Procedimiento para la detección y cuantificación de toxinas diarreicas de dinoflagelados (DSP (Diarrhoetic Shellfish Poison)) basado en la inhibición de fosfatasas.
Los dinoflagelados productores de toxinas diarreicas aparecen durante ciertos períodos del año, y su proliferación da lugar a una marea roja, lo cual supone la paralización de la recogida y comercialización de los moluscos de las zonas contaminadas. La monitorización de la posible contaminación de los moluscos se realiza mediante el bioensayo, que consiste en la administración oral a ratones de un extracto de los moluscos, y la observación de los mismos durante 12 horas. La muerte de dos ratones, de tres inoculados, en menos de 12 horas supone un resultado positivo.
Este método implica el uso de una gran cantidad de ratones, lo que eleva el coste del ensayo, una gran inversión en horas laborales, y carece de sensibilidad. Además, tiene una elevada variabilidad, en función del peso de ratón, raza, etc., que se reduce algo empleando ratones con unas características concretas, por lo que su coste y limitaciones es aún mayor.
Las toxinas diarreicas (ácido okadaico, dinofisistoxinas I, II y III, y las recientemente identificadas yessotoxinas y pectenotoxinas), actúan mediante la inhibición potente y selectiva de las fosfatasas citosólicas PPI y PP2A. Estas fosfatasas han sido caracterizadas hace varios años, y su obtención en cantidades elevadas es posible, empleando fuentes ricas en fosfatasas, como son el músculo esquelético o el cerebro. El estudio in vitro del efecto inhibidor de las toxinas DSP sobre las fosfatasas ha sido por lo tanto ya descrito mediante el empleo de marcadores radioactivos, que en ningún caso se podrían utilizar para un método de detección por los problemas que plantea la radiación del fósforo, su corta vida media, el coste y el alto grado de error asociado a este procedimiento.
Las fosfatasas se pueden purificar a partir de un homogeneizado de un tejido mediante cromatografía de intercambio iónico (impulsando la fase móvil con baja presión) y sucesiva repurificación de las fracciones obtenidas que contienen las fosfatasas en cuestión. Este proceso puede prolongarse hasta la purificación total de cada enzima, aunque es muy laborioso y un proceso delicado. Las fosfatasas así obtenidas son activas y si se conservan a bajas temperaturas pueden almacenarse durante 6 meses. El proceso de purificación puede acelerarse y mejorarse mediante el empleo de sistemas que trabajen con presiones de separación medias a altas, reduciendo el tiempo y eficacia de la separación.
Las fosfatasas pueden ser utilizadas sin necesidad de alcanzar una total purificación, de forma que mantienen la sensibilidad al efecto inhibidor de las toxinas DSP pero con un menor esfuerzo y coste de purificación. Las fosfatasas enriquecidas se disponen en una fase sólida (una placa de microtitulación) y el ensayo de inhibición para determinar la presencia o no de las toxinas se realiza mediante una incubación en los pocillos de la placa de un extracto en metanol al 80% de las toxinas en presencia de una determinada cantidad de enzima. Las toxinas se determinan mediante la comparación de la actividad fosfatasa con patrones conocidos de ácido okadaico (que es la principal toxina diarreica). La forma de revelar la actividad de la toxina consiste en cuantificar el color del fosfato libre, la fluorescencia (para substratos fluorescentes) o la luminiscencia (para substratos luminiscentes) en un espectrofotómetro, fluorímetro o luminómetro, que generan los distintos tipos de substratos para la PP2A.
Las ventajas de esta técnica son:
No se necesita emplear ratones. No es necesario un período de observación de los ratones. Se suprime la falta de sensibilidad y especificidad del bioensayo. El tiempo de preparación del ensayo es de 30 minutos. El tiempo de obtención de los resultados es de 5 minutos Se pueden procesar varios cientos de muestras simultáneamente. El coste es menor que el de las técnicas que se llevan a cabo actualmente. Puede ser realizado por personal poco cualificado. No tiene los inconvenientes de otras técnicas basadas en el empleo de marcadores radioactivos o en la detección cromatográfica de las toxinas (coste, falta de repetitividad, peligro de la radioactividad, residuos). Un modo de realización de la invención:
Obtención mediante técnicas cromatográficas de fracciones enriquecidas en fosfatasa PP2A:
Se sacrifica un conejo por sobredosis de anestésico. Se aislan enteros los paquetes musculares de las patas y la espalda y se mantienen en frío. Se homogeneiza el tejido, previamente cortado, en una solución tampón (pH 7,4). El homogeneizado se centrífuga a 100.000 g durante 1 hora, y se recogen los sobrenadantes.
Este sobrenadante se carga sobre una columna de DEAE-celulosa, previamente activada, y se eluye con un gradiente de cloruro sódico entre 0 y 0,4 molar, tamponado con Tris CIH 500 mM, pH 7,4 y con glicerol al 10%.
Los picos obtenidos se detectan en un espectrofotómetro (600 nm). Se obtienen seis picos de absorbancia, de los que el segundo y el tercero están enriquecidos en PP2A. La actividad fosfatasa se comprueba determinando espectrofotométricamente (600 nm) el color generado por el fosfato liberado a partir del fosfopéptido serina/treonina. La actividad se contrasta con una recta de calibrado obtenida con fosfato libre.
Determinación de la presencia de toxinas DSP en muestras contaminadas:
El desarrollo de esta técnica se llevó a cabo utilizando, de forma independiente y con resultados similares, las siguientes fuentes de fosfatasa PP2A:
La subunidad catalítica de la proteína fosfatasa tipo-2A (PP2A) proveniente de músculo de conejo y con una pureza mayor del 70%, obtenida comercialmente. La proteína fosfatasa tipo-2A (PP2A) procedente de glóbulos rojos humanos aislado como el heterodímero formado por las subunidades A (60kDa) y B (36kDa), obtenida comercialmente. Las fracciones cromatográficas enriquecidas en PP2A obtenidas por la purificación parcial de fosfatasas a partir de músculo de conejo. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulación de 96 pocillos donde se incuba la PP2A con el tampón de reacción (Tris HCl 50 mM, pH 8,5) a 37ºC durante un tiempo de 15 minutos en un volumen de 50 - 80 m l. Una vez transcurridos los 15 minutos se añade una alícuota de distintas diluciones de extracto metanólico del molusco contaminado con toxinas DSP (el extracto obtenido se seca y resuspende en dimetilsulfóxido al 10% antes de su uso para la técnica) y se vuelve a incubar durante unos minutos a 37ºC. Para valorar la actividad PP2A se añade el substrato de la PP2A disuelto en un volumen de 150 - 180 m l de tampón Tris HCl 50 mM, pH 8,5, para dar un volumen final de 200 m l. En el caso de la técnica fluorimétrica, para revelar la actividad PP2A se añade un substrato fluorescente de la PP2A que puede ser metilumbeliferona fosfato (70 m M), o fluoresccína difosfato (30 m M). Cuando se utiliza la técnica colorimétrica se añade un substrato específico de la PP2A, como es el fosfopéptido serina/treonina, con la que se valora la liberación de fosfato libre en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
La actividad de la fosfatasa PP2A se inhibirá de forma proporcional a la cantidad de las toxinas DSP. Para la cuantificación de las toxinas DSP se emplea una recta de regresión obtenida a partir de cantidades conocidas de ácido okadaico en la que de los datos de fluorescencia o densidad óptica obtenidos en los pocillos problema se puede extraer la concentración de toxinas DSP capaces de inhibir la actividad fosfatasa. Dependiendo de que el substrato elegido produzca color, fluorescencia o luminiscencia, por la liberación del grupo fosfato, tendremos tres tipos de técnicas, no radioactivas, espectrofotométricas, luminométricas o fluorimétricas para la determinación de toxinas DSP.
Para la realización de estas técnicas, no radioactivas, se necesitan compuestos que reúnan dos características principales:
Ser buenos substratos de la fosfatasa PP2A. Que en la determinación de la actividad fosfatasa por fluorimetría, espectrofotometría o luminometría, según las características del substrato de que se trate, no interfieran los componentes de un extracto metanólico del molusco. Son substratos que reúnen estas dos características imprescindibles para la realización de un ensayo rutinario de toxinas DSP:
La 4-metilumbeliferona fosfato (4 MUP). Excitación 370 / Emisión 430. La fluoresceína difosfato (FDP). Excitación 480 / Emisión 520. El fosfopéptido serina/treonina. Lectura de la densidad óptica de la muestra en un lector de placas a una longitud de onda de 600 nm.
