MÉTODO IN VITRO PARA EL DIAGNÓSTICO, PRONÓSTICO Y/O CRIBADO DE
PACIENTES SUSCEPTIBLES DE SUFRIR CELIAQUÍA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo técnico de la medicina. Particularmente, la presente invención hace referencia a un método in vitro para el diagnóstico, pronóstico y/o cribado de pacientes susceptibles de sufrir celiaquía.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La celiaquía o enfermedad celíaca (EC) es un proceso crónico, multiorgánico autoinmune que lesiona primeramente el intestino y puede dañar cualquier órgano o tejido corporal. Está producida por una "intolerancia" permanente al gluten, que es un conjunto de proteínas presentes en el trigo, avena, cebada y centeno -TACC- y productos derivados de estos cereales. Actualmente se sabe que la celiaquía es realmente una enfermedad sistémica, ya que la respuesta inmunitaria anormal causada por el gluten puede dar lugar a la producción de diferentes autoanticuerpos que pueden atacar y lesionar cualquier parte del organismo. Sin un tratamiento estricto, la celiaquía, puede provocar complicaciones de salud muy graves, entre las que cabe señalar diversos tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares, trastornos neurológicos y psiquiátricos, otras enfermedades autoinmunes y osteoporosis, así como enfermedad celíaca refractaria, que tiene una mortalidad elevada porque no tiene tratamiento, y en casos raros la denominada "crisis celíaca", de aparición súbita y que puede ser mortal.
Tras los avances producidos en el conocimiento de la enfermedad celíaca, actualmente queda patente que no se puede identificar ni diagnosticar siguiendo los criterios empleados tradicionalmente, salvo en casos excepcionales. Tanto los síntomas que se asociaban con la celiaquía como los criterios diagnósticos han cambiado en los últimos años. Además, la población está más informada sobre la enfermedad lo que hace que los profesionales de la salud necesiten actualizarse para adaptarse al nuevo escenario de la clínica para la celiaquía. Los síntomas que se creían siempre presentes en personas celiacas, que incluyen malabsorción grave con diarrea crónica, signos de malnutrición o retraso del crecimiento (presentación clásica) , son actualmente excepcionales, especialmente en niños mayores de dos años y adultos. La mayoría de las personas de todas las edades presenta molestias digestivas leves o intermitentes y/o síntomas no digestivos (presentación no clásica) . Incluso hay enfermos celíacos aparentemente asintomáticos a nivel digestivo, normalmente debido a ue se han acostumbrado a vivir con un estado de mala salud crónica como si fuera normal y al efecto opioide del gluten, que enmascara el daño intestinal. Los síntomas que pueden aparecer son muy variados, donde no existe un patrón único definido, ni una clínica común para todos los pacientes, puesto que las presentaciones de la enfermedad son múltiples y muy diferentes. Puede cursar con diarrea o estreñimiento, con clínica digestiva florida o sin ningún síntoma digestivo, con pérdida de peso u obesidad, con retraso del crecimiento o crecimiento normal, con o sin abdomen abultado, con o sin otras enfermedades autoinmunes asociadas, etc. Todo esto plantea serios problemas a los profesionales de la salud a la hora de emitir un diagnóstico.
Se cree que la mayoría de los celíacos a nivel global, nunca llega a recibir un diagnóstico. Esto es debido al escaso conocimiento sobre la celiaquía existente entre los profesionales de la salud, incluyendo médicos de cabecera, pediatras, gastroenterólogos y especialistas en general y a las dificultades del diagnóstico. Cinco de cada seis celíacos (aproximademante el 83%) permanece sin diagnosticar. En los niños, las cifras llegan a alcanzar el 90%. En aquellos que consiguen ser diagnosticados, el tiempo transcurrido desde el comienzo de los síntomas es habitualmente muy prolongado, con retrasos diagnósticos que pueden oscilar entre los siete y los cincuenta y nueve años. Aunque la media en recibir el diagnóstico está en unos 13 años, período durante el que los pacientes acuden a repetidas consultas de diversos especialistas, los cuales por lo general, no piensan que la celiaquía pueda ser la enfermedad que causa sus diversas molestias. De hecho, no existe ninguna prueba que por sí sola pueda descartar la enfermedad celíaca, ya que las lesiones digestivas no siempre aparecen o lo hacen en fases avanzadas de la enfermedad. Además, dichas lesiones, son comunes en otros procesos patológicos como las infestaciones por parásitos intestinales, el VIH u otros cuadros digestivos diferentes de la celiaquía. Por otro lado, los autoanticuerpos que se usan en el diagnóstico de la celiaquía, pueden tardar varios años en aparecer en la sangre, además del hecho de que también están aumentados en otras patologías (enfermedades inflamatorias intestinales, VIH, fases tardías del infarto de miocardio o en la presencia de parásitos intestinales) . Todo esto no sólo afecta a la demora de tiempo, en la que se produce el diagnóstico, sino implica que incluso muchos pacientes, sean diagnosticados de otras enfermedades cuya causa primaria, la celiaquía, no es identificada.
Las evidencias apuntan a que la genética tiene una clara participación en la predisposición a la enfermedad celíaca, si bien el modo de herencia es aún desconocido. Actualmente, se estima que su heredabilidad ronda el 87%. Aproximadamente, el 56% de la población general resenta genética de riesgo para desarrollar la enfermedad celíaca. De hecho, se conoce que está implicada la presencia de ciertos alelos del sistema HLA (antígenos linfocitarios humanos, ubicados en el brazo corto del cromosoma 6) , el cual está encargado de vigilar que las células del organismo sean propias. Su presencia está relacionada entre otras, con la aparición de diversas enfermedades autoinmunes y el análisis de histocompatibilidad imprescindible para llevar a cabo ciertos trasplantes.
El HLA-DQ2 se presenta en más del 90 % de los celíacos. No obstante, tenerlo positivo no implica que se tenga que desarrollar la enfermedad celíaca. De hecho, los celíacos son solo un 2-5 % de los portadores del HLA-DQ2. Alrededor del 11 % de los celíacos presenta el HLA-DQ8. Al menos el 5 % restante de celíacos no presentan ni el heterodímero DQ2, ni el DQ8, o solo tienen un alelo del DQ2, por lo que su presencia no es obligada para el diagnóstico. Hay en marcha estudios de nuevos marcadores genéticos relacionados con esta enfermedad. Por ejemplo, se han encontrado otros genes del sistema HLA-I, como el MICA y el MICB, asociados a diversos trastornos autoinmunitarios, entre ellos la enfermedad celíaca, aunque no son usados en el diagnóstico de la celiaquía. Sin embargo, la presencia de los marcadores de susceptibilidad HLA-DQ2 y HLA-DQ8 es importante a la hora de realizar estudios familiares y de instaurar una dieta sin gluten (DSG) para analizar la respuesta en pacientes cuyas pruebas diagnósticas no sean concluyentes. No obstante, como se ha mencionado, actualmente no existe una metodología eficaz para llevar a cabo el diagnóstico de la celiaquía, y por ejemplo un diagnóstico basado en la HLA-DQ2 y/o HLA-DQ8 da lugar a la determinación de falsos positivos.
Por lo tanto, la presente invención se centra en solventar el problema técnico arriba planteado y hace referencia a un método in vitro para el diagnóstico, pronóstico y/o cribado de pacientes susceptibles de sufrir celiaquía, particularmente útil en pacientes positivos para HLA-DQ2 y/o HLA-DQ8 que realmente no están enfermos (aproximadamente el 80% de los positivos para HLA-DQ2 y/o HLA-DQ8 no son celíacos) , reduciendo así drásticamente el porcentaje de falsos positivos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
La presente invención hace referencia a un método in vitro para el diagnóstico, pronóstico y/o cribado de pacientes susceptibles de sufrir celiaquía.
Particularmente, el primer aspecto de la invención hace referencia a un método in vitro para el diagnóstico, pronóstico y/o cribado de pacientes susceptibles de sufrir celiaquía que comprende determinar el nivel de ADAMTS-1 en una muestra biológica obtenida del paciente, caracterizado porque una variación estadísticamente significativa del nivel de ADAMTS-1 respecto al valor determinado en pacientes sanos utilizados como control, es un indicativo de que el sujeto sufre celiaquía o es propenso a desarrollarla.
El segundo aspecto de la invención hace referencia al uso in vitro de al menos ADAMTS-1 para el diagnóstico, pronóstico y/o cribado de pacientes susceptibles de sufrir celiaquía.
El tercer aspecto de la invención hace referencia al uso in vitro de un kit que comprende medios o reactivos para la detección del nivel de ADAMTS-1 para el diagnóstico, pronóstico y/o cribado de pacientes susceptibles de sufrir celiaquía.
En un aspecto preferido los sujetos son positivos para HLA-DQ2 y/o HLA-DQ8, y un aumento estadísticamente significativo del nivel de ADAMTS-1 respecto al valor determinado en pacientes sanos utilizados como control, es un indicativo de que el sujeto sufre celiaquía o es propenso a desarrollarla.
En un aspecto preferido los sujetos no son positivos para HLA-DQ2 y/o HLA-DQ8 y una disminución estadísticamente significativa del nivel de ADAMTS-1 respecto a valor determinado en pacientes sanos utilizados como control, es un indicativo de que el sujeto sufre celiaquía o es propenso a desarrollarla.
En un aspecto preferido además se determina el nivel de Angiostatin y/o Neuregulin 1 P1 (NRG1-P1) y/o Pentraxin-3, donde un aumento estadísticamente significativo del nivel de Angiostatin y/o Neuregulin 1 P1 y/o una disminución del nivel de Pentraxin-3 respecto al valor determinado en pacientes sanos utilizados como control, es un indicativo de que el sujeto sufre celiaquía o es propenso a desarrollarla.
En un aspecto preferido se determina ADAMTS-1, Pentraxin-3 y/o Neuregulin 1 P1 de forma previa a la inclusión del gluten en la dieta.
En un aspecto preferido se determina ADAMTS-1, Neuregulin 1 P1, Pentraxin-3 y/o Angiostatin de forma posterior a la inclusión del gluten en la dieta.
En un aspecto preferido se determina ADAMTS-1, Pentraxin-3 y Angiostatin cuando el gluten se elimina de la dieta para hacer un seguimiento al paciente.
En un aspecto preferido, la muestra biológica obtenida del paciente se selecciona del grupo que comprende: sangre, suero o plasma.
El cuarto aspecto de la invención hace referencia a un kit para ser usado en el diagnóstico, pronóstico y/o cribado de pacientes susceptibles de sufrir celiaquía que comprende: a. Medios o reactivos para la determinación del nivel de ADAMTS-1, b. Medios o reactivos para la determinación del nivel de Angiostatin y/o Neuregulin 1 p1 y/o Pentraxin-3, y c. Opcionalmente medios o reactivos para la determinación de la presencia de HLA-DQ2 y/o HLA-DQ8. En un aspecto preferido el kit se caracteriza por ser un inmunoensayo donde el nivel de ADAMTS-1, Angiostatin, Neuregulin 1 pi y/o Pentraxin-3 se detecta a través de la interacción de anticuerpos con epítopos específicos presentes en dichas proteínas.
Alternativamente, la presente invención hace referencia a un kit para ser usado en el diagnóstico, pronóstico y/o cribado de pacientes susceptibles de sufrir celiaquía que comprende: a) Medios o reactivos para la determinación del nivel de ADAMTS-1, b) Medios o reactivos para la determinación de la presencia de HLA-DQ2 y/o HLA-DQ8, y opcionalmente c) medios o reactivos para la determinación del nivel de Angiostatin y/o Neuregulin 1 p1 y/o Pentraxin-3. En un aspecto preferido el kit se caracteriza por ser un inmunoensayo donde el nivel de ADAMTS-1, Angiostatin, Neuregulin 1 p1 y/o Pentraxin-3 se detecta a través de la interacción de anticuerpos con epítopos específicos presentes en dichas proteínas.
Tal y como se muestra en las figuras y en los resultados ofrecidos por la presente invención, la metodología arriba descrita puede basarse en la determinación de forma individual de cualquiera de los marcadores ADAMTS-1, Pentraxin-3, Angiostatin o Neuregulin 1 p1, preferentemente el marcador ADAMTS-1 (ver Figura 1 y Figura 2) , o de cualquier combinación que comprenda al menos dos, tres o cuatro de los marcadores arriba indicados, preferentemente las combinaciones contempladas en la Figura 3.
El quinto aspecto de la presente invención hace referencia a un método de tratamiento de la celiaquía, dirigido a la eliminación del gluten de la dieta, que comprende un diagnóstico previo con la metodología anteriormente descrita.
A los efectos de la presente invención se aportan las siguientes definiciones:
• El término "que comprende" significa que incluye, pero no se limita a, lo que sigue a la palabra "que comprende". Por lo tanto, el uso del término "que comprende" indica que los elementos enumerados son obligatorios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes.
• Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase " que consiste en " indica que los elementos enumerados son obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos.
• ADAMTS-1: "A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1".
Número del gen según pudmed gene: 9510. Número de la proteína en uniprot: Q9UHI8.
• NRG1-P1: "Neuregulin 1 beta 1". Número del gen según pudmed gene: 3084.
Número de la proteína en uniprot: Q02297 y Q7RTW4.
• Pentraxin-3: "Pentraxin-3", TSG-14, PTX3. Número del gen según pudmed gene:
5806. Número de la proteína en uniprot: P26022.
• Angiostatin: Angiostatin, (el fragmento del aminoácido 79 al 466 del plasminógeno) .
Número del gen según pudmed gene: 5340. Número de la proteína en uniprot: P00747.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. ELISA en suero de niños donde se comparan las diferencias entre los celíacos y controles para 3 marcadores angiogénicos en fase clínica 3. El panel A representa los niveles de NRG1-P1 cuando se comparan todos los controles que comparten o no la genética de los celíacos, con los celíacos da igual la fase de la enfermedad. El panel B, representa los niveles de "Pentraxin-3" de todos los controles, genéticamente compatibles con celiaquía o no, en comparación con los celíacos que no comen gluten. Las barras que representan el valor medio de las proteínas contienen también el error medio estándar. *representa diferencias estadísticas de "p" de menos de 0.05, mientras que *** representa valores de "p" por debajo de 0.001.
Figura 2. ELISA en suero de niños, donde se comparan las diferencias entre los celíacos y sus controles. Panel A, niveles de ADAMTS-1 cuando se comparan los valores de todos los celíacos (los que comen gluten y los que no comen) , con los controles sanos genéticamente compatibles con los celíacos pero que no son celíacos. Panel B, Curva ROC donde se compara la sensibilidad y especificidad del marcador ADAMTS-1, así como se expresa el área bajo la curva en porcentaje, en la población de celíacos (los que comen gluten y los que no lo comen) vs controles sanos no celíacos, aunque genéticamente compatibles con la celiaquía. Panel C, niveles de Angiostatin cuando se comparan los valores de los celíacos que comen gluten con los controles sanos compatibles e incompatibles genéticamente con la enfermedad celiaca. Panel D, Curva ROC donde se compara la sensibilidad y especificidad, así como se expresa el área bajo la curva en porcentaje, del marcador Angiostatin en aquellos celíacos que comen gluten vs controles sanos genéticamente compatibles e incompatibles con los celíacos. Las barras representan el valor medio de las proteínas ± el error medio estándar. ** representa diferencias estadísticas de "p" en menos de 0.01, mientras que **** representa valores de "p" por debajo de 0.0001.
Figura 3. Valor predictivo respecto de ADAMTS-1 sólo o en su combinación con otros marcadores. Panel A, mejora del valor predictivo positivo entendido como la capacidad del marcador o de su combinación de identificar a los niños enfermos si el resultado del test es positivo, cuando se comparan con el valor individual de ADAMTS-1. Panel B, mejora del valor predictivo negativo entendido como la capacidad de la combinación entre marcadores de discriminar a los niños no celíacos cuando el resultado del test es negativo, al comparar con el valor individual de ADAMTS-1. Cuando las barras se encuentran por encima de la línea de puntos, reflejan mejoras en los valores predictivos respecto del marcador ADAMTS-1 cuando se analiza por sí sólo. Mientras que, si las barras se encuentran por debajo de la línea de puntos, reflejan valores predictivos menores y por tanto la combinación, no aportaría una mejora respecto de ADAMTS-1 cuando se analiza por si sólo.
Descripción detallada de la invención.
Ejemplo 1. Material y Métodos.
Ejemplo 1.1. Descripción de las muestras.
Para la realización de los estudios clínicos, se usaron muestras de sangre, en particular suero. Para la preparación del suero, 2 ml de sangre total fueron extraídos por punción venosa y se agregaron a un tubo para analítica de sangre. Las muestras de sangre fueron entonces procesadas en el mismo día de recepción. Una vez obtenida la sangre, para favorecer su coagulación, esta se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transcurrido el tiempo de incubación y tras comprobar la formación del coágulo, los tubos fueron centrifugados a 2000 g en una centrifuga para muestras serológicas, Beckman Coulter (Brea, CA, USA) , a 10°C durante 15 minutos. El suero, identificado como el sobrenadante sin restos de células sanguíneas, fue retirado. Aproximadamente unos 500^l de suero fueron obtenidos, para posteriormente ser fraccionados en diferentes tubos de menor volumen y así evitar ciclos de congelación/descongelación sobre la misma muestra. Todas las muestras fueron entonces almacenadas a -80°C hasta ser analizadas. Los sueros, fueron recopilados durante un periodo de 4 años. Los estudios clínicos realizados fueron aprobados por el comite ético de los respectivos hospitales donde se situaban los biobancos usados (Bucarest, Rumania y Tampere, Finlandia) . Las muestras fueron dadas voluntariamente por los tutores legales de los niños participantes, que firmaron un documento de consentimiento donde se les explicaba detalladamente el uso y los fines que se les iban a dar. Todos los datos clínicos de los participantes incluidos en el estudio, fueron debidamente almacenados de acuerdo a la legislación vigente y procesados con absoluta confidencialidad. Las muestras, a su vez, fueron etiquetadas mediante un código para mantener la confidencialidad de los participantes.
Ejemplo 1.2. Grupos experimentales, preparación de muestras y protocolos específicos de los ELISA usados para cada marcador.
Un total de 450 pacientes y controles, fueron usados en este estudio, lo que se corresponde con un estudio de fase clínica 2-3. Las muestras de los pacientes o de los controles procedieron de dos bio-bancos situados en Rumania y en Finlandia (como se ha descrito en el apartado 1.1) . Los pacientes o voluntarios incluidos en el estudio, tenían edades que llegaban hasta los 5 años. Los grupos experimentales incluidos en esta fase clínica, fueron:
1. Controles sanos genéticamente compatibles con los celíacos, es decir, positivos para HLA DQ2 y/o DQ8, pero que no son celiacos.
2. Controles sanos genéticamente incompatibles con la celiaquía y por consiguiente, que nunca pueden padecer la enfermedad.
3. Controles enfermos, es decir, niños que presentan alguna patología digestiva diferente a la enfermedad celiaca.
4. Grupo de celíacos cuando comían gluten. Estos niños celiacos, fueron diagnosticados mediante cambios morfológicos en biopsias intestinales, siguiendo la clasificación en la escala Marsh. Se consideró celiaquía cuando los valores de Marsh eran de III. Además, en estos niños donde se sospechaba celiaquía, el título de anticuerpos "antitransglutaminase-2" (anti-TG2) , "anti-endomisium" (EMA) y en algunos casos "antideamidated gliadine" fueron estudiados en las muestras serológicas. Sólo se aceptaron como participantes en este estudio, aquellos niños que presentaban títulos de anticuerpos positivos para EMA y muy elevados para TG2, y valores de Marsh de III en los estudios de la histología digestiva.
5. El mismo grupo de niños celíacos cuando no comían gluten. Estos niños celiacos, diagnosticados según lo descrito en el apartado anterior, no consumían gluten al menos, durante un año. Así durante esta dieta, todos estos niños presentaron valores negativos para los títulos de anticuerpos EMA y TG2, y mostraron valores de Marsh de 0 tras el análisis histológico de sus biopsias digestivas.
Los datos epidemiológicos muestran que por cada dos mujeres que padecen de celiaquía, solo hay un hombre, y por consiguiente las muestras experimentales se repartieron de la misma manera, es decir, 2 tercios de las muestras incluidas en los grupos controles o en los grupos de celíacos se correspondían con niñas y un tercio fueron muestras de niños. Los estudios clínicos realizados fueron aprobados por el comité ético de los respectivos hospitales donde se situaban los bio-bancos y fueron registrados de acuerdo a la legislación. Las muestras fueron dadas voluntariamente por los tutores legales de los niños participantes, que firmaron un documento de consentimiento donde se les explicaba detalladamente el uso y los fines que se les iban a dar. Todos los datos clínicos de los participantes en el estudio fueron debidamente almacenados de acuerdo a la legislación vigente y procesados con absoluta confidencialidad. Las muestras a su vez fueron etiquetadas con un código para mantener la confidencialidad de los participantes.
Las muestras de sangre se prepararon para la obtención de suero como se describió en el apartado 1.1. Una vez obtenido el suero, la muestra fue diluida en buffer de dilución (provisto con el kit) si así era necesario. Una muestra control fue usada para testar que los valores de los marcadores estudiados entraran dentro de la curva de calibrado del kit y la dilución se ealizo de acuerdo con esta información. A continuación, se detallan los protocolos de los ELISA usados para cada marcador.
Ejemplo 1.3. ELISA para ADAMTS-1.
Para la detección de ADAMTS-1 de origen humano en muestras de suero, un ELISA tipo "Sandwich" de Antibodies online GmbH (Aachen, Alemania, para más detalles sobre el kit revisar la Tabla 1) fue usado. Al ser un kit comercial, todos los reactivos y los estándares fueron preparados de acuerdo a las instrucciones dadas por el fabricante. Así, 100 μl de estándares o de muestra fueron agregados a una placa de 96 pocillos que contenían anticuerpos frente a ADAMTS-1 de origen humano. Las muestras de suero fueron diluidas 1:1000 en buffer de dilución provisto con el kit. Tras una incubación de 2 horas a 37°C, el contenido del pocillo fue descartado para eliminar el exceso de proteínas no unidas a los anticuerpos en el pocillo. Posteriormente, 100 μl de buffer de detección A, que consiste en un segundo anticuerpo contra ADAMTS-1 conjugado con "Biotin", fueron agregados a cada pocillo para ser incubados durante 1 hora a 37°C. Tras 3 lavados en buffer de lavado (suministrado con el kit) , 100 μl de buffer de detección B fueron agregados a cada pocillo e incubados durante 30 minutos a 37°C. Dicho buffer consiste en "Avidin" conjugada con "Horse Radish Peroxidase" (HRP) , ya que la "Avidin" presenta una muy alta eficiencia de union a la "Biotin". Finalmente, 90 μl de una solución de sustrato que contiene "3, 3, 5, 5-Tetramethylbenzine" (TMB) fue agregada a cada pocillo e incubada durante 10-20 minutos a 37°C. En aquellos pocillos donde ADAMTS-1 estaba presente, la adición de TMB produjo una reacción coloreada por su hidrolisis con la HRP. Para evitar la saturación en el color, la reacción fue detenida por la adición de 50 μl de ácido sulfúrico (suministrado con el kit) . Así, las variaciones de color, que son proporcionales a la cantidad de proteína presente, fueron detectadas en un espectrofotómetro a 450nm. Una curva donde se representaron los valores de concentración de los patrones estándares en el eje de las "X" frente a los valores de absorbancia en el eje de las "Y", fue usada para interpolar el valor de absorbancia de las muestras de los pacientes y controles. El valor de la concentración de ADAMTS-1 calculado para cada muestra, fue multiplicado por el factor de dilución y representado usando Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) . Todos los estándares y las muestras fueron incluidas por duplicado, para evitar las variaciones en los resultados debidos a errores metodológicos, y el valor final de la concentración se obtuvo como resultado de la media de las medidas de absorbancia de cada pareja de duplicados.
Tabla 1. Información de los kits ELISA usados en el presente estudio
Ejemplo 1.4. ELISA para "Angiostatin".
El test usado es un ELISA tipo "Sandwich" de Millipore (Burlington, MA, USA, para más detalles sobre el kit revisar la Tabla 1) , que viene preparado para la detección de "Angiostatin" de origen humano en muestras de suero. Todos los reactivos fueron preparados de acuerdo a las instrucciones facilitadas por el fabricante. El suero una vez preparado, fue diluido 3 veces en el buffer de dilución suministrado con el kit. Entonces, 100 μl de los estándares y de muestra de todos los grupos experimentales incluidos en el estudio, fueron agregados a una placa de 96 pocillos que contiene anticuerpos inmovilizados frente a la proteína. Tras una incubación de 2, 5 horas a temperatura ambiente, el contenido del pocillo fue descartado, quedando solo aquellas proteínas que se corresponden con la "Angiostatin" y que estaban unidas a los anticuerpos absorbidos a la superficie del pocillo. Posteriormente, 100 μl de anticuerpo frente a "Angiostatin" conjugado con "Biotin", fueron agregados a cada pocillo para ser incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras 3 lavados en buffer de lavado, (suministrado con el kit) , 100^l de buffer de detección que contiene HRP conjugada con "Streptavidine" fueron agregados a cada pocillo e incubados 1 hora a temperatura ambiente. Entonces, 100^l de sustrato TMB fueron agregados a cada pocillo y la presencia de HRP produjo un compuesto coloreado proporcional a la cantidad de proteína detectada, tras una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad. La reacción de color fue detenida por la adición de 50^l de solución stop (suministrado con el kit) , para medir las variaciones de color a 450nm. Finalmente, se realizo una curva donde se tomaron los valores de concentración de los patrones estándares y se representaron en el eje de las "X" frente a los valores de absorbancia en el eje de las "Y". Para poder calcular la concentración de "Angiostatin" de cada muestra, el valor de absorbancia fue interpolado en la curva de patrones. El valor así obtenido fue multiplicado por 3 ya que este es el factor de dilución usado y fue representado usando Prism 6 (GraphPad Software) . Para evitar la variabilidad en los resultados debido a errores metodológicos, cada estándar o muestra fueron incluidos por duplicado. La concentración final se obtuvo a partir de la media de los valores de absorbancia de cada pareja de duplicados.
Ejemplo 1.5. ELISA para NRGi-pi.
El test usado es un ELISA tipo "Sandwich" de Abcam (Cambridge, UK, para más detalles sobre el kit revisar la Tabla 1) . Este kit no estaba testado por el fabricante, para la detección en suero de NRG1-P1. Por esto, antes de su uso, hicimos pruebas donde observamos que los iveles de la proteína eran medibles. Todos los reactivos y los estándares fueron preparados previamente a la realización del kit de acuerdo al protocolo facilitado por el fabricante. Las muestras de los pacientes y de los voluntarios sanos, incluidos en el estudio clínico, no fueron diluidas y 100^l de las mismas fueron cargadas en sus correspondientes pocillos donde los anticuerpos anti- NRG1-P1 estaban inmovilizados. Tras una incubación durante la noche a 4°C, las proteínas no unidas a los anticuerpos fueron succionadas del pocillo, para posteriormente ser lavadas, durante 4 veces, en buffer de lavado. Así, 100^l de anticuerpos anti- NRG1-P1 conjugados con "Biotin", fueron agregados a cada pocillo, e incubados durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. Posteriormente, cada pocillo fue lavado 4 veces en buffer de lavado, para seguidamente agregar HRP conjugada con "Streptavidin". Tras una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente y en agitación, se repitieron los lavados descritos anteriormente, para agregar seguidamente 100^l de TMB. La reacción coloreada se produjo a temperatura ambiente durante 30 minutos en agitación y fue detenida mediante la adición de 50^l de solución de stop (suministrada en el kit) . La absorbancia a 450nm fue medida a consecuencia de la reacción de color producida y los valores de concentración de los estándares fueron representados en relación a sus valores de absorbancia. La concentración de NRG1-P1 en las muestras de pacientes así como en los controles sanos, fue calculada a partir del valor medio de las absorbancias respectivas de cada pareja de duplicados, tras la interpolación en la curva estándar. El valor de concentración calculado fue representado usando Prism 6 (GraphPad Software) .
Ejemplo 1.6. ELISA frente a "Pentraxin-3".
Para detectar los niveles de "Pentraxin-3", se usó un ELISA cuantitativo tipo "Sandwich" de Aviscera Biosciences (Santa Clara, CA, USA, para más detalles ver la Tabla 1) , que se compone de todos los reactivos necesarios para la identificación de la proteína en muestras de suero. Todos los reactivos fueron preparados de acuerdo a las instrucciones del fabricante, antes de la realización del kit. Entonces, 100 μl de los estándares y de muestra sin diluir, de todos los grupos experimentales incluidos en el estudio, fueron agregados a una placa de 96 pocillos que contiene anticuerpos inmovilizados frente a "Pentraxin-3". Tras una incubación de 2 horas a temperatura ambiente y en agitación, cada pocillo se lavo en buffer de lavado (suministrado por el kit) . Entonces, 100 μl de anticuerpo para la detección de "Pentraxin-3" conjugado con HRP fueron agregados a cada pocillo, e incubados 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Una nueva serie de lavados fue realizada, para inmediatamente agregar 100^l del sustrato TMB que sería incubado durante 15 minutos a temperatura mbiente en condiciones de oscuridad. La reacción de color, del azul al amarillo proporcional a la concentración de proteína existente en la muestra, fue detenida en 100 μl de solución de parada (suministrada por el kit) . La densidad óptica en cada pocillo, fue medida a 450nm durante los primeros 15 minutos después de detener la reacción de color. Los valores de concentración de los patrones estándares se representaron frente a sus valores de absorbancia, donde se interpoló el valor de absorbancia de las muestras problema y así se calculo su concentración. El valor de concentración, así obtenido, fue representado usando Prism 6 (GraphPad Software) . Para evitar la variabilidad en resultados debido a errores metodológicos, cada estándar así como muestra fueron incluidos por duplicado. La concentración final se obtuvo a partir de la media de los valores de absorbancia de cada pareja de duplicados.
Ejemplo 1.7. Análisis estadístico de los resultados de los ELISA.
Una vez finalizados todos los test ELISA, los valores de la concentración de las proteínas fueron introducidos en Prism 6 (GraphPad Software) , para su posterior análisis estadístico. Antes de seleccionar el test estadístico apropiado, un primer muestreo de los datos fue realizado para determinar la homocedasticidad de la varianza para cada grupo de proteínas. Si las variables son homocedásticas, es apropiado usar un test ANOVA, mientras que si no son homogéneas, el test Kruskal-Wallis es la alternativa no paramétrica de elección. En el caso de nuestro resultados, todas las proteínas estudiadas resultaron ser no homocedásticas, y por consiguiente se prefirió el uso de un test Krukal-Wallis. Consideramos los valores significativos, cuando como resultado del test estadístico, obtuvimos diferencias del valor "p" de probabilidad menores de 0.05. A los grupos de proteínas que resultaron significativas, se les incluyó en un segundo test "post hoc" donde se estudiaron las diferencias existentes en cada grupo experimental mediante el test de "Dunns". Todos los valores de las proteínas se representaron en diagramas de barras donde la significación se expresa por asteriscos, (1 asterisco refleja diferencias de al rededor de 0.05, 2 representan diferencias de menos de 0.01, 3 ó más representan valores tremendamente significativos con diferencias de 0.001 ó 0.0001 respectivamente) . A su vez, el error medio estándar fue calculado y representado en cada gráfica. En aquellos marcadores donde se observaron diferencias significativas respecto a sus grupos control, la especificidad y sensibilidad del marcador fue estudiada mediante la elaboración de una curva de característica operativa del receptor o ROC. Esta representación, relaciona la especificidad y sensibilidad de un marcador considerando la cantidad de valores positivos verdaderos frente a los falsos positivos, así como los negativos verdaderos frente a os falsos negativos. Sólo se aceptaron aquellas curvas ROC que resultaron estadísticamente significativas, y en éstas, el área bajo la curva que representa el porcentaje de la sensibilidadespecificidad fue calculado. Cuando este área fue mayor del 90%, el marcador se acepto como muy fiable, valores de entre 80% y 90% se tomaron como fiables, mientras que los valores de menos del 80% se consideraron poco o muy poco fiables.
Ejemplo 2. Resultados.
Ejemplo. 2.1. Análisis de los marcadores encontrados en el estudio clínico.
Inicialmente, se realizó un estudio de proteómica donde encontramos una serie de marcadores que son comunes entre los celíacos cuando no comen o comen gluten pero diferentes a los controles sanos que son, NRG1-P1, "Pentraxin-3" y ADAMTS-1. Además se incluyó "Angiostatin". Así un total de 450 muestras de suero procedentes de pacientes o controles sanos fueron incluidas en esta fase, para identificar la presencia de estos marcadores medidos mediante ELISA realizados en muestras individuales, no tipificados para uso clínico. Dos tercios de las muestras incluidas procedían de niñas mientras que un tercio de los participantes tanto pacientes como controles se correspondieron con niños. La edad media esta por debajo de 5 años aunque en algunos casos incluimos pacientes o controles de más edad. Los pacientes celíacos incluidos en esta fase clínica eran celíacos que no comían gluten o los mismos celíacos cuando comían gluten. Por otro lado, un grupo de controles sanos que no son celíacos aunque comparten la genética de los celíacos, fueron incluidos en el estudio, junto con un grupo de niños sanos que no comparte la genética de los celíacos. La Figura 1, muestra los valores circulantes de las proteínas NRG1-P1 y "Pentraxin-3" de los celíacos en relación con los controles. El marcador NRG1-P1 (Figura 1A) , es un marcador que aparece aumentado en el suero de niños celíacos independientemente de si comen o no gluten, cuando éstos se comparan con los niveles en todos los controles, es decir, aquellos que son genéticamente compatibles o incompatibles con la celiaquía. La proteína "Pentraxin-3" aparece disminuida en los celíacos que no comen gluten, cuando se comparan sus valores con los controles sanos no genéticamente compatibles con la celiaquía (como muestra la Figura 1B) .
ADAMTS-1 (Figura 2A) apareció aumentada en el suero de todos los celíacos, es decir, de aquellos que comen o no gluten, cuando se comparan con los controles no celíacos pero que comparten su genética. En el grupo de controles que difieren con la genética de los celíacos, os niveles de ADAMTS-1 circulantes fueron mayores que en celíacos (resultado no mostrado) . A su vez la curva ROC de especificidad y sensibilidad del marcador, mostró valores del 92.26% (Figura 2B) . Por otro lado, Los niveles en el suero de "Angiostatin" se encontraron aumentados en niños celíacos durante la fase activa de la enfermedad, es decir, aquellos que comen gluten, cuando se comparan con todos los controles sanos, aquellos que comparten o no la genética de los celíacos (Figura 2C) . Es importante destacar que cuando los niños dejan de comer gluten, sus valores se normalizan y se hacen similares a los controles (resultado no mostrado) . El análisis de especificidad y sensibilidad mostrado en la Figura 2D, mostró valores ROC del 95.11%.
De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio clínico, ambas proteínas, ADAMTS-1 y "Angiostatin", constituyen marcadores fiables para la identificación de los celíacos. Es interesante destacar, que ADAMTS-1 es un marcador de los celíacos independientemente del estadio de la enfermedad y por tanto es útil para el pronostico de la celiaquía antes de la incorporación del gluten en la dieta. Este marcador, aparece aumentado en relación con un control que es compatible genéticamente con los celíacos, (recordemos que el DQ2/DQ8 del HLA aparece en todos los celíacos pero también se comparte con otro 30% de la población sana) . Como los niveles de ADAMTS-1 son específicos de los celíacos, sus valores pueden ser usados para discriminar quienes son celíacos de los que no lo son, incluso cuando comparten la misma genética DQ2 o DQ8 positiva para el HLA. En otras palabras, podría usarse para discriminar en ese 30% de la población genéticamente compatible con la celiaquía, quienes son realmente celíacos. A su vez, los valores de ADAMTS-1 no se modifican en relación con el gluten, es decir, da igual que este presente o ausente en la dieta, por tanto es un marcador adecuado para pronosticar la aparición de la enfermedad antes de la incorporación del gluten. Además, ADAMTS-1 y "Pentraxin-3" pueden ser buenos aliados, ya que los valores de esta última, aparecen disminuidos en el suero de niños celíacos que no comen gluten, en relación con los controles sanos que son o no compatibles con la genética de los celíacos. Otra combinación posible, es la identificación de ADAMTS-1 junto con NRG1 P1, ya que esta última proteína aparece aumentada en el suero de niños celíacos independientemente del estado de la enfermedad, y difiere de los valores de los controles independientemente de si son o no genéticamente compatibles. Una de las limitaciones en el uso de ADAMTS-1, es que es una proteína eficaz para discriminar la celiaquía en niños que tienen una genética compatible con la enfermedad. Sin embargo, de acuerdo a nuestros resultados, su combinación con "Pentraxin-3" o NRG1 P1 puede facilitar diferenciar a los no elíacos, aun cuando estos, no sean compatibles con la genética. En otras palabras, la identificación de ADAMTS-1 especialmente junto con NRG-1 P1 y "Pentraxin-3", podría estar indicada para discriminar aquellos casos de niños que no tienen una genética compatible de la celiaquía, sin necesidad de hacer un test genético. Finalmente, la "Angiostatin" aparece aumentada exclusivamente en niños celíacos que están comiendo gluten, mientras que sus controles sanos, los controles sanos con igual genética que los celíacos y los niños que son celíacos pero que no comen gluten, presentan valores similares y que están muy por debajo de los encontrados en celíacos de fase activa. "Angiostatin", por tanto, constituye un marcador de fase activa, es decir, cuando se incorpora gluten en la dieta y seria un complemento de ADAMTS-1. La Figura 3 muestra el efecto de la combinación de los marcadores para los valores predictivos positivo y negativo, cuando se comparan con el valor individual del marcador ADAMTS-1. Es de especial importancia destacar, que el valor predictivo negativo aumenta considerablemente en la combinación de todos los marcadores con ADAMTS-1. Recordemos que el valor predictivo negativo, es la capacidad de un marcador de discriminar aquellos pacientes negativos cuando los resultados son negativos. Además, los valores predictivos positivos mejoran sensiblemente en la combinación de los marcadores, que cuando ADAMTS-1 se estudia de manera individual (Figura 3) . Así pues, ADAMTS-1 es un buen marcador para discriminar quienes en la población genéticamente compatible con los celíacos son realmente celíacos, que junto con NRG1 P1 y "Pentraxin-3", podría facilitar el pronóstico de la celiaquía antes, incluso, de la incorporación del gluten en la dieta. Estos marcadores, serian de elección en niños que tiene entre 6 a 8 meses de edad. Este rango de edad, no es incompatible con el hecho de que estos marcadores puedan ser estudiados en niños de más edad, ya que nuestros datos soportan esto (en nuestro estudio clínico se incluyeron niños de edades mayores) . Por otro lado, "Angiostatin" combinada con ADAMTS-1 (y alternativamente junto con NRG1 P1 y "Pentraxin-3") , constituirían un marcador para discriminar a aquellos niños que son celíacos y que están consumiendo gluten. Esta identificación sería útil especialmente en fases iniciales de la enfermedad, donde no necesariamente existe un cuadro clínico, o alguno de los marcadores serológicos usados actualmente en clínica, no es detectable. Recordemos que especialmente en niños, los marcadores basados en anticuerpos que se usan actualmente en el diagnóstico, pueden tardar hasta 5 años o incluso más tempo en desarrollarse. La combinación de "Angiostatin", ADAMTS-1 y alternativamente NRG1 P1 y "Pentraxin-3" sería, por tanto útil, para el reconocimiento de la celiaquía en niños de más de 8 meses de edad. Además, durante la incorporación de la dieta sin gluten en los celiacos, los niveles de "Angiostatin" disminuyen rogresivamente, mientras que ADAMTS-1 no se modifica, pero "Pentraxin-3" disminuye incluso por debajo de los controles en la dieta sin gluten. Así, esta combinación de "Angiostatin" con "Pentraxin-3" y ADAMTS-1, sería útil para monitorizar la calidad de la dieta sin gluten, además de permitir el seguimiento de la remisión de la enfermedad en el celiaco cuando el gluten no está presente.
Ejemplo 2.2. Detección de los marcadores por ELISA.
Para la detección de los marcadores, se pretende el desarrollo del siguiente kit ELISA tipo sándwich que contiene los siguientes reactivos:
1. Placa multipocillo de poliestireno apta para la absorción de anticuerpos.
2. Tampón carbonato-bicarbonato para unir los anticuerpos al poliestireno de la placa.
3. Anticuerpos frente a una región externa de la proteína o frente al N terminal. Las Tablas 2-6 muestran los epítopos de las proteínas frente a los que se van a construir los anticuerpos.
4. Estándares a base de proteínas recombinantes que contienen las secuencias detectables por los anticuerpos descritos en las Tablas 2-6.
5. Buffer de lavado y dilución a base de fosfato buffer salino o tris buffer salino mezclado con tween 20 o triton entre 0.05% al 5%.
6. Buffer de detección A, que contiene fosfato buffer salino o Tris buffer salino mezclado con algún anticuerpo descritos anteriormente, previamente biotinilado mediante el uso de biotina.
7. Solución de detección B, que contiene estreptavidina o avidina, conjugada con peroxidasa de rábano en buffer fosfato salino o Tris buffer salino.
8. Solución de revelado donde se agrega "3, 3, 5, 5-Tetramethylbenzine" (TMB) en fosfato buffer salino o Tris buffer salino.
9. Ácido sulfúrico para parar la reacción del TMB.
Tabla 2. Péptidos candidatos para la elaboración de anticuerpos frente a ADAMTS-1. Se representan la secuencia de aminoácidos, así como el número del aminoácido de inicio y final de la secuencia dentro de la cadena peptídica de la proteína. Cada anticuerpo se producirá frente a cada secuencia.
Comienzo 
Final 
Secuencia 
190 248 SEQ ID NO: 1
884 915 SEQ ID NO: 2
3 32 SEQ ID NO: 3
464 485 SEQ ID NO: 4
611 632 SEQ ID NO: 5
162 180 SEQ ID NO: 6
746 764 SEQ ID NO: 7
563 579 SEQ ID NO: 8
584 599 SEQ ID NO: 9
105 118 SEQ ID NO: 10
337 350 SEQ ID NO: 11
677 690 SEQ ID NO: 12
493 505 SEQ ID NO: 13
49 60 SEQ ID NO: 14
634 645 SEQ ID NO: 15
526 536 SEQ ID NO: 16
716 726 SEQ ID NO: 17
729 739 SEQ ID NO: 18
919 929 SEQ ID NO: 19
315 324 SEQ ID NO: 20
551 560 SEQ ID NO: 21
Tabla 3. Péptidos candidatos para la elaboración de anticuerpos frente a "Pentraxin-3". Se representan la secuencia de aminoácidos así como el numero del aminoácido de inicio y final de la secuencia dentro de la cadena peptídica de la proteína. Cada anticuerpo se producirá frente a cada secuencia.
i
100 112 SEQ ID NO: 23
136 147 SEQ ID NO: 24
312 318 SEQ ID NO: 25
347 356 SEQ ID NO: 26
380 SEQ ID NO: 27
Tabla 4. Péptidos candidatos para la elaboración de anticuerpos frente a NRG1 p1. Se representan la secuencia de aminoácidos así como el numero del aminoácido de inicio y final de la secuencia dentro de la cadena peptídica de la proteína. Cada anticuerpo se producirá frente a cada secuencia.
Tabla 5. Péptidos candidatos para la elaboración de anticuerpos frente a "Angiostatin". Se representan la secuencia de aminoácidos así como el numero del aminoácido de inicio y final de la secuencia dentro de la cadena peptídica de la proteína. Cada anticuerpo se producirá frente a cada secuencia.
48 95 SEQ ID NO: 36
112 121 SEQ ID NO: 37
130 151 SEQ ID NO: 38
183 207 SEQ ID NO: 39
220 239 SEQ ID NO: 40
244 261 SEQ ID NO: 41
272 295 SEQ ID NO: 42
299 342 SEQ ID NO: 43
348 367 SEQ ID NO: 44
Tabla 6. Péptidos candidatos para la elaboración de anticuerpos frente a HLA DQ. Se representan la secuencia de aminoácidos así como el número del aminoácido de inicio y final de la secuencia dentro de la cadena peptídica de la proteína. Cada anticuerpo se producirá frente a cada secuencia.
127 139 SEQ ID NO: 47
Previo a la detección de las proteínas, las placas de 96 pocilios son tratadas con tampón bicarbonato-carbonato que contiene hasta un máximo de 20^g de anticuerpos. Este proceso de "coating" se realiza durante la noche a 4 C. Todos los reactivos y búferes de lavado y detección son preparados a la dilución correcta. Una muestra de, suero, plasma, sangre total o saliva u orina diluidas en buffer de dilución o no, se pipetean en la placa de 96 pocillos que contiene un "coating" de anticuerpos frente a regiones internas de la proteína o frente al N terminal, como se describe en las tablas correspondientes. También se agregan los estándares que se corresponden con proteínas recombinantes que contienen secuencias de aminoácidos detectados por los anticuerpos incluidos en este ensayo. Tras un periodo de incubación de un máximo de 2-4 horas a 37°C, el contenido del pocillo se elimina, quitando así el exceso de proteína o de estándares que no se han unido a los anticuerpos que están en el pocillo. En este punto se realzan unos lavados para eliminar el exceso de proteína que aun pueda quedar residual. Entonces se agrega el buffer de detección A, que consiste en un segundo anticuerpo contra el marcador conjugado con biotina, Estos se incuban desde minutos hasta varias horas a 37°C. Tras una serie de lavados en buffer de lavado (como máximo 4) , se agrega a cada pocillo el buffer de detección B que contiene avidina o estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano. Tras una incubación durante unos minutos a varias horas a 37°C se agrega una solución de sustrato que contiene TMB de 1 a 30 minutos a 37°C. Para evitar la saturación en el color, la reacción es detenida por la adición de ácido sulfúrico. Las variaciones de color resultantes, son proporcionales a la cantidad de proteína presente, y son detectadas en un espectrofotómetro a unos 450nm. Los resultados se obtienen a partir de la representación de los patrones estándares en el eje de las "X" frente a los valores de absorbancia en el eje de las "Y". El valor de la absorbancia de las muestras introducidas en el kit será calculado por su interpolación en la recta formada por los estándares.
Ejemplo 2.3. Detección de los marcadores por lateral flow
Para la realización del lateral flow los componentes que se van a usar son:
1. "Sample" y "Conjugate" pad: Son de celulosa para la muestra "sample pad" y para el "conjugate pad", es decir, donde se realiza la unión de la muestra con los anticuerpos, se usarán fibra de vidrio o poliéster o celulosa. Una tercera membrana puede ser usada omo "Stacking pad", es decir una superficie que da más oportunidad a los marcadores a unirse con los anticuerpos conjugados. Esta se usará de ser necesario, para mejorar la sensibilidad del resultado. Esta membrana de "stacking" es de poliéster, celulosa o fibra de vidrio con tamaños entre 0.1-0.5mm, 0.5-1mm, 0.2-0.6mm respectivamente.
2. Membrana: La membrana a usar, es de nitrocelulosa o polyvinylidene fluoride (PVDF) , o nylon o de Polythersulfone, con un tamaño de poro de entre 0.1 a 3 |im.
3. Absorbent pad que es de celulosa.
4. Carcasa de plástico para montaje y una tira "backing" adhesiva para ensamblar todos los componentes.
5. Anticuerpos: los epítopos de los anticuerpos se encuentran descritos en las Tablas 2-6.
Los anticuerpos serán conjugados con partículas de oro o con partículas de látex o con partículas de PVDF o partículas de poliestireno, de un máximo de 150nm. En la línea de ensayo en el kit del lateral flow, anticuerpos frente a otros epítopos diferentes de aquellos usados para unir el marcador a la nanopartícula de oro o látex o PVDF o poliestireno, serán usados para capturar los complejos marcador/anticuerpos conjugados con nanopartículas. Para las muestras serológicas un control de IgG será usado y para las muestras de saliva un control de amilasa o mucina. En su ausencia un control con diferentes concentraciones del marcador conocidas podrá ser usado.
6. Otros reactivos: solución hipotónica de cloruro sódico o agua destilada para rotura de los eritrocitos.
Este lateral flow es multiplex, significa que o bien diferentes tiras reactivas para cada marcador se ponen en una misma carcasa o en la misma tira reactiva se agregan los anticuerpos unidos a partículas en colores distintivos para la detección de cada marcador individualmente. En este último caso, cada marcador daría una banda de color diferente. Una gota de sangre del dedo es tomada por punción y agregada a un vial que contiene una solución de cloruro sódico o agua destilada para hemolizar la sangre. Alternativamente el "sample pad" puede contener la solución de cloruro sódico o agua destilada o cualquier material, para hemolizar la sangre, y así evitar que el usuario tenga que realizar este paso. La muestra de sangre esta calibrada por el uso de un capilar con medidas entre 10 a 100 microlitros de sangre o cuando se observe que el "sample pad" ya no absorbe más muestra. Para la cuantificación de los niveles del marcador, se realiza una foto de la tira reactiva. La intensidad del color de la banda, que es proporcional a la cantidad de proteína circulante y por tanto representada por la cantidad de marcador unido a los complejos anticuerponanopartícula, es medida mediante un procesamiento de imagen en dispositivo portátil. Otra opción es medir la presencia, ausencia del marcador jugando con los valores umbrales de los marcadores, definido como el valor por encima o debajo del cual el resultado es positivo. Para el HLA el presencial genotipo del celiaco dará una banda positiva, mientras que su ausencia dará una banda negativa. Para ADAMTS-1 (para los HLA DQ2 y DQ8 positivos) , NRG1 pi y "Angiostatin" los niveles del marcador son positivos cuando sobrepasan un valor de concentración umbral. El kit contendrá la concentración de anticuerpo necesaria para detectar dicho valor umbral, significa que los resultados negativos para celiaquía darán bandas negativas, es decir no hay banda o son muy tenues, ya que los anticuerpos en el kit no pueden detectar los valores por debajo del umbral. Mientras que el kit es positivo cuando para estos marcadores aparece una banda clara. Para "Pentraxin-3" es al contrario, valores positivos para celiaquía implican que no aparece la banda o es muy tenue, mientras que valores negativos para celiaquía implican la existencia de una banda clara. La lectura de la positividad o negatividad de la combinación de los marcadores y de sus bandas, son el resultado del kit, que en este caso, puede visualizarse a simple vista o alternativamente por procesamiento de imagen en dispositivo portátil.
