Vacuna anti-Vibrio anguillarum (GAVA-3) pa- ra la prevención de la enfermedad vibriosis en rodaballo y peces salmónidos, y procedimiento de obtención.
La presente patente de invención está destinada a dar a conocer una nueva vacuna para proteger al rodaballo y peces salmónidos cultivados en agua de mar contra la vibriosis, y está basada en la combinación de células y productos extracelulares de cepas de Vibrio anguillarum, causantes de mortalidades de peces, pertenecientes a los serotipos O1 y O2 (subgrupos O2a y O2b ). La ventaja de esta vacuna frente a las ya existentes es que cubre un mayor espectro antigénico, confiriendo a los peces un elevado grado de protección (80 %) frente al serotipo O1 y los dos subgrupos antigénicos del serotipo O2 (O2a y O2b ).
La vibriosis, causada principalmente por la especie Vibrio anguillarum, es una de las enfermedades bacterianas más importantes que afectan a peces marinos, moluscos y crustáceos a nivel mundial. Esta enfermedad fue diagnosticada por primera vez en rodaballo cultivado en Galicia en el año 1985 (Devesa et al, (1985): In Fish and Shellfish Pathology, A. E. Ellis, ed. Chapter XIV pp 131-140, Academic Press) convirtiéndose desde entonces en uno de los principales problemas patológicos para la piscicultura marina de nuestra área. Aunque se han descrito un total de 10 serotipos en esta especie bacteriana, prácticamente todos los aislados de Vibrio anguillarum implicados en mortalidades de peces pertenecen a los serotipos O1 y O2 (Toranzo et al., (1987): Aquaculture, 67: 41-51; Santos et al., (1995): Applied and Environmental Microbiology, 61: 2495-2498). Además, mientras el serotipo O1 constituye un grupo fenotípica y genéticamente homogéneo, el serotipo O2 muestra heterogeneidad a nivel bioquímico, genético y serológico, detectándose la existencia de dos subgrupos antigénicamente distintos (O2a y O2b ) (Toranzo et al., (1987); Santos et al., (1995) opus cited. Además, se ha demostrado que los productos extracelulares de cepas pertenecientes al serotipo O1 y a los dos subgrupos antigénicos del serotipo O2 (O2a y O2b ) son tóxicos al ser inoculados en peces, presentan diferencias cualitativas y/o cuantitativas en la composición enzimática y son imnunológicamente distintos (Santos et al, (1991): Journal of Applied Ichthyology, 7: 160-167; Santos et al., (1995) op. cited. Teniendo en cuenta todo esto se ha realizado la selección de los componentes de la vacuna. Las cepas de Vibrio anguillarum incluidas en esta vacuna son los aislados R-82 (serotipo O1), RG-111 (serotipo O2, subgrupo O2a ) y RV-22 (serotipo O2, subgrupo O2b ), que han sido depositadas por los inventores de esta patente en la Colección Española de Cultivos Tipo con las referencias CECT 5031, CECT 5032 y CECT 5033, respectivamente. Estas cepas presentan las características típicas de la especie, siendo bacilos halófilos Gram-negativos, móviles, oxidasa positivos, fermentativos y sensibles al agente vibriostático O/129.
En cuanto a los productos extracelulares, los de las tres cepas han mostrado actividad hemolítica, proteolítica y citotóxica. Las cepas CECT 5031 y CECT 5032 mostraron además actividades valina arilamidasa, tripsina, quimiotripsina y dermonecrótica que estaban ausentes en la cepa CECT 5033. Los productos extracelulares de las tres cepas presentan componentes proteicos y lipopolisacarídicos inmunológicamente distintos (Santos et al., (1995) op. cited.
Preparación
A partir de preinóculos en fase logarítmica de crecimiento se inoculan matraces de dos litros conteniendo un litro de medio de cultivo caldo triptona de soja (TSC) con NaCl a una concentración final del 1 % (TSC-1, triptona 17 gr/L; peptona de soja 3 gr/L; glucosa 2,5 gr/L; fosfato bipotásico 2,5 gr/L; cloruro sódico 10 gr/L; pH 7,3 ± 0,2).
La incubación se realiza a 25ºC durante 48 horas. Finalizado el período de incubación, se añade al cultivo formol a una concentración final de 0,35 % para matar las bacterias e inactivar los productos extracelulares, y se mantiene durante tres horas más en agitación, al cabo de las cuales se transfiere a 4ºC. Los cultivos de las tres cepas empleadas en la vacuna se ajustan a una densidad óptica de 1 (A550: Absorbancia550) y se mezclan en proporción 50:25:25 % (CECT 5031: CECT 5032: CECT 5033). La mezcla vacunal contiene aproximadamente 1010 células/mL y 160 m g de proteína extracelular/mL.
El control de esterilidad se lleva a cabo sembrando la mezcla vacunal en placas de agar triptona de soja (TSA) con NaCl a una concentración final del 1 % (TSA-1) y en tubos de tioglicolato, incubando durante 72 horas a 25 y 37ºC, respectivamente.
El control de especificidad se realiza mediante aglutinación en portaobjetos, utilizando los antisueros obtenidos en conejo frente a cada una de las cepas empleadas en la fabricación de la vacuna (CECT 5031, CECT 5032, CECT 5033) y como antígeno las células enteras de dichas cepas.
El producto debe ser conservado a 4ºC hasta su utilización.
Modo de administración
Para administrar la vacuna por baño corto, esta se diluye 1/10 en el agua de cultivo y los peces se introducen en este baño vacunal y se mantienen en el mismo durante 1 min. Con cada litro de vacuna se pueden vacunar 100 Kg de peces en 20 tandas de 5 Kg, manteniendo aireado el baño vacunal. También se puede emplear una dilución 1/1000 de la vacuna, y en este caso los peces se mantienen en este baño durante 1 hora con fuerte aireación (baño prolongado). Para administrar la vacuna por inyección, se inoculan los peces con 0,1-0,2 mL/pez (dependiendo del peso del pez) de mezcla vacunal sin diluir.
Para mejorar la protección obtenida se recomienda realizar la vacunación en peces de aproximadamente 1,0 g, así como la revacunación al cabo de un mes.
Las cepas de Vibrio anguillarum empleadas en esta vacuna son R-82 (serotipo O1), RG-111 (Serotipo O2, subgrupo O2a ) y RV-22 (Serotipo O2, subgrupo O2b ) y han sido aisladas a partir de rodaballo cultivado en Galicia.
La eficacia de esta vacuna fue evaluada en rodaballo tanto a escala de laboratorio como a escala industrial. La potencia, expresada como Por- centaje de Supervivencia Relativa (RSP) ha sido superior al 80 %.
