Campo técnico de la invención
La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de las proteínas inactivadoras de ribosomas, las cuales impiden el funcionamiento ribosómico de manera catalítica por inactivación del ácido ribonucléico. De forma mas específica, la presente invención se refiere a una pro teína denominada Petroglaucina 1 aislada de la planta Petrocoptis glaucifolia (Lag.) Boiss, con actividad N-glucosidasa del ácido ribonucléico e inhibidora de la síntesis de proteínas, a su procedimiento de obtención a partir de dicha planta y a sus diferentes utilizaciones.
Estado de la técnica anterior a la invención
En el reino vegetal existen algunas especies que contienen actividades inhibidoras de la biosíntesis de proteínas en sistemas derivados de organismos eucariontes, que son de naturaleza protéica y que a la espera de una definición bioquímica precisa se conocen con el nombre de proteínas inactivadoras de ribosomas (Gasperi-Campani y cols. Biochem. J. 186,439-441 [1980]; Gasperi-Campani y cols. J. Nat. Prod. 48, 446-454 [1985]; Ferreras y cols. Gell. Mol. Biol. 35,89-95 1[989]; Merino y cols. J. Exp. Bot. 41,67-70 [1990]; Arias y cols. Planta 186, 532-540 [1992]). Estas proteínas tienen una masa molecular (Mr) entre 20000 y 33000, son de naturaleza básica e impiden el funcionamiento ribosómico de manera catalítica por inactivación del ácido ribonucléico (Jimenez y Vázquez, Annu. Rev. Microbiol. 39, 649-672 [1985]; Roberts y Selitrennikoff, Biosc. Rep. 6,19-29 [1986]; Stirpe y Barbieri, FEBS Lett. 195 1-8 [1986]; Endo y Tsurugi, J. Biol. Chem. 262,8128-8130 [1987]; Stirpe y cols. Nucleic Acid Res. 16, 1349-1357 [1988]). El papel biológico de estas toxinas en la planta que las produce es totalmente desconocido (Roberts y Selitrennikoff Biosc. Rep. 6,19-29 [1986]). Estas proteínas son inmunológica y químicamente diferentes unas de otras aunque guardan alguna homologia secuencial en los aminoácidos del extremo amino-terminal en particular cuando las toxinas pertenecen a la misma familia botánica (Montecucchi y cols. Int. J. Peptide Protein Res. 33,263-267 [1989]). Su enorme interés reside en que se utilizan en la construcción de inmunotoxinas para terapia del cáncer (Vitetta y Uhr, Annu. Rev. Immunol. 3,197-212 [1985]; Frankel y cols. Annu. Rev. Med. 37,125-142 [1986]; Koppel. Bioconj. Chem. 1,13-23 [1990]; Lord, Plant Physiol. 85, 1-3 [1987]) y del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (Till y cols. Science 242,1166-1168 [1988]; Ghetie y cols. Bioconj. Chem. 1, 24-31 [1990]). Muy recientemente se ha encontrado que diversos miembros de este grupo de proteínas y en particular la llamada tricosantina poseen per se carácter inactivador del, virus RNA HIV-1 que es el agente etiológico del síndrome de inmunodefiencia adquirida (McGrath y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,2844-2848 [1989]; Lee-Huang y cols. FEBS Lett. 272,12-18 [1990]; Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad Sci. USA 88,6570-6574 [1991]; Zarling y cols. Nature 347,92-95 [1990]).
Dado que las proteínas son substancias antigénicas poderosas, para poder abordar cualquier tipo de terapia con ellas es necesario disponer de una batería de dichas toxinas lo mas amplia posible con el objeto de seleccionar la menos inmunorreactiva por un lado y de poder substituir la toxina o la parte tóxica de la inmunotoxina según se van desarrollando anticuerpos neutralizantes en el paciente por otro. De hecho ya se han descrito casos de resistencia inmunológica frente a ricina en la administración de inmunotoxina conteniendo ricina en el tratamiento de melanoma (Mischak y cols. Mol. Biother. 2, 104-109 [1990]). Además, no todas estas toxinas protéicas poseen la misma citotoxicidad (Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,6570-6574 [1991]).
Descripción detallada de la invención
La presente invención, tal y como indica su título, se refiere a una proteína de la planta Petrocoptis glaucifolia (Lag.) Boiss, denominada Petroglaucina 1, a un procedimiento para su obtención y a su utilización como inactivador del ácido ribonucléico e inhibidor de síntesis de proteínas.
La mencionada proteína es una toxina vegetal que, en base a sus propiedades químico-físicas y broquímicas por un lado y a su composición química y secuencia amino-terminal por otro, se clasifica dentro del grupo de las proteínas vegetales inactivadoras de ribosomas.
La Petroglaucina 1 se aisla de la planta Petrocoptis glaucifolia (Lag.) Boiss, mediante un procedimiento que se caracteriza por las siguientes etapas:
a) extraer la Petrocoptis glaucifolia (Lag.) Boiss previamente liofilizada con una solución acuosa de NaCl y NaPO4H2;
b) filtrar el extracto líquido resultante, previamente acidulado, a través de un lecho cromatográfico;
c) someter el fluido extraido a cromatografía de intercambio iónico, desechándose la parte no retenida en la columna;
d) eluir la columna, previamente lavada con soluciones acuosas de acetato sódico y fosfato monosódico con una solución de NaCl y NaPO4H2;
e) someter a cromatografía de intercambio iónico la proteína eluida en gradiente de fuerza iónica para obtener las fracciones conteniendo la Petroglaucina 1;
f) purificar la Petroglaucina 1 por cromatografía de intercambio iónico utilizando un gradiente de fuerza iónica.
La masa molecular relativa (Mr) de la Petroglaucina 1 así obtenida, determinada por el procedimiento de electroforesis en geles de poliacrilamida y por el procedimiento de exclusión molecular resultó ser de 26.700 y 25.200 respectivamente.
Por otra parte, se ha podido determinar que la Petroglaucina 1 no posee cadenas glucídicas reactivas con el sistema de detección de glicanos de Boehringer.
La composición de aminoácidos se determinó por hidrólisis ácida de la proteína y por análisis cromatográfico de los aminoácidos resultantes. Los valores se relacionan en la siguiente Tabla 1.
Tabla 1 Composición de aminoácidos de petroglaucina 1. | |
| Aminoácido | Petroglaucina 1 |
| |
| |
| Cys | 23.2 (23)* |
| Asp | 19.1 (19) |
| Thr | 18.5 (19) |
| Ser | 22.8 (23) |
| Glu | 26.5 (27) |
| Pro | 19.4 (19) |
| Gly | 23.7 (24) |
| Ala | 17.7 (18) |
| Val | 10.9 (11) |
| Met | 1.7 (2) |
| Ile | 13.2 (13) |
| Leu | 17.7 (18) |
| Tyr | 4.6 (5) |
| Phe | 5.9 (6) |
| Lys | 10.1 (10) |
| His | 2.8 (3) |
| Arg | 13.2 (13) |
| Trp | no determinado |
| |
* Entre paréntesis se indica el número más probable de restos de aminoácido. Se admite un error de ± 2 restos excepto en Cys.
Asimismo, se determinó la secuencia de aminoácidos empleando un secuenciador de proteínas, que resultó ser la que se indica a continuación:
| 1 | | 5 | 10 | 15 |
| Ile-Ser-Xxx- | Pro-G | ln-Val-Thr-Ser-Ser- | Val-Ser-Pro-Leu-Ile- | Ser- |
| 20 | | 25 | |
| Tyr-Leu-Arg- | Gly-G | ly-Gln-Gly-Pro-Ser- | Pro-Gly | |
Se ha comprobado que la Petroglaucina 1, así obtenida y caracterizada es una proteína capaz de interaccionar catalíticamente con el ácido ribonucléico y de provocar la inhibición de la biosíntesis de proteínas en sistemas derivados de organismos eucariontes, mamíferos y plantas. Sus aplicaciones más importantes son: como inactivador in vitro de ribosomas sensibles a la toxina; como inactivador in vitro del ácido ribonucléico ribosómico de plantas y mamíferos; como inhibidor de la biosíntesis de proteínas por inactivación in vivo de ribosomas de organismos eucariontes, como inhibidor de la propagación funcional in vivo y en células intactas aisladas de ácido ribonucléico, en enfermedades provocadas o mantenidas por virus cuyo contenido genético sea ácido ribonucléico (virus RNA).
Modos de realización de la invención
Los diferentes aspectos de la invención se describen con el siguiente Ejemplo ilustrativo que no pretende limitar en modo alguno la invención, cuyo alcance viene definido única y exclusivamente por la nota reivindicatoria adjunta.
Ejemplo
a) Obtención de petroglaucina 1 a partir de Petrocoptis glaucifolia;
b) Caracterización químico-física, composición y secuencia de aminoácidos amino-terminal y actividad N-glucosidasa del RNA;
c) Inhibición de la biosíntesis de proteínas.
a) Obtención de petroglaucina 1
100 g de planta total Petrocoptis glaucifolia (Lag.) Boiss liofilizada se extrajeron con 4 1 de solución 140 mM cloruro sódico y 5 mM fosfato monosódico (pH 7,2) a 4ºC durante 12 h. La pasta resultante se filtró a través de una malla para queso para eliminar los sólidos remanentes. El extracto líquido se acidificó a pH 4 con ácido acético glacial y los sólidos que aparecieron se eliminaron por centrifugación a 12400 x g durante 45 min a 0ºC. El fluido sobrenadante se filtró a través de un lecho cromatográfico de 1 x 2 cm de Sephadex G-25. El fluido eluido (aproximadamente 3,5 L) se sometió a cromatografía de intercambio iónico en S Sepharose Fast Flow (columna de 12 x 5 cm). La solución de equilibrado de columna fue acetato sódico 10 mM (pH 4,5). El fluido protéico acidificado se aplicó a la columna. La parte no retenida a la columna se desechó. A continuación la columna se lavó con una solución de acetato sódico 10 mM (pH 4,5) hasta que la absorbancia a 280 nm se redujo al mínimo. A continuación se lavó la columna con solución de fosfato monosódico 5 mM (pH 7). Los dos lavados se desecharon. Por último la columna se eluyó con solución 1 M de cloruro sódico y 5 mM de fosfato monosódico (pH 7). La proteína eluida se dializó frente a 25 1 de una solución 5 mM fosfato monosódico (pH 7). La proteína dializada se sometió a una cromatografía de intercambio iónico en gradiente de fuerza iónica en CM-Sepharose Fast Flow (columna de 15 x 1,3 cm preequilibrada con solución 5 mM fosfato monosódico (pH 7). Primero se fijó la proteína y después se aplicó el gradiente iónico consistente en 0,75 L de solución 5 mM de fosfato monosódico (pH 7) y 0,75 L de solución 400 mM de cloruro sódico. La velocidad se ajustó a 7 mL por min y se recogieron fracciones de 10 mL. Se recogieron dos grupos de fracciones: I (fracciones 21 a 33 con 130 mL aproximadamente), y II (fracciones 48 a 63 con 160 mL aproximadamente).
Las fracciones de cada grupo se juntaron. El grupo I contenía petroglaucina 1. La petroglaucina 1 se purificó por cromatografía de intercambio iónico en Fast Protein Liquid Chromatography-Mono S. Se utilizó un gradiente formado por 50 mL de solución de fosfato 5 mM (pH 7) y 50 mL de solución 100 mM de cloruro sódico y 5 mM de fosfato monosódico (pH 7). La cromatografía rindió petroglaucina 1 pura.
a) Caracterización químico-física, composición y secuencia amino-terminal de aminoácidos, actividad N-glucosidasa del r-ARN.
- Caracterización químico-física
La masa molecular relativa (Mr) se determinó por dos procedimientos, (1) electroforesis en geles de poliacrilamida y (2) cromatografía de exclusión molecular, cuyos protocolos se detallan a continuación:
(1) Protocolo de electroforesis en geles de poliacrilamida.
Se emplean geles discontinuos de poliacrilamida en presencia de SDS (dodecilsulfato sódico) siguiendo el procedimiento de Laemly (1970) con un aparato Mighty-Small II de Hoefer (San Francisco, Cal., USA) y una fuente de alimentación Promax modelo FAC-400. El procedimiento esencialmente es como se describe a continuación. Se disuelven entre 1-10 m g de las muestras en un tampón desnaturalizante que contiene 75 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 2% de SDS, 10% de glicerol y 5% de b -ME. Se hierve la muestra 90 segundos y se le añade azul de bromofenol hasta una concentración de 0,02%.. El gel consta de dos fases con distinta concentración de poliacrilamida: "el gel de compactación" que está formado con una mezcla de un 14,6% de acrilamida y un 0,4% de bisacrilamida (15% T 2,7% C), Tris-HCl 375 mM (pH 8,8), SDS 0,1%, persulfato amónico 0,1% y TEMED 0,07%, y "el gel de compactación" que está formado por 3,9% acrilamida, 0,1% bisacrilamida (4% T 2,7% C), Tris-HCl 125 mM (pH 6,8), SDS 0,1%, persulfato amónico 0,08% y TEMED 0,08%. La electroforesis se lleva a cabo en tampón Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), glicina 192 mM y SDS 0,1%, durante aproximadamente 45-60 min (el frente de azul de bromofenol sirve como testigo del proceso) a la intensidad limitante de 20 mA por gel y 20ºC de temperatura. Al finalizar la electroforesis se retiran los geles y se tienen durante 3-4 h con solución de teñido formada por 0,125% de coomassie brilliant blue R-250 en una solución al 50% de metanol y 10% de ácido acético en agua. Después se cambia el gel a un recipiente con solución de desteñido compuesta de ácido acético 7%, metanol 5% en agua, hasta que se destiñe suficientemente.
Para determinar la masa molecular aparente (Mr) de las muestras se colocan en una de las calles varios marcadores de masa molecular conocida: BSA de 68000 Daltons, L-Glutamato Deshidrogenasa de 54000 D, Alcohol Deshidrogenasa de 37000 D, Anhidrasa Carbónica de 29000 D, e Inhibidor de Tripsina 20100 D. La Mr se determina por interpolación.
El valor de Mr obtenido por este procedimiento fue de 26700.
(2) Protocolo de cromatografía de exclusión molecular.
Se inyectan 200 m g de proteína en 200 m l de tampón fosfato de sodio 5 mM (pH 6,66) que contiene NaCl 0,4 M en un sistema FPLC (Cromatografía líquida de proteínas rápida) de Pharmacia equipado con una columna Superdex 75 de Pharmacia y un detector de luz ultravioleta. La columna se equilibra previamente con fosfato de sodio 5 mM (pH 6,66) que contiene NaCl 0,4 M. La elución se hace con el mismo tampón a un flujo de 0,5 ml/min. Para determinar la masa molecular aparente (Mr) de las muestras se cromatografían varios marcadores de masa molecular conocida: BSA de 68000 Daltons, Alcohol Deshidrogenasa de 37000 D, Inhibidor de Tripsina de 20100 D, Aprotinina de 6500 D, Dextrano azul de 200000 D y tirosina de 181 D. La Mr se determina por interpolación.
El valor de Mr obtenido por este procedimiento fue de 25200.
La Petroglaucina 1 no posee cadenas glucídicas reactivas con el sistema de detección de glicanos de Boehringer, para lo cual se utilizó "el Glycan Detection Kit" de Boehringer Mannhein (Mannheim, Alemania). Se disolvieron 1-10 m g de muestra en 20 m l de tampón acetato sódico 0,1 M (pH 5,5) y se añadieron 10 mul de una disolución de metaperiodato sódico 6,67 mg. ml-1 para oxidar los grupos hidroxilo de los azúcares a grupos aldehído. A continuación se incubó durante 20 min en oscuridad a temperatura ambiente. Posteriormente el exceso de metaperiodato sódico se destruyó añadiendo 10 m l de disulfito sódico 15 mg. ml-1.
Se dejó actuar a temperatura ambiente durante 5 min. Seguidamente se añadieron 5 m l de una solución de DIG-succinil-6-ácido amidocaproico hidrazida, con lo cual se une el grupo DIG (digoxigenina) a los aldehidos de los azúcares gracias al grupo hidrazido. Se incubó 1 h a temperatura ambiente. Por último se añadieron 15 m l de tampón (Tris-HCl 300 mM (pH 8,8), 8% SDS, 40% glicerol, 20% 2-ME)), se hirvió la mezcla a 100ºC durante 2 min y se añadieron 2 m l de azul de bromofenol 0,5% (p/v). Las muestras se sometieron a electroforesis como se indica anteriormente. Posteriormente las proteínas se transfirieron a una membrana de Immobilon (Millipore) utilizando el sistema semiseco Semi-Phor modelo TE70 de Hoefer. Las muestras se separan previamente por electroferosis como se describe en el apartado anterior, pero en vez de ser teñidas se embeben durante 15 min en un tampón de transferencia compuesto por Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), glicina 192 mM, SDS 1,3 mM y 10% de metanol. El lecho de papel consiste en tres trozos de papel Whatman 3M (Whatman International Ltd., Maidstone, England) del mismo tamaño que el gel y otros tres dos milímetros más grandes por cada lado, también embebidos en el mismo tampón. La membrana de nitrocelulosa Immobilon de Millipore a la que serán transferidas las proteínas, también cortada al mismo tamaño que el gel, se humedece unos 10 segundos en metanol puro y a continuación se lava con abundante agua tipo I, tras lo cual se sumerge en tampón de transferencia durante 15 min. Una vez preparadas las capas del "sandwich" de transferencia (lecho de papel sobre y bajo la membrana), se colocan sobre uno de los electrodos, teniendo el cuidado de evitar en lo posible el estancamiento de burbujas. A continuación se coloca el segundo electrodo y se conecta a la fuente de alimentación a la intensidad limitante de 0,8 mA.cm-2 de gel durante 1 h. Tras la transferencia la membrana se incubó en el tampón de bloqueo proporcionado por el "kit", durante 30 min. Después, se lavó la membrana 3 veces durante 10 min con 50 ml de TBS pH 6,5 (Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,15 M). Seguidamente la membrana se incubó con el anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina disuelto en TBS pH 6,5 durante 1 h. Tras lo cual se lavó como antes. Finalmente, se añadió el sustrato de la fosfatasa alcalina formado por X-fosfato y NBT disueltos en tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 9,5) conteniendo MgCl. 0,05 M y NaCl 0,1 M. El desarrollo del color se efectuó sin agitación y en pocos minutos. Para parar la reacción se lavó varias veces con agua destila da. Las proteínas con azúcares en sus cadenas desarrollan un color gris oscuro lo que no ocurrió con la Petroglaucina 1.
- Composición y secuencia amino-terminal
La composición de aminoácidos se determinó hidrolizando las proteínas durante 24h, 48h y 72h a 100ºC, con 200 m l de HCl 5,7 M conteniendo b -ME al 0,05% (v/v), en tubos cerrados a vacío. Las muestras hidrolizadas se secaron al vacío en caliente, se disolvieron en tampón citrato sódico 0,2 M (pH 2,2), conteniendo norleucina 25 mM, y se aplicaron a un analizador de aminoácidos Beckman system 6000 equipado con un procesador de datos Shimadzu modelo C-R6A (Shimadzu Corporation Analytical Instruments División, Kyoto, Japón). La sensibilidad empleada en el espectrofotómetro fue tal que la escala total era de 0,1 unidades de D.O. a 440 y 570 nm. Para detectar la presencia del aminoácido cisteína una alícuota fue previamente oxidada con ácido perfórmico recién preparado (se incubó a temperatura ambiente durante 2 h una mezcla de 900 m l de ácido fórmico con 50 m l de H2O2). El tratamiento de la muestra secada consistió en añadir 25 m l de ácido fórmico y 30 m l del ácido perfórmico (previamente enfriado a 0ºC) y se incubó a 0ºC durante 2 h 30 min, tras lo cual se secó e hidrolizó durante 24 h como se explicó anteriormente.
La composición de aminoácidos así obtenida se detalla en la Tabla 1 anteriormente expuesta.
La secuencia de aminoácidos del extremo aminoterminal de las proteínas se realizó por degradación de Edman. El proceso consiste en la reacción en medio básico del reactivo de Edman (fenilisotiocianato) con el grupo amino del aminoácido del extremo amino terminal del polipéptido. El posterior tratamiento con TFA rompe el primer aminoácido (sin alterar los otros enlaces peptídicos) que queda formando un derivado de tiazolinona, el cual al tratarse con un ácido en solución acuosa genera un feniltiohidantoin (PTH)-aminoácido estable. El proceso se llevó a cabo empleando un secuenciador Knauer modelo 810, acoplado en serie a un analizador de PTH-aminoácidos Knauer (Fisher y cols., 1989). Los PTH-derivados resultantes fueron analizados empleando una columna Nucleosil 10 C-18 (2 x 250 mm) de 5 m m de diámetro de partícula, equilibrada con un 88% de fase móvil A (acetato sódico 7,6 mM: acetonitrilo [85:15 (v/v)] pH 4,77) y un 12% de fase móvil B (acetonitrilo). La columna fue eluída a un flujo de 1 ml.min-1 a 51ºC con el siguiente gradiente de acetonitrilo: 12% durante 1,05 min, de 12% a 22% en 4,95 min, de 22% a 31% en 4 min, de 31% a 33% en 7 min, de 33% a 35% en 6 min y de 35% a 90% en 0,15 min. El cromatograma de cada etapa era comparado automática y manualmente con un cromatograma patrón.
La secuencia obtenida resultó ser la siguiente:
| 1 | 5 | | 10 | |
| Ile-Ser-Xxx-Pro-Gl | n-V | al-Thr-Ser-Ser- | Val-S | er-Pro-Leu-Ile- |
| 15 | | 20 | | 25 |
| Ser-Tyr-Leu-Arg-Gl | y-Gl | y-Gln-Gly-Pro- | Ser-P | ro-Gly |
- Actividad N-glucosidasa del r-ARN
La actividad N-glucosidasa de petroglaucina 1 se determinó como liberación del fragmento de r-RNA como consecuencia de la acción de la anilina en medio ácido sobre el r-RNA depurinado.
La liberación del fragmento de r-RNA se determinó incubando ribosomas purificados de lisado de reticulocito de conejo con cantidades variables de petroglaucina 1 como se indica a continuación. 4 unidades de A260 de ribosomas purificados de lisados de reticulocitos se incubaron con 100 ng de petroglaucina 1 en solución acuosa, durante 15 minutos a 37ºC. Después el rRNA se extrajo de estas mezclas de reacción con un volumen de fenol saturado de 0,1 M Tris-HCl pH 7,8, en presencia de 1,5 mM EDTA. La extracción con fenol se realizó otras dos veces y finalmente el rRNA se precipitó con dos volumenes de etanol en solución 0,3 M Acetato sodio pH 5,2, a -80ºC durante 2 h. A continuación se trató el r-RNA con 1 volumen de anilina 2 M pH 4,5 durante 10 min a 0ºC en oscuridad. La anilina se extrajo con éter dietílico (un volumen dos veces). El r-RNA se precipitó a continuación con dos volumenes de etanol y 0,3 M NaAc (pH 5,2). El análisis electroforético del fragmento liberado se realizó como sigue. El precipitado de rRNA obtenido en la última etapa se resuspendio en agua. Se colocaron 3 m g de rRNA en tampón de electroforesis (100 mg/ml de sacarosa, 7 M de urea, 0,4 m g/ml de azul de bromofenol, Tris-HCl 89 mM (pH 8,3), ácido bórico 89 mM, EDTA 25 mM (pH 8,3) en cada uno de los pocillos del gel de poliacrilamida (4,85% acrilamida y 0,15% de bisacrilamida) preparado en un tampón que contenía Tris-HCl 89 mM (pH 8,3), ácido bórico 89 mM y EDTA 25 mM (pH 8,3). La electroforesis se llevó a cabo a 15 mA durante 1h 30 min en un sistema de minigeles (7 x 10 cm) (Mighty Small, Hoefer). El teñido del gel se realizó con 0,5 m g/ml bromuro de etidio durante 30 min. La visualización se realizó con transiluminador de lámpara U.V. a 312 nm.
3) Inhibición de la biosíntesis de proteínas por petroglaucina
Los estudios de inhibición de biosíntesis in vitro de proteínas se realizaron utilizando distintos sistemas acelulares en las condiciones standard.
Las condiciones de síntesis de proteínas fueron distintas para cada sistema y se encuentran resumidas a continuación:
Hígado de rata: Tris-HCl 20 mM (pH 7,8), KCl 50 mm, MgCl2 8 mM, NH4 Cl 100 mM, Ditiotreitol 5 mM, ATF (Adenosin 5'-Trifosfato) 2 mM, GTP (Guanosin 5'-Trifosfato) 1 mM, CTP (Citidin 5'-Trifosfato) 0,2 mM, Fosfoenolpiruvato 2 mM, Piruvato quinasa 40 m g/ml, todos los aminoácidos proteicos menos L-valina 0,1 mM y L-[3H]valina 3 m Ci/ml. La reacción de síntesis de proteínas se llevó a cabo en mezclas de un volumen final de 25 )al. La reacción se incubó a 37ºC durante 60 min.
Sistemas vegetales (Trigo, Vicia Sativa L. y Cucumis Sativus L,): Tris-HCl 29 mM (pH 7,8), KCl 30 mM, Mg(ACO)2 9,8 mM, NH4Cl 28 mM, Ditiotreitol 5 mM, ATP (Adeno sin 5'-Trifosfato) 4 mM, GTP (Guanosin 5'-Trifosfato) 1 mM, Creatin Fosfato 8 mM, creatín quinasa 60 m g/ml, t-RNA de germen de trigo 0,4 mg/ml, todos los aminoácidos proteicos menos L-valina 0,1 mM y L-[3H]valina 7,4 m Ci/ml. La reacción de síntesis de proteínas se llevó a cabo en mezclas de un volumen final de 50 m l. La reacción se incubó a 30ºC durante 30 min.
Lisado de reticulocitos de conejo: Tris-HCl 20 mM (pH 7,8), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Ditiotreitol 5 mM ATP (Adenosin 5'-Trifosfato) 1 mM, GTP (Guanosin 5'-Trifosfato) 0,2 mM, Creatín-Fosfato 10 mM, creatín quinasa 40 m g/ml, 20 mM de Hemina, todos los aminoácidos proteicos menos L-valina 0,04 mM y L-[3H]valina 2 m Ci/ml. La reacción de síntesis de proteínas se llevó a cabo en mezclas de un volumen final de 50 m l. La reacción se incubó a 30ºC durante 20 min.
Escherichia coli: Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), Mg(AcO)2 10 mM, NH4Cl 80 mM, Ditiotreitol 5 mM, ATP (Adenosin 5'-Trifosfato) 1 mM, GTP (Guanosin 5'-Trifosfato) 0,02 mM, CTP (Citidín 5-Trifosfato) 0,02 mM, Fosfoenol piruvato 5 mM, Piruvato quinasa 30 m g/ml, t-RNA de E. coli 0,1 mg/ml, todos los aminoácidos proteicos menos L-Metionina 0,05 mM, L-[35S] Met 1.48 m Ci/ml, 1 m l de polisomas y 1 m l de S-100. La reacción de síntesis de proteínas se llevó a cabo en mezclas de un volumen final de 50 m l. La reacción se incubó a 37ºC durante 15 min.
La reacción de síntesis de proteínas se para con la adición de 500 m l de KOH 0,1 N (utilizado para degradar las moléculas de los aminoacil-tRNAs cargados que no se han incorporado en la cadena polipeptídica). Después de 15 min se añaden 500 m l de TCA al 20% (p/v), (para que precipiten las cadenas polipeptídicas formadas). Los precipitados proteicos son recogidos sobre filtros de fibra de vidrio (GF/A, Whatman) de 2,5 cm de diámetro, cada tubo de reacción es lavado 2 veces con 1 ml de TCA al 5% y luego el filtro con 2 ml de etanol absoluto del 96%. Posteriormente los filtros son secados a 120ºC durante 10 min y colocados en el interior de viales de plástico a los cuales se les añade 2 ml de líquido de centelleo (Ready Safe de Beckman).
En el caso de lisado de reticulocitos de conejo se añade 30 m l de H2O2 del 30% (v/v) para eliminar el color de las muestras. En el caso de sistemas vegetales y de Escherichia coli se añadió después del KOH 100 m g BSA para facilitar la precipitación de proteínas.
La radiactividad incorporada se determinó en un contador de centelleo Beckman modelo LS1710.
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 2:
Tabla 2 Efecto de petroglaucina 1 sobre la biosíntesis de proteínas llevada a cabo por distintos sistemas celulares | |
| Sistema acelular | IC50 (ng/ml) |
| |
| |
| Lisados de reticulocitos | 6 |
| de conejo | |
| Higado de rata | 540 |
| Gérmen de trigo | 900 |
| Gérmen de Vicia sativa L. | 1470 |
| Gérmen de Cucumis sativus L. | 6560 |
| Escherichia coli | > 31600 |
| |
IC50 indica la concentración de proteína que provoca un 50% de inhibición de biosíntesis de proteínas en las condiciones standard de cada sistema acelular.
