Composiciones para el tratamiento de enfermedades de las plantas ocasionadas por hongos pertenecientes al género Fusarium.
Campo de la técnica
Esta invención está relacionada con el tema general del control de microorganismos patógenos y específicamente con composiciones eficaces en el tratamiento de enfermedades de las plantas ocasionadas por hongos pertenecientes al género Fusarium. Dichas composiciones contienen componentes activos diseñados bioracionalmente.
Introducción
La creciente resistencia de los microorganismos patógenos a las plantas ha llevado a la búsqueda de nuevas alternativas para combatirlos, entre las cuales se encuentran la Biotecnología (incorporando genes que imparten resistencia), el Fitomejoramiento, (vía el cruzamiento e hibridizaciones entre especies que presenten mejores y mayores propiedades agronómicas y fitopatológicas), las Prácticas Agroculturales (rotación y asociación de cultivos) y la metodología Química, a través del diseño de compuestos sintéticos o semisintéticos activos contra virus, bacterias, hongos, insectos y nemátodos.
Sin embargo, la mayoría de estos compuestos han sido obtenidos sin tener en cuenta los modelos estructurales, fisiológicos y bioquímicos que presentan tales organismos y solo recientemente se ha hecho una aproximación racional a partir del conocimiento y de la observación del posible papel que representan los metabolitos secundarios tanto en microorganismos, nemátodos, insectos, así como en las mismas plantas. No obstante el panorama general no es muy claro debido a la amplia gama de actividades que se atribuyen a esta clase de compuestos y además a los amplios estudios realizados en áreas muy diversas de la fisiología, la bioquímica, la botánica, la agronomía y la medicina humana (Hedin, P. (Ed.) "Host Plant Resistance to Pests", American Chemical Symposium Series (ACSS) # 61, Washington D.C. p. 286 (1977); Cutler, H. (Ed.) "Biologically Active Natural Products. Potential Use in Agriculture". ACSS #380, Washington D.C, p. 483 (1988); Hedin, P. (De.) "Bioregulators for Pest Control" ACSS # 276, Washignton, D.C, p. 540 (1985); Le Baron, L. (Ed.) "Biotechnology in Agricultural Chemistry", p. 367 (1987)).
A pesar de la disponibilidad de muchos pesticidas cada vez se requiere de la aplicación de mayores cantidades de ellos para tratar de contrarrestar la creciente resistencia que van adquiriendo los microorganismos patógenos, hecho que por otra parte atenta contra la estabilidad de todo el ecosistema y aún contra los seres humanos; por ello se hace necesario el diseño bioracional de nuevas moléculas que presenten mayores y mejores ventajas que los pesticidas de uso actual.
Estado de la técnica
Una alternativa hacia el diseño de pesticidas bioracionales podrían ser las fitoalexinas, un tipo de compuestos producidos por las plantas en pequeñísimas cantidades bajo situaciones de estrés físico, químico o como respuesta al ataque de microorganismos (Brooks, C.W. y Watson, D. (1985) Natural Products Report 2, 427; Brooks, C.W. y Watson, D. (1985) Natural Products Report 8, 367 (1991), habiéndose encontrado en varios estudios que algunas fitoalexinas tienen actividades antimicrobianas (Bailey, J. y Mansfield, J. (Eds.) "The Phytoalexins", Blackie, Glasgow, p. 334 (1982); Paxton, J. En " Biologically Active Natural Products. Potential Use in Agriculture", Cutler, H. (Ed.), p. 109).
La disponibilidad mediante síntesis química de tales sustancias o de análogos estructurales con mejores propiedades físicas, químicas y antimicrobianas supondría un avance hacia el logro de un nuevo tipo de pesticidas.
Un ejemplo de esta posible aproximación lo constituye el hecho de que recientemente se ha encontrado que la fitoalexina Camalexina, aislada de hojas infectadas de Camelia sativa y que tiene una actividad antimicrobiana importante, posee una estructura muy similar a la del Tiabendazol, un fungicida sintético, el cual se obtuvo después de largos y costosos ensayos de la relación existente entre la estructura y la actividad de numerosos compuestos también sintéticos (Ayer, W., Craw, P., Ma, P. y Miao, S. (1992) Tetrahedron 48, 2919).
Este ejemplo muestra que las fitoalexinas pueden constituir un modelo para la obtención por síntesis de análogos estructurales con actividad antimicrobiana, susceptibles de ser aplicados como pesticidas bioracionales; tal planteamiento fue el empleado para el presente invento, tras el aislamiento y caracterización por parte de los inventores de un nuevo tipo de fitoalexinas fenil-fenalenónicas producidos por la platanera (Musa acuminata).
Los cultivares de Platanera (Musa acuminata, Familia Musaceae), productora en sus distintas variedades del plátano comestible comercial, son afectadas por el hongo Fusarium oxisporum var. Cubense (FOC), que vive y persiste en el suelo por largo tiempo y es el causante de la enfermedad conocida como Mal de Panamá o fusariosis del plátano, caracterizada por una infección generalizada por vía vascular. Aunque la platanera es atacada por varias razas del hongo Fusarium oxysporum var. Cubensis (FOC), la raza 4 es la mas virulenta para las plantaciones de Cavendish (Gran Enana) y está presente en Taiwan, Australia, Islas Canarias, Africa del Sur y Filipinas. En Brasil, uno de los principales productores mundiales están afectadas diversas variedades, incluyendo Cavendish, no existiendo hasta ahora ningún remedio efectivo contra la enfermedad. Después de emplear varios pesticidas, entre ellos el Benlate (Registrado Dupont,) (compuesto con un 50 % de benomilo) a dosis de hasta 1000 mg/L (miligramos/litro) (dosis recomendada 500 mg/L), la enfermedad no ha podido ser controlada.
El análisis químico comparativo de los rizomas de plantas de platanera enfermas y sanas, permitió aislar en las primeras y determinar la estructura de las mismas de varias fitoalexinas, producidas de novo como parte de los mecanismos de defensa de la planta, todas ellas poseyendo un núcleo básico de fenalen-1-ona (perinaftenona). Por metodología de síntesis se prepararon dichas sustancias y varios de sus análogos estructurales.
Son el objeto de la presente invención, tanto las fenalenonas mismas, como fungicidas frente a la infección de plantas por hongos del género Fusarium, como el procedimiento de preparación de dichas fitoalexinas fenil-fenalenónicas, conteniendo un núcleo de fenalenona.
Descripción de la invención
En estas circunstancias, el objeto de esta invención es suministrar agentes fungicidas que controlan la fusariosis del plátano y de otras plantas, causada por diferentes razas de Fusarium oxysporum y especialmente la conocida como Mal de Panamá, producida por la var. Cubense raza 4.
Nosotros, los presentes inventores, hemos hecho intensivas investigaciones acerca de la actividad fungicida de los compuestos fitoalexinas y derivados que tienen la fórmula general (I) en un intento por controlar las enfermedades originadas en plantas por distintas razas del hongo Fusarium oxysporum, con una nueva clase de fungicidas.
Esta invención desarrolla compuestos fungicidas de fórmula general (I) de uso en agricultura y horticultura y el tratamiento consiste en la aplicación en la superficie de la planta o directamente en el suelo o indirectamente a través del agua de riego o por inmersión del sistema radicular de dichas sustancias a una dosis de 15-200 mg/L, pero preferiblemente entre 30-75 mg/L, lo que no excluye la posibilidad de usar concentraciones mas altas según la raza del patógeno o la variedad de la planta a tratar ni tampoco el uso de mezclas sinérgicas de compuestos de fórmula general (I) a las concentraciones activas.
Los compuestos fungicidas de fórmula general (I), pueden ir acompañados además de un soporte o vehículo sólido o líquido convencional y opcionalmente de los excipientes apropiados, además de fertilizantes orgánicos o inorgánicos, insecticidas, bactericidas, herbicidas o abonos.
Así esta invención suministra compuestos fungicidas de uso en agricultura y horticultura de fórmula general (I):
Donde: X, Y, Z, R1, R2, R3 y R4 son algunos de los radicales siguientes:
| X = H, OH, OCH3; Y = H, Ar(OH)n, Ar(OCH3); Z = H, Ar, Ar(OH), Ar(OH)(OCH3); |
| R1 = H, OH; R2 = H, OH; R3 = H, OH; R4 = H, OH. |
En los que a su vez n puede ser n = 1 ó 2; como se indica en los ejemplos de la tabla 1 para los compuestos ensayados
TABLA 1 | | | | | | | |
| Compuesto | X | Y | Z | R1 | R2 | R3 | R4 |
| | | | | | | |
| Perinaftenona (1) | H | H | H | H | H | H | H |
| Fitoalexina A (2) | OH | H | Ar-OH | H | H | H | H |
| Fitoalexina B (3) | OCH3 | H | Ar | H | H | H | H |
| Fitoalexina C (4) | OH | H | Ar | H | H | H | H |
| Fitoalexina D (5) | OH | Ar-OH | H | H | H | H | H |
Ejemplos
Ejemplo 1
Empleando como medio de cultivo un medio agar mínimo, se prepararon placas Petri con 0.1 ml de una disolución en DMSO (dimetilsulfóxido) a concentraciones de 0 mg/L (controles), 30 mg/L y 75 mg/L para cada una de las siguientes sustancias: fenalen-1-ona (perinaftenona) (1); 2-hidroxi-9-(4-hidroxifenil)-fenalen-1-ona (2) (fitoalexina A en las gráficas y Tabla 1); 2-metoxi-9-fenil-fenalen-1-ona (3) (fitoalexina B en las gráficas y tabla 1); 2-hidroxi-9-fenil-fenalen-1-ona (4) (fitalexina C en las gráficas y tabla 1) y 2-hidroxi-4(4-hidroxifenil)-fenalen-1-ona (5) (fitoalexina D en las gráficas y tabla 1). En todos los casos la proporción final de DMSO fue del 2 %.
Se tomaron 4 lotes idénticos de las preparaciones en placa de Petri anteriores y cada una de ellas se sembró con explantes de 5 mm Ø extraidos de placas que habían sido sembradas en medio mínimo con cinco días de antelación (Placas de Inicio), con cada una de las siguientes razas de hongos:
| - | Fusarium oxysporum Schlecht F. Sp. Cubense (E.F. Smith) raza 4 |
| VCG 120 (origen Islas Canarias) (FOCR4 en las gráficas) |
| - | Fusarium oxysporum Schlecht F. Sp. Cubense (E.F. Smith) raza 1 |
| VCG 125 (origen Australia) (FOCR1 en las gráficas) |
| - | Fusarium oxysporum Schlecht (saprofito) |
| (origen Islas Canarias) (FOS en las gráficas) |
| - | Alternaria sp. |
| (Origen Islas Canarias) (ALT en las gráficas) |
Todos los experimentos se realizaron en condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar y bajo condiciones controladas.
El crecimiento radial del hongo se midió a los cinco días para fenalen-1-ona (1), fitoalexina A (2) y fitoalexina B (3) y a los cuatro días para la fitoalexinas C (4) y la fitoalexina D (5). Los resultados se muestran en la Figura 1, donde están expresados como porcentaje de inhibición del crecimiento radial respecto a la media del control mediante la fórmula:
% inhibición= 100 - [(CRT/MCRC) x 100]
| donde: | CRT = crecimiento radial en el tratamiento |
| MCRC = valor medio del crecimiento radial en el control |
Como se aprecia en la Figura 1, se observa inhibición del crecimiento radial tanto a 30 mg/L como a 75 mg/L de todas y cada una de las sustancias ensayadas.
A la dosis de 75 mg/L la fenalen-1-ona (1), inhibe totalmente la germinación de las esporas de todas las razas de Fusarium ensayadas.
El diseño experimental fue completamente aleatorio y los datos del crecimiento radial se estudiaron mediante análisis de la varianza (ANOVA), utilizándose un test de rango múltiple de Duncan para la partición de las medias.
Ejemplo 2
A partir de explantes de 5 mm Ø de las Placas de Inicio (ver ejemplo 1), se prepararon suspensiones en agua destilada de esporas para cada una de las razas de hongo hasta una concentración de 100.000 esporas/ml. Alicuotas de 150 m l de esta suspensión de esporas (aprox. 15.000 esporas) se sembraron en placas de Petri preparadas como en el Ejemplo 1, pero usando una sola concentración de 30 mg/L para cada una de las sustancias: fenalenona (1); 2-hidroxi-9-(4-hidroxifenil)-fenalen-1-ona (2) (fitoalexina A en las gráficas); 9-fenil-fenalen-1-ona (3) (fitoalexina B en las gráficas); 2-hidroxi-9-fenil-fenalen-1-ona (4) (fitalexina C en las gráficas) y 2-hidroxi-4(4-hidroxifenil)-fenalen-1-ona (5) (fitoalexina D en las gráficas). En todos los casos la proporción final de DMSO fue del 2 %. Cada tratamiento se realizó por triplicado.
El tamaño del tubo germinativo de 30 esporas tomadas al azar en cada placa, se midió con un microscopio a 40 aumentos a las 18 y 46 horas de sembradas (Figura 2). Asimismo, se hizo un contaje de las esporas germinadas (Figura 3). Como se aprecia en la Figura 2, en todos los tratamientos se observó inhibición del crecimiento del tubo germinativo de los hongos, no disponiéndose de datos para el caso de Alternaria debido a que creció demasiado.
El diseño experimental fue asimismo, completamente aleatorio y los datos del crecimiento radial se estudiaron mediante análisis de la varianza (ANOVA), utilizándose un test de rango múltiple de Duncan para la partición de las medias. El análisis de varianza (ANOVA) mostró que existen diferencias significativas tanto en el efecto del tratamiento de los hongos y la concentración así como para las interacciones tratamiento X hongo, tratamiento X concentración, lo que indica la existencia de cierta especificidad de las fitoalexinas frente a cada hongo.
Como se observa en la Figura 3 sólo la fenalen-1-ona (1) inhibió la germinación de esporas.
Las medidas de control y el tratamiento a 30 mg/L para la elongación del tubo germinativo se compararon para cada hongo y compuesto, mediante un test T y los porcentajes de germinación mediante un test G.
Ejemplo 3
1.48 gr. de perinaftenona (1) disueltos en benceno, fueron adicionados lentamente a una solución de bromuro de p-metoxi-fenil-magnesio en éter (C6H5Br 1.86 gr.; Mg 1.27 gr.; éter 100 ml.), la mezcla se mantuvo en reflujo y bajo atmósfera de argón durante 3 horas; pasado este tiempo se neutralizó con HCl al 5 % y se extrajo repetidas veces con benceno. Se secó sobre MgSO4 y el filtrado llevado a sequedad en un rotavapor.
El crudo de reacción se disolvió en CH2Cl2 (50 ml.). y después de la adición de un equivalente de DDQ (diclorodicianobenzoquinona), se dejó en agitación durante 15 horas, las tres primeras a reflujo. El lavado con H2O, y el secado de la capa orgánica sobre MgSO4, dejó un crudo de reacción que fue purificado por cromatografía en columna sobre gel de sílice, obteniéndose así 9-(4-metoxifenil)-fenalen-1-ona (80 %), que mostró espectros IR, EM y RMN 1H bien definidos.
100 mg. del crudo de reacción disueltos en benceno (20 ml.) a 0ºC, fueron tratados sucesivamente con: 150 m l de una solución de t-Bu-OOH (70 % en H2O) y 150 m l de hidróxido de bencil-trimetilamonio (Tritón B, 40 % en MeOH). Después de retirar el baño de hielo la mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante tres horas. La anterior adición se repitió dos veces, con el mismo intervalo de tiempo cada una, y se dejó en agitación durante la noche. Se lavó con H2O, y la capa orgánica fue secada sobre NaSO4. La separación cromatográfica en columna sobre gel de sílice, usando n-Hexano-AcOEt (20 %), rindió 2,3-epoxi-9-(4-metoxifenil)-fenalen-1-ona (80 %), caracterizado por sus espectro de masas y de RMN 1H.Cuando 30 mg. del epoxido anterior disueltos en 4.0 ml de CH2Cl2 fueron dejados en agitación con 5 mg. de ácido p-toluen-sulfónico a temperatura ambiente y durante 24 horas se obtuvo 2-hidroxi-9-(4-metoxifenil)-fenalen-1-ona (85 %).
Ejemplo 4
65 mg de 9-(4-metoxifenil)-fenalen-1-ona, obtenido como indicado en el ejemplo 3 se disolvieron en 15 ml. de tolueno seco a -78ºC, y bajo atmósfera de argón se le adicionaron 175 m l de DIBAL [Diisobutil-Aluminio-Hidruro (1.0 M en tolueno)]. Se dejó en agitación durante 4 horas, y pasado este tiempo se neutralizó con una solución saturada de NH4Cl y se lavó con H2O (3 x 10 ml.), la capa orgánica fue secada sobre MgSO4 y el solvente llevado a sequedad en un rotavapor. La mezcla de alcoholes alílicos resultante, disueltos en acetona (4.0 ml.), y tratados con 5.0 ml. del reactivo de Jones se dejaron en agitación a temperatura ambiente; cuando la reacción se completó, 20 minutos, el crudo de reacción se purificó por el procedimiento habitual, y se obtuvo 2-hidroxi-4-(4-metoxi-fenil) fenalen-1-ona (70 %). Tratamiento de este último con tribromuro de boro en diclorometano a temperatura ambiente, dio cuantitativamente: 2-hidroxi-4-(4-hidroxifenil)-fenalen-1-ona (2)
