DERIVADOS DE 8-METOXI-2-OXO-1.2-DIHIDROCICLOPENTArde1QUINOLINA Y SU APLICACIÓN COMO REACTIVOS DE MARCAJE DE LA LUMINISCENCIA DE
LANTÁNIDOS
La presente invención se refiere al diseño y síntesis de nuevos fluoróforos con aplicación en el desarrollo de biosensores de fluorescencia, y particularmente, a derivados de 8-metoxi-2-oxo-1, 2-dihidrociclopenta[de]quinolina y su aplicación como reactivos de mareaje de la luminiscencia de lantánidos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El conocimiento de la estructura y funciones de células, órganos y organismos vivos constituye un reto constante en la biología y la medicina modernas, que requiere el desarrollo de técnicas analíticas y de visualización ingeniosas e innovadoras y de biosensores apropiados. Entre estos, los biosensores ópticos ocupan un lugar destacado por su rapidez de respuesta, su sensibilidad y la posibilidad de detección simultanea de varios analítos. Dentro de este grupo, en los últimos años, los biosensores luminiscentes se encuentran entre los más utilizados, por su alta selectividad, sensibilidad y versatilidad, pudiéndose utilizar incluso en aplicaciones in vivo con alta resolución espacial y temporal (Velasco-García, M. N. Semin. Cell. Dev. Biol. 2009, 20, 27; Kobayashi, H. et al. Acc. Chem. Res. 2011, 44, 83) . Esta técnica implica la excitación de las biomoléculas, mediante irradiación con luz UV/visible, seguida de relajación a su estado fundamental, mediante emisión de gran parte de la energía absorbida en forma de luz.
En los últimos años los sensores o sondas basados en la luminiscencia de lantánidos están emergiendo como potentes herramientas en los campos de la Biología Molecular, la Bioquímica y la Biomedicina, debido a las ventajas que presenta su uso frente a los fluoróforos orgánicos y las proteínas fluorescentes, entre las que destacan: a) largos tiempos de vida de luminiscencia (ps-ms) , que posibilitan la fluorimetría en tiempo resuelto, donde se aplica un retraso entre el pulso de excitación y la ventana de detección, eliminando las interferencias por la autofluorescencia de los medios biológicos y aumentando sensiblemente la relación señal-ruido y, por tanto, la sensibilidad; b) bandas de emisión muy finas que no solapan, permitiendo el uso imultaneo de sondas de diferentes lantánidos para detectar cuantitativamente distintos analitos sin interferencia cruzada (detección multicanal) ; c) grandes desplazamientos de Stokes entre las longitudes de onda de excitación y las de emisión, evitando los problemas de auto-absorción dependiente de la concentración (Werts, M. H. V. Sci. Prog. 2005, 88, 101; Eliseeva, S. V. Et al. Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 189; Heffern, M. C. et al. Chem. Rev. 2014, 114, 4496) . Las bandas de absorción y emisión de los cationes lantánidos corresponden a transiciones electrónicas entre los orbitales 4f que son prohibidas. Por ello, presentan bajos coeficientes de absorbancia, lo que dificulta su excitación. Este problema se evita aprovechando la posibilidad de excitación indirecta mediante transferencia de energía desde cromóforos orgánicos con alto coeficiente de absorción molar. Este proceso se conoce como sensibilización o efecto antena y al cromóforo se le denomina "antena" (Heffern, M.C. et al. Chem. Rev. 2014, 114, 4496)
A pesar de las excepcionales propiedades fotofísicas de las antenas de lantánidos, actualmente, se dispone de un número muy limitado de compuestos de este tipo para el estudio de sistemas biológicos y su aplicación resulta limitada debido a la falta de herramientas que permitan el mareaje de biomóleculas (ej: péptidos y proteínas) o nanopartículas de una forma eficaz y sencilla (Sy, M. Chem. Commun. 2016, 52, 5080) . El mareaje luminiscente de material biológico con antenas de lantánidos requiere la introducción de una funcionalidad reactiva en la antena para su unión covalente de forma específica al material o diana de interés, generalmente, a través de grupos nucleófilos amino o tioles (Sy, M. Chem. Commun. 2016, 52, 5080; Hagan, A. K. Anal. Bioanal. Chem. 2011, 400, 2847) . Para el mareaje en grupos amino se han utilizado isocianatos, ésteres de W-hidroxisuccinimida o cloruros de ácidos sulfónicos, mientras que, para el mareaje en grupos tioles se han utilizado los grupos maleimida, haloacetamida, ditiopiridina o metanosulfonato (Sy, M. Chem. Commun. 2016, 52, 5080) . Estos grupos se unen a través de un espaciador a la antena. Esta funcionalización requiere el diseño y manipulación química apropiada de la antena, que, no debe afectar significativamente a las propiedades fotofísicas de la antena. La utilización de estos reactivos generalmente requiere el lavado de la muestra marcada para eliminar el exceso de reactivo de mareaje y evitar su interferencia en el análisis fotofísico de la muestra.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a compuestos derivados de 8-metoxi-2-oxo-1, 2dihidrociclopenta[de]quinolina de fórmula (I) que se comportan como aceptores de Michael muy reactivos frente a tioles (RSH) , transformándose por reacción con éstos en estructuras que, a su vez, se comportan como antenas de la luminiscencia de cationes lantánidos (Ln3+) .
Esta característica hace que los compuestos de fórmula (I) tengan aplicación como reactivos muy eficaces para el mareaje luminiscente de muestras biológicas, entre las que se incluyen péptidos y proteínas, y de nanopartículas, con utilidad en el desarrollo de biosensores luminiscentes, tal y como se representa en el siguiente esquema de reacción, donde R1 y X s e definen más adelante.
Entre las ventajas que presenta la presente invención destacar que:
a) Los compuestos de fórmula (I) no emiten fluorescencia y no sensibilizan la luminiscencia de cationes lantánidos, mientras que, los productos de su reacción con las especies a marcar, de fórmula (II) , sensibilizan la emisión de diversos lantánidos, preferentemente la luminiscencia roja de Eu3+. Por lo cual, estos reactivos no interfieren en la emisión de las especies marcadas a analizar y, por ello, no es necesario lavar las muestras para eliminar el exceso de reactivo. Esta característica simplificaría los análisis y aportaría alta sensibilidad.
b) A diferencia de otras sondas luminiscentes, los compuestos de fórmula (I) no requieren la incorporación de grupo reactivo para el anclaje al material a marcar, ya que, en este caso, el anclaje se realiza por adición al doble enlace, que forma parte del propio cromoforo, contribuyendo con ello a un pequeño tamaño y, por tanto, a una menor perturbación de la estructura de la diana a marcar.
c) Las 2-oxo-1, 2, 4, 5-tetrahidrociclopenta[de]quinolinas (II) , que se forman en la reacción de los compuestos de la invención (I) con tioles, sensibilizan diversos cationes lantánidos, por lo que estos compuestos constituyen herramientas de mareaje que permitirían la detección multicanal de diferentes lantánidos.
d) Los grandes desplazamientos de Stokes entre la longitud de onda de absorción de la antena (~ 300 nm) y las longitudes de onda de emisión de los lantánidos evitan problemas de autoabsorción.
e) Largos tiempos de vida de luminiscencia (ps-ms) , que posibilitan la fluorimetría en tiempo resuelto, donde se aplica un retraso entre el pulso de excitación y la ventana de detección, eliminando las interferencias por la autofluorescencia de los medios biológicos y aumentando sensiblemente la relación señal-ruido y, por tanto, la sensibilidad.
f) Bandas de emisión de los lantánidos muy finas que no solapan, permitiendo el uso simultaneo de sondas de diferentes lantánidos para detectar cuantitativamente distintos analitos sin interferencia cruzada (detección multicanal) .
g) Los compuestos de fórmula (I) constituyen herramientas de mareaje luminiscente para estudios tanto in vitro como in cellulo.
h) Esta forma de mareaje luminiscente es novedosa y no ha sido descrita en los reactivos de mareaje conocidos hasta la fecha.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) :
o cualquiera de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables,
donde R1 se selecciona de entre H, -OR2, y -NR3R4, siendo R2, R3 y R4 seleccionados independientemente de entre H, y alquilo (Ci-C6) opcionalmente sustituido; y
X se selecciona de entre los grupos -CO2R5.- PO (OH) 2.- PO3HR5.- SO3R5.- SO2NHR5, -CONHR5.- PO (OH) NHR5, y -PO (NHR5) 2, donde R5 se selecciona de entre H, alquilo (Ci-Ce) , la estructura (A) y la estructura (A) :
(A) (A')
donde m se selecciona de entre 2, 3 y 4; y Ln3+ es un lantanido, que preferiblemente se selecciona de entre La3+, Ce3+, Pr3+, Nd3+, Pm3+, Sm3+, Eu3+, Gd3+, Tb3+, Dy3+, Ho3+, Er3+, Tm3+, Yb3+, y Lu3+.
En una realización preferida, R1 es -OR2 y R2 es un alquilo (Ci-C6) , más preferiblemente R2 es metilo.
En otra realización preferida X es -CO2 R5; y más preferiblemente -CO2 H.
En otra realización preferida X es -PO (OH) 2.
En otra realización preferida X es -CONHR5siendo R5 un grupo de estructura (A) , donde m se selecciona de entre 2, 3 y 4 ; y más preferiblemente m es 2.
En otra realización preferida X es -CONHR5 siendo R5 un grupo de estructura (A) , donde m se selecciona de entre 2, 3 y 4 y Ln3+ se selecciona de entre La3+, Ce3+, Eu3+, y Tb3+; más preferiblemente m e s 2 y Ln3+ es La3+, Eu3+, o Tb3+.
En otra realización preferida X es -PO (OH) NHR5 siendo R5 un grupo de estructura (A) , donde m se selecciona de entre 2, 3 y 4 ;y más preferiblemente m es 2.
En otra realización preferida X es -PO (OH) NHR5 siendo R5 un grupo de estructura (A) , donde m se selecciona de entre 2, 3 y 4 y Ln3+ se selecciona de entre La3+, Ce3+, Eu3+, y Tb3+; más preferiblemente m e s 2 y Ln3+ es La3+, Eu3+, o Tb3+.
Asimismo, hay que entender que la presente invención abarca todos los isómeros de los compuestos de fórmula (I) , es decir, todas las formas geométricas, tautoméricas y ópticas, y sus mezclas (por ejemplo, mezclas racémicas) . Cuando hay más centros quirales en los compuestos de fórmula (I) , la presente invención incluye dentro de su alcance todos los posibles diastereómeros, incluidas sus mezclas. Las diferentes formas isómeras pueden separarse o resolverse entre sí por métodos convencionales, o cualquier isómero dado puede obtenerse por métodos sintéticos convencionales o por síntesis estereoespecífica, estereoselectiva o asimétrica.
El término "tautómero" o "forma tautomérica", tal y como se usa en la presente invención, se refiere a isómeros estructurales de diferentes energías que son interconvertibles vía una barrera de baja energía. Por ejemplo, tautómeros protónicos (también conocidos como tautómeros prototrópicos) que incluyen interconversiones mediante la migración de un protón, como por ejemplo isomerizaciones ceto-enólicas o imina-enamina. Los tautómeros de valencia incluyen interconversiones por reorganización de algunos electrones de enlace.
La presente invención también incluye compuestos marcados con isótopos, que son idénticos a los citados en las fórmula (I) salvo en que uno o más átomos se han reemplazado por un átomo que tiene una masa atómica o número másico diferente de la masa atómica o número másico encontrado habitualmente en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en compuestos de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, flúor, yodo y cloro, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 123l y 125l.
En este sentido, dentro del alcance de la presente invención se encuentran las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos que contienen los isótopos mencionados anteriormente y/u otros isótopos de otros átomos. Los compuestos marcados con isótopos de la presente invención, por ejemplo aquéllos en que se incorporan isótopos radioactivos tales como 3H o 14C, son útiles en ensayos de distribución de fármacos y/o sustratos en tejidos. Se prefieren particularmente los isótopos tritio, es decir 3H, y carbono-14, es decir, 14C, por su facilidad de preparación y detectabilidad. Los isótopos 11C y 18F son particularmente útiles en PET (tomografía de emisión de positrones) , y los isótopos 125l son particularmente útiles en SPECT (tomografía computerizada de emisión de un solo fotón) , todos útiles en la formación de imágenes del cerebro. Además, la sustitución con isótopos más pesados tales como euterio, es decir, 2H, puede proporcionar algunas ventajas terapéuticas que resultan de la mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, mayor vida media in vivo o menores requisitos de dosificación, y por lo tanto en algunos casos pueden ser preferidos. Los compuestos isotópicamente marcados de fórmula (I) se pueden preparar generalmente llevando a cabo los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos, sustituyendo un reactivo no marcado isotópicamente por un reactivo isotópicamente marcado fácilmente disponible.
Por otro lado, las sales mencionadas anteriormente serán sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las descritas por Berge, Bighley y Monkhouse, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19. Así, la expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales preparadas a partir de bases farmacéuticamente aceptables no tóxicas incluyendo bases inorgánicas y bases orgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen sales de aluminio, amonio, calcio, cobre, férricas, ferrosas, de litio, de magnesio, sales mangánicas, manganosas, de potasio, de sodio, de cinc y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluidas aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas, y resinas de intercambio iónico básicas, tales como arginina, betaína, cafeína, colina, N, N-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etil-morfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina, y similares. Cuando el compuesto de la presente invención es básico, pueden prepararse sales a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos inorgánicos y orgánicos. Tales ácidos incluyen el ácido acético, bencenosulfónico, benzoico, canforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenosulfónico y similares.
Los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio, y las formadas a partir de ácidos maleico, fumárico, benzoico, ascórbico, pamoico, succínico, clorhídrico, sulfúrico, bismetilensalicílico, metanosulfónico, etanodisulfónico, propiónico, tartárico, salicílico, ítrico, glucónico, aspártico, esteárico, palmítico, itacónico, glicólico, p-aminobenzoico, glutámico, bencenosulfónico, ciclohexilsulfámico, fosfórico y nítrico.
Asimismo, los compuestos de fórmula (I) pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y ambas formas están dentro del alcance de la presente invención. Los métodos de solvatación se conocen generalmente dentro de la técnica. Los solvatos adecuados son solvatos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, los solvatos son hidratos o bien las moléculas de solvatación son moléculas de disolvente, como por ejemplo alcoholes.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I) tal y como se ha definido anteriormente como reactivos para el mareaje luminiscente de muestras biológicas que contienen péptidos, proteínas, y/o nanopartículas, con utilidad en el desarrollo de biosensores luminiscentes.
En una realización preferida, el mareaje de péptidos se selecciona de entre secuencias peptídicas de substratos de quinasas, concretamente, de entre péptidos de 15 aminoácidos derivados de la proteína tau.
En una realización más preferida, la secuencia peptídica a marcar se selecciona de entre las que poseen una única cisteína.
En una realización más preferida, el mareaje luminiscente de péptidos se selecciona de entre mareaje en disolución o mareaje en fase sólida.
En una realización preferida, el material a marcar luminiscentemente con el reactivo (I) se selecciona de entre nanopartículas de poliestireno funcionalizadas con grupos tiol.
En una realización más preferida, la coordinación de las nanopartículas de poliestireno con lantánidos y sensibilización de su luminiscencia se realiza "in vitro.
En una realización más preferida, la coordinación de las nanopartículas de poliestireno con lantánidos y sensibilización de su luminiscencia se realiza en células tumorales de pulmón A549, que pueden estar vivas o muertas (fijadas) .
Otro aspecto de la invención se refiere a biosensores luminiscentes que comprenden al enos un compuesto de fórmula (I) tal y como se ha definido anteriormente.
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de mareaje luminiscente de muestras biológicas aisladas que comprende poner en contacto la muestra biológica con al menos un compuesto de fórmula (I) tal y como se ha definido anteriormente.Cuando el compuesto de fórmula (I) no incorpora el lantánido en su estructura, éste debe ser añadido in situ a través de su sal correspondiente.
En la presente invención el término "alquilo" se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 4, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo etc. Opcionalmente puede estar sustituido por al menos un sustituyente, donde los sustituyeles se seleccionan de entre OR', =0, SR', SOR', SO2 R', NO2 , NHR', N (R') 2, =N-R', NHCOR', N (COR') 2, NHSO2 R', NR'C (=NR') NHR', CN, halógeno, C (O) R', COOR', 0C (O) R', CONHR', CON (R') 2 , alquilo (C1-C10) sustituido o no sustituido, alquenilo (C2-C10) sustituido o no sustituido, alquinilo (C2-C10) sustituido o no sustituido, arilo (C6-Cis) sustituido o no sustituido y heterociclo (Cs-Cis) sustituido o no sustituido, donde cada grupo R' es seleccionado independientemente entre H, OH, NO2 , NH2 , SH, CN, halógeno, O, C (O) H, C (O) alquilo, COOH, alquilo (C1-C5) sustituido o no sustituido, alquenilo (C2-C5) sustituido o no sustituido, alquinilo (C2-C5) sustituido o no sustituido.
En la presente invención el término "lantánido" se refiere a cualquiera de los elementos químicos del periodo 6 de la tabla periódica comprendidos entre los números atómicos 57 y 71 (Lantano, Cerio, Praseodimio, Neodimio, Prometió, Samario, Europio, Gadolinio, Terbio, Disprosio, Holmio, Erbio, Tulio, Iterbio y Lutecio) , preferentemente Europio o Terbio.
En la presente invención el término "muestra biológica" se refiere a materiales tanto de origen natural como sintético que presentan actividad biológica, comprendiendo fundamentalmente biomoléculas, tales como por ejemplo péptidos y proteínas, nanopartículas y células.
En la presente invención el término "nanopartícula" se refiere a partículas de diversos materiales de tamaño inferior a100 nm.
En la presente invención se entiende "mareaje en disolución" cuando el material a marcar está disuelto en un disolvente, como por ejemplo diversos tampones acuosos; y "mareaje en fase sólida" cuando el material a marcar se encuentra anclado a una resina polimérica sólida.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Esquema del mareaje luminiscente de péptidos en fase sólida con el reactivo de mareaje (3)
FIG. 2. Gráfico de luminiscencia de péptidos marcados y no marcados con el fluoróforo (3) , en presencia y en ausencia de cationes Ln3+.
FIG. 3. Esquema del mareaje luminiscente de nanopartículas de poliestireno con NP-6 (Ln3+)
FIG. 4. Visualización de células A549 con nanopartículas marcadas con el fluoróforo (6) y coordinadas con cationes Ln3+ [NP-6 (Ln3+) ]
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1: Síntesis del ácido 8-metox¡-2-oxo-1.2-d¡h¡drociclopentarcte1qu¡nol¡na-3-carboxílico (3)
El compuesto ácido 8-metoxi-2-oxo-1, 2-dihidrociclopenta[de]quinolina-3-carboxílico (3) se sintetizó a partir de 8-metoxi-2-oxo-1, 2, 4, 5-tetrahidrociclopenta[de]quinolina-3-carboxilato de metilo (1) (González-Vera, J. A. et al. Chem. Commun. 2016, 52, 9652) tal como se indica en el siguiente esquema de reacción:
Síntesis de 8-metoxi-2-oxo-1, 2-dihidrociclopentarcfelquinolina-3-carboxilato de metilo (21
A una disolución de 8-metoxi-2-oxo-1, 2, 4, 5-tetrahidrociclopenta[cfe]quinolina-3-carboxilato de metilo (1) (810 mg, 3, 30 mmol) en tolueno (25 mi) , se le añadió 2, 3-dicloro-5, 6-diaciano-p-benzoquinona (900 mg, 3, 95 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 4 horas. A continuación, el crudo de reacción se evaporó a sequedad y se purificó mediante cromatografía flash, utilizando gradiente 0-5% de MeOH en CH2CI2 como eluyente, para obtener el derivado deseado 2 (350 mg, 42%) como un sólido rojizo. Pf: 2030C HPLC-MS (gradiente 30-95% de disolución 0, 1 % de ácido fórmico en acetonitrilo en disolución 0, 1 % de fórmico en H2O, 10 min) ír = 2.32 min. 1H-RMN (CDCI3 , 400 MHz) 5: 3, 89 (s, 3H) , 3, 91 (s, 3H) , 6, 62 (d, 1H, J= 7, 5 Hz) , 6, 82 (d, 1H, J = 5, 5 Hz) , 6, 96 (d, 1H, J = 7, 5 Hz) , 7, 05 (d, 1H, J = 5, 5 Hz) , 9, 79 (s, 1H) .13C-RMN (CDCI3 , 100 MHz) 5: 52, 5, 56, 4, 110, 8, 118, 3, 119, 86, 120, 1, 125, 4, 126, 3, 131, 5, 141, 05, 147, 6, 152, 7, 161, 6, 164.7.HRMS (ESI) m/z\ Caled, para C14H11CINO4 ([M+H]+) : 258, 0760, Encd: 258, 0756.
Síntesis del ácido 8-metoxi-2-oxo-1.2-dihidrociclopentaídelauinolina-3-carboxílico (3) Al éster metílico 2 (200 mg, 0.77 mmol) , se le añadió una disolución de NaOH 2N (5 mi) y la mezcla se calentó a reflujo durante 30 minutos. A continuación, se liofilizó y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en fase reversa, usando gradiente 0-10% de CH3CN en H20 como eluyente, obteniéndo el ácido carboxílico deseado 3 (150 mg, 80 %) como un sólido naranja-rojizo. Pf: 274 0C. HPLC-MS (gradiente 5-95% de disolución 0, 1 % de ácido fórmico en acetonitrilo en disolución 0, 1 % de fórmico en H20, 10 min) tR= 7.93 min.1H-RMN (D20, 400 MHz) 5: 3, 76 (s, 3H) , 6, 59 (d, 1H, J= 5, 5 Hz) , 6, 62 (d, 1H, J= 7, 5 Hz) , 6, 96 (d, 1H, J= 5, 5 Hz) , 6, 98 (d, 1H, J= 7, 5 Hz) .13C-RMN (D20, 100 MHz) 5: 55, 8, 109, 5, 119, 0, 119, 1, 120, 0, 124, 4, 128, 0, 130, 7, 137, 0, 144, 1, 150, 0, 166, 2, 174, 0. HRMS (ESI) m/z\ Caled, para C13H9NO4 ([M+H]+) : 244, 0604, Encd: 244, 0604.
Ejemplo 2: Síntesis del ácido 2.2'.2"- (10- (2- (8-metox¡-2-oxo-1, 2-d¡h¡droc¡clopentarcfe1qu¡nol¡na-3-carboxam¡do) et¡l) -1, 4.7.10-tetraazac¡clododecano-1.4.7- tr¡¡l) -tr¡acét¡co (6)
El ácido 2, 2', 2"- (10- (2- (8-metoxi-2-oxo-1, 2-dihidro-ciclopenta[de]quinolina-3-carboxamido) etil) -1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano-1, 4, 7-triil) -triacético (6) se sintetizó a partir del derivado de D03A 2, 2', 2"- (10- (2-aminoetil) -1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano-1.4.7- triil) triacetato de tri-terc-butilo (4) (de la Reberdiére, A. et al. Tetrahedron Letters 2012, 53, 6115) y del ácido 3 tal como se indica en el siguiente esquema de reacción:
Síntesis de 2.2'.2"- (10- (2- (8-metoxi-2-oxo-1.2-dihidrociclopentarde1-quinolina-3-carboxa-mido) etil) -1.4.7.10-tetraazaciclododecano-1.4.7-triil) triacetato de tri-terc-butilo (51
A una disolución de la ciclopentaquinolinona (3) (70 mg, 0, 29 mmol) y del derivado de D03A (4) (176 mg, 0, 31 mmol) en DMF (10 mi) , se le añadió HBTU (130 mg, 0, 35 mmol) , HOBt (53 mg, 0, 35 mmol) y DIPEA (60 pL, 0, 35 mmol) . La mezcla se agitó en atmosfera de argón durante 16 horas. Transcurrido este tiempo, la mezcla se evaporó a sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía flash, usando gradiente 0-5 % de MeOH en CH2CÍ2 Como eluyente, obteniendo el derivado deseado (5) (120 mg, 53 %) como sirupe naranja. HPLC-MS (gradiente 5-95% de disolución 0, 1 % de ácido fórmico en cetonitrilo en disolución 0, 1 % de fórmico en H20, 10 min) fR = 7, 32 min. 1H-RMN [ (CD3) 2CO, 400 MHz] 5: 1, 31 (s, 27H) , 1, 3.- 1, 39 y 1, 8.- 1, 95 (2m, 20H) , 2, 41 (s, 2H) , 3, 2.- 3, 28 (m, 2H) , 3, 4.- 3, 53 (m, 2H) , 3, 86 (s, 3H) , 6, 82 (d, 1H, J = 7, 5 Hz) , 7, 07 (d, 1H, J = 7, 5 Hz) , 7, 11 (d, 1H, J = 5, 5 Hz) , 7, 55 (d, 1H, J = 5, 5 Hz) , 10, 03 (t, 1H, J = 6 Hz, ) .13C-RMN [ (CD3) 2CO, 125 MHz] 5: 28, 2, 29, 4, 30, 2, 36, 6, 43, 4, 55, 4, 56, 8, 82, 7, 82, 7, 112, 1, 119, 6, 119, 8, 121, 2, 125, 6, 129, 3, 132, 3, 141, 4, 148, 7, 154, 4, 164, 8, 164, 9, 165, 0 y 174, 0.
Síntesis del ácido 2, 2', 2"- (10- (2- (8-metoxi-2-oxo-1, 2-dihidro-ciclopentarcfe1quinolina-3-carboxamido) etil) -1.4.7.10-tetraazaciclododecano-1, 4.7-triil) triacetico (6)
Una disolución del éster ferc-butílico (5) (40 mg, 0.05 mmol) en TFA (2 mi) , se agitó a temperatura ambiente bajo atmosfera de argón durante 1, 5 horas. A continuación, se evaporó el TFA y el residuo se purificó por HPLC-semipreparativa en una columna SunFire Prep C18 OBD de 5 pm (19x150 mm) , obteniendo el compuesto deseado (6) (8 mg, 25 %) como un sólido naranja claro. HPLC-MS (gradiente 2-30% de disolución 0, 1 % de ácido fórmico en acetonitrilo en disolución 0, 1 % de fórmico en H20, 10 min) fR = 8, 80 min. 1H-NMR (D20, 500 MHz) 5: 2, 8.- 3, 37 (m, 16H) , 3, 3.- 3, 46 (m, 4H) , 3, 48 (s, 2H) , 3, 63 (s, 3H) , 3, 65-3, 71 (m, 4H) , 6, 33 (d, 1H, J= 7, 5 Hz) , 6, 60 (d, 1H, J = 5 Hz) , 6, 64 (d, 1H, J= 7, 5 Hz) , 6, 73 (d, 1H, J= 5 Hz) . 13C-RMN [ (CD3) 2CO, 125 MHz] 5: 35, 2, 45, 6, 47, 7, 48, 3, 50, 4, 51, 1, 54, 2, 55, 9, 56, 3, 111, 0, 115, 8, 117, 5, 121, 6, 123, 0, 126, 0, 130, 1, 141, 3, 147, 5, 153, 0, 163, 3, 165, 5, 169, 7. HRMS (ESI) : Caled, para C^HeaNeOg ([M+H]+) : 783, 4651, Encd: 783, 4664.
Ejemplo 3: Síntesis de 2.2'.2"- (10- (2- (8-metoxi-2-oxo-1.2-d¡h¡droc¡clopentarcfelqu¡nol¡na-3-carboxamido) et¡l) -1.4.7.10-tetraazac¡clododecano-1.4.7-triiPtriacetato de europio (IIP (7)
A una disolución del ácido (6) en H20 (310 pl, 10 mmol) , se le añadió una disolución de EuCl3 en H20 (310 pl, 50 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas, obteniendo una disolución 5 mM de la sal de Eu (lll) deseada (7) , que fue utilizada tal cual para el mareaje de muestras de interés con la luminiscencia de este catión. HPLC-MS (gradiente 5-95% de disolución 0, 1 % de ácido fórmico en acetonitrilo en disolución 0, 1 % de fórmico en H20, 10 min) ír = 5, 38 min. HRMS (ESI) : Caled, para C41H63N6O9 ([M+H]+) : 783, 4651, Encd: 783, 4660.
Ejemplo 4: Mareaje luminiscente en disolución de péptidos con el compuesto (3)
Los péptidos utilizados en este estudio fueron derivados de la proteína Tau (Wada, Y. et al. J. Biochem. 1998, 124, 738) , que incorporan un único residuo de cisteína. Se sintetizaron mediante síntesis en fase sólida y después de aislarlos y purificarlos, se disolvieron en tampón Hepes a pH 7, 4 y se marcaron en residuo de cisteína por reacción con el compuesto (3) en exceso (de 5-10 veces) , durante 16h a 40C. Posteriormente, el exceso de antena se eliminó por purificación en columnas NAP-5 (GE Healthcare; rendimiento 100% por HPLC-MS analítico) y los péptidos marcados resultantes se coordinaron con el correspondiente lantánido tras adición in situ de la respectiva sal de lantánido (TbCh, EuCh, Sc (OTf) 3 , Y (OTf) 3 o La (OTf) 3) en exceso (de 5-100 veces) a 25 0C en buffer Hepes a pH 7, 4.
Ejemplo 5: Mareaje luminiscente en fase sólida de péptidos con el compuesto (3)
Al igual que en el Ejemplo 4, los péptidos utilizados en este estudio fueron derivados de la proteína Tau (Wada, Y. et al. J. Biochem. 1998, 124, 738) , incorporan un único residuo de cisteína y se sintetizaron en fase sólida. Tal como se muestra de forma simplificada en la Figura 1, estos péptidos unidos a la resina (PAL-PEG, 50 mg, 0, 0095 mmol, 1 equiv.) , que incorporaba el residuo de cisteína protegido como Cys (Mmt) , lábil en medio ácido, se hincharon con CH2CI2 (5 min) y DMF (5 min) . El grupo protector Mmt se eliminó por tratamiento con TFA al 1%, triisopropilsilano (TIS) al 5% en CH2CI2 bajo atmósfera de N2 (4 x 20 min o hasta que la mayor parte del color amarillo debido al catión Mmt desapareció) . A continuación, la resina se sometió a un lavado riguroso con CH2CI2 (5 x) y DMF (5 x) , se le añadió DIEA (0, 0475 mmol, 5 equiv.) en DMF anhidra (200 pL) y la mezcla resultante se agitó durante 2-3 min a 25 0C. Seguidamente se añadió el compuesto (3) (17 mg, 0, 0285 mmol, 3 equiv.) a la resina en DMF anhidra (150 pL) y tras 12 horas agitando a temperatura ambiente, la resina se filtró para eliminar los reactivos en exceso y se lavó con DMF, CH2CI2, MeOH, CH2CI2 (5 x cada uno) . El esanclaje del péptido de la resina y eliminación de los grupos protectores se llevó a cabo por tratamiento de los péptidos unidos a la resina con TFA/EDT/H20/TIS (94:2, 5:2, 5:1% v/v) . La disolución resultante se concentró bajo una corriente de N2 y se precipitó mediante la adición de Et20 frío. El sedimento se trituró con Et20 frío (3 x) , se redisolvió en agua, se filtró y se liofilizó. Los péptidos se purificaron mediante HPLC-MS de fase reversa semipreparativa. Los péptidos marcados resultantes se coordinaron con el correspondiente lantánido tras adición in situ de la respectiva sal (TbCh, EuCh, Sc (OTf) 3 , Y (OTf) 3 o La (OTf) 3) en exceso (de 5-100 veces) a 250C en buffer Hepes a pH 7, 4. La coordinación con TbCh dio lugar a un incremento de luminiscencia de 12.100 veces, mientras que la coordinación con EuCh dio lugar a un incremento de luminiscencia de 68.000 veces (Figura 2) .
Ejemplo 6: Coordinación del compuesto (6) con diversos lantánidos
A una disolución del compuesto (6) (2, 3 mg, 0, 003 mmol) en 300 pL de buffer Hepes 50 mM, pH 7, 4, NaCI 500 mM, se le añadieron 300 pL de la correspondiente sal del lantánido (TbCh, EuCh, Sc (OTf) 3 , Y (OTf) 3 o La (OTf) 3 (disolución 40 mM en HCI 1 mM) , la disolución resultante se diluyó hasta 1 mL en H20 y, posteriormente, la mezcla se agitó durante 16h a 40C. El complejo resultante [6- (Ln3+) ] (rendimiento 100% por HPLC-MS analítico) se usó en la siguiente etapa de mareaje sin purificación adicional (Figura 3) .
Ejemplo 7: Mareaje de nanopartículas con los complejos T6- (Ln3+) 1
Tal como se muestra en la Figura 6, nanopartículas de poliestireno funcionalizadas con grupos tiol se marcaron por reacción con complejos [6- (Ln3+) ] en exceso (5-10 equivalentes) durante toda la noche a 4-370C en buffer Hepes a pH 7.4. Los reactivos en exceso se eliminaron mediante diversos ciclos de centrifugación y la eficacia del mareaje se evaluó por citometría de flujo acoplada a espectrometría de masas CyTOF. Como control negativo se emplearon nanopartículas marcadas con (6) y sin lantánido. Finalmente, las nanopartículas luminiscentes resultantes (NP-6- (Ln3+) ]) se usaron para su visualización en células tumorales de pulmón A549 (ca. 5000 NPs por célula, Figura 4) .
