Procedimiento para la determinación cuantitativa de proteínas en micromuestras biológicas preparadas en tampón de electroforesis.
El procedimiento para la determinación de la concentración de soluciones proteicas está basado en la adsorción de micromuestras a un soporte sólido, seguida de tinción con Azul Brillante de Coomassie R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250, Color Index 42660) y cuantificación densitométrica. Esta técnica es sensible, de fácil realización y mínimo coste, presentando la particularidad de ser utilizable cuando las muestras han sido disueltas con dodecilsulfato de sodio (SDS: sodium dodecyl sulfate) o tampón de electroforesis (0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8; 2 % SDS; 5 % beta-mercaptoetanol; 10 % glicerol; 0.002 % azul de bromofenol) (Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227. 680-685. 1970).
La determinación de proteínas en los laboratorios de investigación clínica y biomédica se realiza en general mediante espectrofotometría UV-V, bien analizando la absorbancia a 280 nm (A280) de la solución proteica, o bien mediante pruebas colorimétricas, de las cuales las más empleadas son las del biuret, el ensayo de Lowry, el ensayo de Bradford y el ensayo del BCA.
La medición de la A280 (Warburg O, Christina W: Isolierung und Kristallisation des Gaerungsferments Enolase. Biochem. Z 310: 384-421. 1941) no constituye una medición directa de la cantidad de proteína presente, sino que refleja la abundancia de residuos aromáticos en la cadena polipeptídica, por lo que el coeficiente de extinción molar de cada proteína varía entre amplios márgenes. Su uso se restringe fundamentalmente a la monitorización de fracciones en técnicas cromatográfica, y su rango de sensibilidad abarca de 0.2 a 2 mg/mL. Su principal ventaja es la de ser un método no destructivo.
La reacción del biuret para la determinación de proteínas fue uno de los primeros métodos desarrollados para el análisis colorimétrico de las mismas (Gornall AG, Bardawill CJ, David MM: Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J Biol. Chem. 177. 751-766. 1949) y se usa todavía hoy extensamente en aplicaciones que requieren rapidez pero no una elevada sensibilidad. Se basa en el complejamiento del cobre en una disolución alcalina con el enlace peptídico de las proteínas, y también con los residuos de tirosina. Su principal inconveniente, es el gran número de sustancias que interfieren con la misma, entre ellas numerosos tampones utilizados frecuentemente en biología (Tris, Hepes, Pipes, Mes, etc.).
El ensayo de Lowry (Lowry OH, Rosebrough NJ, Far LA, Randail RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol. Chem. 193:265-275. 1951) ha sido la técnica más empleada para la determinación de proteínas hasta hace relativamente poco tiempo. Es una ampliación del procedimiento del biuret en la que se forma un complejo de cobre-proteína en solución alcalina, que a su vez reduce un reactivo Fosfomolíbdico-fosfotúngstico para dar un color azul intenso. A pesar de ser una técnica sensible (0.005 a 0.1 mg/mL) y muy específica, presenta varias desventajas que la han desplazado: Los reactivos utilizados son inestables; la cinética de la reacción es lenta, y numerosas sustancias interfieren con la reacción.
El ensayo del BCA (bicinchoninic acid assay) (Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC: Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150: 76-85. 1985) es una variante del método de Lowry desarrollada recientemente, más sencilla de realizar y menos sujeta a interferencias. En ella se utiliza el BCA como un sistema indicador para monitorizar el ion Cul1+ producido durante la reacción del biuret. Presenta un rango de sensibilidad de 0.01 a 1.2 mg/mL, pero la cinética de la reacción es lenta, requiriéndose incubaciones relativamente largas a temperaturas de hasta 60 ºC para lograr la máxima sensibilidad.
El ensayo de Bradford (Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. 1975) es un método rápido para la determinación de la concentración de proteínas. Su rango de sensibilidad va de 0.1 a 2 mg/mL (en su formulación estándar) o de 0.01 a 0.2 mg/mL (formulación micrométodo). La base de la técnica es la formación de un complejo insoluble azulado entre el colorante y la proteína que es cuantificado posteriormente en base a su absorbancia a 595 nm.
La posibilidad de determinar la concentración de proteína en micromuestras con las técnicas espectrofotométricas mencionadas, está condicionada al volumen mínimo necesario para realizar la lectura de la absorbancia, que es de 1.5 mL para las cubetas estándar, 0.5 mL para las cubetas semimicro, y 0.1 mL para las microcubetas (Tabla I). Estas últimas no son sin embargo accesorios estándar incluidos con los espectrofotómetros más utilizados, debiendo ser adquiridas por separado y a un elevado coste.
TABLA I. Cantidad mínima de muestra requerida para lectura (mL) | | | | |
| Relación | Cubeta estándar | Cubeta semimicro | Cubeta micro |
| muestra: reactivo | (1.5 mL) | (0.5 mL) | (0.1 mL) |
| | | | |
| | | | |
| A280 | - | 1.500 | 0.500 | 0.100 |
| Biuret | 5:2 | 1.000 | 0.350 | 0.070 |
| Lowry | 1:5 | 0.300 | 0.100 | 0.020 |
| BCA | 1:20 | 0.080 | 0.025 | 0.005 |
| Bradford | 1:50 | 0.030 | 0.010 | 0.002 |
| | | | |
De los datos de la Tabla I se deduce que en el caso de utilizar microcubetas, son necesarios 0.002 mL en el caso del ensayo de Bradford y 0.005 mL en el caso del ensayo del BCA. En la práctica normal (cubeta semimicro) las cantidades consumidas en la mayoría de los laboratorios para realizar la medida de la concentración de proteína son de 0.010 y 0.025 mL, respectivamente.
La medición de la concentración de proteínas en muestras de pequeño volumen es por ello un problema práctico muy frecuente. Ninguna de las técnicas disponibles es aplicable directamente a situaciones en las que la cantidad de muestra disponible sea limitante y especialmente cuando ésta contenga sustancias que interfieran con los métodos habituales de cuantificación de proteínas. Ello ocurre muy en particular cuando se usan técnicas de electroforesis en un laboratorio biomédico.
La electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS es una de las técnicas analíticas más potentes y de uso más difundido para la resolución de mezclas proteicas complejas (Laemmli UK. op. cit.). Esta técnica ofrece un gran poder resolutivo, es fácil de realizar, reproducible, económica, y requiere cantidades mínimas de muestra (0.001 a 0.1 mL), por lo que se ha convertido en una técnica de rutina en los laboratorios de investigación clínica y básica. Su uso requiere conocer previamente la concentración de proteína en las muestras para: (1) evitar la sobrecarga del gel, con la consiguiente pérdida de resolución que conlleva; (2) asegurar la reproducibilidad de la técnica; y (3) permitir la obtención de datos cuantitativos y la comparación entre muestras problema.
En muchas circunstancias, el volumen total de muestra es mínimo, por lo que no se dispone de cantidades suficientes para realizar una determinación de la concentración de proteína en paralelo por métodos espectrofotométricos convencionales. Además, en caso de muestras muy pequeñas, lo habitual es solubilizarlas directamente en tampón de electroforesis (especialmente si la técnica ha requerido una precipitación previa de la proteína mediante ácido tricloroacético o acetona, o por inmunoprecipitación con anticuerpos específicos). Este tampón (Laemmli, op. cit) contiene elevadas cantidades de SDS (típicamente un 2 % p/v) como agente solubilizador y desnaturalizante; un agente reductor como el mercaptoetanol (5 % v/v), y azul de bromofenol (0.002 % p/v) como colorante trazador. Estas sustancias, en las cantidades mencionadas, interfieren seriamente con todos los métodos habituales de determinación espectrofotométrica de proteínas (A280, reacción del biuret, reacción de Bradford, reacción de Lowry, reacción del BCA), por lo que sería de extremada utilidad un método práctico para determinar la concentración de proteína en muestras así preparadas.
Se han propuesto varios métodos para tratar de resolver este problema, pero la mayoría de los mismos son relativamente poco sensibles y/o laboriosos. Así, el método de Schaffner (Schaffner W, Weissmann C: A rapid, sensitive and specific method for the determination of protein in dilute solution. Anal. Biochem. 56. 502-514. 1973) requiere la precipitación previa de las proteínas con ácido tricloroacético, tras lo cual el material precipitado es recogido por filtración sobre filtros Millipore. Las proteínas son reveladas en los filtros por tinción con AmidoBlack 10B, colorante que es seguidamente eluído mediante etanol en medio básico, y cuantificado por espectrofotometría. A pesar de permitir la medición de micromuestras en presencia de SDS, resulta demasiado laborioso como método de aplicación general. Dos modificaciones de este método (Sheffield JB, Graff D, Li HP: A solid-phase method for the quantitation of protein in the presence of sodium dodecil sulfate and other interfering substances. Anal. Biochem. 166. 49-54. 1987); ( Henkel AW, Bieger SC: Quantification of proteins dissolved in an electrophoresis sample buffer. Anal. Biochem. 223: 329-331. 1994) se basan en la aplicación directa de las muestras a una membrana de nitrocelulosa, eliminándose los pasos de precipitación con ácido tricloroacético y filtración. Las muestras adsorbidas a la membrana son posteriormente teñidas con AmidoBlack 10B, que es a continuación eluído y cuantificado espectrofotométricamente. El procedimiento resulta menos laborioso, pero se requiere todavía la elución del colorante para la cuantificación de la proteína. Este problema es obviado en un procedimiento similar (Sportsman JR, Elder JH. A microanalytical protein assay using laser densitometry. Anal. Biochem. 139: 298-300. 1983), en el que la cuantificación del colorante se realiza mediante un densitómetro láser. Esta última técnica resulta sencilla de realizar y permite la cuantificación rápida y fiable de proteínas en el rango 0.1-1.0 mg/mL, usando muestras de 0.0025 mL (0.25 a 2.5 m g de proteína). Su principal problema lo constituye el soporte utilizado, la nitrocelulosa, quebradiza y poco manejable, y cuya capacidad de ligazón de proteínas se ve reducida por la presencia de SDS, por lo que la concentración utilizada se ha limitado al 1 % p/v.
El fundamento de la invención que aquí se describe es un procedimiento utilizado frecuentemente para la valoración semicuantitativa de proteínas (Coluccio LM, Bretscher A: Calcium-regulated cooperative binding of the microvillar 110K-calmodulin complex to a F-actin. J Cell. Biol 105: 325-333. 1987) en fracciones cromatográficas. En este procedimiento las muestras (0.003 mL) son aplicadas directamente sobre una tira de papel de cromatografía, tras lo cual son teñidas simplemente con el colorante estándar utilizado para la tinción de los geles de electroforesis (Azul brillante de Coomassie R-250 en metanol-acético), y desteñidas con la solución de destinción estándar. Este procedimiento ha sido modificado para permitir la utilización directa de muestras preparadas en tampón de electroforesis mediante la adición de un paso de fijación-lavado previo a la tinción, y se ha hecho cuantitativo mediante evaluación de la densidad óptica de las manchas proteicas en imágenes digitalizadas por medio de un escáner de sobremesa. Estos aparatos constituyen en la actualidad un accesorio ampliamente difundido en todos los laboratorios y centros de investigación debido a su precio reducido (menos de un 10 % del coste de un videodensitómetro o un densitómetro láser) y buenas prestaciones. Su utilización, acoplada a un software adecuado de análisis de imagen, permite mediciones precisas y fiables de densidad óptica en muestras digitalizadas (Shea TB: An inexpensive densitometric analysis system using a MacintoshTM computer and a desktop scanner. BioTechniques, 16. 1126-1128. 1994); (Velleman SG: Quantifying immunoblots with a digital scanner. BioTechniques. 18:1056-1058.1995).
La presente invención resuelve el problema técnico de la determinación de la cantidad de proteína en muestras de pequeño tamaño (0.002 mL), por lo que proponemos su uso como ensayo de proteínas de aplicación general para micromuestras. Muy en especial, resuelve el problema de las muestras solubilizadas previamente con SDS o tampón de electroforesis. Esta técnica es muy sencilla, rápida, reproducible, y requiere un equipamiento de bajo coste, disponible en la gran mayoría de los laboratorios clínicos y de investigación. Permite la determinación de la concentración de proteína en el rango 0.1-1 mg/mL, un rango similar al abarcado por el ensayo de Bradford, el más utilizado en la actualidad, aunque el pequeño volumen requerido permite la detección de cantidades de proteína tan pequeñas como 0.2-2 m g. Por último, la técnica no resulta afectada por la presencia de SDS hasta un 2 % p/V, o tampón de electroforesis.
El procedimiento se basa en el descrito originalmente por Coluccio y Bretscher en 1987 (op. cit.), que es únicamente semicuantitativo, modificado para eliminar la interferencia por SDS, beta-mercaptoetanol y azul de bromofenol (componentes del tampón que se utiliza habitualmente para disolver las muestras que van a ser analizadas por electroforesis sobre gel de poliacrilamida), y adaptado para la determinación cuantitativa.
Modo de realización:
Material:
Papel de filtro de calidad, grueso (BioRad, o Whatman 3MM Chr). Manipularlo siempre con guantes para no contaminarlo con proteínas cutáneas. Solución patrón de proteína: Albúmina Sérica Bovina (BSA), solución a 1 mg/mL en agua destilada (si se van a medir muestras acuosas) o en tampón de electroforesis (para muestras disueltas en el mismo). Disponible comercialmente de varias fuentes, o preparada en el laboratorio a partir de una disolución de albúmina bovina a 10 mg/mL (absorbancia a 280 nm de 6.6). Solución de tinción: Azul Brillante de Coomassie R-250 (SERVA blue R) 1 mg/mL, disuelto en Metanol:Acético:Agua (10:4:10), y filtrado a través de una membrana de 0.44 mm. Tampón de electroforesis de Laemmli (0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8; 2 % SDS; 5 % beta-mercaptoetanol; 10 % glicerol; 0.002 % azul de bromofenol): Solución de destinción: 12.5 % Metanol-10 % Acético. Secador: Lámpara de infrarrojos o secador de pelo manual. Escánen: Cualquier escáner de oficina capaz de trabajar a 8 bits (256 grises) y con una resolución de al menos 150 puntos por pulgada (En nuestro caso, AppleTM Color One). Ordenador personal: Cualquier ordenador capaz de controlar el escáner (MacintoshTM o PC compatible. En nuestro caso un MacintoshTM LC 475). Software de Integración: Cualquier paquete de software capaz de realizar lecturas de densidad óptica integrada a partir de la imagen generada por el escáner. En nuestro caso hemos utilizado NIH Image, un programa de dominio público para análisis digital 2, de imagen en ordenadores Apple MacintoshTM, elaborado por Wayne Rasband (U.S. National Institutes of Health) y disponible sin coste a través de Internet (por ftp al servidor < zippy.nimh.nih.gov > ) o en diskette (National Technical Information Service, Springfield, Virginia, item número PB93-504868). Los mismos resultados pueden obtenerse con otros muchos paquetes de software, entre ellos Adobe PhotoshopTM, disponible para ordenadores MacintoshTM y PC-compatibles. Método:
Preparar una curva estándar a partir del patrón de proteína. La utilizada por nosotros se prepara como sigue:
Muestras acuosas | | |
| Concentración | Estándar 1 mg/mL | |
| (mg/mL) | (acuoso) | Agua |
| | |
| | |
| 0.00 | 0 | 100 |
| 0.10 | 10 | 90 |
| 0.25 | 25 | 75 |
| 0.50 | 50 | 50 |
| 0.75 | 75 | 25 |
| 1.00 | 100 | 0 |
| | |
Muestras preparadas en tampón de electroforesis | | |
| Concentración | Estándar 1 mg/mL | Tampón de |
| (mg/mL) | (en tampón) | Electroferesis |
| | |
| | |
| 0.00 | 0 | 100 |
| 0.10 | 10 | 90 |
| 0.25 | 25 | 75 |
| 0.50 | 50 | 50 |
| 0.75 | 75 | 25 |
| 1.00 | 100 | 0 |
| | |
Pipetear 0.002 mL de cada uno de los puntos de la curva sobre el papel de filtro, espaciados regularmente, cuidando de no arañar la superficie del papel con la punta de la micropipeta. Podemos ayudarnos de un retículo de 1 x 1 cm dibujado previamente sobre el papel con un lápiz blando, depositando cada muestra cuidadosamente en el centro de los cuadrados.
Pipetear 0.002 mL, de cada muestra problema sobre el papel, de la misma manera que los patrones. Si la concentración inicial es totalmente desconocida, pueden pipetearse varias diluciones diferentes de cada muestra.
Secar completamente el papel con la lámpara de infrarrojos o el secador. Alternativamente, dejar secar al aire, resguardándolo del polvo.
Fijación/lavado: Colocar el papel de filtro, una vez seco, en una cubeta con solución de destinción. Incubar con agitación suave hasta que el azul de bromofenol que contienen las muestras desaparezca completamente. Si ninguna de las muestras a analizar contiene tampón de electroforesis, este paso puede eliminarse, procediéndose directamente desde el secado a la tinción.
Tinción: Retirar la solución de destinción y sustituirla por solución de tinción. Incubar 15 minutos, con agitación suave.
Destinción: Eliminar la solución de tinción (que puede ser reciclada varias veces) y sustituirla por solución de destinción. Incubar con agitación suave y cambiarla cada 15 minutos hasta obtener un fondo claro y uniforme.
Secado: Con la lámpara de infrarrojos, el secador, o en estufa. Alternativamente, dejar secar al aire en lugar resguardado del polvo.
Digitalización: De acuerdo con las instrucciones que acompañan al escáner, a 8 bits (256 grises) y 150 puntos por pulgada. Grabar la imagen resultante en un formato compatible con el software de integración (en general, en formato TIFF -Tag Image File Format-. No utilizar formatos que resulten en compresión con pérdida de datos, como JPEG).
Cuantificación: La metodología concreta dependerá del software utilizado. En general, definir una región de tamaño ligeramente superior al de la mancha de mayor tamaño, y utilizarla para tomar lecturas de densidad óptica de cada uno de los estándares y las muestras. Representar gráficamente la curva estándar y extrapolar la concentración de proteína de las muestras problemas. El ensayo es lineal para la BSA en el rango 0.1-1 mg/mL tanto en muestras acuosas como en muestras preparadas en tampón de electroforesis. Es decir, aproximadamente el mismo rango que abarca el ensayo estándar de Bradford. Se obtienen resultados similares para otras proteínas, como amilasa, alcohol deshidrogenasa (ADH) y citocromo C (Citocr. C). Los resultados obtenidos para varias proteinas en solución acuosa se reflejan en la Tabla II. La Tabla III recoge los resultados para las mismas proteínas disueltas en tampón de electroforesis. En ambos casos se han realizado 14 determinaciones para cada una de las proteínas (n = 14). Los resultados obtenidos para la BSA se muestran gráficamente en la Figura 1 (en solución acuosa) y en la Figura 2 (en buffer de electroforesis), como las medias y desviaciones estándar de las densidades ópticas obtenidas (eje Y) para cada concentración de proteína (eje X).
TABLA II Concentración vs. densidad óptica para varias proteínas en solución acuosa (media ± desviación estándar, n=14) | | | | |
| | | Alcohol | Citocromo |
| BSA | Amilasa. | Deshidrog. | C |
| | | | |
| | | | | | | | |
| mglmL | Media | D.E. | Media | D.E. | Media | D.E. | Media | D.E. |
| | | | | | | | |
| | | | | | | | |
| 0.00 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.03 |
| 0.05 | 0.05 | 0.01 | 0.04 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.19 | 0.03 |
| 0.10 | 0.15 | 0.02 | 0.09 | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 0.30 | 0.04 |
| 0.25 | 0.33 | 0.03 | 0.25 | 0.03 | 0.15 | 0.05 | 0.56 | 0.09 |
| 0.50 | 0.54 | 0.07 | 0.48 | 0.05 | 0.33 | 0.06 | 0.86 | 0.12 |
| 0.75 | 0.74 | 0.03 | 0.71 | 0.06 | 0.50 | 0.11 | 0.99 | 0.14 |
| 1.00 | 0.95 | 0.04 | 0.83 | 0.05 | 0.55 | 0.11 | 1.14 | 0.18 |
| | | | | | | | |
TABLA III Concentración vs. densidad óptica para varias proteínas en tampón de electroforesis (media ± desviación estándar, n=14) | | | | |
| | | Alcohol | Citocromo |
| BSA | Amilasa. | Deshidrog. | C |
| | | | |
| | | | | | | | |
| mglmL | Media | D.E. | Media | D.E. | Media | D.E. | Media | D.E. |
| | | | | | | | |
| | | | | | | | |
| 0.00 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.04 | 0.04 |
| 0.05 | 0.05 | 0.03 | 0.04 | 0.04 | 0.06 | 0.04 | 0.16 | 0.07 |
| 0.10 | 0.13 | 0.06 | 0.09 | 0.05 | 0.13 | 0.06 | 0.33 | 0.13 |
| 0.25 | 0.40 | 0.08 | 0.32 | 0.08 | 0.40 | 0.08 | 0.71 | 0.17 |
| 0.50 | 0.70 | 0.10 | 0.63 | 0.11 | 0.66 | 0.11 | 1.08 | 0.15 |
| 0.75 | 0.92 | 0.13 | 0.83 | 0.10 | 0.88 | 0.08 | 1.27 | 0.12 |
| 1.00 | 1.07 | 0.14 | 1.00 | 0.12 | 1.00 | 0.09 | 1.42 | 0.13 |
| | | | | | | | |
Posibilidades de aplicación industrial:
Es una técnica de utilidad general como método para microdeterminación de proteínas en muestras de pequeño volumen. Es de destacar su utilidad en casos de muestras que contengan sustancias que interfieran con los métodos estándar de determinación de proteínas (concentración elevada de sales, presencia de detergentes o colorantes), ya que éstas son eliminadas durante la fijación/lavado en metanol ácido. Resulta especialmente aplicable en laboratorios clínicos y de investigación biomédica, al permitir evaluar de un modo rápido y sencillo la concentración de proteína de las muestras previamente a su caracterización electroforética.
