Proceso para la extracción acuosa de biosurfactantes a partir de los licores de lavado de maíz o "Corn steep liquor"
Sector de la técnica
La presente invención pertenece al sector de la obtención de detergentes de origen natural, denominados biosurfactantes.
El objeto principal de la invención es la obtención de un extracto biosurfactante obtenido a partir de los licores de lavado de maíz (CSL) , también denominados "Corn steep liquor" generados durante el fraccionamiento del maíz por vía húmeda, empleando una disolución acuosa salina tamponada o una disolución tampón como único agente extractante.
Antecedentes de la invención
Los licores de lavado de maíz (CSL) son un residuo de la industria de fraccionamiento del maíz por vía húmeda (Singh y Eckhoff, 1996, Yan et al 2005, Ramírez et al 2008) . Estos licores están compuestos por agua y sólidos (Ramírez et al 2008) . La concentración de sólidos en estos licores puede llegar hasta el 50% en peso, cuando son sometidos a un proceso de evaporación de agua. De hecho la mayoría de los licores de lavado de maíz que se comercializan como suplemento nutricional, de bajo coste, en procesos biotecnológicos o para alimentación animal, contienen alrededor de un 50% en sólidos (véase el porcentaje en sólidos de los licores de lavado de maíz comercializados por Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology o FeedStimulants) . Los fracción sólida de estos licores está formada principalmente por biomasa microbiana que se va muriendo durante el proceso de maceración así como por sustancias que no han alcanzado el grado de solubilidad necesario procedentes del maíz. Es conocido que durante el proceso de maceración del maíz, para su fraccionamiento por vía húmeda crecen bacterias lácticas, entre otros microorganismos (Yang et al 2005) , por lo que los licores de lavado de maíz contienen una elevada concentración de ácido láctico.
Por otra parte en los últimos años se ha demostrado la existencia de biosurfactantes en los licores de lavado de maíz (CSL) en varias publicaciones y patentes (Vecino et al 2014, Vecino et al 2015, Rodriguez-López et al 2017, Patente WO2014/044876 A, Patente ES 2424 399, Patente ES 2 527 366 B1) , procedentes de la fermentación espontánea de estos licores por parte de microorganismos que crecen durante el proceso de maceración del maíz. Hasta el momento el único proceso descripto para la obtención de estos biosurfactantes a partir del CSL consiste en una extracción líquido-líquido, utilizando disolventes orgánicos como el cloroformo o el acetato de etilo principalmente (Patente WO2014/044876) . Vecino et al 2015 también recoge el uso de otros disolventes como Isoamyl alcohol; Tributil fosfato (TBP) ; Metil butil éter (MTBE) ; Tricloroetileno (TCE) ; Diclorometano; Xileno; Hexano Heptano, además de cloroformo y acetato de etilo. En la Figura 1 se muestra en forma de diagrama de diagrama de flujo del proceso seguido hasta el momento, para obtener biosurfactantes a partir de los licores de lavado de maíz.
Subrayar que el uso de disolventes orgánicos puede suponer un inconveniente a la hora de aplicar este extracto biosurfactante en determinados sectores industriales, principalmente en el sector farmacéutico, por lo que sería interesante utilizar métodos alternativos que permitiesen obtener biosurfactantes, a partir de estos licores, utilizando extractantes más biocompatibles y de menor impacto ambiental.
A continuación se recogen algunos usos demostrados bibliográficamente de los biosurfactantes obtenidos de los licores de lavado de maíz mediante extracción líquido-líquido con disolventes orgánicos: i) a nivel de tratamiento de suelos y lodos se ha observado que el uso de este extracto biosurfactante favorece la solubilización y posterior biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (Vecino et al 2014, Vecino et al 2015) ; ii) a nivel cosmético se han realizado ensayos con este extracto biosurfactante sobre pelo humano (Rincón- Fontán et al 2016, Rincón Fontán et al 2017) , observándose una mejora en las características físicas de la cubierta pilosa, tras el tratamiento del mismo con el extracto biosurfactante obtenido del (CSL) , en comparación con el surfactante químico dodecyl sulfato sódico (SDS) ; iii) también se ha evaluado la utilización del extracto biosurfactante en la formulación de nanopartículas de oro y plata (Gómez-Graña et al 2017) , observándose que este extracto no sólo tiene capacidad surfactante, sustituyendo al surfactante catiónico Bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) , sino que además tiene capacidad reductora evitando la utilización de agentes reductores sintéticos en la formulación de estas nanoemulsiones. Las partículas de oro son introducidas en muchas formulaciones cosméticas con el fin de favorecer la nutrición, la luminosidad y la vitalidad de la piel. Además, Rodríguez-López et al 2019 también ha corroborado la mejora de la permeación de principios activos a través de la piel, en presencia del extracto biosurfactante obtenido a partir de los licores de lavado de maíz, mediante extracción con disolventes orgánicos. Por otra parte, López-Prieto et al 2019 ha aplicado este mismo extracto biosurfactante en la formulación de yogures bebibles con el fin de mejorar sus propiedades reológicas, no viéndose afectada la biomasa probiótica contenida en el yogurt.
Como ya se ha mencionado anteriormente, los licores de lavado de maíz presentan un elevado contenido de sólidos, generalmente 50% w/w. Un elevado porcentaje de estos sólidos es representado por la biomasa microbiana que crece durante el proceso de maceración del maíz (Ramírez et al 2008) . Dentro de la flora microbiana presente en los licores de lavado de maíz, se encuentran, entre otras, bacterias lácticas. En diversos trabajos ha quedado demostrada la presencia de biosurfactantes adheridos a la membrana plasmática de este tipo de bacterias (Velraeds et al 1996, Rodríguez-López et al 2018, Vecino et al 2018) , aunque hasta el momento la extracción de biosurfactantes a partir de la fracción sólida de los licores de lavado de maíz, mediante extracción sólido- líquido, no ha sido contemplada.
Por otra parte, resaltar que no existen evidencias hasta el momento de la obtención de biosurfactantes a partir de licores de lavado de maíz utilizando como agente extractante una disolución acuosa salina.
Como se ha mencionado con anterioridad los biosurfactantes se pueden aplicar en distintos campos industriales y cada extracto biosurfactante se puede considerar único, debido a que cada microorganismo produce biosurfactantes de forma muy específica. Así pequeños cambios en la composición del medio de fermentación o en las variables de operación hacen que los microoganismos produzcan biosurfactantes diferentes a nivel de composición, variando en muchos casos la longitud de los ácidos grasos o los aminoácidos que los conforman (Mata-Sandoval et al 2001, Singh et al 2014, Vecino et al 2017) . De hecho, se ha demostrado que, incluso bajo las mismas condiciones de operación, un mismo microorganismo puede producir biosurfactantes diferentes, en función de la fase de crecimiento en la que se encuentre (Velraeds et al 1996, Angelo et al 2003) .
Actualmente, en cuanto a los usos de los biosurfactantes, la industria que mejor puede afrontar su inclusión en formulaciones, es la industria cosmética, dado al alto valor añadido de sus productos. Esto es debido a que la producción biotecnológica de biosurfactantes, mediante fermentaciones controladas, requiere de grandes inversiones. En la Tabla 1 se recogen los biosurfactantes incluidos hasta el momento en la lista Europea de Ingredientes cosméticos (Coslng) .
Tabla 1. Lista de biosurfactantes ineludidos en el Coslng y sus funciones
Biosurfactante Microorganismo Funciones Pseudomonas Emoliente Rhamnolípidos
aeruginosa Emulsionante Soforolípidos obtenidos Candida bombicola Acondicionador utilizando como sustrato Protector hidrolizados de palma Detergente Antioxidante Antoseborreico Soforolípidos Starmerella bombicola Limpiador Emulsionante Surfactante Antimicrobiano Soforolípidos obtenidos Limpiador Usando como sustrato Candida bombicola Desodorante colza Surfactante Limpiador Surfactina sódica Bacillus subtillis Emulsionante Gelificante Surfactante
Explicación de la invención
Se propone un proceso para la obtención de biosurfactantes de bajo coste, a partir de la fracción sólida de los licores de lavado de maíz, generados durante el fraccionamiento del maíz por vía húmeda, utilizado como único agente extractante una disolución acuosa salina tamponada o una disolución tamponada. Tras el análisis del extracto biosurfactante, utilizando espectrometría de masas tipo electrospray, se observa que el extracto biosurfactante obtenido por esta vía presentan unos biomarcadores diferenciadores de los demás biosurfactantes recogidos en la bibliografía y además presenta un aspecto y capacidad tensoactiva diferente al extracto biosurfactante obtenido a partir de los licores de lavado de maíz mediante extracción con disolventes orgánicos, por tanto se puede deducir que los licores de lavado de maíz contienen distintos tipos de biosurfactantes, probablemente producidos por diferente clases de microorganismos.
Explicación detallada de la invención
Se tomaron licores de lavado de maíz, procedentes del proceso de fraccionamiento del maíz por vía húmeda, y se sometieron a un proceso de centrifugación, con el fin de obtener la fracción sólida contenida en estos licores, la cual, una vez eliminado el sobrenadante, se lavó varias veces con agua desionizada a temperatura ambiente repitiéndose el proceso de centrifugado, entre cada ciclo de lavado.
Posteriormente los sólidos, procedentes de los licores de lavado de maíz, una vez lavados y centrifugados, se sometieron a un proceso de extracción con una solución acuosa salina tamponada (PBS) que puede presentar las siguientes sales: cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato de potasio. El proceso de extracción se llevó a cabo durante al menos 1 h, a temperatura ambiente. Tras la extracción se centrifugó la disolución salina y la racción sólida de los licores de lavado de maíz, obteniéndose un extracto biosurfactante y un precipitado sólido, que se desechó.
Además se realizaron extracciones con el mismo agente extractante pero eliminando el NaCI (disolución acuosa tampón) . En este caso, para obtener rendimientos equiparables hubo que trabajar a temperaturas superiores a 50°C, siguiendo el mismo protocolo de lavado y centrifugado que el descrito con anterioridad.
La Figura 2 recoge, a modo de ejemplo, el esquema del nuevo proceso propuesto para la obtención de biosurfactantes a partir de los licores de lavado de maíz, mediante extracción con PBS.
Una vez obtenido el extracto biosurfactante, este fue dializado y liofilizado, para posteriormente someterlo a varios análisis entre los que se incluyen análisis elemental, capacidad surfactante (en base a medición de la tensión superficial) , cálculo de la concentración micelar crítica, evaluación de la capacidad espumante y análisis de masas mediante espectrometría de masas de tipo electrospray.
Breve descripción de los dibujos
Para complementar la descripción realizada y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Figura 1. Esquema del proceso propuesto hasta el momento para la obtención de biosurfactantes a partir de los licores de lavado de maíz. En este esquema los licores de lavado de maíz, los cuales pueden contener un porcentaje en sólidos de entre el 18 y 50%, son sometidos a un proceso de extracción líquido- líquido con disolventes orgánicos tipo acetato de etilo o cloroformo, durante 1-2 h, dependiendo del disolvente seleccionado. Durante este proceso los biosurfactantes contenidos en los licores de lavado de maíz pasan a la fase orgánica, la cual posteriormente se separa de la fase acuosa de los licores y se somete a un proceso de destilación a vacío, obteniéndose un extracto biosurfactante. El extracto biosurfactante obtenido presenta un aspecto oleoso y no tiene capacidad espumante.
Figura 2. Esquema propuesto en esta invención para la obtención de biosurfactantes a partir de los licores de lavado de maíz. En este esquema se parte de los licores de lavado de maíz con un 50% en sólidos, los cuales son centrifugados, obteniéndose un precipitado que es lavado varias veces con agua, desechándose el sobrenadante. Posteriormente el precipitado es sometido a un proceso de extracción con PBS (tampón fosfato salino) o simplemente con tampón fosfato, durante al menos 2 h entre 20°C y 70°C. Tras el proceso de extracción se obtiene una fase acuosa con biosurfactantes, la cual es recuperada mediante centrifugación y sometida a un proceso de diálisis. De este modo las sales presentes son eliminadas. Finalmente, la disolución resultante es liofilizada, obteniéndose un polvo blanco con capacidad biosurfactante, capaz de formar espuma en disolución acuosa.
Figura 3. Espectro de masas del extracto biosurfactante objeto de estudio, en el cual se observa una serie de biomarcadores entre 905, 1034 y 1141 m/z que se corresponden con la masa del biosurfactante objeto de esta invención y que cae dentro del rango de masas de los biosurfactantes de naturaleza lipopeptídica.
Realización preferente de la invención
Se realizaron extracciones a licores de lavado de maíz suministrados por FeedStimulants (Utrecht, Países Bajos) .
El extracto objeto de esta invención se obtuvo, de los licores de lavado de maíz, tras centrifugación de los mismos y tras someter al precipitado, una vez separado del sobrenadante, a una extracción acuosa con PBS. Como alternativa también se puede utilizar agua tamponada con tampón fosfato a temperaturas en torno a 50°C-65°C. En la Tabla 2, se recoge a modo de ejemplo algunas de las condiciones empleadas durante el proceso de extracción.
Tabla 2. Condiciones de obtención del extracto a partir de licores de lavado de maíz.
Disolvente Agente Extractante Tiempo (h) Temperatura (°C)
Agua PBS 2 Ambiente
Agua PBS exento de NaCI 1.5 65°C
Tras la extracción, el análisis del extracto biosurfactante (dializado y liofilizado) reveló que este es capaz de reducir la tensión superficial del medio en 16-20 unidades y que presenta una concentración micelar crítica (CMC) en torno a 420 mg/L, aunque la CMC puede variar en función del grado de pureza alcanzado durante el proceso de extracción. El análisis por espectrometría de masas (Figura 3) revela que el biosurfactante producido es un lipopéptido.
Tras la caracterización se observa que el extracto biosurfactante obtenido presenta un aspecto y una composición diferente al biosurfactante extraído a partir de los licores de lavado de maíz mediante extracción con disolvente orgánicos. Así el extracto biosurfactante obtenido mediante extracción con disolventes orgánicos tiene un color amarillo, es viscoso, de aspecto aceitoso y no presenta capacidad de formar espuma. Sin embargo, el extracto biosurfactante, objeto de esta invención, tiene aspecto de polvo blanco y presenta capacidad de formar espuma. En cuanto a su composición elemental el extracto objeto de esta invención está compuesto por un 12.5% de N, 42.5% de C, 6.2% de H y menos de un 0.3% de azufre.
Tanto la composición como el aspecto y propiedades físico-químicas del extracto biosurfactante objeto de esta invención son diferentes al extracto biosurfactante extraído de los licores de lavado de maíz con anterioridad (Patente WO2014/044876 A, Patente ES 2424399, Patente ES 2527 366 B1) . Probablemente la diferencia en el aspecto y composición de este nuevo extracto biosurfactante, se deba a que en las invenciones anteriores el extracto biosurfactante es obtenido a partir de la fracción líquida, donde los biosurfactantes presentes en la misma son producidos extracelularmente, por parte de los microrganismo que allí crecen de forma espontánea, mientras que el biosurfactante objeto de estudio probablemente se encuentra adherido a la membrana plasmática de los microrganismos presentes en los licores de lavado de maíz, cambiando la naturaleza del mismo. Incluso hay cepas de microorganismos que producen biosurfactantes extracelulares cuando están en estado vegetativo y biosurfactantes no extracelulares cuando crecen en forma esporulada pudiendo variar las características y propiedades de los mismos (Angelo et al 2003) . Por otra parte el extracto biosurfactante obtenido mediante extracción con disolventes orgánicos a partir de los licores de lavado de maíz, presenta en su composición otras sustancias (como ácidos grasos libres, o ntioxidantes) que le confieren al conjunto del extracto unas características diferentes (Rodriguez-López et al 2016) , al extracto biosurfactante objeto de estudio.
En el análisis del extracto biosurfactante, objeto de esta invención, mediante espectrofotometría de masas, por electrospray, se observan varios biomarcadores a 905, 1034 y 1141 m/z (Figura 3) que se pueden corresponder con masas de biosurfactante de naturaleza lipopeptídica. Destacar que los microorganismos en general producen biosurfactantes muy específicos en función del medio de fermentación donde crecen, siendo muy difícil encontrar dos biosurfactantes iguales, obtenidos a partir de medios diferentes. Incluso durante el mismo proceso fermentativo los microrganismos pueden producir distintos tipos de biosurfactantes en función de la fase de crecimiento en la que se encuentran (Velraeds et al 1996, Angelo et al 2003) . De hecho en la Figura 3 se observan varias señales por encima de 900 m/z que probablemente se deba a este hecho.
Destacar que el biosurfactante objeto de esta invención presenta unos biomarcadores y unas masas diferentes a los que se recogen en la bibliografía y que por tanto todavía no han sido aplicados en ningún campo industrial, incluido el cosmético, farmacéutico, medioambiental, agroquímico o alimentario.
Así Chen et al (2017) ha producido un lipopéptido utilizando Bacillus licheniformis con biomarcadoras a 994, 1008, 1022 y 1036 m/z, mientras que Bechet et al. (2012) produjo también un lipopéptido con capacidad surfactante utilizando Bacillus thuringiensis, en el cual fueron indentificados biomarcadores a 879, 893, 893, and 907 m/z. Por otra parte Madonna et al (2003) produjo varios homólogos del biosurfactante producido por Bacillus subtilis con biomarcadores a 892, 906 y 920 m/z. Además Li et al (2016) encontró que Bacillus pseudomycoides produce un lipopéptido con capacidad surfactante con una señal principal a 933 m/z, y otras señales menores a 1533, 1231 y 1024 m/z, que se corresponden con diferentes biosurfactantes producidos por la misma cepa en diferentes fases de crecimiento. Angelo et al (2003) observó que Bacillus globigii produce bisourfactantes diferentes en función de si se encuentra en estado vegetativo o estado esporulado.
Resaltar que los biosurfactantes descritos con anterioridad, son lipopéptidos que presentan unos biomarcadores cercanos a los del biosurfactante objeto de esta invención, aunque ninguno coincide en su totalidad con el biosurfactante extraído de los licores de lavado de maíz mediante extracción con PBS y objeto de estudio. Resaltar también que estos biosurfactantes fueron producidos en fermentaciones controladas con medios de fermentación diferentes a los licores de lavado de maíz, a diferencia del biosurfactante objeto de esta invención. Además, los biosurfactantes mencionados en estos trabajos se han extraído del medio fermentativo, utilizando otros métodos diferentes a la extracción con disolución acuosa propuesta en esta invención.
