Proteína inactivadora de ribosomas, denominada nigrina f, de la planta Sambucus nigra L., procedimiento para su obtención y preparación.
Campo técnico de la invención
La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de las proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs) las cuales impiden el funcionamiento ribosómico de manera catalítica por inactivación del ácido ribonucléico.
De forma más específica, la presente invención se refiere a una nueva RIP de dos cadenas obtenidas de frutos de Sambucus nigra L. con potencial aplicación en la terapia del cáncer y del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Estado de la técnica anterior a la invención
En el reino vegetal existen algunas especies que contienen actividades inhibidoras de la biosíntesis de proteínas en sistemas derivados de organismos eucariontes, que son de naturaleza proteica y que a la espera de una definición bioquímica precisa se conocen con el nombre de proteínas inactivadoras de ribosomas (Gasperi-Campani y cols. Biochem. J. 186,439-441 [1980]; Gasperi-Campani y cols. J. Nat. Prod. 48,446-454 [1985]; Ferreras y cols. Cell. Mol. Biol. 35,89-95 [1989]; Merino y cols. J. Exp. Bot. 41, 67-70 [1990]; Girbés y cols. Cell. Mol. Biol. 38, 803-812 [1992]; Citores y cols. Cell. Mol. Biol. 39, 885-995 [1993]; Stirpe y cols. Bio/technol. 10, 405-412 [1992]; Citores y cols. FEBS Lett. 329, 59-62 [1993]). Estas proteínas pueden ser de una cadena polipeptídidca (de tipo 1), de dos cadenas polipeptídicas (de tipo 2) o de cuatro cadenas polipeptídicas (de tipo 4) (Citores y cols. FEBS Lett. 329, 59-62 [1993]). Las de una cadena polipeptídica son N-glucosidasas del ácido ribonucleico ribosómico (Stirpe y cols. Nucleic Acid Res. 16,1349-1357 [1988]) mientras que las de dos cadenas tienen una actividad N-glucosidasa del ácido ribonucleico ribosómico (cadena A) y una lectina (cadena B) (Stirpe y cols. Bio/technol. 10, 405-412 [1992]) que habitualmente reconoce restos de galactosa y sus derivados. Las proteínas de cuatro cadenas están formadas por dímeros del tipo A-B (equivalentes cada uno a una molécula de tipo 2) (Citores y cols. FEBS Lett. 329, 59-62 [1993]). Estas proteínas (A y B) tienen una masa molecular (mr) entre 20000 y 34000. Las cadenas A impiden el funcionamiento ribosómico de manera catalítica por inactivación del ácido ribonucléico (Jiménez y Vázquez, Annu. Rev. Microbiol. 39,649-672 [1985]; Roberts y Selitrennikoff, Biosc. Rep. 6,19-29 [1986]; Stirpe y Barbieri, FEBS Lett. 195,1-8 [1986]; Stirpe y cols. Bio/technol. 10, 405-412 [1992]; Citores y cols. FEBS Lett. 329, 59-62 [1993]; Girbés y cols. J. Biol. Chem. 268, 18195-18199 [1993]; Girbés y cols. Plant Mol. Biol. 22, 1181-1186 [1993]). La inactivación consiste en la liberación de una adenina del ARN ribosómico mayor del ribosoma (Endo y Tsurugi, J. Biol. Chem. 262,8128-8130 [1987]; Stirpe y cols. Nucleic Acid Res. 16, 1349-1357 [1988]; Girbés y cols. J. Bacteriol. 175, 6721-6724 [1993]; Iglesias y cols. FEBS Lett. 325, 291-294 [1993]; Iglesias y cols. FEBS Lett. 318, 189-192 [1993]). El papel biológico de estas toxinas en la planta que las produce es totalmente desconocido (Roberts y Selitrennikoff Biosci. Rep. 6,19-29 [1986]). Estas proteínas son inmunológica y químicamente diferentes unas de otras aunque guardan alguna homología secuencial en los aminoácidos del extremo amino-terminal en particular cuando las toxinas pertenecen a la misma familia botánica (Montecucchi y cols. Int. J. Peptide Protein Res. 33, 263 -267 [1989]; Arias y cols. Planta 186, 532-540 [1992]). El enorme interés de las proteínas inactivadoras de ribosomas reside en que se utilizan en la construcción de inmunotoxinas para terapia del cáncer (Vitetta y Uhr, Annu. Rev. Immunol. 3,197-212 [1985]; Frankel y cols. Annu. Rev. Med. 37, 125-142 [1986]; Koppel, Bioconj. Chem. 1, 13-23 [1990]; Lord, Plant Physiol. 85, 1-3 [1987]) y del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (Till y cols. Science 242,1166-1168 [1988]; Ghetie y cols. Bioconj. Chem. 1, 24-31 [1990]; Khan y cols. AIDS 4, 1197-1204 [1990]; Byers y cols. AIDS 4, 1189-1196 [1990]). Muy recientemente se ha encontrado que diversos miembros de este grupo de proteínas y en particular la llamada tricosantina poseen per se carácter inactivador del virus RNA HIV-1 que es el agente etiológico del síndrome de inmunodefiencia adquirida (McGrath y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,2844-2848 [1989]; Lee-Huang y cols. FEBS Lett. 272, 12-18 [1990]; Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6570-6574 [1991]; Zarling y cols. Nature 347,92-95 [1990]).
Dado que las proteínas son substancias antigénicas poderosas, para poder abordar cualquier tipo de terapia con ellas es necesario disponer de una batería de dichas toxinas lo más amplia posible con el objeto de seleccionar la menos inmunoreactiva por un lado y de poder substituir la toxina o la parte tóxica de la inmunotoxina según se van desarrollando anticuerpos neutralizantes en el paciente por otro. Además no todas estas toxinas proteicas poseen la misma citotoxicidad (Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6570-6574 [1991]).
Descripción detallada de la invención
La presente invención, tal y como se indica en su enunciado, se refiere a una nueva proteína inactivadora de ribosomas (RIPs) de Sambucus nigra L., a un procedimiento para su preparación y a sus aplicaciones.
Las mencionada proteína es una nueva toxina vegetal de naturaleza proteica que, en base a sus propiedades químico-físicas y bioquímicas, se clasifica en el grupo de proteínas vegetales inactivadoras de ribosomas de tipo dos o de dos cadenas que en contraste con la ricina no posee actividad tóxica sobre ratones.
La originalidad de la presente invención frente al estado de la técnica expuesto en el apartado anterior reside en la búsqueda de proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo 2 en frutos de Sambucus nigra L., en cuya corteza ya se ha descrito la existencia de una proteína inactivadora de ribosomas de tipo 2, llamada nigrina b (Girbés y cols. Plant Mol.Biol. 22, 1181-1186 [1993]).
La nueva proteína de la presente invención está constituída por dos cadenas, una con actividad N-glucosidasa del ácido ribonucleico ribosómico, en especial con actividad de N-glucosidasa del ácido ribonucleico 28 S de ribosomas de mamíferos y otra con actividad lectina; caracterizándose dicha nueva proteína porque ligada a una molécula transportadora (anticuerpo, hormona u otra proteína) reconocible por un receptor de membrana presente en la célula diana, permite la actuación específica y selectiva de la toxina sobre dichas células diana por inactivación del ácido ribonucleico de sus ribosomas.
La proteína de la presente invención así definida es capaz de interaccionar catalíticamente con el ácido ribonucleico y de provocar la inhibición de la biosíntesis de proteínas en sistemas acelulares. Su poder inhibidor es muy superior a los inhibidores antibióticos no proteicos de la biosíntesis de proteínas (Pestka, S. (1977) Inhibitors of protein synthesis. En: Molecular Mechanisms of Protein Biosynthesis. Ed. H. Weissbach y S. Pestka. Academic Press. pp. 468-553).
Adicionalmente, dicha proteína presenta actividad como N-glucosidasas del ácido ribonucleico ribosómico ARN-r.
La extraordinaria potencia como inhibidor de la biosíntesis de proteínas y su efecto sobre el ácido ribonucleico, equivalente al ejercido por ejemplo por la PAP (pokeweed antiviral protein, Irvin, Pharmacol. Ter 21, 371-387 [1983]), una proteína con actividad anti-HIV-1 (Zarling y cols. Nature 347 92-95 [1990]), confiere a esta proteína una enorme utilidad.
Las aplicaciones más importantes de la RIP de tipo 2 de la presente invención son: como inactivadora in vitro de ribosomas sensibles a la toxina, como inactivadora in vitro del ácido ribonucleico de mamíferos, como inhibidora de la síntesis de proteínas en sistemas in vitro, como inhibidora de la síntesis de proteínas en células y tejidos acopladas a anticuerpos monoclonales frente a receptores específicos en dichas células y tejidos y como antiviral contra virus ARN, en particular el HIV causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Asimismo, a partir de dicha proteína es posible la construcción de conjugados con otras especies químicas con la finalidad de inhibir la biosíntesis de proteínas por inactivación in vivo de ribosomas de organismos eucariontes. El transporte de proteínas al interior celular se consigue acoplándola a transportadores adecuados como anticuerpos, hormonas y otras proteínas que puedan ser reconocidas por receptores específicos en la superficie celular y que puedan ser transportados al interior de la célula [Stirpe y cols. Bio/technol. 10, 405-412 (1992); Barbieri y Stirpe, Cáncer Surv. 1, 490-520 (1982)].
Por lo tanto, la RIP de tipo 2 de la presente invención es potencialmente útil para la terapia de enfermedades tales como cáncer y SIDA.
El procedimiento general para la obtención de la RIP de Sambucus nigra de la presente invención comprende el aislamiento de la misma de frutos de Sambucus nigra incluyendo una primera operación de extracción con un solución acuosa a base de cloruro de sodio y fosfato monosódico para obtener un extracto que sea capaz de inhibir la síntesis de proteínas, seguido de purificación del extracto mediante técnicas de cromatografía de afinidad e intercambio iónico.
El procedimiento general para la obtención de la RIP de dos cadenas a partir de frutos de Sambucus nigra de la presente invención comprende las siguientes operaciones:
Obtención del extracto proteico de frutos de dicha planta con cloruro sódico y fosfato monosódico. Cromatografía de afinidad. Diálisis y desarrollo de una cromatografía de intercambio iónico del pico eluído de la etapa anterior. Los valores de Mr obtenidos en ausencia de reductor fueron 58000 daltons. Nigrina f presenta dos isoformas: la mayoritaria presenta una cadena B de 31600 daltons y una cadena A de 26200 unidas por puentes disulfuro, la minoritaria tiene una cadena B de 30000 daltons y una cadena A de 28200 daltons unidas por puentes disulfuro, valores todos ellos obtenidos en presencia de reductor. Se determinó la secuencia de aminoácidos del extremo amino -terminal de la Nigrina f, empleando un secuenciador de proteínas, que resultaron ser las que se indican a continuación:
Cadena A: 1 5 10 15 Ile-Asp-Tyr-Pro-Ser-Val-Ser-Phe-Asn-Leu-Ala-Gly-Ala-Xaa-Ser-Ala- 20 Thr-Tyr-Arg-Asp-Phe-Leu-Ser-Asn Cadena B: 1 5 10 15 Asp-Gly-Glu-Thr-Xaa-Pro-Ile-Pro-Ala-Ser-Phe-Thr-Arg-Xaa-Ile-Val- 20 Gly-Arg-Asp-Gly-Leu-Xaa-Val-Asp
Modos de realizar la invención
Los varios aspectos de la invención se describen con el siguiente ejemplo que no intenta limitar en modo alguno la invención. El ejemplo se desglosa en 9 partes:
a) obtención de nigrina f a partir de frutos de Sambucus nigra L.; b) determinación de la maza molecular aparente; c) presencia de azúcares en las cadenas; d) secuencia amino-terminal de las cadenas polipeptídicas de nigrina f; e) actividad N-glucosidasa del ARN; f) inhibición de la biosíntesis de proteínas; g) relación inmunológica; h) actividad hemaglutinante; i) toxicidad.
a) Obtención de nigrina f
100 g de frutos verdes de Sambucus nigra L. se extrajeron con 500 ml de solución 280 mM cloruro sódico y 5 mM fosfato monosódico (pH 7,5) a 4ºC durante 12 h. La pasta resultante se filtró a través de malla para queso para eliminar los sólidos remanentes. El extracto líquido se centrifugó a 25900 x g durante 45 min a 0ºC. El fluido sobrenadante se filtró a través de malla para queso. La muestra (aproximadamente 580 ml) se sometió a cromatografía de afinidad en Sepharose 6B tratada con ácido (columna de 10 x 5 cm). La solución de equilibrado de columna fue 280 mM cloruro sódico y 5 mM fosfato monosódico (pH 7,5). La parte no retenida a la columna se desechó. A continuación la columna se lavó con solución de 280 mM de cloruro sódico y 5 mM de fosfato monosódico (pH 7,5) hasta que la absorbancia a 280 nm se redujo al mínimo. A continuación se eluyó la columna con solución 0,2 M de lactosa, 280 mM de cloruro sódico y 5 mM de fosfato monosódico (pH 7,5). El pico que contenía la proteina fue dializado extensivamente frente a 5 mM de fosfato monosódico (pH 7,5) y se sometió a cromatografía de intercambio aniónico en DEAE-Celulosa (columna de 5,6 x 2,6 cm.) acoplada a un sistema de FPLC. primero se fijó la proteina y después se aplicó el gradiente iónico consistente en 100 ml de solución 5 mM de fosfato monosódico (pH 7,5) y 100 ml de solución 300 mM de cloruro sódico. Al comienzo del gradiente aparece la nigrina f electroforéticamente homogénea. Las fracciones que contienen la proteína se recogieron y se dializaron frente a agua y posteriormente se liofilizaron.
b) Determinación de la maza molecular aparente de la nigrina f
La masa molecular relativa se determinó por electroforesis en geles discontinuos de poliacrilamida en presencia de SDS (dodecil sulfato sódico) por el procedimiento de Laemmli (Nature 227, 680-685, [1970]) con un aparato Mighty-Small II de Hoefer (San Francisco, Cal., USA) y una fuente de alimentación Promax modelo FAC-400. El procedimiento esencialmente es como se describe a continuación. Se disuelven entre 1-10 m g de las muestras en un tampón desnaturalizante que contiene 75 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 2 % de SDS, 10 % de glicerol y 5 % de P-ME. Se hierve la muestra 90 segundos y se le añade azul de bromofenol hasta una concentración de 0,02 %. El gel consta de dos fases con distinta concentración de poliacrilamida: "el gel separador" se forma con una mezcla de un 14,6 % de acrilamida y un 0,4 % de bisacrilamida (15 % T 2,7 % C), Tris-HCl 375 mM (pH 8,8), SDS 0,1 %, persulfato amónico 0,1 % y TEMED 0,07 %, y "el gel de compactación" que está formado por 3,9 % acrilamida, 0,1 % bisacrilamida (4 % T 2,7 % C), Tris-HCl 125 mM (pH 6,8), SDS 0,1 %, persulfato amónico 0,08 % y TEMED 0,08 %. La electroforesis se lleva a cabo en tampón Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), glicina 192 mM y SDS 0,1 %, durante aproximadamente 45-60 min (el frente de azul de bromofenol sirve como testigo del proceso) a la intensidad limitante de 20 mA por gel y 20ºC de temperatura. Al finalizar la electroforesis se retiran los geles y se tiñen durante 3-4 h con solución de teñido formada por 0,125 % de coomassie brilliant blue R-250 en una solución al 50 % de metanol y 10 % de ácido acético en agua. Después se cambia el gel a un recipiente con solución de desteñido compuesta de ácido acético 7 % y metanol 5 % en agua, hasta que se destiñe suficientemente.
Para determinar la masa molecular aparente (Mr) de las muestras se colocan en una de las calles varios marcadores de masa molecular conocida: Albúmina de suero bovino de 68000 Daltons, L-Glutamato Deshidrogenasa de 54000, Alcohol Deshidrogenasa de 37000, Anhidrasa Carbónica de 29000, e Inhibidor de Tripsina 20100. La Mr se determina por interpolación.
Los valores de Mr obtenidos en ausencia de reductor fueron 58000 daltons. Nigrina f presenta dos isoformas. La mayoritaria presenta una cadena B de 31600 daltons y una cadena A de 26200 unidas por puentes disulfuro. La minoritaria tiene una cadena B de 30000 daltons y una cadena A de 28200 daltons unidas por puentes disulfuro.
c) Presencia de cadenas glucídicas en nigrina f
Para detectar la existencia de grupos glucídicos en las proteínas estudiadas se utilizó el "Glycan Detection Kit" de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). Se disolvieron 1-10 m g de muestra en 20 m l de tampón acetato sódico 0,1 M (pH 5,5) y se añadieron 10 m l de una disolución de metaperiodato sódico 6,67 mg·ml-1 para oxidar los grupos hidroxilo de los azúcares a grupos aldehído. A continuación se incubó durante 20 min en oscuridad a temperatura ambiente. Posteriormente el exceso de metaperiodato sódico se destruyó añadiendo 10 m l de disulfito sódico 15 mg·ml-1. Se dejó actuar a temperatura ambiente durante 5 min. Seguidamente se añadieron 5 m l de una solución de DIG-succinil-e -ácido amidocaproico hidrazida, con lo cual se une el grupo DIG (digoxigenina) a los aldehídos de los azucares gracias al grupo hidrazido. Se incubó 1 h a temperatura ambiente. Por último se añadieron 15 m l de tampón (Tris-HCl 300 mM (pH 8,8), 8 % SDS, 40 % glicerol, 20 % 2-ME), se hirvió la mezcla a 100ºC durante 2 min y se añadieron 2 m l de azul de bromofenol 0,5 % (p/v). Las muestras se sometieron a electroforesis como se indica anteriormente. Posteriormente las proteínas se transfirieron a una membrana de Immobilon (Millipore) utilizando el protocolo descrito por los fabricantes del sistema de transferencia utilizado, el sistema semiseco Semi-Phor modelo TE70 de Hoefer. Las muestras se separan previamente por electroforesis como se describe anteriormente, pero en vez de ser teñidas se embeben durante 15 min en un tampón de transferencia compuesto por Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), glicina 192 mM, SDS 1,3 mM y 10 % de metanol. El lecho de papel consiste en tres trozos de papel Whatman 3M (Whatman international Ltd., Maidstone, England) del mismo tamaño que el gel y otros tres dos milímetros más grandes por cada lado, también embebidos en el mismo tampón. La membrana de nitrocelulosa Immobilon de Millipore a la que serán transferidas las proteínas, también cortada al mismo tamaño que el gel, se humedece unos 10 segundos en metanol puro y a continuación se lava con abundante agua tipo I (obtenida con un sistema MilliQ de Millipore), tras lo cual se sumerge en tampón de transferencia durante 15 min. Una vez preparadas las capas del "sandwich" de transferencia (lecho de papel sobre y bajo la membrana), se colocan sobre uno de los electrodos, teniendo el cuidado de evitar en lo posible el estancamiento de burbujas. A continuación se coloca el segundo electrodo y se conecta a la fuente de alimentación a la intensidad limitante de 0,8 mA·cm-2 de membrana durante 1 h. Tras la transferencia la membrana se incubó en el tampón de bloqueo proporcionado por el "kit", durante 30 min. Después, se lavó la membrana 3 veces durante 10 min con 50 ml de TBS pH 6,5 (Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,15 M). Seguidamente la membrana se incubó con el anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina disuelto en TBS pH 6,5 durante 1 h. Tras lo cual se lavó como antes. Finalmente, se añadió el sustrato de la fosfatasa alcalina formado por 5-Bromo 4 cloro 3 indolil-fosfato y NTB (cloruro de Nitroblue-tetrasodio-disulfato disuelto en dimetilformamida) disueltos en tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 9,5) conteniendo MgCl2 0,05 M y NaCl 0,1 M. El desarrollo del color se efectuó sin agitación y en pocos minutos. Para parar la reacción se lavó varias veces con agua destilada. Las proteínas con azúcares en sus cadenas desarrollaron un color gris oscuro. Como patrón se utilizó la glicoproteína transferrina (76000 daltons).
Nigrina f posee cadenas glucídicas reactivas con el sistema de detección de glicanos de Boehringer sólo en la cadena B.
d) Secuencia amino-terminal de las cadenas polipeptídicas de nigrina f
La secuencia amino-terminal se determinó como se indica en Limas y cols. (Planta 181,1-9 [1990]) con un secuenciador de proteínas Knauer modelo 810 equipado con un analizador de PTH-aminoácidos (feniltiohidantoilderivados de los aminoacidos). La secuencia de aminoácidos del extremo amino-terminal de la proteína se realizó por degradación de Edman. El proceso consiste en la reacción en medio básico del reactivo de Edman (fenilisotiocianato) con el grupo amino del aminoácido del extremo amino terminal del polipéptido. El posterior tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) rompe el primer aminoácido (sin alterar los otros enlaces peptídicos) que queda formando un derivado de tiazolinona, el cual al tratarse con un ácido en solución acuosa genera un feniltiohidantoín (PTH)-aminoácido estable. Los PTH-derivados resultantes fueron analizados empleando una columna Nucleosil 10 C-18 (2 x 250 mm) de 5 m m de diámetro de partícula, equilibrada con un 88 % de fase móvil A (acetato sódico 7,6 mM:acetonitrilo [85:15(v/v)] pH 4,77) y un 12 % de fase móvil B (acetonitrilo). La columna fue eluída a un flujo de 1 ml·min-1 a 51ºC con el siguiente gradiente de acetonitrilo: 12 % durante 1.05 min, de 12 % a 22 % en 4.95 min, de 22 % a 31 % en 4 min, de 31 % a 33 % en 7 min, de 33 % a 35 % en 6 min y de 35 % a 90 % en 0, 15 min. El cromatograma de cada etapa era comparado automática y manualmente con un cromatograma patrón.
La secuencia se determinó en ausencia de polibreno. Las secuencia se presenta en la Tabla 1.
TABLA 1 Secuencia amino-terminal de la nigrina f
Cadena A: 1 5 10 15 Ile-Asp-Tyr-Pro-Ser-Val-Ser-Phe-Asn-Leu-Ala-Gly-Ala-Xaa-Ser-Ala- 20 Thr-Tyr-Arg-Asp-Phe-Leu-Ser-Asn Cadena B: 1 5 10 15 Asp-Gly-Glu-Thr-Xaa-Pro-Ile-Pro-Ala-Ser-Phe-Thr-Arg-Xaa-Ile-Val- 20 Gly-Arg-Asp-Gly-Leu-Xaa-Val-Asp
e) Actividad N-glucosidasa sobre el ARN
La actividad N-glucosidasa de la nigrina f se determinó como liberación del fragmento de ARN como consecuencia de la acción de la anilina en medio ácido sobre el ARN depurinado por la nigrina f. La liberación del fragmento de ARN se determinó incubando 100 m l de lisado de reticulocitos de conejo (obtenido tal y como se describirá más adelante) con 10 m g de nigrina f en una solución que contenía [MgAc2 1 mM, ditiotreitol 5 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl (pH 7,8) 20 mM], durante 15 min a 37ºC. Después el ARN se extrajo de estas mezclas de reacción con un volumen de fenol saturado de Tris-HCl 0,1 M (pH 7,8), en presencia de 2,5 mM EDTA y 1 volumen 0,5 % SDS/50 mM Tris-HCl (pH 7,6). La extracción con fenol se realizó otras dos veces y finalmente el ARN se precipitó con dos volúmenes de etanol en solución 0,3 M de acetato de sodio pH 5,2 a -80ºC durante 2 h. A continuación se trató el ARN con 1 volumen de anilina 2 M (pH 4,5) durante 10 min a 0ºC en oscuridad. La anilina se extrajo con éter dietílico (un volumen, dos veces). El ARN se precipitó a continuación con dos volúmenes de etanol y 0,3 M NaAc (pH 5,2). El análisis electroforético del fragmento liberado se realizó como sigue. El precipitado de ARN obtenido en la última etapa se resuspendió en H2O. 3 m g de ARN en tampón de electroforesis (100 mg/ml de sacarosa, 7 M de urea, 0,4 m g/ml de azul de bromofenol, Tris-HCl 89 mM (pH 8,3), ácido Bórico 89 mM, EDTA (etilen diamino tetra-acético) 25 mM (pH 8,3), se colocaron en cada uno de los pocillos del gel de poliacrilamida (4,85 % acrilamida y 0,15 % de bisacrilamida) preparado según Salustio y Stanley (J.Biol.Chem. 265, 582-588 [1990]) en un tampón que contenía Tris-HCl 89 mM (pH 8,3), ácido Bórico 89 mM y EDTA 25 mM (pH 8,3). La electroforesis se llevó a cabo a 15 mA durante 100 min en un sistema de minigeles (7 x 10 cm) (Mighty Small, Hoefer). El teñido del gel se realizó con bromuro de etidio (0,5 m g·ml-1) durante 30 min. La visualización se realizó con transiluminador de lámpara U.V. a 312 nm. Nigrina f mostró actividad N-glucosidasa.
f) Inhibición de la biosíntesis de proteínas
Los estudios de inhibición de biosíntesis in vitro de proteínas se realizaron utilizando distintos sistemas acelulares en las condiciones que se describen a continuación. Se utilizaron lisados de reticulocitos de conejo, S-30 de hígado de rata y S-30 obtenidos de germen de distintas especies vegetales (trigo, Vicia sativa L. y Cucumis sativus L.).
Para obtener un lisado de reticulocitos de conejo se parte de 4 conejos de entre 3-4 kg y se les somete a un tratamiento previo con fenilhidrazina, sustancia que impide la completa maduración de los reticulocitos. La fenilhidrazina es preparada fresca de la siguiente forma: se pesan 0,25 g y se disuelven en 7 ml de tampón fosfato sódico 5 mM (pH 7,4), conteniendo 0,14 M de NaCl. A continuación se vuelve a ajustar el pH con NaOH 0,1 N hasta pH 7-7,5 y finalmente se enrasa a 10 ml con agua tipo I. Tras filtrarse a través de una membrana de 0,22 m m se guarda en frasco de vidrio tapado en total oscuridad.
La fenilhidrazina se inyecta subcutáneamente en el lomo de los animales, 1 ml de la solución por conejo durante 5 días seguidos. Tras dos días de descanso se anestesian con 2 ml de pentotal sódico 2 g·ml-1, y se sangran seccionando la vena yugular y la arteria carótida. La sangre se recoge sobre vasos de precipitados previamente bañadas sus paredes con 1 ml de heparina al 0,05 %. Posteriormente la sangre se filtra a través de 2 gasas para limpiarla de coágulos. La sangre filtrada se centrifuga a 6000 rpm (5500 xg) durante 15 min a 2ºC en un rotor JA-14. Se retira el sobrenadante con ayuda de un sistema de vacío y se añaden al sedimento 200 ml de la solución de NaCl 130 mM, KCl 5 mM y MgCl2 7,5 mM. Tras resuspender los reticulocitos se vuelven a centrifugar en las mismas condiciones anteriores. Se desecha el sobrenadante y se vuelve a lavar otras 2 veces de la forma ya descrita. El sedimento obtenido en la última centrifugación se pesa y se le añade un volumen de solución de MgCl2 2 mM y DTT 10 mM. Con esta solución se lisan los reticulocitos agitándolos durante 10 min a 4ºC. El lisado se centrifuga a 15000 rpm (27000 xg) durante 15 min a 2ºC en un rotor JA-20. Se recoge el sobrenadante y se le añade un décimo de volumen del tampón Tris-HCl 200 mM (pH 7, 8) y KCl 0,5 M. Tras homogeneizar la mezcla se reparte en alícuotas de 300 m l y se guarda a -80ºC hasta su uso. La reacción de síntesis de proteínas se llevó a cabo en mezclas de un volumen final de 50 m l que contenía 10 m l de lisado y Tris-HCl 20 mM (pH 7,8), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Ditiotreitol 5 mM, ATP (Adenosín 5` Trifosfato) 1 mM, GTP (Guanosin 5` Trifosfato) 0,2 mM, Creatín-Fosfato 10 mM, creatín quinasa 40 m g/ml, 20 mM de Hemina, todos los aminoácidos proteicos menos L-valina 0,04 mM y L-[3H]valina 2 m Ci/ml. La reacción se incubó a 30ºC durante 20 min. La reacción de síntesis de proteínas se para con la adición de 500 m l de KOH 0,1 N (utilizado para degradar las moléculas de los aminoacil-tRNAs cargados que no se han incorporado en la cadena polipeptídica) y 30 m l de H2O2 del 30 % (v/v) para eliminar el color de las muestras. Después de 15 min se añaden 500 m l de TCA al 20 % (p/v), (para que precipiten las cadenas polipeptídicas formadas). Los precipitados proteicos son recogidos sobre filtros de fibra de vidrio (GF/A, Whatman) de 2,5 cm de diámetro, cada tubo de reacción es lavado 2 veces con 1 ml de TCA al 5 % y luego el filtro con 2 ml de etanol absoluto del 96 %. Posteriormente los filtros son secados a 120ºC durante 10 min y colocados en el interior de viales de plástico a los cuales se les añade 2 ml de líquido de centelleo (Ready Safe de Beckman).
El S-30 de hígado de rata se hizo según se describe a continuación. La rata es sacrificada bajo los efectos del pentotal sódico (100-200 mg·g-1 de peso) perfundiendo el hígado con tampón de extracción compuesto de: Tris-HCl 20 mM (pH 7,8), KCl 150 mM, MgAc2 3 mM y DTT 5 mM. El hígado, una vez extraído, se lava dos veces con el tampón de extracción de hígado, se trocea con tijeras y se homogeneiza manualmente durante 5 min manteniendo el homogeneizador en un baño de agua/hielo. Durante el proceso se añade un volumen del tampón correspondiente equivalente a cinco/cuartos el peso en gramos. El tejido homogeneizado se centrifuga a 2500 rpm (750 xg) durante 5 min a 4ºC en un rotor JA-20, tras lo cual el sobrenadante se recoge y, de nuevo, es centrifugado pero esta vez a 16000 rpm (30000 xg) 15 min a 4ºC en el mismo rotor. El sobrenadante es retirado, teniendo especial cuidado no contaminarlo con la capa superior de grasa, y a continuación es filtrado a través de una columna de Sephadex G-25 (8 x 2,5 cm) previamente equilibrada con el tampón de extracción correspondiente. El eluato no retenido se recoge en fracciones y se juntan aquellas de color más intenso. Seguidamente se reparte los extractos en alícuotas y se guardan a -80ºC hasta su uso. La reacción de síntesis de proteínas se llevó a cabo en mezclas de un volumen final de 25 m l que contenía 25 m l de S-30 de hígado de rata y Tris-HCl 20 mM (pH 7,8), KCl 50 mM, MgCl2 8 mM, NH4Cl 100 mM, Ditiotreitol 5 mM, ATP (Adenosín 5` Trifosfato) 2 mM, GTP (Guanosín 5` Trifosfato) 1 mM, CTP (Citidín 5` Trifosfato) 0,2 mM, Fosfoenolpiruvato 2 mM, Piruvato quinasa 40 m g/ml, todos los aminoácidos proteicos menos L-valina 0,1 mM y L-[3H]valina 3 m Ci/ml. La reacción se incubó a 37ºC durante 60 min. La reacción de síntesis de proteínas se para con la adición de 500 m l de KOH 0,1 N (utilizado para degradar las moléculas de los aminoacil-tRNAs cargados que no se han incorporado en la cadena polipeptídica). Después de 15 min se añaden 500 m l de TCA al 20 % (p/v), (para que precipiten las cadenas polipeptídicas formadas). Los precipitados proteicos son recogidos sobre filtros de fibra de vidrio (GF/A, Whatman) de 2,5 cm de diámetro, cada tubo de reacción es lavado 2 veces con 1 ml de TCA al 5 % y luego el filtro con 2 ml de etanol absoluto del 96 %. Posteriormente los filtros son secados a 120ºC durante 10 min y colocados en el interior de viales de plástico a los cuales se les añade 2 ml de líquido de centelleo (Ready Safe de Beckman).
El S-30 de gérmenes vegetales se hizo según Arias y cols; Planta 186, 532-540 [1992]; Arias y cols. Phytochemistry 30, 3185-3187 [1991]. Se esterilizan las semillas con lejía comercial diluida (una parte de lejía y tres de agua corriente estéril) y se aclaran abundantemente con agua corriente estéril. Una vez aclaradas las semillas se depositan en el fondo de un tarro de vidrio (previamente esterilizado en autoclave) sobre cuatro capas de papel de filtro humedecido (esterilizado en estufa a 150ºC). Todo este proceso se realiza dentro de una cabina de flujo laminar horizontal modelo Micro-H (Telstar S.A., Tarrasa). La germinación se lleva a cabo a 20ºC en oscuridad y durante 4-5 días, al cabo de los cuales resultan gérmenes de aproximadamente 1 cm, de color blanco debido a la ausencia de clorofila.
Cuando el germen alcanza el tamaño deseado se separa de la semilla mediante pinzas de cirugía y es depositado en un vaso de precipitados enfriado a 0ºC. Este proceso y todos los siguientes se realizan en condiciones libres de RNasas. Se pesan entre 4-6 gramos de germen y se lavan dos veces con agua tipo I estéril (obtenida con el equipo Milli RO-Milli Q de Millipore (Madrid)) y una vez con tampón de extracción enfriado en un baño agua/hielo. El tampón de extracción utilizado está compuesto por Tris-HCl 20 mM (pH 7,8), KCl 25 mM, MgAc2 9 mM y DTT 5 mM. El germen lavado y escurrido se coloca en un mortero de porcelana no vitrificada enfriado a -20ºC y se machaca durante unos 15 minutos, hasta que adquiere un aspecto homogéneo y brillante. Durante el proceso se añaden entre 0,2 y 0,4 ml de tampón de extracción. Todo el proceso se realiza en la cámara fría (4ºC). A continuación se centrifuga el extracto a 4000 rpm (2000 xg) durante 10 minutos a 4ºC en un rotor JA-20 de la centrífuga Beckman modelo J2-21 (Beckman instruments, INC, Palo Alto, CA, USA). Después se desecha el sedimento formado por restos de tejido vegetal y el sobrenadante se incuba durante 15 min a 0-2ºC. Seguidamente se centrifuga de nuevo, pero esta vez a 16000 rpm (30000 xg) durante 20 min a 4ºC en el mismo rotor. El sobrenadante resultante se recoge con una pipeta Pasteur evitando en lo posible la capa de grasa y se cromatografía a través de una columna de Sephadex G-25 (10 cm x 4 cm) equilibrada previamente con tampón de extracción. La elución se lleva a cabo en cámara fría. El eluato conteniendo las fracciones que muestran mayor opacidad es repartido en alícuotas de 0,2 ml, etiquetadas como S 30 y congeladas a -80ºC hasta su uso. La reacción de síntesis de proteínas se llevó a cabo en mezclas de un volumen final de 50 m l que contenía 15 m l de S-30 de germen vegetal y Tris-HCl 29 mM (pH 7,8), KCl 30 mM, Mg(AcO)2 9,8 mM, NH4Cl 28 mM, Ditiotreitol 5 mM, ATP (Adenosín 5` Trifosfato) 4 mM, GTP (Guanosín 5` Trifosfato) 1 mM, Creatín-Fosfato 8 mM, creatín quinasa 60 m g/ml, t-RNA de germen de trigo 0,4 mg/ml, todos los aminoácidos proteicos menos L-valina 0,1 mM y L-[3H]valina 7,4 m Ci/ml. La reacción se incubó a 30ºC durante 30 min. La reacción de síntesis de proteínas se para con la adición de 500 m l de KOH 0,1 N (utilizado para degradar las moléculas de los aminoacil-tRNAs cargados que no se han incorporado en la cadena polipeptídica) y 100 m g BSA para facilitar la precipitación de proteínas. Después de 15 min se añaden 500 m l de TCA al 20 % (p/v), (para que precipiten las cadenas polipeptídicas formadas). Los precipitados proteicos son recogidos sobre filtros de fibra de vidrio (GF/A, Whatman) de 2,5 cm de diámetro, cada tubo de reacción es lavado 2 veces con 1 ml de TCA al 5 % y luego el filtro con 2 ml de etanol absoluto del 96 %. Posteriormente los filtros son secados a 120ºC durante 10 min y colocados en el interior de viales de plástico a los cuales se les añade 2 ml de líquido de centelleo (Ready Safe de Beckman). Los resultados se indican en la tabla 2.
TABLA 2 Efecto de nigrina f sobre la biosíntesis de proteínas llevada a cabo por distintos sistemas acelulares | |
| Sistema acelular | IC50 (ng/ml) |
| nigrina f |
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| Lisados de reticulocitos de conejo | 1.8 |
| hígado de rata | 4.84 |
| germen de trigo | > 100000 |
| germen de Vicia sativa L. | > 100000 |
| germen de Cucumis sativus L. | > 100000 |
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IC50 indica la concentración de proteína que provoca un 50 % de inhibición de biosíntesis de proteínas en las condiciones standard de cada sistema acelular y se obtuvieron por regresión lineal de los resultados obtenidos incubando los distintos sistemas con cantidades variables de las distintas proteínas. Como control se incubaron los distintos sistemas en ausencia de proteína.
g) Relación inmunológica
La nigrina b (proteína inactivadora de ribosomas de tipo 2 aislada de corteza de Sambucus nigra) posee una fuerte actividad inmunogénica que permitió obtener anticuerpos policlonales en conejo por los procedimientos standard (Harlow y Lane "Antibodies, a laboratory manual" Cold Spring Harbor Laboratory [1988]).
Dos conejos de 3-4 kg fueron inyectados subcutáneamente en el lomo con 0,5 mg de proteína en emulsión completa de Freund y 100 mM de NaCl. Las inyecciones se repitieron a las 3 y a las 6 semanas con 0,5 mg en emulsión incompleta de Freund. Después de dos meses de la primera inyección, los conejos se anestesian con 2 ml de pentotal sódico 2 g·ml-1 y se sangran seccionando la vena yugular y la arteria carótida. La sangre se incubó durante 1 hora a 37ºC y después 12 horas a 4ºC. El suero (que contiene los anticuerpos policlonales) se separó del coágulo por centrifugación. Dicho suero se purificó por cromatografía de afinidad a través de Proteína A-Sepharosa y reaccionó fuertemente con la nigrina b.
El ensayo de la relación inmunológica se llevó a cabo mediante ELISA (Enzyme-Linked Immunospecific Assay). Básicamente se siguió el procedimiento descrito por Pérez-Maceda y cols. (1991) y Clark y cols. (1988) pero con alguna modificación. Se utilizaron placas de 96 pocillos de poliestireno con el fondo plano. Tanto las muestras a determinar como la proteína utilizada en la recta patrón se diluyeron en tampón carbonato/bicarbonato 0.1 M (pH 9.5) y se colocaron en los pocillos de forma que la concentración total de antígeno por pocillo fuera de 200 ng y el volumen total de 200 m l, completando con BSA disuelto en el mismo tampón. La recta patrón consistió en concentraciones crecientes de la proteína nigrina b abarcando desde 1 ng hasta 25 ng y completando hasta 200 ng de proteína con BSA.
Para nigrina f se añadieron las mismas cantidades crecientes desde 1 ng hasta 25 ng y completando hasta 200 ng de proteína con BSA de la misma manera que para nigrina b con objeto de comparar las dos rectas que obtengamos. El blanco fue 200 ng de BSA. Una vez añadidos los antígenos se dejaron las placas toda la noche a 4ºC.
Al día siguiente se desechó el líquido sobrenadante y se lavaron los pocillos 3 veces con 200 m l de PBS-T pH 7.4 (Na2HPO4.2H2O 8 mM, KH2PO4 1.5 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM y Tween 20 0.05 % (v/v)). Posteriormente se añadieron 200 m l de PBS-BSA (idéntico al anterior salvo que el Tween 20 fue sustituido por BSA 3 %). Se incubó durante 30 min a 37ºC, tras lo cual se repetía el proceso de lavado con PBS-T. Seguidamente se añadieron 200 m l del anticuerpo específico anti-nigrina b diluido en proporción 1/3000 en PBS-T y se incubó 1 h a 37ºC. Después se lavó como antes se indicó y se añadieron 200 m l del anticuerpo anti-conejo (anticuerpo de ratón dirigido contra anticuerpos de conejo) conjugado con la enzima fosfatasa alcalina, y diluido en proporción 1/3000 en PBS-T, tras una incubación de 1h a 37ºC se volvieron a lavar los pocillos con PBS-T. Por último se añadieron 200 m l de sustrato pNPP disuelto a una concentración de 1 mg·ml-1 en glicina 0.1 M (pH 10.4) conteniendo MgCl2 1 mM y ZnCl2 1 mM, el desarrollo del color amarillo se realizó durante 1 h a 37ºC. Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector automático Pasteur diagnostics modelo LP400.
Todas las medidas se realizaron por cuadriplicado. La reacción inmunológica de la nigrina f frente a los anticuerpos antinigrina b fue total.
h) Actividad hemaglutinante de eritrocitos
La actividad hemaglutinante de eritrocitos de la nigrina f se determinó con el siguiente ensayo:
Se preparó una solución de sangre en 0,14 M de cloruro de sodio, 5 mM de fosfato (pH 7,5) con un 1 % de eritrocitos y se añadieron 50 m l a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. A su vez se añadieron 50 m l de la solución de nigrina f a distintas concentraciones en el mismo tampón.
Nigrina f produce aglutinación total de sangre humana del grupo 0 a la concentración de 58 m g/ml y del grupo AB a 116 m g/ml.
i) Toxicidad
La toxicidad se determinó inyectando las proteínas a ratones. Se disolvieron 50 m g de nigrina f en 0,125 ml de una solución 5 mM fosfato monosódico (pH 7.5) conteniendo 0,14 M NaCl. La proteína se inyectó intraperitonealmente en ratones de 32 gramos de peso y se observó el número de supervivientes al cabo de 10 días. La supervivencia fue del 100 %.
