Secuencia génica humana homóloga al gen AFC1 de levaduras implicado en el procesamiento proteolítico de proteínas preniladas.
Campo de la invención
La invención se adscribe al campo de la oncología humana. En concreto la presente invención versa sobre las enzimas procesadoras de proteínas preniladas y sobre los genes que las codifican. Más particularmente, la presente invención aborda la identificación de las proteasas humanas, y de sus posibles inhibidores, encargadas de las modificaciones post-traduccionales que sufren las proteínas ras y otras relacionadas para activarse y poder desempeñar sus funciones patológicas.
Estado de la técnica
Las proteínas ras forman parte de una superfamilia de proteínas enlazantes de nucleótidos de guanina que, tras activarse por mutación, tienen la capacidad de transformar las células eucariotas. Las formas mutadas u oncogénicas de los genes ras se han encontrado en un porcentaje muy significativo de tumores humanos, alcanzando el 50 % en los carcinomas de colon y páncreas (Annu. Rev. Biochem., 56, 779, (1987)). Estas observaciones indican que los genes ras contribuyen al desarrollo de diversos tipos de tumores humanos, siendo por tanto dianas moleculares de intervención terapéutica.
Las proteínas ras se sintetizan en el citoplasma celular como moléculas precursoras que requieren diversas modificaciones post-traduccionales para insertarse en la membrana y desempeñar allí sus funciones biológicas. La primera de estas modificaciones consiste en la prenilación o farnesilación de un residuo de cisteína, localizado en la región carboxilo-terminal, y formando parte de una secuencia Cys-A-A-X, donde A suele ser un aminoácido alifático y X cualquier aminoácido. Tras la prenilación, los tres residuos adyacentes a la cisteina prenilada son eliminados proteolíticamente y el grupo carboxilo resultante es metilado. Hasta el momento se han identificado diversas proteínas que participan en las etapas de prenilación y metilación de las proteínas ras y de otras proteínas que experimentan modificaciones post-traduccionales análogas, y entre las que se pueden citar feromonas fúngicas como el factor-a de levadura, las subunidades g de diversas proteínas G triméricas o pequeñas proteínas enlazantes de GTP implicadas en el tráfico vesicular celular (Annu. Rev. Biochem. 61, 355, (1992)). Sin embargo, actualmente no se conoce ninguna proteína humana responsable de la eliminación proteolítica de los residuos adyacentes a la cisteína prenilada, etapa esencial en la maduración de ras y proteínas relacionadas.
Una de las estrategias para la identificación de las proteasas humanas activadoras de proteínas preniladas consistiría en la búsqueda de proteínas homólogas en otras especies filogenéticamente alejadas, como son las levaduras, pero que también son capaces de desarrollar reacciones análogas de procesamiento proteolítico en secuencias Cys-A-A-X. En este sentido, cabe señalar que recientemente Boyartchuk et al., (Science 275, 1797, (1997)) han descrito la existencia en Saccharomyces cerevisiae de dos proteínas (Afc-1 y Rce-1) que participan en la maduración proteolítica de proteínas preniladas. La proteína Afc-1 se ha descrito como una metaloproteasa que participa en el procesamiento de la feromoma denominada factor-a. Por el contrario, la proteína Rce-1 puede contribuir al procesamiento proteolítico tanto de factor-a como de proteínas ras de levaduras. La descripción de estas dos proteínas abre la posibilidad de búsqueda de proteínas análogas en humanos a través de una estrategia de "clonación por homología". Una de las múltiples formas de abordar esta estrategia, persigue en un primer paso la búsqueda en bancos de datos accesibles públicamente, de fragmentos de secuencias de nucleótidos de genes humanos que tengan similitud con las secuencias de los genes AFC1 y RCE1 de Saccharomyces cerevisiae. Tras su identificación, los hipotéticos fragmentos homólogos se pueden amplificar mediante PCR de ARN total de tejidos humanos en los que se sospeche la expresión de dichos genes, y utilizarlos como sondas para hibridar genotecas de ADNc preparadas a partir de ARN de los mismos tejidos. Finalmente, la secuenciación y posterior caracterización de los clones humanos aislados mediante técnicas estándar de Biología Molecular, permitiría confirmar el posible papel de las proteínas codificadas por dichos clones en el procesamiento proteolítico de proteínas preniladas. Basándose en esta idea, los autores de la invención, tras los pertinentes estudios experimentales, han llegado a los objetivos antes enumerados que constituyen los diversos aspectos de la presente invención.
Breve descripción de la invención
Un objeto de la presente invención es identificar el gen humano que codifica una proteína homóloga a la proteína Afc-1 de Saccharomyces cerevisiae.
Un segundo objeto de la invención es analizar la expresión en tejidos humanos del gen homólogo a AFC1 de Saccharomyces cerevisiae.
Descripción detallada de la invención
El primer objeto de la invención consistió en la identificación de un gen humano que pudiera codificar una proteína homóloga a la proteína Afc-1 de Saccharomyces cerevisiae. Para ello la secuencia de aminoácidos descrita para esta proteína se comparó con la división de "Expressed Sequence Tags" (ESTs) de la base de datos GenBank utilizando el programa TBLASTN (J. Mol. Biol. 215, 403, (1990)). Se identificaron seis ESTs humanas solapantes, cuyos números de acceso son AA210930, F11310, Z43272, R54272, T35312 y N76181. Del solapamiento de estas ESTs, dedujimos una secuencia parcial de nucleótidos, que codifica un fragmento de una hipotética proteína humana con un grado de similitud de aproximadamente 40 % con la proteína Afc-1 de Saccharomyces cerevisiae. Esta proteína humana fue denominada tentativamente Face-1, (Farnesylated-proteins converting enzyme 1). Su secuencia de aminoácidos, así como la secuencia nucleotídica que la codifica se muestra como SEQ ID NO : 1.
A partir de esta secuencia diseñamos y sintetizamos dos oligonucleótidos,
AFC1 (5'-ATGAGGAGGTACTCGCTGTACTAGG-3') y
AFC2 (5'-GCTGGAACATGCTGCCCAGGAC-3').
Estos oligonucleótidos fueron utilizados para amplificar el fragmento de ADNc correspondiente utilizando como molde ADN total aislado a partir de una genoteca de ADNc humano de ovario, construida en Lambda DR2 (Clontech Nº de Catálogo HL1146x). Para ello se utilizaron 20 pmoles de cada oligonucleótido, aproximadamente 1 microgramo de ADNc, 0,2 mM dNTPs y 1,25 U de Taq ADN polimerasa en un volumen total de 50 microlitros de "ExpandLong buffer 3" (Boehringer Mannheim). La amplificación se llevó a cabo en un aparato GeneAmp2400 de Perkin-Elmer, y consistió en ciclo inicial de desnaturalización (1 min, 94ºC), 35 ciclos de desnaturalización (15 s, 94ºC), hibridación (15 s, 60ºC) y extensión (1 min, 72ºC), seguidos de un ciclo final de extensión de 10 min a 72ºC. El fragmento de ADN resultante, de 516 pares de bases (pb) se purificó por electroforesis en gel de agarosa y extracción con GeneClean. La identidad del fragmento amplificado con la secuencia parcial deducida para Face-1 fue verificada tras subclonarlo en pUC18 y determinar su secuencia de nucleótidos mediante técnicas estándar de Biología Molecular.
Con objeto de obtener una secuencia de ADNc que contuviera la información codificante de la proteína Face-1 completa, el producto de PCR obtenido con los oligonucleótidos AFC1 y AFC2, anteriormente descrito, se marcó radiactivamente y se hibridó con 106 clones de la genoteca de ADNc de ovario antes citada siguiendo procedimientos estándar. Se obtuvieron 11 clones de fago lambda que hibridaban específicamente con la sonda utilizada. El ADN de los fagos aislados fueconvertido en los plásmidos pDR2 correspondientes por excisión in vivo, siguiendo las instrucciones del proveedor de la genoteca. Los plásmidos pDR2 recombinantes fueron analizados mediante Southern blot, análisis que nos condujo a seleccionar el clon 1.3a, por ser el que contenía el inserto de mayor longitud. La secuencia de nucleótidos de este plásmido se determinó por el método de terminadores de cadena descrito por Sanger (PNAS, 74, 5463, (1977)). La secuenciación reveló la existencia de una fase abierta de lectura, que codifica una proteína de 475 aminoácidos a la que denominamos Face-1 humana. La comparación de esta secuencia de aminoácidos con todas las secuencias presentes en los bancos de datos accesibles públicamente demostró que el mayor grado de similitud (40 %) correspondía a la proteína Afc-1 de Saccharomyces cerevisiae. Asimismo se detectó un grado significativo de similitud con la denominada proteína hipotética p59 de Schizosaccharomyces pombe y con una proteína de Escherichia coli de función desconocida y denominada htpX. Un análisis más detallado de la secuencia de aminoácidos de Face-1 reveló la presencia de motivos estructurales que permiten clasificarla como una metaloproteasa de la familia de las gluzincinas (Methods Enzymol. 248, 183, (1995)). Así, en posición 335 se encuentra la secuencia HELGH, que corresponde perfectamente con la secuencia HEXXH presente en las metaloproteasas e implicada en la unión de iones metálicos. Además, en posición 415 se encuentra un residuo de glutámico, conservado en la secuencia de Afc-1, p59 y htpX, y que forma parte asimismo del sitio de unión al metal. A cuatro residuos de distancia de este ácido glutámico se encuentra un residuo de ácido aspártico, esencial para la actividad catalítica de estas proteasas (Eur. J. Biochem. 221, 475, (1994)). La existencia de una única proteína humana con estas propiedades nos lleva a concluir que Face-1 es el homólogo humano de la proteína Afc-1 de Saccharomyces cerevisiae y por tanto es presumible su participación en la maduración proteolítica de proteínas preniladas.
El segundo objeto de la invención es analizar la expresión en tejidos humanos del gen homólogo a AFC1 de Saccharomyces cerevisiae. Con este fin, dos membranas conteniendo ARN poliadenilado procedente de múltiples tejidos humanos (leucocitos, colon, intestino delgado, ovario, testículo, próstata, timo, bazo, páncreas, riñón, músculo esquelético, hígado, pulmón, placenta, cerebro y corazón) se hibridaron con la sonda de Face-1 marcada radiactivamente. Dos microgramos de ARN poliadenilado de los tejidos indicados se hibridaron con el ADNc de Face-1. Tras una prehibridación a 42ºC durante tres horas en formamida al 40 %, 5x PBS/EDTA (1x=NaCl 150 mM, NaH2PO4 10 mM, EDTA 1mM, pH 7,4), 10x Solución de Denhardt (1x= Albúmina de suero bovino, 0,02 %, polivinilpirrolidona, 0,02 %, ficoll, 0,02 %), SDS 2 % y ADN de esperma de salmón 100 mg/ml, se añadió la sonda y se hibridó durante 20 horas en las mismas condiciones. Los filtros se lavaron con 1x SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM, pH 7,0) conteniendo SDS al 0,1 % durante 2 horas a 50ºC, y finalmente se expusieron a autorradiografía (Fig. 1). Como puede observarse en la figura 1A, tras hibridación con la sonda de Face-1, se detectó un ARN mensajero de aproximadamente 3,5 kilobases en todos los tejidos analizados. La expresión ubicua del gen Face-1 es consistente con la amplia distribución tisular de proteínas preniladas, lo cual implica a su vez la necesidad de que las proteasas responsables de su maduración estén presentes en todos los tejidos del organismo.
Descripción de las figuras
Figura 1. Análisis Northern de la expresión en tejidos humanos de los genes Face-1 (A), Face-2 (B) y un control de Actina (C) que se expresa en todos los tejidos. A la izquierda se indica el tamaño de los ARNs utilizados como marcadores. (1) Leucocitos, (2) colon, (3) intestino, (4) ovario, (5) testículo, (6) próstata, (7) timo, (8) bazo, (9) páncreas, (10) riñón, (11) músculo, (12) hígado, (13) pulmón, (14) placenta, (15) cerebro y (16) corazón.
