MÉTODO PARA LA CONSERVACIÓN DE CEPAS MICROALGALES EN UN MEDIO
SEMISÓLIDO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se enmarca en el campo de los procesos de conservación de microorganismos. Más concretamente, el objeto de la invención se refiere a un método para la conservación de cepas microalgales en un medio semisólido que prolongue la viabilidad de estas células para su posterior uso y crecimiento.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las microalgas son microorganismos unicelulares fotosintéticos altamente eficientes en la fijación de dióxido de carbono, así como en la generación de materia orgánica ("biomasa") a partir de energía solar. Además, presentan una rápida tasa de reproducción en cultivo líquido (1-10 días) , tolerancia a condiciones extremas, alto contenido lipídico (más del 50% en peso en algunos casos) , bajos requerimientos de sustrato y espacio para su cultivo, plasticidad metabólica, capacidad de sintetizar y secretar algunos metabolitos, y posibilidad de manipulación genética.
Las excelentes propiedades de estos microorganismos han desencadenado un creciente interés en los campos de la bioingeniería, la biomedicina, y la biotecnología. En concreto, para la producción de biocombustibles, biofertilizantes, biocompuestos (ácidos grasos, pigmentos, vitaminas, antibióticos, etc.) , nutracéuticos, y piensos para ganado y acuicultura, la depuración de aguas residuales, la absorción de CO2 , y el desarrollo de cosmética orgánica. Para que estos usos sean viables a escala industrial, se requiere, no solo una producción masiva que preserve la integridad genética y características funcionales de las microalgas, sino también que se descubran y valoricen un mayor número de especies. Ello acentúa la importancia de los métodos de preservación a largo plazo de líneas celulares puras, pues una alteración genética puede conducir a cambios en la productividad y bioactividad de la cepa de microalga en cuestión.
Aunque existen un amplio abanico de técnicas que permiten mantener viables a las células con el fin de que estén disponibles en un estado biológicamente activo en el futuro, en el aso concreto de las microalgas, es un tema complejo. Esto se debe a la presencia de pared celular de algunas cepas, así como una fisiología específica casi para cada género según se adapten a entornos salinos, dulces o con escasos recursos hídricos.
El subcultivo en medio líquido es el método más primitivo para mantener cultivos de microalgas. Consiste en la transferencia periódica y secuencial de una alícuota de cultivo algal conteniendo células a un tubo o matraz que contiene medio líquido fresco diluido. Esta dinámica permite mantener las células viables durante largos periodos de tiempo, con un bajo coste tanto a nivel técnico como económico, pues únicamente se requiere medio de cultivo fresco, matraces y un entorno aséptico. Sin embargo, este método aumenta el riesgo de contaminación microbiana del cultivo y de mutaciones en las microalgas, lo que genera cambios fenotípicos y aumenta la probabilidad de perder la bioactividad de interés. Por ello, el uso de este método debería restringirse al mantenimiento de cultivos a corto plazo (p. ej. como inóculos para el desarrollo de experimentos puntuales) , pero no para la preservación de las estirpes a largo plazo por los riesgos que conlleva.
En 1954, Daily y McGuire introdujeron la liofilización como método de conservación de cepas microalgales a medio-largo plazo, consistente en la extracción del agua de las células mediante sublimación. Con el paso de los años, se ha modificado para incluir tres fases: congelación, secado primario y secado secundario. Los cultivos se someten primero a temperaturas de alrededor de -40 °C en la fase de congelación. Después, a vacío durante un máximo de 2 horas para inducir la sublimación y eliminar la humedad. Y, por último, se deshidratan aún más en la fase de secado secundario elevando la temperatura a 0 °C y terminando con la inmersión en una atmósfera de gas inerte como el nitrógeno. Los cultivos conservados de esta manera son estables a temperatura ambiente y son altamente resistentes a la contaminación bacteriana y fúngica debido a su bajo grado de humedad. Además, el pequeño volumen requerido por los cultivos liofilizados permite utilizar los recursos de manera eficiente al reducir el espacio de almacenamiento, el uso de energía, y los costes de transporte. Como desventajas, se ha observado que la viabilidad celular disminuye a medida que aumenta la duración del almacenamiento y que este método de preservación no es adecuado para microalgas con un alto contenido lipídico -posiblemente debido a la oxidación química o la actividad bacteriana- o flageladas, como es el caso de las haptófitas (Haptophyta o Pr y mnesiophyta) , por tratarse de células móviles y crecer en ambientes salinos.
Estas desventajas condujeron a la aplicación de la criopreservación en la conservación de cepas microalgales a medio-largo plazo. Este método consiste en someter y mantener un inóculo del cultivo microalgal a una temperatura muy reducida (comprendida entre -70 °C y -195 °C) , generalmente en presencia de un agente crioprotector para evitar la formación de cristales de hielo que puedan dañar las células (glicerol, sacarosa, etc.) . A estas temperaturas tan bajas, todos los procesos bioquímicos dentro de las células se detienen, dejando a las mismas en un estado de reposo. A diferencia de la liofilización, la criopreservación sí es aplicable a las microalgas flageladas, encontrándose varios ejemplos de ello en el estado de la técnica [véase Kihika, J.K., et al. Sci. Rep., 2022, 12 (1) , p. 646; Rhodes, L., et al. Cr y obiology, 2006, 52 (1) , p. 152-156].
En base a este estado de la técnica, y dada la subida del coste de la energía eléctrica y la agudización de los efectos del cambio climático, surge la necesidad de desarrollar un método de conservación de cepas microalgales a largo plazo sostenible desde un punto de vista medioambiental, con un mínimo consumo de energía, coste y mano de obra sin que ello afecte a la viabilidad celular.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra diluciones seriadas de la microalga flagelada C. rntalis cultivada en placas Petri con 0, 15% o 0, 2% de agar y f/2 (30 PSU) como medio de cultivo para la obtención de colonias aisladas, donde las condiciones de cultivo para las placas Petri de la hilera superior son: (1) 0, 15% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/1, (2) 0, 15% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/10, (3) 0, 15% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/100, (4) 0, 15% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/1000, (5) 0, 15% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/10000, y donde las condiciones de cultivo para las placas Petri de la hilera inferior son: (1) 0, 2% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/1, (2) 0, 2% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/10, (3) 0, 2% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/100, (4) 0, 2% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/1000, (5) 0, 2% agar, medio f/2, 30 PSU, dilución: 1/10000.
La Figura 2 muestra el crecimiento en diámetro de C. rntalis cultivada en placas Petri con proporciones variables de agar técnico a 0, 0% v/v, 0, 1% v/v, 0, 2% v/v, 0, 3% v/v, 0, 4% v/v, 0, 5% v/v, 0, 6% v/v, 0, 7% v/v, 0, 8% v/v, 0, 9% v/v y 1, 0% v/v, respectivamente.
La presente invención se refiere a un método que permite mantener cepas microalgales, preferentemente flageladas, en medio semisólido con agentes gelificantes de manera que puedan ser viables para su posterior recuperación en medio líquido de cultivo. Dados los costes de la energía y la exigencia por encontrar procedimientos sostenibles que, además, prolonguen la viabilidad celular, este tipo de conservación de microalgas resulta una mejor alternativa que la criopreservación. De esta manera se evitan problemas por pérdida de viabilidad.
El método de la invención permite mantener el cultivo de microalgas durante tiempos prolongados mayores a los reportados en documentos del estado de la técnica, con una menor variabilidad de poblaciones y una reducción de la mano de obra y coste de dichos mantenimientos. Además, puede ser utilizado para el transporte a temperatura ambiente, y facilita la reproducibilidad de bioprocesos basados en microalgas, particularmente microalgas flageladas, al preservar la estabilidad metabólica original de las células.
Así, la presente invención se refiere a un método para la conservación de una cepa microalgal, caracterizado por que comprende la realización de los siguientes pasos:
a) disponer un primer recipiente de cultivo, donde dicho recipiente contiene un medio de cultivo microalgal semisólido que comprende una concentración de agar entre 0, 1-1, 0% v/v;
b) depositar una cepa microalgal sobre el medio de cultivo microalgal semisólido; e c) incubar la cepa microalgal depositada sobre el medio de cultivo microalgal semisólido a una temperatura comprendida entre los 15-30°C y bajo una irradiación incidente de 40-400 ^mol m-2 s-1 con un fotoperiodo de entre 16:8 a 8:16 (luz: oscuridad) durante un tiempo entre 7-30 días.
Transcurrido el periodo de tiempo indicado en la etapa (c) (es decir, una vez transcurridos los 30 días) , el método puede incluir opcionalmente una etapa (d) , de tomar células adaptadas al cultivo en agar, resuspender en medio líquido y repetir la operación descrita en las etapas (a) a (c) .
En un modo de realización de la invención, la cepa microalgal que se deposita sobre el medio de cultivo microalgal semisólido en la etapa (b) del método de la invención procede de un cultivo en suspensión, donde el cultivo en suspensión es un cultivo en suspensión de la microalga que se quiere conservar. En la etapa (b) el paso de depositar la cepa microalgal sobre el medio de cultivo semisólido se realiza por cualquier técnica o por ualquier medio conocido para el experto en la materia, y adecuado para la formación de colonias individuales. Así, en modos particulares de realización de la invención, un volumen relativamente pequeño de líquido (por ejemplo, pero no limitado a, 0.1-1.0 mL) que contiene un número conocido o un número desconocido de microalgas se esparce sobre la superficie de una placa de agar, creando una placa esparcida, o se deposita de forma discreta en forma de gotas individuales.
En el ámbito de interpretación de la presente invención, se entenderá por "microalga" cualquier microorganismo unicelular procariota o eucariota capaz de realizar fotosíntesis oxigénica. Por tanto, las cianobacterias se considerarán incluidas bajo dicho término en la presente invención. En el ámbito de interpretación de la presente invención, se entenderá por "cepa microalgal", al grupo de microalgas que pertenecen a la misma especie pero que comparten ciertas características genéticas que no se encuentran en otros miembros de dicha especie.
En una realización particular del método de la invención, la cepa microalgal depositada en el paso b) sobre el medio de cultivo microalgal semisólido es una cepa microalgal flagelada. En modos particulares de realización de la invención la microalga flagelada es una microalga haptófita. En modos particulares de realización de la invención, la microalga es una microalga del género que se selecciona del grupo que consiste en Chr y sochromulina, Chlorella, Chr y sotila, Emiliania, Ankistrodesmus, Haematococcus, Pavlova, Scenedesmus, Amphidinium, Euglena, Coelastrum, Chlamydomonas, Odontella, Closterium, Dunaliella, Pediastrum, Oscillatoria, Tetraselmis, Rhodomonas, Desmodesmus, Pr y mnesium, Micractinium, Golenkinia, Phormidium, Isochr y sis, Botr y ococcus, Arthrospira, Nitzschia, y combinaciones de los mismos. En una realización particular del método de la invención, la microalga es una microalga del género Chr y sochromulina. En modos particulares de realización de la invención, la microalga es una microalga de la especie que se selecciona del grupo que consiste en Chlorella acuminata, Chlorella antarctica, Chlorella vulgaris var. autotrophica, Chlorella bacteroidea, Chlorella botr y oides, Chlorella chlorelloides, Chlorella colonialis, Chlorella conglomerata, Chlorella ellipsoidea f. antarctica, Chlorella elongata, Chlorella faginea, Chlorella vulgaris f. globosa, Chlorella godinezii, Chr y sochromulina acantha, Chr y sochromulina adriatica, Chr y sochromulina ahrengotii, Chr y sochromulina alifera, Chr y sochromulina andersonii, Chr y sochromulina apheles, Chr y sochromulina bergenensis, Chr y sochromulina palpebralis f. bisquamata, Chr y sochromulina brachycylindra, Chr y sochromulina camella, Chr y sochromulina campanulifera, Chr y sochromulina cyathophora, Chr y sochromulina cymbium, Chr y sochromulina discophora, Chr y sochromulina elegans, Chr y sochromulina ephippium, Chr y sochromulina fragilis, Chr y sochromulina inornamenta, Chr y sochromulina lanceolata, Chr y sochromulina latilepis, Chr y sochromulina leadbeateri, Chr y sochromulina mactra, Chr y sochromulina mantoniae, Chr y sochromulina megacylindra, Chr y sochromulina microcylindra, Chr y sochromulina chiton var. minuta, Chr y sochromulina novae-zelandiae, Chr y sochromulina orbiculata, Chr y sochromulina pachycylindra, Chr y sochromulina palpebralis f. palpebralis, Chr y sochromulina papillata, Chr y sochromulina parva, Chr y sochromulina pelagica, Chr y sochromulina planisquama, Chr y sochromulina pontica, Chr y sochromulina pringsheimii, Chr y sochromulina pseudolanceolata, Chr y sochromulina pyramidosa, Chr y sochromulina quadrikonta, Chr y sochromulina rotalis, Chr y sochromulina simplex, Chr y sochromulina spinifera, Chr y sochromulina strobilus, Chr y sochromulina tenuispina, Chr y sochromulina tenuisquama, Chr y sochromulina throndsenii, Chr y sochromulina tobinii, Chr y sochromulina vexillifera, Amphidinium aculeatum, Amphidinium acutissimum, Amphidinium acutum, Amphidinium adriaticum, Amphidinium akanensis, , Amphidinium aloxalocium, Amphidinium asymmetricum, Amphidinium aureum, Amphidinium belauense, Amphidinium bipes, Amphidinium boekhoutensis, Amphidinium caerulescens, Amphidinium carbunculus, Amphidinium carterae, Amphidinium celestinum, Amphidinium coeruleum, Amphidinium conradii, Amphidinium conus, Amphidinium corallinum, Scenedesmus armatus var. major, Scenedesmus brasiliensis var. major, Scenedesmus lefevrei var. manguinii, Scenedesmus matebae, Scenedesmus acuminatus f. maximus, Scenedesmus quadricauda var. microspina, Scenedesmus quadricauda f. minor, Scenedesmus parisiensis f. minus, Scenedesmus mirificus, Scenedesmus monomorphus, Scenedesmus morzinensis, Scenedesmus multispina, Scenedesmus multistriatus, Scenedesmus muzzanensis, Scenedesmus naegelii, Scenedesmus disciformis f. obiciturus, Scenedesmus obliquus f. tetradesmoides, Isochr y sis galbana, Isochr y sis litoralis, Isochr y sis maritima, Isochr y sis nuda, Isochr y sis zhanjiangensis, Arthrospira amethystina, Arthrospira ardissonei, Arthrospira argentina, Arthrospira balkrishnanii, Arthrospira brevis, Arthrospira miniata var. constricta, Arthrospira gomontiana var. crassa, Arthrospira desikachar y iensis, Arthrospira gomontiana, Arthrospira jenneri var. platensis, Arthrospira jenneri, Arthrospira joshii, Arthrospira khannae, Arthrospira laxissima, Arthrospira margaritae, Arthrospira massartii var. indica, Arthrospira massartii, Arthrospira miniata, Arthrospira pellucida, Arthrospira platensis var. tenuis, Arthrospira platensis var. non-constricta, Arthrospira platensis, Arthrospira santannae, Arthrospira skujae, Arthrospira spirulinoides f. tenuis, Arthrospira tenuis, Chlamydomonas lundii, Chlamydomonas korschikoffii var. macrochloris, Chlamydomonas macroplastida, Chlamydomonas incerta var. macropyrenoidosa, Chlamydomonas macropyrenoidosa, Chlamydomonas macrostellata var. gallica, Chlamydomonas macrostellata, Chlamydomonas macrostigma, Chlamydomonas globosa var. maculata, Chlamydomonas maderaspatana, Chlamydomonas madraspatensis, Chlamydomonas magnusii, Chlamydomonas magurensis, Chlamydomonas pila f. maior, Chlamydomonas moewusii var. major, Chlamydomonas pseudopulsatilla var. major, Chlamydomonas manshurica, Chlamydomonas maramuresensis, Chlamydomonas marsupium, Chlamydomonas marvanii, Chlamydomonas matwienkoi, Chlamydomonas mediostigmata, Chlamydomonas melanospora y combinaciones de las mismas. En modos particulares de realización de la invención, la microalga del género Chr y sochromulina es una microalga de la especie que se selecciona del grupo que consiste en Chr y sochromulina acantha, Chr y sochromulina adriatica, Chr y sochromulina ahrengotii, Chr y sochromulina alifera, Chr y sochromulina andersonii, Chr y sochromulina apheles, Chr y sochromulina bergenensis, Chr y sochromulina palpebralis f. bisquamata, Chr y sochromulina brachycylindra, Chr y sochromulina brevifilum, Chr y sochromulina camella, Chr y sochromulina campanulifera, Chr y sochromulina cyathophora, Chr y sochromulina cymbium, Chr y sochromulina discophora, Chr y sochromulina elegans, Chr y sochromulina ephippium, Chr y sochromulina ericina, Chr y sochromulina fragilis, Chr y sochromulina hirta, Chr y sochromulina inornamenta, Chr y sochromulina lanceolata, Chr y sochromulina latilepis, Chr y sochromulina leadbeateri, Chr y sochromulina mactra, Chr y sochromulina mantoniae, Chr y sochromulina megacylindra, Chr y sochromulina microcylindra, Chr y sochromulina chiton var. minuta, Chr y sochromulina novae-zelandiae, Chr y sochromulina orbiculata, Chr y sochromulina pachycylindra, Chr y sochromulina palpebralis f. palpebralis, Chr y sochromulina papillata, Chr y sochromulina parva, Chr y sochromulina pelagica, Chr y sochromulina planisquama, Chr y sochromulina polylepis, Chr y sochromulina pontica, Chr y sochromulina pringsheimii, Chr y sochromulina pseudolanceolata, Chr y sochromulina pyramidosa, Chr y sochromulina quadrikonta, Chr y sochromulina rotalis, Chr y sochromulina simplex, Chr y sochromulina spinifera, Chr y sochromulina strobilus, Chr y sochromulina tenuispina, Chr y sochromulina tenuisquama, Chr y sochromulina throndsenii, Chr y sochromulina tobinii, Chr y sochromulina vexillifera, y combinaciones de las mismas. En una realización particular del método de la invención, la microalga del género Chr y sochromulina es la microalga Chr y sochromulina rotalis.
Tal y como se define en el contexto de la presente invención, el término "medio de cultivo microalgal semisólido" se refiere a cualquier formulación de nutrientes adecuada más un agente gelificante. Es decir, el término "medio de cultivo microalgal semisólido" se refiere cualquier solución que comprende los nutrientes necesarios para promover y sustentar, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de microalgas, donde dicha solución se mezcla con un agente gelificante. En el contexto de la presente invención, el agente gelificante es preferiblemente agar, aunque también es posible usar, de manera no limitante, otros agentes gelificantes tales como polisacáridos del ácido glucurónico con ramnosa y glucosa y grupos O-acetil, goma gellan (Phytagel™, Gelzan™) , etcétera. La solución del medio de cultivo puede ser uno cualquiera de los medios de cultivo líquido microalgales divulgados en Andersen, R. A. Algal cultunng techniques; Elservier: Amsterdam, The Netherlands, 2005. A modo de ejemplo, los medios de cultivo f/2 (Guillard & Ryther 1962, Guillard 1975) , L1 (Guillard & Hargraves 1993) y/o variaciones de los mismos podrían ser adecuados para este uso, tales como f/2, L1, K, ALGAL, Walne, BG, TAP y MM-F. En el contexto de la presente invención, el medio de cultivo se puede utilizar en agua dulce (0-0, 5 PSU) , en agua salobre (0, 5-30 PSU) , o en agua salada (30-50 PSU) , teniendo que adecuar la salinidad del medio de cultivo al tipo de microalga. Así, los valores de PSU pueden variar entre 0 y 50, dependiendo de lo halófilas o no que sea la microalga de estudio deseada. En el contexto de la presente invención, el término "PSU" (unidades prácticas de salinidad) se refiere a la relación de la conductividad de una muestra de agua de mar con respecto a la de una solución estándar de cloruro potásico (KCl) .
En una realización particular del método de la invención, se dispone un primer recipiente de cultivo que contiene un medio de cultivo microalgal semisólido que comprende una concentración de agar entre 0, 1-1, 0% v/v, de entre 0, 15-0, 8% v/v, o de entre 0, 2-0, 4% v/v. En modos particulares de realización, la concentración de agar en el primer recipiente de cultivo es de 0, 10% v/v, de 0, 15% v/v, de 0, 20% v/v, de 0, 25% v/v, de 0, 30% v/v, de 0, 35% v/v, de 0, 40% v/v, de 0, 45% v/v, de 0, 50% v/v, de 0, 65% v/v, de 0, 70% v/v, de 0, 75% v/v, 0, 80% v/v, de 0, 85% v/v, de 0, 90% v/v, de 0, 95% v/v, o de 1, 00% v/v. En un modo preferido de realización de la presente invención, la concentración de agar en el primer recipiente de cultivo es de 0, 3% v/v.
En el contexto de la presente invención, el término "primer recipiente de cultivo" se refiere, sin estar limitado a, a una placa de Petri estándar, una placa Petri de pozo profundo, una placa Petri cuadrada, una placa Petri compartimentada, una placa multipocillo, un tubo de ensayo, o similar.
Tal y como se usa en el contexto de la invención, el término "irradiación incidente" o "radiación incidente" se refiere a la iluminación a la que son sometidas las células de la epa de microalga, donde la radiación incidente se puede producir en un amplio rango de longitudes de onda (350-1000 nm) , teniendo en cuenta que las longitudes de onda en los que emita el foco luminoso debe ser luz fotosintéticamente aprovechable (400-700 nm) . En el contexto de la invención, la iluminación bajo la que se incuba la cepa microalgal, en unidades PPFD (acrónimo inglés para Photosynthetically Photon Flux Density/ Densidad de flujo de fotones fotosintéticos) , es de 40-400 ^m o lm '2 s_1, de 50-300 ^m o lm '2 s_1, de 60-200 ^m o lm '2 s_1, de 70-150 ^m o lm '2 s_1, o de 80-100 ^m o lm '2 s_1. En modos particulares de realización, la iluminación, en unidades PPFD, es de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350, o 400 ^m o lm '2 s_1. En un modo particular de la invención, la iluminación, en unidades PPFD, es de 80-100 ^mol m"2 s_1. En modos particulares de realización de la invención, la iluminación se aporta con tubos fluorescentes, tubos incandescentes de halogenuros metálicos, diodos emisores de luz (LEDs) , o cualquier combinación posible de los mismos. Los LEDs pueden ser mono- o multi-color, en distintos formatos como luminarias, tiras o clústeres. En modos particulares de realización de la invención, la irradiación se aporta con tubos fluorescentes de 58W.
En el ámbito de interpretación de la presente invención, se entenderá por "fotoperiodo" la relación entre las horas de luz y de oscuridad a las que es expuesta la cepa microalgal en el método de la presente invención. En modos particulares de realización de la invención, el fotoperiodo está en el rango de entre 16:8 a 8:16 (luz: oscuridad) , de entre 15:9 a 9:15 (luz: oscuridad) , de entre 14:10 a 10:14 (luz: oscuridad) , o de entre 13:11 a 11:13 (luz: oscuridad) . En modos particulares de realización, el fotoperiodo es 16:8 (luz: oscuridad) , 15:9 (luz: oscuridad) , 14:10 (luz: oscuridad) , 13:11 (luz: oscuridad) , 12:12 (luz: oscuridad) , 11:13 (luz: oscuridad) , 10:14 (luz: oscuridad) , 9:15 (luz: oscuridad) , o 8:16 (luz: oscuridad) . En un modo preferido de realización de la invención, el fotoperiodo es de 12:12 (luz: oscuridad) .
En otra realización preferente de la invención, la temperatura de incubación en el paso c) del método de la invención es de entre 15-30 °C, de entre 15-25 °C, de entre 16-22 °C, o de entre 17-19 °C. En modos particulares de realización de la presente invención, la temperatura de incubación en el paso c) del método de la invención es de 15 °C, de 16 °C, de 17°C, de 18 °C, de 19 °C, de 20 °C, de 21 °C, de 22 °C, de 23 °C, de 24 °C, de 25 °C, de 26 °C, de 27 °C, de 28 °C, de 29 °C, o de 30 °C. En una realización preferida del método de la invención, la temperatura de incubación en el paso c) es de 18 °C.
En modos de realización particulares de la presente invención, la incubación de la cepa microalgal durante la etapa (c) se lleva a cabo durante un tiempo de entre 7-30 días. En realizaciones particulares de la invención, la incubación de la cepa microalgal durante la etapa (c) se lleva a cabo durante un tiempo de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 días.
En modos de realización del método de la invención, el método comprende adicionalmente:
i. aislar y resuspender al menos una colonia microalgal amplificada durante la etapa (c) en un segundo recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo de mantenimiento para obtener un cultivo primario de microalgas;
ii. preparar al menos un escalado sucesivo mediante la inoculación del cultivo primario en al menos un tercer recipiente de cultivo, para generar inóculo adecuado para el volumen final de al menos un fotobiorreactor;
iii. inocular al menos un fotobiorreactor.
Las etapas i-iii del método se realizan preferiblemente bajo agitación contante, ya que la agitación constante favorece el intercambio de materia entre el medio y el aire y mejora la mezcla en el interior del cultivo.
En un modo concreto de realización del método de la invención, dicho método comprende adicionalmente:
i. aislar y resuspender al menos una colonia microalgal amplificada durante la etapa (c) en un segundo recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo de mantenimiento para obtener un cultivo primario de microalgas; e incubar el cultivo primario de microalgas a una temperatura comprendida entre los 15-30 °C bajo agitación constante y una irradiación incidente de 40-400 ^mol m'2 s_1 durante un tiempo entre 5-10 días;
ii. preparar al menos un escalado sucesivo mediante la inoculación del cultivo primario en al menos un tercer recipiente de cultivo, para generar inóculo adecuado para el volumen final de al menos un fotobiorreactor; e incubar el al menos un escalado sucesivo a una temperatura comprendida entre los 15-30 °C bajo agitación constante y una irradiación incidente de 40-400 ^mol m"2 s_1 durante un tiempo entre 5-10 días;
iii. inocular al menos un fotobiorreactor; e incubar el cultivo en el fotobiorreactor a una temperatura comprendida entre los 15-30 °C bajo agitación constante y una irradiación incidente de 40-400 ^m o lm -2s-1 durante un tiempo entre 5-10 días;
En el contexto de la invención, el término "cultivo primario" hace referencia al cultivo inicial en volumen reducido (por ejemplo, pero no limitado a, 10-25 ml de medio de cultivo) al seleccionar una colonia individual crecida en una placa, antes de realizar un cultivo en mayor escala (por ejemplo, pero no limitado a, 50-2000 ml de medio de cultivo) . En un modo de realización particular de la presente invención, el cultivo primario es un cultivo semilla. El término "cultivo semilla" proviene de la expresión original en inglés "seed culture" (o también "starter culture") . En el ámbito de interpretación de la presente invención, se entenderá por "medio de cultivo de mantenimiento" cualquier solución que contenga los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de temperatura e iluminación, el crecimiento de microalgas. En particular, dicho medio de cultivo de mantenimiento es apropiado para la realización de un cultivo primario o cultivo semilla (en inglés "starter culture") . Los medios de cultivo ya indicados anteriormente para el crecimiento de una microalga pueden ser adecuados para esta etapa del método de la invención. Así, a modo de ejemplo, los medios de cultivo f/2 (Guillard & Ryther 1962, Guillard 1975) , L1 (Guillard & Hargraves 1993) y/o variaciones de los mismos podrían ser adecuados para este uso.
En el contexto de la invención, el término "segundo recipiente de cultivo" se refiere a un recipiente adecuado para un cultivo primario o cultivo semilla, como puede ser, sin estar limitados a, tubos de fondo cónico, tubos de fondo redondo, tubos de tipo Falcon™, o similar, en un volumen de entre 5-50 mL. Por otra parte, el término "tercer recipiente de cultivo" se refiere a recipientes adecuados para realizar el escalado desde el cultivo semilla, hasta el cultivo de producción. En este caso, los recipientes adecuados pueden ser, sin estar limitados a, matraces Erlenmeyer, en un volumen de entre 0, 05-2, 00 litros. Por último, el cultivo de producción se realiza en un fotobiorreactor o sistema de cultivo similar, de al menos, pero sin restringirse a, 10 litros, de al menos 20 litros, de al menos 50 litros, de al menos 100 litros, de al menos 1000 litros, de al menos 10000 litros, de al menos 100 000 litros, o incluso de volumen superior a los 100 000 litros. Así, los fotobiorreactores pueden ser de hasta centenas de m3. En este último caso, se trataría ya de reactores de producción para la multiplicación masiva de la microalga de interés.
Adicionalmente, se puede verificar la carga bacteriana mediante la siembra de una colonia microalgal amplificada durante la etapa (c) , o mediante la siembra del cultivo derivado de la etapa i) . Así, en un modo de realización de la invención, el método comprende la etapa de verificar la carga bacteriana mediante la siembra de una colonia microalgal amplificada durante la etapa (c) , o mediante la siembra del cultivo derivado de la etapa i) . La verificación de la carga bacteriana que pueda tener el cultivo se puede realizar en paralelo al procedimiento de escalado para la preparación del cultivo de producción en el fotobiorreactor. En un modo de realización de la invención, la verificación de la carga bacteriana se lleva a cabo mediante un contaje en agar nutritivo. La etapa de verificación se lleva a cabo en agar nutritivo, y no en agar estándar microbiológico, ya que el agar nutritivo favorece el crecimiento bacteriano y visibiliza la carga bacteriana presente en el cultivo. En modos particulares de realización de la presente invención, el agar nutritivo (https://es.wikipedia.org/wiki/Agar_nutritivo) comprende (en valores % peso/ volumen) :
0, 5% de peptona; 0, 3% de extracto de carne/ extracto de levadura; 1, 5% de agar; 0, 5% de cloruro de sodio; agua destilada; pH casi neutro (6, 8) a 25 °C. El agar nutritivo para el proceso de cuantificación y control de la carga bacteriana que pudiera contener el cultivo se prepara con una matriz de agua, donde el agua tiene el mismo grado de salinidad (en unidades prácticas de salinidad, PSU) que se utiliza para el cultivo de la microalga, de tal manera que no se pierdan las bacterias que deben crecer en este entorno halófilo concreto. El proceso de cuantificación y control de la carga bacteriana se puede realizar en estático en placas Petri o sistemas de cultivo similares, donde se puede llevar a cabo el contaje. En modos particulares de realización, el cultivo en estático en placas Petri o similar para el contaje de la carga bacteriana se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre los 15-30 °C y una irradiación incidente de 40-400 ^m olm "2 s_1 durante un tiempo entre 5-10 días
El método de la presente invención hace posible y viable reducir la carga bacteriana mediante el aislamiento de colonias específicas de microalgas por debajo de un límite o carga bacteriana deseada (umbral de carga bacteriana) . Así, el método de la invención permite reducir la carga bacteriana en al menos un 10%, en al menos un 15%, en al menos un 20%, en al menos un 25%, en al menos un 30%, en al menos un 35%, en al menos un 40%, en al menos un 45%, en al menos un 50%, en al menos un 55%, en al 60%, en al menos un 65%, en al menos un 70%, en al menos un 75%, en al 80%, en al menos un 85%, en al menos un 90%, en al menos un 95%, en al 98%, o en al menos un 99%, con respecto a la carga bacteriana en el cultivo microalgal inicial.
Todos los términos y modos de realización descritos anteriormente son aplicables a cualquier aspecto y modo de realización de la invención. De acuerdo con la presente invención, el término en singular "el", "la", "un", "uno", "una", se refiere igualmente a su correspondiente en plural "los", "las", "unos", "unas", salvo que se desprenda del contexto que claramente el término se refiere a una especie en el singular. El término "comprende" o "que comprende", tal y como se usa en el presente documento, también describe "consiste en" o "que consiste en" de acuerdo con la práctica de patentes generalmente aceptada.
EJEMPLOS
La siguiente invención se describe por medio de los siguientes ejemplos, que deben interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención. A título de ejemplo se ensaya la microalga Chr y sochmmulina rntalis, partiendo del cultivo Chr y sochmmulina rotalis BMCC18 proporcionado por la colección vasca de cultivos de microalgas de la Universidad del País Vasco en medio líquido y mantenido como cultivo primario en agitación orbital en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 25 mL con el medio de cultivo microalgal f/2 (Guillard, R.R.L. and J.H. Ryther. 1962. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239) , contenía carga bacteriana observable bajo microscopía óptica, cuya concentración fue inicialmente establecida en 7x105 UFC/mL. Con el fin de asegurar la obtención de cultivos monoespecie para la cepa microalgal se realizaron cultivos en placas de agar salinas (PSU 30) con medio de cultivo microalgal f/2 (Guillard, 1962) , donde se realizaron diluciones seriadas del cultivo hasta obtener colonias únicas y separadas de C. rotalis. Se inocularon 9 "gotas" de cultivo primario de Chr y sochmmulina rotalis BMCC18 por placa y se observó el crecimiento en diámetro de las colonias microalgales con el paso del tiempo. Tras 3 semanas de cultivo en una cámara termostatizada a 18 ± 1°C e iluminación tipo ON/OFF realizada en un ciclo de 12:12 (luz: oscuridad) con tubos fluorescentes de 58W que aportaron 100 ^m o ls -1m'2, se tomaron fotografías desde un punto de vista de la planta de la placa y se midió el valor del diámetro de cada colonia crecida (Fig. 1) . Estas colonias se mantuvieron durante un mínimo de 2 semanas en una cámara termostatizada a 18 ± 1°C e iluminación tipo ON/OFF realizada en un ciclo de 12:12 (luz: oscuridad) con tubos fluorescentes de 58W que aportaron 100 ^m o ls -1m'2. Semanalmente, se eliminaba la acumulación de agua formada en el interior de la placa y se repicaban los cultivos mensualmente sobre medio fresco.
Uno de los factores a solventar durante el mantenimiento de este microorganismo en placas Petri con agar fue el porcentaje de este gelificante, ya que a medida que se aumenta su proporción, se obtiene un medio más sólido, lo cual perjudica e imposibilita la viabilidad de estas microalgas flageladas, llegando a ocurrir su inactivación por la rotura o pérdida de los flagelos. Algunos estudios indican que ciertas bacterias regulan la densidad en el número de sus flagelos en presencia de entornos viscosos. Es por ello por lo que, este valor tuvo que ser optimizado con el fin de mejorar la longevidad y viabilidad de las células microalgales mantenidas en placas Petri f/2 solidificadas. Así, la Figura 2 muestra el crecimiento en diámetro de las colonias de C. rntalis provenientes del cultivo primario de Chr y sochromulina rntalis BMCC18, cultivadas en placas Petri de 90 mm que contenían el medio de cultivo microalgal salino (PSU 30) f/2 semisólido en diferentes concentraciones de agar técnico microbiológico desde 0, 1 a 1%. De acuerdo con los resultados obtenidos, la concentración óptima de agar es 0, 3%, ya que su consistencia permite la gelificación del medio manteniendo una textura porosa y vítrea. Asimismo, la carga bacteriana fue finalmente establecida en 3, 7x105 UFC/mL, lo que supuso una reducción de un 50% de la carga bacteriana. Concentraciones de agar por debajo de 0, 3%, presentaban un crecimiento del diámetro de las colonias difuminado en toda el área de la placa (principalmente a 0, 1% de agar) . Aunque en estos valores se presentaba mayor crecimiento, no son tan eficaces como valores de 0, 3% de agar ya que se buscaba una superficie fácil de transportar y que mantuviese la estructura del gel, adquiriendo los geles a concentraciones de agar por debajo de 0, 3% una textura casi líquida. Por el contrario, porcentajes mayores a 0, 3% de agar mostraban un comportamiento restrictivo respecto a la motilidad de las microalgas de la cepa Chr y sochromulina rotalis BMCC18, dando como resultado un menor diámetro de las colonias formadas.
En el caso de otras especies de microalga, algunos estudios han sido capaces de separar dos cepas de especies microalgales diferentes, Chlamydomonas y Chlorella, mediante el empleo de una concentración de agar del 0, 45% [véase Banerjee, C. et al. Indian J. Microbiol., 2012, 52, 710-712]. Bajo esta concentración de gelificante, las microalgas flageladas de agua dulce Chlamydomonas son capaces de moverse y dividirse en el agar por fototaxia, lo que indica la posibilidad de las microalgas flageladas de agua dulce Chlamydomonas para moverse y dividirse en porcentajes de agar dentro del rango definido en la presente invención.
Por otro lado, algunas investigaciones profundizan en la capacidad de generar alelopatía (influencia de un químico segregado por un organismo a otro) causada por diversas especies de microalgas marinas (Scenedesmus quadricaule y Chorella vulgaris) cuando se cultivan en sistemas semisólidos como el agar utilizando el cultivo en placas [véase Chan, A. T., et al. Mar. Biol., 1980, vol. 59, p. 7-13]. Ello asevera la capacidad de difusividad en el medio de diversas moléculas excretadas de forma extracelular y que difunden e inhiben el crecimiento de otras microalgas en dicho medio semisólido, lo cual da indicios de su potencial para aislar líneas celulares microalgales de interés.
Finalmente, se ensayó la viabilidad de las colonias de Chr y sochromulina rotalis BMCC18 conservadas por el presente método. Para ello, se eligió una placa Petri de un cultivo de conservación de acuerdo con la invención, donde la placa contiene medio de cultivo microalgal f/2 (30 PSU) semisólido con una concentración de agar de 0, 3% y se procedió a su escalado hasta cultivo en un fotorreactor. Para ello, se picaron varias colonias microalgales sembradas en la placa Petri y se resuspendieron en el medio de cultivo de mantenimiento (Tabla 1) en matraces Erlenmeyer de 50 mL de capacidad con un volumen de trabajo del 50% (es decir, 25 mL) a 18 ± 1 °C con una irradiación incidente de 80-100 ^m o lm -2s-1.
Tabla 1. Composición del medio de cultivo de mantenimiento.
El medio definido en la tabla 1 difiere del medio divulgado por Guillard, R.R.L. y J.H. Ryther (Canadian Journal of Microbiology, 1962, 8 (2) : 229-239) en que el medio de la presente invención presenta una concentración de NaH2PO4 ^ 2O de 1.81x10-4 M, frente a una concentración de NaH2PO4 ^ 2O de 3.62x10-5 M, de tal manera que la relación nitrógeno/ fósforo es 5. Los demás componentes permanecen inalterados.
A partir de aquí, se realiza una fase de escalado sucesivo mediante la inoculación de matraces Erlenmeyer con un volumen de 500 mL de medio de cultivo f/2 a 30 PSU con un volumen en torno al 10% del volumen final de un cultivo microalgal que ha llegado a fase estacionaria al agotar nutrientes. Dichos matraces se someten a agitación constante entre 5-10 días en una cámara termostatizada a 18 ± 1 °C e iluminación tipo ON/OFF realizada un ciclo de 12:12 (luz:oscuridad) con tubos fluorescentes de 58 W que aportaban 100 ^m o lm '2 s_1. Este proceso se continúa para incrementar el volumen final una vez que el crecimiento de la microalga se detiene por ausencia de nutrientes, hasta llegar a generar suficiente inóculo con el que inocular los fotobiorreactores de ensayo, dependiendo del volumen final de dichos fotobiorreactores de ensayo.
Asimismo, se cuantificó la carga bacteriana que pudiese contener el cultivo a través de la siembra en placas Petri de agar nutritivo comercial para microbiología Panreac 500 g [413792] (ISO 6579, ISO 10273, ISO 19250) con una matriz de agua salada (30 PSU) . El conteo se realizó por diluciones seriadas y contaje visual de unidades formadoras de colonias (UFC) .
