Recubrimiento fotocatalítico con propiedades antimicrobianas
La presente invención se refiere a un recubrimiento fotocatalítico con propiedades antimicrobianas basado en un nanocomposite resultado de una heterounión de BiV04y ZnO obtenida mediante un proceso sol-gel. Este recubrimiento tiene acción viricida y bactericida, ya que por un lado reduce la adhesión bacteriana a las superficies, lo que dificulta su colonización (en condiciones oscuras) y, por otro, además presenta una alta inactivación fotocatalítica de virus y bacterias tras ser irradiado, por lo que las superficies de los sustratos permanecen libres de virus, de colonización bacteriana y de formación de biopelículas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las infecciones por diferentes tipos de patógenos causan enfermedades contagiosas que pueden conducir a una significativa mortalidad, particularmente en pacientes ancianos e inmunodeprimidos, como es el caso de las infecciones víricas que afectan de forma aguda el tracto respiratorio. Los coronavirus pueden infectar al ser humano causando enfermedades que van desde el resfriado común hasta enfermedades más graves, como bronquitis, bronquiolitis, neumonías y síndromes respiratorios agudos, entre otras, y la mayoría de las personas se infectan por estos virus en algún momento de su vida. Desde finales del 2019, la aparición de un nuevo tipo de coronavirus llamado Síndrome Respiratorio Agudo Severo Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) , [Gorbalenya, A.E. et al. Nat. Microbio!., 2020, 5, 536-544.] ha producido una pandemia mundial que está causando un elevado número de fallecimientos y pacientes infectados con serias secuelas de salud. El tiempo de supervivencia de los virus en el medio ambiente es relativamente bajo, aunque algunos virus pueden sobrevivir durante más tiempo dependiendo de las condiciones ambientales locales (temperatura, humedad y velocidad del aire) y el tipo de material sobre el que se depositan las partículas víricas. Se ha demostrado que el SARS-CoV-2, como muchos otros virus estudiados, puede sobrevivir en distintas superficies durante varias horas, incluso días [Warnes, S.L. et al. MBio, 2015, 6, e01697-e15; van Doremalen, N. et. al N. Eng!. J. Meó., 2020, 382, 1564 1567], Esto supone un importante riesgo de contagio dado que se pueden transferir por contacto.
Además, en las últimas décadas, el aumento de la resistencia de las bacterias a los antibióticos convencionales ha causado serios problemas de salud. Se sabe que más del 70% de las infecciones bacterianas son resistentes a uno o más de los antibióticos que se utilizan generalmente para erradicar la infección.
Como resultado, el contagio de microbios patógenos sigue siendo una de las causas más comunes de muerte. Todo esto ha llevado a importantes investigaciones en el desarrollo de soluciones tecnológicas que se puedan implementar para prevenir la diseminación de estos agentes (tanto virus como bacterias) sobre superficies (de trabajo, de instrumental, de tránsito...) y evitar su transmisión por contacto.
En este sentido, las superficies antimicrobianas que contienen un agente biocida actúan como barrera de contención ya que inhiben o reducen la capacidad de crecimiento de los microorganismos en la superficie de los materiales. Los recubrimientos antimicrobianos fotocatalíticos basados en nanopartículas de óxidos metálicos presentan un prometedor potencial para inactivar una amplia gama de microorganismos [Liu, Y. et a\.Chem. Soc. Rev. 2019, 48, 428-446, Gian Lúea Guerrini, G.L. J. Photocatal., 2021, 2, 25-34}. Estos óxidos semiconductores, que exhiben actividad antimicrobiana, son capaces de catalizar diversas reacciones al ser activados mediante luz y no implican la liberación de ningún compuesto dañino. Suponen un enfoque emergente que se usa para inactivar una amplia variedad de microorganismos, y de esta forma prevenir problemas de transmisión e infección [Yemmireddy, V. K. & Hung, Y. C. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf., 2017, 16, 617-631],
Entre los semiconductores inorgánicos, el óxido de zinc (ZnO) es uno de los fotocatalizadores más prometedores debido a su abundancia natural, bajo costo, escasa toxicidad y su compatibilidad con la piel humana, que hacen que sea un aditivo adecuado para los materiales textiles y las superficies que entran en contacto con el cuerpo humano. Asimismo, presenta, buena estabilidad química, la posibilidad de crear diferentes arquitecturas nanométricas, un band-gap ancho (3.37 eV) y una energía de excitación alta (60 meV) . Además, el ZnO muestra actividad antimicrobiana contra diferentes microorganismos gracias principalmente a la generación de radicales (especies reactivas de oxígeno, ROS) y la liberación de cationes metálicos (Zn2+) . Sin embargo, su acción está limitada al empleo solo de luz ultravioleta (región de absorción de su band-gap) y es necesario reducir la recombinación de los huecos y electrones otogenerados, que conduce a rendimientos cuánticos bajos, siendo estos los principales inconvenientes en el uso del ZnO como fotocatalizador, que condicionan su aplicación práctica.
Por otra parte, el vanadato de bismuto (BÍVO4) es un óxido mixto de dos metales, y un fotocatalizador que es activado con luz visible gracias a un menor band gap de 2, 4 eV. Además, presenta una alta movilidad de las cargas fotogeneradas. El BÍVO4 existe en cuatro formas polimorías: ortorrómbico, tetragonal y monoclínico, además de una fase tetragonal reversible, formada a partir de la monoclínica a 528 K.
Existen ya en la literatura combinaciones tipo p-n del BÍVO4 con otros semiconductores como el TÍO2, BÍFO3 y ZnO, entre otros, con aplicaciones como electrodos, fundamentalmente como ánodos aplicados en el proceso de wáter splittting [Huang, X. e ta l. Mater. Sci. Semicond. Process., 2019, 97, 106-111],
Existen diversas técnicas para depositar nanopartículas como una película delgada o monocapa sobre un sustrato, y la elección depende fundamentalmente del área que se va a cubrir, la elección del disolvente, la concentración de partículas... Para sustratos relativamente pequeños (~ 1-2 cm2) , el método de drop-casting (deposición por gota) es fácil y rápido. En principio, el espesor de la película depende del disolvente, del volumen dispersado y de la concentración de partículas, los cuales pueden variarse fácilmente y puede ajustarse de forma sencilla. El método de spin-coating es también una técnica simple y con la que se pueden obtener capas muy homogéneas y uniformes sobre superficies planas [Kawa, M. et al. Nat. Commun., 2012, 3, 1-8], Se puede controlar el espesor y la topografía de la película mediante deposición de capas sucesivas de películas del material optimizando la cantidad y las velocidades de rotación. Otras ventajas que aporta esta técnica es la rapidez de operación, una buena reproducibilidad y rentabilidad. Otras técnicas alternativas, como la deposición electroquímica, la pulverización o la electro-pulverización, presentan múltiples variables acopladas, haciendo la optimización del proceso mucho más compleja.
DESCRIPCIÓNDE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la preparación de recubrimientos con propiedades biocidas muy eficientes para evitar la transmisión e infección por bacterias y virus a ravés del contacto con las superficies donde se depositan. Estos recubrimientos son activos gracias a la optimización de los procesos de trasferencia de carga tras iluminar y la estabilidad de los materiales. En consecuencia, inactivan bacterias y virus en las superficies.
Por lo tanto, este recubrimiento por un lado reduce la adhesión bacteriana a las superficies, lo que dificulta su colonización (en condiciones oscuras) , y presenta, además, una actividad fotocatalítica de alta eficiencia tras ser irradiado (iluminación solar o de sala) , por lo que las superficies de los sustratos permanecen libres de colonización bacteriana y formación de biopelículas. Por otro lado, inactiva virus depositados en las superficies tras ser irradiadas con luz UVA de baja potencia.
Para ello, la presente invención se refiere, por un lado, a un recubrimiento que comprende un nanocomposite fotoactivo basado en BiVOVZnO y su procedimiento de obtención, y, por otro, a su aplicación como superficie fotoactiva con alta función biocida. La invención se enmarca por tanto en el sector de la salud y tiene su aplicación no sólo en el ámbito hospitalario y de la industria alimentaria para evitar infecciones, sino que también se puede extender a todos aquellos entornos con gran tránsito de personas, como guarderías y colegios, aeropuertos, gimnasios, instalaciones deportivas, restaurantes, hoteles, oficinas, estaciones de transporte masivo, edificios públicos, áreas comerciales y residenciales, cuyas superficies de contacto se convierten en focos de propagación de infecciones y enfermedades, por las condiciones de aglomeración, calor y humedad.
Para tal fin, inicialmente se sintetizaron separadamente nanopartículas de ZnO y BÍVO4. Las nanopartículas de ZnO presentan estructura tipo Wurtzite y se forman por un procedimiento sol-gel, dando lugar a suspensiones estables de nanopartículas del óxido en un medio alcohólico; mientras que el BÍVO4 se sintetizó mediante el método hidrotermal. Posteriormente, los diferentes composites BiV04/ZnO se obtuvieron mezclando la suspensión sol-gel de ZnO con diferentes proporciones de BÍVO4 siguiendo un novedoso protocolo definido de agitación y sonicación. La suspensión obtenida con ambos óxidos fue finalmente depositada sobre superficies de vidrio, particularmente mediante las técnicas de spin-coating y drop-casting.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un recubrimiento que omprende una composición de agregados de ZnO de entre 50 y 100 nm dispersos sobre agregados de BÍVO4, con un contenido en BÍVO4 de entre el 5 y el 50% en peso con respecto a la composición final.
Los agregados de BÍVO4 se encuentran en forma de láminas delgadas como entidades 2D de 200x200 nm2.
En una realización preferida el contenido en BÍVO4 es del 15% en peso.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un material que comprende el recubrimiento de la invención según se ha descrito anteriormente, y un sustrato donde se encuentra depositado dicho recubrimiento.
En una realización preferida el sustrato se selecciona de entre sustratos de vidrio, metálicos, poliméricos, cerámicos, textiles, maderas, entre otros. Más preferiblemente, el sustrato es vidrio.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento de obtención del material de la invención, que comprende las siguientes etapas:
i) síntesis a través de un procedimiento sol-gel de los agregados de ZnO; ii) síntesis a través de un procedimiento hidrotermal de los agregados de BÍVO4; ni) dispersión de los agregados de BiV040btenidos en la etapa ii) en el sol-gel de agregados de ZnO de la etapa i) hasta una concentración final de entre el 5 y el 50% en peso;
iv) deposición de la suspensión de BiV04/ZnO procedente de la etapa iii) sobre un sustrato.
En una realización preferida la concentración de BÍVO4 en la etapa ii) es del 15% en peso.
En una realización más preferida la dispersión de la etapa iii) tiene lugar mediante una combinación de ultrasonidos y agitación magnética.
En otra realización preferida el sustrato de la etapa iv) se selecciona de entre sustratos de vidrio, metálicos, poliméricos, cerámicos, textiles, y maderas, entre otros.
Por otro lado, los recubrimientos de la invención, tal y como han sido definidos anteriormente, presentan propiedades fotocatalíticas antimicrobianas, representando una solución eficaz para inactivar una amplia variedad de microorganismos y prevenir problemas de transmisión e infección.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención es el uso del recubrimiento de la invención tal y como ha sido descrito anteriormente, y/o del material que lo comprende, como bactericida y/o viricida.
En una realización preferida el recubrimiento y/o material de la invención se emplea para la eliminación de bacterias Gram-positivas seleccionadas de entre Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, Streptococcus aglactiae, Streptococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguis, Clostridium tetani, Bacillus antracis, Clostridium botullinum, Clostridium perfringes.
En otra realización preferida el recubrimiento y/o material de la invención se emplea para la eliminación de bacterias Gram-negativas seleccionadas de entre Escherichia coli., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella bortus, Francisella tularensis, Pasteurella multocida.
En otra realización preferida el recubrimiento y/o material de la invención se emplea para la eliminación de virus, preferiblemente con envoltura lipídica, aún más preferiblemente de la familia Coronaviridae (coronavirus) , y aún más preferiblemente del género Alphacoronavirus seleccionados de entre HCoV-229E, HCoV-NL63, Alphacoronavirus 1, FCoV, TGEV, Miniopterus 1, Miniopterus HKU8, Rhinolophus HKU2 y Scotophilus 512.
En otra realización preferida el recubrimiento y/o material de la invención se emplea para la eliminación de coronavirus del género Betacoronavirus seleccionados de entre SARS-CoV, SARS-CoV-2, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, BtCoV-HKU9 y MERS-CoV.
En la presente invención, el término "agregados de ZnO" se refiere a nanopartículas con un tamaño comprendido entre 50 y 100 nm obtenidas mediante un método sol-gel que involucra una suspensión coloidal de nanopartículas.
En la presente invención, el término "sustrato" se refiere a cualquier superficie sobre la cual puede depositarse el recubrimiento de la invención. Los ejemplos de sustratos incluyen sin restricción vidrio, poliméricos, metal y madera, entre otros.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Unidades formadoras de colonias (CFU) , Condiciones de oscuridad: L (-) . Condiciones de iluminación diurna: L (+) . S. aureus, aerosol.
Fig. 2. Unidades formadoras de colonias (CFU) , Condiciones de oscuridad: L (-) . Condiciones de iluminación diurna: L (+) . E. coli, aerosol.
Fig. 3. Unidades formadoras de placas (PFU) , Condiciones de oscuridad: L (-) . Condiciones de iluminación con luz UVA durante 120 min: L (+) . (A) HCoV-229E y (B) SARS-CoV-2.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1. Síntesis de agregados de ZnO
Los agregados de óxido de zinc se preparan mediante una síntesis sol-gel de acuerdo con un método mejorado derivado de Spanhel y Anderson [Valenzuela, L., Iglesias, A., et al., Hazard. Mater., 2019, 665-673], Para ello se disuelve 0, 14 M de acetato de zinc hidratado (Zn (CH3C00) 2H20 en metanol (CH3OH) y se agita magnéticamente durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, sobre esta solución se añade, gota a gota, hidróxido de tetrametilamonio 0, 14 M ( (CH3) 4NOH) 25% en peso en metanol. Después de 48 horas en agitación, se obtiene un sol-gel estable de ZnO que se usa sin ningún acondicionamiento posterior.
Ejemplo 2. Síntesis de los agregados de BÍVO4
El BÍVO4 se sintetiza mediante un procedimiento hidrotermal. Para ello se prepararon dos soluciones: la primera solución contiene 5 mmol de Bi (N03) 3 5H2O en 10 mi de HNO34M.La segunda solución contiene 5 mmol de NH4VO3 en 10 mi de 2M NaOH. Posteriormente, la segunda solución se vierte en la primera, formando una solución naranja intensa. El pH de la solución se eleva a 7 usando NaOH 2M y controlando el valor con un medidor de pH. A través de la basificación, se forma una suspensión amarilla. En este procedimiento hidrotermal, la suspensión se deja en agitación durante 30 minutos, y luego se transfiere a un autoclave de acero inoxidable con revestimiento de teflón que se calienta en un horno de convección a 453 K durante 24 h. El sólido amarillo final se separa por centrifugación, se lava en profundidad con H2O y etanol, y se seca al aire a temperatura ambiente durante 12 h, y posteriormente a 373 K durante 2 h.
De esta manera, el BiV04se obtuvo en fase monoclínica, con objeto de obtener el mejor rendimiento fotocatalítico. Sin embargo, presenta una baja área superficial, lo cual limitaría su aplicación catalítica.
Ejemplo 3. Síntesis de los recubrimientos basados en BiVOJZnO
La cantidad apropiada de BÍVO4 (para obtener composiciones con concentraciones de BÍVO4 de entre el 5 y el 50% en peso) se dispersó en el sol-gel de agregados de ZnO obtenido en el Ejemplo 1 mediante una combinación de ultrasonidos y agitación magnética. De esta forma, el BÍVO4 se disgrega homogéneamente dentro de la suspensión favoreciendo un contacto íntimo entre los dos componentes. El composite que se obtiene está formado por láminas delgadas de BÍVO4 (entidades 2D de 200x200 nm2) decoradas con nanopartículas de ZnO.
Esta estrategia de combinar ambos materiales permitió superar los inconvenientes descritos para los materiales empleados individualmente, consiguiendo la obtención de un composite dirigido a favorecer el empleo de luz solar y reducir la recombinación de los pares electrón-hueco fotogenerados durante las reacciones fotocatalíticas y así aumentar las velocidades de fotoactividad evitando los fenómenos de desactivación.
Asimismo, la interacción entre ambos componentes, BÍVO4 y el ZnO, contrarresta la baja área superficial detectada para el BÍVO4, al favorecer su dispersión, y por otro lado mejora en gran medida la actividad fotocatalítica debido a la separación eficiente de los pares de electrones-huecos fotogenerados al irradiar con la luz.
Por lo tanto, esta incorporación de BÍVO4 tipo p y ZnO tipo n y el campo eléctrico interno resultante en la interfaz de unión p-n conducen a aplicaciones fotocatalíticas y fotoelectrónicas mejoradas.
Finalmente, la suspensión de BiV04/ZnO se deposita sobre sustratos de vidrio mediante la técnica de recubrimiento por rotación, spin-coating, para formas cuadradas (tamaños 1x1 cm2 aprox.) y, mediante deposición por gota, drop-casting, para formas circulares (20 mm de diámetro) . Antes del proceso de deposición, los sustratos de vidrio se limpiaron secuencialmente en un baño de ultrasonidos con detergente, agua destilada, acetona, etanol y agua destilada, y posteriormente se secaron a 423 K durante 10 minutos. El proceso de recubrimiento por rotación se realiza con un equipo WS-650-23B (Laurell Technologies Corporation) usando un método dinámico de 0, 2 segundos de proyección a 500 rpm, seguido de 15 segundos de aceleración a 500 rpm y pasos de secado a 1500 y 3500 rpm, respectivamente. Después, los recubrimientos se secan a 423 K durante 10 minutos con objeto de evaporar el disolvente residual. El procedimiento de deposición por spin-coating se repite diez veces, es decir, deposición de 10 capas sucesivas. El proceso de recubrimiento por drop-casting se realiza usando una pipeta pasteur y depositando un total de 5 gotas. Después, los recubrimientos se secan a 423 K durante 10 minutos con objeto de evaporar el disolvente residual. En ambas técnicas, los recubrimientos finales se calcinan a 573 K durante 1 hora para obtener las películas de nanocomposite de BiVOVZnO, logrando una densidad de masa por superficie de0, 11 ± 0, 05 mg cm-2 y 0, 31 ± 0, 05 mg cm-2, respectivamente.
Ejemplo 4. Ensayos de actividad antimicrobiana y procedimientos bioanalíticos
La actividad antibacteriana de los recubrimientos de BiV04/ZnO sobre sustratos de vidrio de 1x1 cm2 se investigó utilizando cultivos de bacterias Gram-positivas (Staphylococcus aureus) y Gram-negativas (Escherichia cotí) formadoras de biopelículas, según la norma ISO 22196 referida a la "Actividad antibacteriana de superficies plásticas y otras superficies no porosas". Se ensayaron diferentes dosis de irradiación. La bioactividad de los recubrimientos se evaluó cuantificando el número de bacterias cultivables y visualizando la formación de biopelículas.
Los bioensayos se realizaron utilizando la metodología de exposición a los microorganismos por pulverización con aerosol. Se cargó una suspensión de células en un nebulizador, que generó un aerosol sobre los cubreobjetos de vidrio, recubiertos con el fotocatalizador y sin recubrir (denominado blanco o control) . El aerosol que contenía bacterias se pulverizó en una cámara de polipropileno sellada. La temperatura se mantuvo a 310 K y la humedad relativa se controló por encima del 96%. Se permitió que las bacterias colonizaran las superficies y formaran biopelículas durante 20 horas a 310 K en oscuridad.
Inmediatamente después de la incubación, las muestras se irradiaron usando una lámpara de Xenón (simulador solar) con una irradiancia de 18, 2 W.m-2 (menor que la equivalente a la exposición natural diurna) . También se realizaron ensayos con exposición a luz de sala o laboratorio. Se utilizaron distintos tiempos de exposición (3, 6 y 120 minutos) .
Tras la irradiación, se realizó un recuento de colonias. El número de bacterias viables dheridas a la superficie se determinó mediante el recuento en placa siguiendo la norma estándar ISO 22196. Para recuperar las bacterias adheridas a la superficie, se utilizó caldo SCDLP. Se realizaron diluciones seriadas 1/10 en placas estériles de 96 pocilios y se depositaron gotas de 10 pL en placas Petri que contenían agar de recuento. Las placas Petri se incubaron a 310 K durante 24 horas y el número de unidades formadoras de colonias (UFC) se determinó utilizando al menos tres réplicas con dos diluciones en serie como mínimo.
Se observa en las Figuras 1 y 2 que estas superficies presentan notables propiedades biocidas ya que inhiben en gran medida la adhesión bacteriana (en ausencia completa de luz) y combinadas con luz se mantienen libres de bacterias viables. La alta actividad fotocatalítica tiene efectos bactericidas sobre ambos tipos de bacterias Gram-positivas (S. aureus) y Gram-negativas (E. coli) . Las superficies recubiertas con el composite con un contenido de BÍVO4 del 15% en peso mostraron la mayor actividad antimicrobiana, con resultados de los más altos presentados en la literatura, tras solo unos minutos de iluminación. Las superficies permanecieron libres de colonización bacteriana y de formación de biopelículas. La mejora del rendimiento bactericida por la adición de BÍVO4 se debe a la reducción efectiva de la recombinación de pares de electrones-hueco fotogenerados y se correlaciona con una mayor generación de radicales HO" (especies ROS) . Estas especies ROS fotogeneradas causan daño en la membrana celular y producen un alto estrés oxidativo intracelular en las bacterias.
Ejemplo 5. Ensayos de actividad viricida
La actividad viricida de los recubrimientos de BiV04/ZnO sobre sustratos de vidrio circulares de 20 mm de diámetro se investigó utilizando virus con envoltura lipídica de la familia Coronaviridae (virus HCoV-229E y SARS-CoV-2) . La bioactividad de los recubrimientos se evaluó cuantificando el número de unidades formadoras de placas (ufp) recuperadas en células susceptibles.
Los bioensayos se realizaron utilizando la metodología de exposición a los virus por inoculación de 100 pl de la suspensión del virus sobre la superficie de vidrio recubierta con el fotocatalizador o sin recubrir (control) .
Inmediatamente después de la incubación, las muestras se irradiaron usando dos ámparas de luz UVA (pico centrado en 368 nm) con una irradiancia de 3, 6 W.m-2. Se utilizaron distintos tiempos de exposición (30, 60, 90 y 120 minutos) .
Tras la irradiación, se recuperó el virus adherido a la superficie mediante lavados con el medio de recuperación de virus [DMEM completo con 2% suero fetal bovino (SFB) ]. A partir de la solución de virus recuperado, se realizaron diluciones en serie de 10 veces en placas estériles de 48 pocilios. El número de virus viables recuperado se determinó mediante un ensayo de titulación viral en medio semisólido por duplicado. Para ello, se emplearon 200 pl de cada dilución para infectar monocapas de células HuH7, en el caso del virus HCoV-229E, o Vero E6, en el caso del virus SARS-CoV-2, crecidas en placas de 12 pocilios. Tras la primera hora de infección, se retiró el inoculo y se añadió medio semisólido (0, 7% agar noble, 2% SFB y 0, 045 mg/ml DEAE-dextrano en DMEM, en el caso de HCoV-229E, o medio DMEM con carboximetilcelulosa al 4% SFB para SARS-CoV-2) . Posteriormente, en el caso de la titulación del virus HCoV-229E, las placas fueron incubadas a 306 K durante 4 días, tiempo tras el cual se fijaron con una solución de 2% formaldehído durante 15 minutos. Para la titulación del virus SARS-CoV-2, las placas fueron incubadas a 310 K durante 3 días y se fijaron con una solución de 10% formaldehido durante 45 minutos. Tras la fijación, en ambos casos, se retiró el medio semisólido y las placas se tiñeron con 0, 02% cristal violeta en 10% etanol y 2% formaldehído. Finalmente se contaron las unidades formadoras de placas (ufp) formadas (ver Figura 3) .
