el plásmido pAAD contiene y expresa los genes responsables del catabolismo de PA en E. coli W.
Ejemplo 2
Secuenciación y análisis de un fragmento de DNA de 14.328 pares de bases clonado en el plasmido pAAD.
El inserto de DNA del plásmido pAAD se secuenció utilizando oligonucleótidos sintéticos como cebadores mediante la técnica de terminación de la polimerización por dideoxinucleótidos (Sanger, F.S., Nicklen, S. y Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). Para ello se siguieron las instrucciones recomendadas por el fabricante del "Taq DNA polymerase-iniciated cycle sequencing kit" (Applied Biosystems Inc.) y las reacciones de secuencia fueron analizadas con un secuenciador automático modelo ABI Prism 377 (Applied Biosystems Inc.). La secuencia de nucleótidos ha sido depositada en el GenBank/EMBL Data Bank con el número de acceso X97452.
Ejemplo 3
Mutagénesis con el transposón Tn1000 del DNA clonado en pAAD y caracterización del mutante #3.
La obtención de mutantes en el plásmido pAAD se llevó a cabo mediante mutagénesis con el transposón Tn1000 presente en el plásmido F de la cepa E. coli MG1063 (Guyer, M.S. (1983) Methods Enzymol. 101, 362-369). La transformación de esta cepa con el plásmido pAAD da lugar a la formación de cointegrados entre los dos plásmidos a través del Tn 1000. Estos cointegrados pueden ser transferidos a una cepa receptora mediante las funciones de movilización del plásmido F (Guyer, M.S. (1983) Methods Enzymol. 101, 362-369). Así, se cultivó durante 16 h a 37ºC la cepa donadora, E. coli MG1063 (pAAD), en medio Luria-Broth (LB) suplementado con Cm (35 m g/ml), y la cepa receptora, E. coli CC118 (Ferrández, A., García, J.L. y Díaz, E. (1997) J. Bacteriol. 179, 2573-2581), en medio LB. Los cultivos fueron diluidos en el mismo medio sin antibióticos a una DO600 de 0,1 e incubados a 37ºC sin agitación hasta alcanzar una DO600 de 0,5, momento en el que se procedió a mezclar 2 ml del cultivo de la cepa donadora con 1 ml del de la cepa receptora, incubándose la mezcla durante 2 h a 37ºC sin agitación. Finalmente, la mezcla de cultivos se llevó a un volumen de 12 ml con medio LB, y fue incubada durante 3 h a 37ºC con fuerte agitación. Se inocularon distintas diluciones de esta mezcla en placas de LB suplementadas con 50 m g/ml de rifampicina (Rf) (marcador de la cepa receptora) y Cm (35 m g/ml). Una vez en la célula receptora, los cointegrados son resueltos dando lugar a la recuperación del plásmido F y a un derivado del plásmido pAAD que contiene una copia del transposón Tn1000.
De uno de los exconjugantes obtenidos, denominado #3, se extrajo el plásmido pAAD mutante y mediante digestión con enzimas de restricción se localizó la inserción del transposón Tn1000 en la ORF denominada paaZ. Cuando el plásmido pAAD::Tn1000 #3 se introdujo mediante transformación en células de E. coli W14, la cepa resultante no fue capaz de crecer, según el protocolo que se describe en el Ejemplo 1, utilizando PA como única fuente de carbono. Este resultado indicaba que la interrupción de la ORF paaZ impide el catabolismo de PA en E. coli.
Ejemplo 4
Biotransformación de PA a 2HPA mediante fermentación de E. coli W14 (pAAD::Tn1000 #3).
Se inoculó la cepa E. coli W14 (pAAD::Tn1000#3) a DO600 de 0,1 en medio mínimo M63 suplementado con glicerol 20 mM como fuente de carbono, vitamina B12 (5 ng/ml), Cm (35 m g/ml) y PA (1 mM). Se tomaron alícuotas del cultivo a distintos tiempos de incubación con agitación (300 rpm) a 30ºC, se centrifugaron y el sobrenadante libre de células se sometió a un análisis por HPLC según se describe en el Ejemplo 5. El resultado de este análisis reveló que el PA se había transformado en 2HPA al cabo de 24 h de incubación. Por lo tanto, la inactivación de la ORF paaZ en el plásmido pAAD::Tn1000#3 provoca la transformación específica de PA a su derivado hidroxilado 2HPA, el cual se secreta fuera de la célula y se acumula en el medio de cultivo.
Ejemplo 5
Detección e identificación de 2HPA.
Para la detección de 2HPA en las diferentes muestras de los ejemplos 4, 6 y 8, 20 m l de cada una de ellas se analizó por HPLC empleando un equipo Gilson equipado con una columna Lichrosphere 5 RP-8 (150 x 46 mm). Como eluyente se empleó metanol-H2O 40 % conteniendo ácido trifluoroacético 1:1000, a un flujo de 1 ml/min. Dos picos con tiempos de retención 5,60 y 10,67 minutos, correspondientes a los compuestos patrón 2HPA (adquirido de Sigma) y PA, respectivamente, fueron detectados espectrofotométricamente a 210 nm.
Para confirmar la identidad del 2HPA presente en las muestras analizadas, se realizaron análisis por espectroscopía de masas empleando un espectrofotómetro Q-Mass (Perkin-Elmer) acoplado a un cromatógrafo de gases Autosystem (Perkin-Elmer). La muestra fue preparada por extracción de los correspondientes sobrenadantes, llevados a pH 3 con HCl, con un volumen de acetato de etilo. La fase orgánica se secó con Na2SO4 y fue evaporada bajo una corriente de N2. El residuo obtenido fue disuelto en 50 m l de piridina (Fluka) suplementada con 3-etilvanillina (4 mg/ml) como patrón interno, y 12,5 m l de esta solución fueron tratados durante 30 minutos a 80ºC con 20 m l de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) como agente derivatizante. La muestra así preparada fue inmediatamente analizada, revelando la existencia de 2HPA.
Ejemplo 6
Biotransformación de PA a 2HPA con células en suspensión de E. coli W14 (pAAD::Tn1000#3).
Se inocula la cepa E. coli W14 (pAAD::Tn1000#3) a DO600 de 0,1, en medio mínimo M63 suplementado con glicerol 20 mM como fuente de carbono, vitamina B12 (5 ng/ml), Cm (35 m g/ml) y PA (1 mM). Tras incubación a 30ºC con agitación (300 rpm) hasta alcanzar una DO600 de 1,0, el cultivo se centrifugó y las células se lavaron con un volumen de medio M63. El sedimento celular se resuspendió en 1/10 de volumen de medio M63 conteniendo PA (1 mM). La suspensión celular (5 ml) se incubó a 30ºC con agitación y se tomaron muestras (0,5 ml) a distintos tiempos. Las muestras se centrifugaron 5 min en una microcentrifuga (12.000 rpm) y el sobrenadante libre de células se sometió a los análisis descritos en el Ejemplo 5. Se observó que al cabo de 24 h de incubación el PA se había transformado en 2HPA.
Ejemplo 7
Construcción de los plásmidos pAFK5 y pAFAF1.
Para la construcción del plásmido pAFK5, el fragmento de DNA SphI/BamHI de 4,9-kb y que se encuentra contenido en el plásmido pAAD, se clonó en el vector pUC19 (Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) digerido con las enzimas de restricción SphI y BamHI. La mezcla de ligación se transformó en E. coli DH5a seleccionándose los transformantes resistentes a 100 m g/ml de ampicilina (Ap). El análisis de plásmido en los transformantes reveló la presencia de pAFK4, un plásmido que contiene las ORFs paaK y paaXY. Para expresar únicamente paaK, el plásmido pAFK4 se digirió con las enzimas de restricción BsrGI y SmaI, posteriormente se rellenó el extremo cohesivo generado por BsrGI con la ayuda del fragmento Klenow de la DNA-polimerasa I de E. coli (Pharmacia), y el plásmido se religó con la DNA-ligasa del fago T4 (Amersham). La mezcla de ligación se transformó en E. coli DH5a y los transformantes Ap resistentes mostraron un plásmido, pAFK5, que contiene la ORF paaK bajo el control del promotor Plac en un replicón de alto número de copias.
Para la construcción del plásmido pAFAF1, el fragmento de DNA BglII de 5,4-kb proveniente de pAAD::Tn1000#10, se ligó al plásmido de bajo número de copias pCK01 (Fernández, S., de Lorenzo, V. y Pérez-Martín, J. (1995) Mol. Microbiol. 16, 205-213) digerido con la enzima de restricción BamHI. La mezcla de ligación se transformó en E. coli DH5a y de los transformantes resistentes a Cm (35 m g/ml) se aisló un plásmido, pAFAF1, que contenía las ORFs paaABCDE bajo el control del promotor Plac y en un replicón compatible con el del plásmido pAFK5.
Ejemplo 8
Biotransformación de PA a 2HPA mediante fermentación de E. coli W14 (pAFK5, pAFAF1).
Se inoculó la cepa de E. coli W14 conteniendo los plásmidos compatibles pAFAF1 y pAFK5 a una DO600 de 0,1, en medio mínimo M63 suplementado con glicerol 20 mM como fuente de carbono, vitamina B12 (5 ng/ml), Cm (35 m g/ml), Ap (100 m g/ml) y PA (1 mM). Se tomaron alícuotas del cultivo a distintos tiempos de incubación con agitación (300 rpm) a 30ºC, se centrifugaron y el sobrenadante libre de células se sometió a un análisis por HPLC según se describe en el Ejemplo 5. El resultado de este análisis reveló que el PA se había transformado en 2HPA al cabo de 24 h de incubación. Por lo tanto, la expresión simultánea de las ORFs contenidas en pAFK5 y pAFAF1 provoca la transformación específica de PA a su derivado hidroxilado 2HPA, el cual se secreta y se acumula en el medio de cultivo.
