Vacuna anti-Pasteurella piscicida (DI) para la prevención de la enfermedad pasteurelosis en dorada y lubina, y procedimiento de obtención.
La presente patente de invención está destinada a dar a conocer una nueva vacuna para proteger dorada y lubina cultivadas en agua de mar contra la pasteurelosis, y está basada en la combinación de cepas, causantes de mortalidades en peces, aisladas en distintas zonas geográficas, que difieren en la composición de sus productos extracelulares. La ventaja de esta vacuna frente a las ya existentes es su alta tasa de protección (80%) a las que supera en más de un 20%.
La pasteurelosis, producida por Pasteurella piscicida, es una de las principales enfermedades en acuicultura marina, especialmente para dorada y lubina, debido a las enormes pérdidas económicas que ocasiona.
Desde 1990 se han detectado con cierta frecuencia epizootias de pasteurelosis en diversas piscifactorías gallegas y del resto de España, afectando principalmente a dorada y en menor medida a lubina. Aunque se ha empleado la quimioterapia para el tratamiento de la enfermedad, la aparición de resistencias a antibióticos y la creciente preocupación sobre la permanencia en el medio ambiente de los mismos han impulsado la vacunación como medida preventiva de la enfermedad.
Todas las cepas aisladas de estas epizootias presentan gran homogeneidad bioquímica, serológica y genética (Magariños y col., 1992: Applied and Environmental Microbiology, 58: 3316-3322). Si se han detectado, sin embargo, diferencias entre las cepas en la composición de sus productos extracelulares y en base a estas diferencias se ha realizado la selección de los componentes vacunales (Magariños y col., 1992: Joumal of General Microbiology, 138:2491-2498). Las cepas de Pasteurella piscicida incluidas en esta vacuna son los aislados DI-21 e IT-1, que han sido depositados por los inventores de la patente en la Colección Española de Cultivos Tipo, con referencias CECT 4780 y 4781, respectivamente. Ambas presentan las características típicas de la especie siendo bacilos halófilos Gram. negativos, imnóviles, oxidasa y catalasa positivos, fermentativos y sensibles al agente vibriostático O/129. Son además positivas para las reacciones de rojo de metilo y Voges-Proskauer y negativas para las pruebas del indol y citrato.
En cuanto a sus productos extracelulares en los de ambas cepas se ha detectado alta actividad fosfolipasa, fosfatasa alcalina y ácida, esterasa, lipasa, leucina arilamidasa y fosfoamidasa. La cepa CECT 4780 presenta además actividad N-acetil-b -glucosaminidasa que no está presente en la cepa CECT 4781. Este aislado (CECT 4781) posee en sus productos extracelulares, a diferencia del CECT 4780, actividad a -glucosidasa.
Preparación
A partir de preinóculos en fase logarítmica de crecimiento se inoculan matraces de dos litros conteniendo un litro de medio de cultivo caldo cerebro-corazón (BHI, del inglés brain heart infusión: infusión de sólidos de cerebro de ternera 12,5 g/L; infusión de sólidos de corazón bovino 5,0 g/L; proteosa peptona 10 g/L; cloruro sódico 5,0 g/L; glucosa 2,0 g/L; fosfato disódico 2,5 g/L; pH 7,4 ± 0,2) suplementado con un 1,5% de cloruro sódico.
La incubación se realiza a 25ºC durante 48 horas. Cuando el cultivo alcanza una densidad óptica de 1 (Absorbancia580)(aproximadamente 1010 células/mL), se le añade formol a una concentración final de 0,35% para matar las bacterias, y se mantiene durante tres horas más en agitación, al cabo de las cuales se transfieren a 4ºC. Las dos cepas empleadas se mezclan en proporción del 50%.
Paralelamente, las mismas cepas se siembran sobre placas (25 x 25 cm) con el mismo medio de cultivo sólido (TSA-EL: Agar cerebro-corazón suplementado con 1,5% de ClNa), incubando a la misma temperatura durante 48 horas. Al cabo de ese tiempo a cada placa se le añaden 5 mL de formol al 35%. Las células muertas se recogen con una espátula estéril, lavando con tampón fosfato (PBS)-formol (PBS-formol: ClNa 8 g/L, ClK 0,3 g/L, PO4HNa2 0,73 g/L, PO4H2K 0,2 g/L, formol 0,35%; pH 7,4). Esta fracción, rica en productos extracelulares, se diluye hasta una densidad óptica de 1 (Absorbancia580) y se añade al cultivo líquido inactivado en una proporción 1/10.
El control de esterilidad se lleva a cabo sembrando la mezcla vacunal en placas de BHIA-2 y en tubos de tioglicolato, incubando durante 72 horas a 25 y 37ºC, respectivamente.
El control de especificidad se realiza mediante aglutinación en portaobjetos, utilizando como antígeno las células enteras empleadas en la fabricación de la vacuna.
El producto debe ser conservado a 4ºC hasta su utilización.
Modo de administración
Para administrar la vacuna, esta se diluye 1/10 en el agua de cultivo y los peces se mantienen en este baño vacunal durante 1 min. Con cada litro de vacuna se pueden vacunar 100 Kg de peces en 20 tandas de 5 Kg, manteniendo aireado el baño vacunal. También se puede emplear una dilución 1/1000 de la vacuna, y en este caso los peces se mantienen en este baño durante 1 hora. Para administrar la vacuna por inyección intraperitoneal, se inoculan los peces con 0,1-0,2 mL/pez (dependiendo del peso del pez) de mezcla vacunal sin diluir.
Para mejorar la protección obtenida se recomienda realizar la vacunación en peces de aproximadamente 0,5 g, así como la revacunación al cabo de tres meses.
Las cepas de Pasteurella piscicida empleadas en esta vacuna son DI-21 (aislado gallego) e IT-1 (aislado italiano).
La eficacia de esta vacuna fue evaluada en dorada tanto a escala de laboratorio como a escala de campo. La potencia, expresada como Porcentaje de Supervivencia Relativa (RSP) ha sido superior al 80%.
