Método de producción de la proteína glucosa-6-fosfatasa 2
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está relacionada con el campo de la producción de proteínas recombinantes. En concreto, la invención se relaciona con la producción de la proteína glucosa-6-fosfatasa 2 en forma de proteína de fusión con el domino intercoil de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La obtención de proteínas de membrana tanto de eucariotas como de procariotas, es un proceso extremadamente difícil. Normalmente la cantidad de estas proteínas en las células es bastante pequeña, de forma que la única manera de obtener grandes cantidades de ellas para diversas aplicaciones, como determinar su función, estructura o ser empleadas en estudios inmunológicos, pasa por su clonación en diversos vectores y la introducción de éstos en organismos que permitan expresar grandes cantidades como bacterias o levaduras. Sin embargo, la gran mayoría de estas proteínas son tóxicas una vez que se induce su expresión en distintos organismos, limitando enormemente la posibilidad de obtener cantidades apreciables de éstas.
La proteína glucosa-6-fosfatasa-2 ("Islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein", IGRP) es un antígeno importante en el desarrollo de la diabetes tipo 1 (T1D) o diabetes insulino-dependiente. En esta enfermedad, el sistema inmunitario de los pacientes diabéticos destruye específicamente las células productoras de insulina de los islotes de Langerhans pancreáticos. Para que dicha destrucción tenga lugar, los linfocitos de estos pacientes son activados por distintas proteínas o antígenos expresadas por las células productoras de insulina como son la propia insulina, la isoforma de 65 kDa de la decarboxilasa del ácido glutámico (GAD65) , el antígeno 2 asociado a insulinoma (IA-2) o, más recientemente IGRP, antígeno que fue identificado al descubrirse que era el objetivo reconocido por un linfocito T CD8 murino altamente diabetogénico, el clon 8.3 (Lieberman SM et al, . Proc Natl Acad Sci USA. 2003. 100:8384-8388) . Más importante es el hecho de que el úmero de linfocitos específicos para este antígeno en sangre periférica de ratones NOD ("Non-Obese Diabetic" mice) , el modelo murino de la T1D humana, es capaz de predecir el desarrollo de síntomas clínicos de la enfermedad (Trudeau JD et al., J Clin Invest. 2003, 111:217-223) y que en el páncreas de ratones NOD diabéticos la presencia de linfocitos T CD8 específicos para este antígeno es la población más prevalente en los primeros estadios del rechazo de trasplantes de islotes (Wong CP et al., J Immunol. 2006, 176:1637-1644) . Además de en el ratón NOD, este antígeno es también un objetivo de la respuesta inmunitaria en pacientes diabéticos humanos (Jarchum I et al., Clin Immunol. 2008, 127:359-365) , lo que hace necesaria su producción y purificación para poder realizar, entre otras cosas, estudios de la respuesta autoinmune en pacientes diabéticos o incluso su posible uso en el futuro como vacuna que pudiese prevenir el desarrollo de la enfermedad.
La incapacidad de producir cantidades apreciables de IGRP han limitado en gran medida los estudios acerca de cuáles son los segmentos (péptidos) reconocidos durante la respuesta autoinmune, algo necesario para diseñar en el futuro posibles vacunas basadas en éstos. Además, al no tener proteína purificada no es posible comprobar en modelos animales, como el ratón NOD, la efectividad de una terapia a la hora de prevenir el desarrollo de síntomas clínicos de la enfermedad.
A día de hoy apenas existen publicaciones donde se mencione la expresión y purificación de esta proteína. Martin et al. mencionan haber clonado la pauta de lectura abierta correspondiente a la IGRP murina y expresado dicha proteína como una proteína de fusión con la beta-galactosidasa, indicando que la proteína se encuentra en cuerpos de inclusión que los autores dicen purificar mediante electroforesis preparativa y emplear dicha proteína para obtener anticuerpos por inmunización de conejos (Martin CC et al., Genes J. Biol. Chem. 2001, 276: 25197-207) . Petrolonis et al. describen la expresión y purificación de IGRP con el sistema de baculovius (Petrolonis AJ et al., J. Biol. Chem. 2004, 279: 13976-83) . En ninguno de estos trabajos se describe la producción de IGRP en cantidades significativas.
Por tanto, existe la necesidad de nuevos métodos para la expresión y purificación de la proteína IGRP.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado un método para expresar y purificar la proteína glucosa-6-fosfatasa 2 (IGRP) como proteína de fusión con el dominio intecoil (IC) de la proteína muNS de Orthoreovirus aviar. Este sistema se basa en la coexpresión de esta proteína de fusión IGRP-IC junto con la proteína muNS-Mi derivada de la proteína muNS de Orthoreovirus aviar, lo que da lugar a la expresión de la proteína de fusión en microesferas (Figura 1) . Sorprendentemente, los inventores han comprobado que, a diferencia de lo que sucede cuando se emplean otros sistemas de expresión como los baculovirus, cuando la proteína de fusión IGRP-IC y la proteína muNS-Mi se coexpresan en bacterias es posible obtener microesferas en las que se encuentra dicha proteína de fusión en cantidades detectables (Figura 5) . Este sistema de expresión presenta la ventaja adicional de que la proteína de fusión se puede purificar separándose de las microesferas mediante la incubación con un tampón adecuado para desestructurar las microesferas. Además, en el caso de que se desee eliminar el dominio IC, la proteína de fusión se puede diseñar incluyendo una secuencia diana para proteasas entre la proteína IGRP e IC. De este modo, una vez separada la proteína de fusión de las microesferas se puede separar el dominio IC mediante proteólisis con la proteasa específica. La reconstitución de las microesferas mediante incubación con el tampón adecuado capturará el dominio IC, siendo por tanto un método de purificación de la proteína IGRP sencillo y escalable.
Por tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende:
(i) la proteína glucosa-6-fosfatasa 2 (IGRP) o una variante funcionalmente equivalente de la misma y
(ii) un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, y
- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores con capacidad de incorporarse a microesferas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una microesfera que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la región de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la región de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de dicha proteína,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus mamífero y
- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores que mantiene la capacidad de formar microesferas cuando se expresa en una célula,
en donde la microesfera además comprende la proteína de fusión de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención, un casete de expresión que comprende dicho polinucleótido o un vector que comprende dicho polinucleótido o dicho casete de expresión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende la proteína de fusión de la invención, el polinucleótido de la invención, el casete de expresión de la invención o el vector de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir la proteína de fusión de la invención que comprende:
(a) expresar en una célula bacteriana un primer polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO:
2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la región de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la región de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de dicha proteína,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus mamífero y
- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores que mantiene la capacidad de formar microesferas cuando se expresa en una célula
(b) someter dicha célula bacteriana a condiciones adecuadas para la formación de microesferas y
(c) concentrar las microesferas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión obtenible según el método para producir la proteína de fusión de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir la proteína IGRP o una variante funcionalmente equivalente de la misma que comprende las siguientes etapas:
(a) producir una proteína de fusión según el método para producir la proteína de fusión de la invención, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de reconocimiento por una proteasa entre sus componentes (i) y (ii) ,
(b) someter a las microesferas a condiciones que conducen a su desintegración, produciéndose la separación de la proteína de fusión y las microesferas,
(c) poner en contacto el producto resultante de la etapa (b) con una proteasa específica para la secuencia de reconocimiento que conecta los componentes (i) y (ii) de la proteína de fusión bajo condiciones adecuadas para la proteólisis de dicha proteína de fusión, con la consiguiente separación de los componentes (i) y (ii) de la proteína de fusión,
(d) someter el producto de la etapa (c) a condiciones adecuadas para la formación de las microesferas y
(e) separar las microesferas de la proteína IGRP o de la variante funcionalmente equivalente de la misma.
En otro aspecto, la invención se relaciona con la proteína IGRP o variante funcionalmente equivalente de la misma obtenible según el método según el aspecto anterior.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende la microesfera de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con la microesfera de la invención para su uso en medicina.
En otro aspecto, la invención se relaciona con la microesfera de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de diabetes tipo 1.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la microesfera de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de diabetes tipo 1.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para inducir diabetes tipo 1 en un modelo animal que comprende administrar a un animal una cantidad eficaz de la microesfera de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema del funcionamiento básico de la metodología "IC-Tagging".
Figura 2. Expresión de IGRP con IC-Tagging usando baculovirus/células Sf9- Análisis por PAGE de la composición proteica de extractos totales de células de insecto Sf9 sin infectar (1) , o infectadas con baculovirus recombinantes que dirigen la expresión de las proteínas IGRP (2) , muNS-Mi (3) o co-infectadas con ambos (4) . El gel fue teñido con azul de Coomasie.
Figura 3. Expresión de muNS-Mi en bacterias con el plásmido pET Duet 1- Análisis por PAGE de la composición proteica de extractos totales de bacterias transformadas con plásmido pET Duet-1, para expresar la proteína muNS-Mi sin inducir (1) , o inducidas durante tres horas con imM de IPTG (2) . La parte derecha de la figura muestra el sobrenadante (3) y el pellet (4) resultante de purificar por centrifugación las microesferas de muNS-Mi presentes en extractos como el mostrado en 2. Los geles fueron teñidos con azul de Coomasie.
Figura 4. muNS-Mi forma microesferas ordenadas dentro de las bacterias- A-Imágenes de microscopio óptico obtenidas con muestras de muNS-Mi prurificadas omo la mostrada en la figura 3, canal 4. B- Imágenes de microscopio electrónico de bacterias conteniendo en su interior microesferas (señaladas con una flecha) de muNS-Mi, tras haber sido inducida su expresión con IPTG. C- Análisis por PAGE del sobrenadante (1) y el pellet (2) , obtenidos después de incubar las microesferas mostradas en A en un tampón sin magnesio.
Figura 5. Concentración de micoesferas conteniendo IC-IGRP- A- Análisis por PAGE de la composición proteica de extractos proteicos de bacterias transformadas con plásmido pET Duet-1, que expresa simultáneamente las proteínas muNS-Mi e IC-IGRP. El gel muestra extractos de bacterias sin inducir (1) , inducidas durante tres horas con 1mM de IPTG (2) , o inducidas y concentradas por centrifugación (3) . Los geles fueron teñidos con azul de Coomasie. Se indican a la izquierda las posiciones de los marcadores de peso molecular y a la derecha las posiciones de las proteínas indicadas. B- La muestra del canal 3 de A se analizó por Western-blot utilizando un anticuerpo específico contra muNS (canal derecho) , comparándola con una muestra similar que contenía solamente muNS-Mi (canal izquierdo) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Proteína de fusión y microesfera de la invención
En un primer aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende:
(i) la proteína glucosa-6-fosfatasa 2 (IGRP) o una variante funcionalmente equivalente de la misma y
(ii) un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, y
- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores con capacidad de incorporarse a microesferas.
El término "proteína de fusión", según se usa en la presente invención, se refiere a polipéptidos que comprenden dos o más regiones que proceden de proteínas distintas o heterólogas.
La proteína de fusión de la invención comprende dos componentes.
(i) Proteína glucosa-6-fosfatasa 2 (IGRP) o una variante funcionalmente equivalente de la misma.
El término "glucosa-6-fosfatasa 2" o "IGRP" o "proteína relacionada con la subunidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa específica de islotes", tal y como aquí se utiliza, se refiere a una proteína capaz de hidrolizar glucosa-6-fosfato para dar glucosa y fosfato. Es una proteína transmembrana que se expresa en páncreas y en menor medida en los testículos. En humanos está codificada por el gen G6PC2. La proteína IGRP puede ser de cualquier origen, por ejemplo humano, bovino, murino, equino, canino, etc. En una realización particular, la proteína IGRP es la proteína humana identificada por el número de acceso Q9NQR9 en la base de datos de UniprotKB (Versión de la entrada 123, 25 de octubre de 2017, versión de la secuencia 1, 1 de octubre de 2000) . En humanos existen tres isoformas de la proteína, identificadas por los siguientes números de acceso de UniprotKB:
- Isoforma 1, considerada como la secuencia canónica, tiene una longitud de 355 aminoácidos: Q9NQR9-1.
- Isoforma 2, con una longitud de 102 aminoácidos: Q9NQR9-2.
- Isoforma 3, con una longitud de 154 aminoácidos: Q9NQR9-3.
En otra realización particular, la proteína IGRP es la proteína de ratón identificada por el número de acceso Q9Z186 en la base de datos de UniprotKB (Versión de la entrada 123, 25 de octubre de 2017; versión de la secuencia 1, 1 de mayo de 1999) . En ratón existen dos isoformas de la proteína, identificadas por los siguientes números de acceso de UniprotKB:
- Isoforma 1, considerada la secuencia canónica, con una longitud de 355 aminoácidos: Q9Z186-1.
- Isoforma 2, con una longitud de 154 aminoácidos: Q9Z186-2.
Estas isoformas así como cualquier otra isoforma de la proteína IGRP de cualquier origen se consideran incluidas dentro del término "IGRP" de acuerdo con la presente invención.
En otra realización particular, la proteína IGRP es la proteína de rata codificada por el gen identificado por el número de acceso Gene ID 681817 en la base de datos de NCBI Genbank (versión del 26 septiembre 2017) .
El término "variante funcionalmente equivalente", tal y como aquí se utiliza, se refiere a cualquier péptido o proteína que resulta de la deleción, inserción, adición o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos con respecto a la secuencia de la que deriva y que conserva la función de dicha secuencia.
En una realización particular, la variante funcionalmente equivalente tiene una identidad de secuencia de al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% en toda su longitud con la secuencia de la proteína IGRP. El grado de identidad entre las variantes e IGRP se determina utilizando algoritmos y métodos informáticos que son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente utilizando el algoritmo BLASTP [BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. y col., J. Mol Biol, 215: 40.- 410 (1990) ]. En una realización más particular, la identidad de secuencia entre la variante funcionalmente equivalente y la secuencia de la proteína IGRP se calcula a lo largo de toda la longitud del polipéptido.
En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes de IGRP comprenden adiciones de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20 aminoácidos. En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes comprenden adiciones de menos de 20, menos de 15, menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6, menos de 5, menos de 4, menos de 3, menos de 2 o 1 aminoácido. De forma similar, también se contemplan variantes que comprenden deleciones de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20 aminoácidos. En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes comprenden deleciones de menos de 20, menos de 15, menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6, menos de 5, menos de 4, menos de 3, menos de 2 o 1 aminoácido. También se contemplan variantes funcionalmente equivalentes que tienen una sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al
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menos 15, al menos 20 aminoácidos de la secuencia de la proteína IGRP. En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes comprenden sustituciones de menos de 20, menos de 15, menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6, menos de 5, menos de 4, menos de 3, menos de 2 o 1 aminoácido. En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes comprenden sustituciones conservativas de uno o más aminoácidos. El término "sustitución conservativa", tal y como aquí se utiliza, se refiere a reemplazar un aminoácido por otro con propiedades estructurales y/o químicas similares. Por ejemplo, los siguientes seis grupos contienen cada uno de ellos aminoácidos que son sustituciones conservativas entre ellos: 1) alanina (A) , serina (S) , treonina (T) ; 2) ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) ; 3) asparagina (N) , glutamina (Q) ; 4) arginina (R) , lisina (K) ; 5) isoleucina (I) , leucina (L) , metionina (M) , valina (V) ; y 6) fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) .
Las variantes funcionalmente equivalentes de IGRP pueden tener adiciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos en cualquier posición. En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes de IGRP comprenden adiciones de aminoácidos en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal o en ambos extremos de la secuencia de IGRP. En otra realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes de IGRP comprenden deleciones de aminoácidos en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal o en ambos extremos de la secuencia de IGRP.
En una realización particular, la variante funcionalmente equivalente de la proteína IGRP conserva al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100% de la función de la proteína IGRP.
La proteína IGRP es capaz de inducir diabetes cuando se administra a un ratón en forma de vacuna de ADN (Fuchs et al., Clinical and Experimental Immunolgoy, 2014, 176: 199-206) . En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes de la proteína IGRP conservan la capacidad de inducir diabetes de la proteína IGRP de la que derivan. La capacidad de una proteína de inducir diabetes en un modelo animal se puede determinar por métodos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante la determinación de los niveles de glucosa en orina o en sangre.
Por ejemplo, Fuchs et al. (supra) consideraron que existe diabetes en el modelo murino cuando se obtienen dos medidas consecutivas de niveles de glucosa en orina de más de 5, 5 mmol/L o en sangre de más de 13, 9 mmol/L. Además, la proteína IGRP tiene actividad glucosa 6-fosfatasa, es decir, es capaz de catalizar la defosforilación de glucosa-6-fosfato a glucosa. En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes de la proteína IGRP conservan la actividad fosfatasa de la proteína IGRP de la que derivan. La actividad glucosa-6-fosfatasa se puede determinar por métodos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, métodos basados en la detección de fosfato inorgánico en soluciones acuosas, como el método del verde de malaquita (Petrolonis et al., supra) , o métodos basados en la detección de glucosa-6-fofasto, como por ejemplo los métodos basados en el sistema glucosa oxidasa/peroxidasa (Mao, H., et al., Anal. Chem. 2002, 74, 379-385) .
(ii) Polipéptido
El segundo componente de la proteína de fusión de la invención es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, y
- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores con capacidad de incorporarse a microesferas.
En una realización particular, el polipéptido que forma parte de la proteína de fusión de la invención consiste en la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) , de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar.
El término "orthoreovirus aviar" o "reovirus aviar", según se usa en la presente invención, se refiere a uno de los doce géneros pertenecientes a la familia de virus Reoviridae y en concreto al grupo dentro del género que infecta aves. Presentan genomas de ARN de doble cadena y por ello, pertenecen al grupo III de virus.
El término "proteína muNS del Orthoreovirus aviar", tal y como aquí se utiliza, se refiere a una de las proteínas no estructurales codificada por el gen M3 del reovirus viar u Orthoreovirus aviar y es la única proteína del reovirus aviar capaz de formar microesferas cuando se expresa en ausencia de otros factores (Touris-Otero et al. Virology, 319; 94-1069) . Se trata de una proteína de 635 aminoácidos definida por el número de acceso Ay608700 en la base de datos NCBI (versión Ay608700.1, 7 de agosto de 2004) o por el número de acceso AAS78998 en la base de datos NCBI (versión AAS78998.1, 10 de abril de 2006) . En una realización particular, la proteína muNS del Orthoreovirus aviar tiene la secuencia SEQ ID NO: 3.
La secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar es un fragmento de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar denominado "intercoil" o "IC". Dicho fragmento presenta la capacidad de incorporarse en microesferas formadas por la proteína muNS de Orthoreovirus aviar o por el fragmento mínimo de dicha proteína.
El término "microesfera" o "inclusión", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a agregados nucleares o citoplásmicos, normalmente de proteínas. En concreto, la proteína que forma las microesferas en el género Orthoreovirus es la proteína muNS o ^NS, que es una de las proteínas no estructurales codificada por el gen M3 y es la única proteína del reovirus aviar capaz de formar microesferas cuando se expresa en ausencia de otros factores virales (Touris-Otero et al., supra) .
En otra realización particular, el polipéptido que forma parte de la proteína de fusión de la invención consiste en la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar.
El término "orthoreovirus mamífero", según se usa en la presente invención, se refiere a uno de los doce géneros pertenecientes a la familia de virus Reoviridae y en concreto al grupo dentro del género que infecta mamíferos. Presentan genomas de ARN de doble cadena y por ello, pertenecen al grupo III de virus.
El término "proteína muNS o ^NS del orthoreovirus mamífero", según se usa en la presente invención, se refiere a una de las proteínas no estructurales codificada por el reovirus mamífero u Orthoreovirus mamífero y es la única proteína del reovirus de mamífero capaz de formar microesferas cuando se expresa en ausencia de otros
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factores virales (Becker, M. M. et al. 2003. J. Virol. 77:5948-5963) . Se trata de una proteína de 721 aminoácidos definida por el número de acceso ABP48918 en la base de datos NCBI (versión ABP48918.1, 11 de abril de 2008) (SEQ ID NO: 4) .
Con el fin de determinar la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus de mamífero con respecto a dichos fragmentos de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, se puede llevar a cabo un alineamiento entre la secuencia de la proteína muNS aviar y la secuencia de la proteína muNS de Orthoreovirus de mamífero. Dicho alineamiento de secuencias puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia. Se pueden llevar a cabo alineamientos óptimos de secuencias, por ejemplo con el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2:482) , con el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, (J. MoI. Biol., 1970, 48:443) , por búsqueda de similitud con el método de Pearson y Lipman, (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1988, 85:2444) , por implementación computerizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) , o por alineamiento manual e inspección visual (Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds. 1995 supplement) .
En una realización particular, la secuencia de la proteína muNS de Orthoreovirus de mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar es la secuencia 561-622 (SEQ ID NO: 5) de la proteína muNS de Orthoreovirus de mamífero.
En una realización particular, el polipéptido que forma parte de la proteína de fusión de la invención consiste en una variante funcionalmente equivalente de (i) la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o (ii) la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, con capacidad de incorporarse a microesferas.
Por "variante funcionalmente equivalente" se entiende todos aquellos péptidos derivados de la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o de la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero orrespondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar mediante modificación, inserción, sustitución y/o deleción de uno o más aminoácidos, siempre y cuando se mantenga sustancialmente la función de las secuencias de la proteína muNS de las que derivan.
La secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar y la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar presenta la capacidad de incorporarse a microesferas formadas por la proteína muNS completa o por la región mínima de dicha proteína con capacidad de formar microesferas (muNS-Mi) en una célula. Las variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar y la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar conservan sustancialmente la capacidad de dichas secuencias de incorporarse a las microesferas formadas por la proteína completa o muNS-Mi en una célula. Métodos adecuados para determinar la capacidad de incorporarse en las microesferas incluyen, pero no se limitan al método descrito en el Ejemplo 3 de la solicitud de patente WO 2011/098652 basado en la formación de las microesferas (inclusiones) y expresión de la proteína de interés en forma de proteína de fusión asociada a los fragmentos que la dirigen a las microesferas. Posteriormente, se procedería a llevar a cabo inmunofluorescencia indirecta, utilizando anticuerpos policlonales contra el epítopo HA o el epítopo de interés, pudiéndose comprobar la incorporación de dichos fragmentos a las microesferas.
Las variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o de la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar tienen capacidad de incorporarse a microesferas. En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o de la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar conservan al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al
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menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100% de la capacidad de incorporarse a microesferas de las secuencias de la que derivan.
Las variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o de la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar incluyen aquellas que muestran al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con respecto a las secuencias de las que derivan.
Los dos componentes de la proteína de fusión pueden estar conectados en cualquier orden, es decir, el componente (ii) puede estar fusionado al extremo amino terminal del componente (i) o el componente (i) puede estar fusionado al extremo amino terminal del componente (ii) . En una realización particular, el componente (ii) está fusionado al extremo amino terminal del componente (i) .
En una realización particular los dos componentes de la proteína de fusión están conectados a través de una secuencia de reconocimiento por proteasas, permitiendo de esta manera la separación de los dos componentes. Las secuencias de reconocimiento por proteasas adecuadas para su incorporación en la proteína de fusión de la invención incluyen enteroquinasa (sitio de corte DDDDK- SEQ ID NO: 6) , factor Xa (sitio de corte IEDGR- SEQ ID NO: 7) , trombina (sitio de corte LVPRGS-SEQ ID NO: 8) , proteasa TEV (sitio de corte ENLYFQG - SEQ ID NO: 9) , proteasa PreScission (sitio de corte LEVLFQGP - SEQ ID NO: 10) , inteínas y similares. En una realización particular, la secuencia de reconocimiento por proteasas es una secuencia de reconocimiento por enteroquinasa o una secuencia de reconocimiento por factor Xa. En una realización más particular, la secuencia de reconocimiento por proteasas es la secuencia de SEQ ID NO: 6 o la secuencia de SEQ ID NO: 7.
En una realización particular la proteína de fusión no tiene modificaciones posttraduccionales de eucariotas. El término "modificaciones post-traduccionales", tal y
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como aquí se utiliza, se refiere a la modificación de las proteínas una vez sintetizadas a través de la adición de un grupo químico mediante un enlace covalente. El término "modificaciones post-traduccionales de eucariotas", tal y como aquí se utiliza, se refiere a las modificaciones post-traduccionales que se dan en organismos eucariotas y no se dan en organismos procariotas. Ejemplos ilustrativos no limitativos de modificaciones post-traduccionales de eucariotas incluyen: miristoilación, palmitoilación, farnesilación, geranil geranilación, modificación con glicosilfosfatidil inositol (GPI) , acilación, acetilación, alquilación, metilación y glicosilación.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una microesfera que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la región de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la región de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de dicha proteína,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus mamífero y
- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores que mantiene la capacidad de formar microesferas cuando se expresa en una célula,
en donde la microesfera comprende la proteína de fusión de la invención.
Los términos "microesfera", "proteína muNS del Orthoreovirus aviar" y "proteína muNS del Orthoreovirus mamífero" han sido previamente descritos.
La microesfera de la invención comprende o está formad por un polipéptido seleccionado del del grupo que consiste en:
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la región de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la región de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de dicha proteína,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus mamífero y
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- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores que mantiene la capacidad de formar microesferas cuando se expresa en una célula.
El término "polipéptido que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar" o "muNS-Mi" se refiere a la región indicada de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar. Dicha región es la región mínima de la proteína muNS de Orthoreovirus aviar que tiene la capacidad de formar microesferas cuando se expresa en una célula.
La región de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la región de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de dicha proteína se puede determinar tal y como se ha explicado previamente para la región de la proteína muNS de Orthoreovirus de mamífero correspondiente a la secuencia 477-542 (SEQ ID NO: 1) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar.
En una realización particular, la secuencia de la proteína muNS de Orthoreovirus de mamífero correspondiente a la secuencia 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar es la secuencia 518-721 (SEQ ID NO: 11) de la proteína muNS de Orthoreovirus de mamífero.
La secuencia 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la 448 635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar y las proteínas completas muNS del Orthoreovirus aviar y muNS del Orthoreovirus de mamífero presentan la capacidad de formar microesferas cuando se expresan en una célula. Las variantes funcionalmente equivalentes de estas secuencias conservan sustancialmente la capacidad de dichas secuencias de formar microesferas. Métodos adecuados para determinar la capacidad de formar microesferas incluyen, pero no se limitan al método descrito en el Ejemplo 1 de la solicitud de patente WO 2011/098652, en donde se detecta la formación de microesferas (inclusiones) mediante microscopía por inmunofluorescencia indirecta empleando anticuerpos policlonales frente a muNS.
Las variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, la secuencia de la proteína muNS del
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Orthoreovirus mamífero correspondiente a la 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar y las proteínas completas muNS del Orthoreovirus aviar y muNS del Orthoreovirus de mamífero tienen capacidad de formar microesferas.
En una realización particular, las variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la 448 635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar y las proteínas completas muNS del Orthoreovirus aviar y muNS del Orthoreovirus de mamífero conservan al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100% de la capacidad de formar microesferas de las secuencias de la que derivan.
Las variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, la secuencia de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar y las proteínas completas muNS del Orthoreovirus aviar y muNS del Orthoreovirus de mamífero incluyen aquellas que muestran al menos un 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con respecto a las secuencias de las que derivan.
La microesfera de la invención se puede obtener mediante los métodos descritos en el presente documento.
Polinucleótido, casete de expresión, vector y célula de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucléotido que codifica la proteína de fusión de la invención.
El término "polinucleótido", según se usa en la presente invención, se refiere a un polímero formado por un número variable de monómeros en donde los monómeros son nucleótidos, incluyendo tanto ribonucleótidos como deoxiribonucleótidos. Los
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polinucleótidos incluyen monómeros modificados mediante metilación así como formas no modificadas. Los términos "polinudeótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente en la presente invención e incluyen ARNm, ADNc y polinucleótidos recombinantes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un casete de expresión que comprende el polinucleótido de la invención.
El término "casete de expresión", tal y como aquí se utiliza, se refiere a un polinucléotido que comprende un gen y un promotor adecuado para controlar ese gen. El casete de expresión puede opcionalmente incluir otras secuencias, por ejemplo, señales de terminación de la transcripción. La elección de un promotor y otro/s elemento/s regulatorios generalmente varía en función de la célula huésped utilizada. Promotores adecuados en el contexto de la presente invención incluyen promotores constitutivos que promueven la expresión de las secuencias asociadas a ellas de forma constante y promotores inducibles, que requieren de un estímulo externo para promover la transcripción de las secuencias asociadas a ellos.
Promotores útiles para la realización de la presente invención incluyen:
- Promotores constitutivos como por ejemplo, el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH1) , el promotor del factor de elongación 1 alfa (TEF) y el promotor del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa (TPI) , el promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GPD) y el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa (GPK) , el promotor MRP7.
- Promotores inducibles como por ejemplo el promotor de la metalotioneína (CUP1) cuya expresión se regula mediante adición de cobre al medio de cultivo, el promotor del gen que codifica el gen FUS1 o el gen FUS2, cuya expresión se activa en presencia de feromonas (el factor a) , el promotor TET cuya expresión se regula en presencia de tetraciclinas, los promotores GAL1-10, GALL, GALS que se activan en presencia de galactosa, el promotor VP16-ER, inducible por estrógenos, el promotor de la fosfatasa (PH05) cuya expresión se activa en presencia de fosfato y el promotor de la proteína de choque térmico HSP150, cuya expresión se activa a elevada temperatura.
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En una realización particular, cuando la célula en la que se va a expresar el polinucleótido de la invención es una bacteria, dicho promotor es el sistema promotor beta-lactamasa y lactosa, el promotor T7 ARN polimerasa, el promotor lambda, el promotor trp o el promotor tac. En una realización más particular de la invención, dicho promotor es un promotor inducible. En otra realización más particular, dicho promotor es un promotor inducible por isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) . En una realización aún más particular, el promotor inducible por IPTG es el promotor T7 ARN polimerasa.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende el polinucleótido o el casete de expresión de la invención.
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende las secuencias necesarias para que después de transcribir y traducir dichas secuencias en una célula se genere la proteína de fusión de la invención. Dicha secuencia está unida operativamente a segmentos adicionales que proporcionan su replicación autónoma en una célula huésped de interés. Preferiblemente, el vector es un vector de expresión, que se define como un vector, que además de las regiones de la replicación autónoma en una célula hospedadora, contiene regiones operativamente ligadas al polinucleótido de la invención y que son capaces de potenciar la expresión de los productos del polinucleótido según la invención. Los vectores de la invención se pueden obtener por medio de técnicas ampliamente conocidas en la técnica. En una realización particular de la invención, cuando el organismo es procariota, tal como una bacteria, vectores adecuados según la invención son, por ejemplo, los vectores pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, pNH8A, pNH16a, pNH18a. En una realización particular de la invención, cuando dicha bacteria es E. coli, dicho vector es el plásmido pET, en particular, el plásmido pET Duet-1. Dicho plásmido comprende dos sitios de clonaje múltiple (MSC, del inglés "múltiple cloning sites") diferentes. Los genes clonados en dicho plásmido se transcriben bajo el control del promotor del bacteriófago T7, cuando se activa la T7 ARN polimerasa en la célula huésped. La expresión se induce con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranósido) , el cual retira al represor del operador para que se lleve a cabo la transcripción y se promueva la expresión de la proteína de interés.
En una realización particular, el vector de la invención comprende además un segundo polinucléotido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la región de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la región de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de dicha proteína,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus mamífero y
- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores que mantiene la capacidad de formar microesferas cuando se expresa en una célula.
Los términos "proteína muNS del Orthoreovirus aviar" y "proteína muNS del Orthoreovirus mamífero" han sido previamente descritos. El polipéptido que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, la región correspondiente a dicho polipéptido de la proteína muNS del Orthoreoviurs de mamífero, así como las variantes funcionalmente equivalentes han sido previamente definidas.
En una realización particular, el polinucleótido de la invención está operativamente unido a un promotor y el segundo polinucléotido está unido operativamente a un segundo promotor. Las realizaciones particulares del primer promotor son igualmente aplicables al segundo promotor. En una realización particular, el primer y el segundo promotor son promotores inducibles. En otra realización más particular, el primer y el segundo promotor son promotores inducibles por isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) . En una realización aún más particular, el promotor inducible por IPTG es el promotor T7 ARN polimerasa.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende la proteína de fusión, el polinucleótido, el casete de expresión o el vector de la invención.
La célula de la invención puede ser cualquier célula procariota o cualquier célula eucariota. En una realización particular, la célula es una célula procariota. En una realización más particular, la célula es una célula bacteriana. En una realización aún ás particular, la célula bacteriana es Escherichia coli. Ejemplos de cepas de E. coli que se pueden emplear para propagar los polinucleótidos o vectores de la invención o para producir la proteína de fusión de la invención incluyen las cepas JM109, DH5a™, XL-1 Blue o BL21 DE3.
Método para producir la proteína de fusión de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir la proteína de fusión de la invención que comprende:
(a) expresar en una célula bacteriana un primer polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- un polipéptido que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO:
2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la región de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la región de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de dicha proteína,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus mamífero y
- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores que mantiene la capacidad de formar microesferas cuando se expresa en una célula
(b) someter dicha célula bacteriana a condiciones adecuadas para la formación de microesferas y
(c) concentrar las microesferas.
Todos los términos han sido descritos previamente. Las realizaciones particulares de dichos términos aplican igualmente al método para producir la proteína de fusión de la invención.
La primera etapa del método para producir la proteína de fusión de la invención comprende expresar en una célula bacteriana un primer polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
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- un polipéptido que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar,
- la región de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondiente a la región de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar que comprende los aminoácidos 448-635 (SEQ ID NO: 2) de dicha proteína,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar,
- la proteína muNS completa del Orthoreovirus mamífero y
- una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores que mantiene la capacidad de formar microesferas cuando se expresa en una célula.
Para expresar el primer y el segundo polinucléotido en una célula bacteriana es necesario, como sabe el experto en la materia, introducir en la célula bacteriana ambos polinucleótidos, por ejemplo, mediante la transformación 
dicha célula con vectores que comprenden cada uno de los polinucléotidos o con un vector que comprenda ambos polinucleótidos. Si el primer y el segundo polinucleótido forman parte de vectores independientes, se podrán introducir ambos vectores en la célula de forma simultánea o secuencial.
En el caso de que uno o ambos polinucleótidos estén operativamente unidos a un promotor inducible, para expresar dichos polinucleótidos será necesario poner en contacto la célula bacteriana con el inductor. En el caso particular de que uno o ambos promotores sean inducibles por IPTG, para la expresión de los polinucleótidos se añade IPTG al cultivo bacteriano durante el tiempo necesario hasta conseguir la expresión de ambos polinucleótidos, por ejemplo al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 5 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas o más. Preferiblemente, la inducción con IPTG se hace durante un periodo de tiempo aproximado de 3 horas. En una realización particular, durante la inducción se incuban las células a una temperatura de entre 18 y 37°C, preferiblemente entre 25 y 37°C, más preferiblemente 37°C. En una realización particular, cuando el tiempo de inducción es de más de 24 horas, durante la inducción se incuban las células a una temperatura de entre 18 y 25°C. Una vez finalizada la inducción, las bacterias se recogen por centrifugación.
Si el primer y el segundo polinucleótido están operativamente unidos a promotores diferentes, la expresión de ambos polinucleótidos podrá ser simultánea, si ambos polinucleótidos se pueden expresar bajo las mismas condiciones, o secuencial. Si el primer y el segundo polinucleótido están operativamente unidos a promotores inducibles diferentes, la expresión de ambos polinucleótidos podrá ser simultánea, añadiendo ambos inductores a la vez al medio de cultivo de las células, o secuencial, añadiendo primero uno de los inductores y luego el otro.
La segunda etapa del método de producción de la proteína de fusión de la invención consiste en someter a las células bacterianas a condiciones adecuadas para la formación de microesferas.
Las condiciones adecuadas para la formación de microesferas pueden ser determinadas por el experto en la materia para cada tipo celular. Métodos adecuados para detectar la formación de microesferas incluyen, pero no se limitan al método descrito en el Ejemplo 1 de la solicitud de patente WO 2011/098652, en donde se detecta la formación de microesferas (inclusiones) mediante microscopía por inmunofluorescencia indirecta empleando anticuerpos policlonales frente a muNS. En una realización particular, las condiciones adecuadas para la formación de microesferas comprenden incubar las células que expresan el primer y el segundo polinucleótido durante un periodo de tiempo de al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 5 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, y a una temperatura de entre 25 y 37°C, preferiblemente 37°C.
La primera y la segunda etapa del método para producir la proteína de fusión de la invención se pueden llevar a cabo de forma simultánea o bien de forma secuencial, de modo que primero se lleva cabo la expresión del primer y segundo polinucleótido y a continuación se someten las células a condiciones adecuadas para la formación de microesferas. En una realización particular, la primera y segunda etapa se llevan a cabo de forma simultánea, puesto que las condiciones a las que se someten las células bacterianas para la expresión del primer y segundo polinucleótido son adecuadas para la formación de microesferas. En una realización más particular, dichas condiciones comprenden incubar las células en presencia del inductor, preferiblemente IPTG, durante un periodo de tiempo de al menos 30 minutos, al
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menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 5 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, y a una temperatura de entre 25 y 37°C, preferiblemente 37°C.
La tercera etapa del método de producción de la proteína de fusión de la invención consiste en concentrar las microesferas. Para concentrar las microesferas es necesario lisar las células bacterianas en las que se han formado las microesferas mediante cualquier método, como la incubación con un tampón de lisis o la sonicación, entre otros. Posteriormente, las microesferas se pueden sedimentar mediante centrifugación, preferiblemente a una velocidad de aproximadamente 2700g. En una realización particular, una vez lisadas las células las microesferas se lavan con un tampón que comprende un catión divalente. El término "catión divalente", según se usa en la presente invención, se refiere a un ion cargado positivamente de cualquier metal de la tabla periódica que tenga una valencia de 2. Cationes divalentes adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, los cationes divalentes de Mg, Cd, Ca, Co, Cu, Fe, Mn, Ni, Sr y Zn. En una forma preferida de realización, el catión divalente es Mg2+. Concentraciones adecuadas de catión divalente para inducir la formación de agregados de la proteína muNS son, por ejemplo, al menos 0, 5 mM, al menos 0, 8 mM, al menos 1 mM, al menos 5 mM, al menos 10 mM, al menos 15 mM, al menos 20 mM o superiores. En una realización particular, las microesferas se lavan con un tampón que comprende Mg2+, por ejemplo MgCl2, preferiblemente a una concentración de 5 mM. En una realización aún más particular, las microesferas se concentran siguiendo el protocolo de purificación que se indica en los ejemplos del presente documento.
En una realización particular, el método de producción de la proteína de fusión de la invención comprende además purificar la proteína de fusión sometiendo a las microesferas a condiciones que conducen a su desintegración.
Las condiciones que conducen a la desintegración de las microesferas incluyen, entre otras:
- incubación de las microesferas con agentes desnaturalizantes, por ejemplo, urea o hidrocloruro de guanidinio,
- incubación de las microesferas con detergentes iónicos, por ejemplo SDS a alta concentración,
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- incubación con NaCI a concentraciones superiores a 500mM, - incubación con un tampón que no comprende cationes divalentes, preferiblemente que no comprende Mg2+.
En una realización particular, las condiciones que conducen a la desintegración de las microesferas son la incubación con un tampón que no comprende cationes divalentes, preferiblemente que no comprende Mg2+.
En una realización particular, una vez desintegradas las microesferas, la proteína de fusión se puede purificar mediante cualquier método conocido.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión obtenible según el método para producir la proteína de fusión de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión de la invención en donde dicha proteína carece de modificaciones post-traduccionales de eucariotas. El término "modificaciones post-traduccionales de ecuariotas" ha sido previamente descrito.
Método para producir la proteína IGRP
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir la proteína IGRP, o una variante funcionalmente equivalente de la misma, que comprende las siguientes etapas:
(a) producir una proteína de fusión según el método para producir una proteína de fusión de la invención, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de reconocimiento por una proteasa entre sus componentes (i) y (ii) ,
(b) someter a las microesferas a condiciones que conducen a su desintegración, produciéndose la separación de la proteína de fusión y las microesferas,
(c) poner en contacto el producto resultante de la etapa (b) con una proteasa específica para la secuencia de reconocimiento que conecta los componentes (i) y (ii) de la proteína de fusión bajo condiciones adecuadas
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para la proteólisis de dicha proteína de fusión, con la consiguiente separación de los componentes (i) y (ii) de la proteína de fusión,
(d) someter el producto de la etapa (c) a condiciones adecuadas para la formación de las microesferas y
(e) separar las microesferas de la proteína IGRP o de la variante funcionalmente equivalente de la misma.
En una realización particular, la secuencia de reconocimiento por una proteasa que une los componentes (i) y (ii) de la proteína de fusión es una secuencia de reconocimiento por enteroquinasa (sitio de corte DDDDK- SEQ ID NO: 6) , factor Xa (sitio de corte IEDGR- SEQ ID NO: 7) , trombina (sitio de corte LVPRGS- SEQ ID NO: 8) , proteasa TEV (sitio de corte ENLYFQG - SEQ ID NO: 9) , proteasa PreScission (sitio de corte LEVLFQGP - SEQ ID NO: 10) , inteínas o similares. En una realización más particular, la secuencia de reconocimiento por proteasas es una secuencia de reconocimiento por enteroquinasa o una secuencia de reconocimiento por factor Xa. En una realización aún más particular, la secuencia de reconocimiento por proteasas es la secuencia de SEQ ID NO: 6 o la secuencia de SEQ ID NO: 7.
Las etapas (a) y (b) del método para producir la proteína IGRP o una variante funcionalmente equivalente de la misma han sido previamente descritas.
Las condiciones adecuadas para la proteólisis de la proteína de fusión comprenden poner en contacto la proteína de fusión con la proteasa específica para la secuencia de reconocimiento que conecta los componentes (i) y (ii) de la proteína de fusión bajo condiciones de pH, temperatura, etc. que dependerán de la proteasa concreta a utilizar. El experto en la materia sabe determinar estas condiciones para cada proteasa particular.
Las condiciones adecuadas para la formación de microesferas incluyen poner en contacto el producto resultante de la etapa (a) con un tampón que contiene un catión divalente, tal y como se ha descrito previamente. En una forma preferida de realización, el catión divalente es Mg2+. Concentraciones adecuadas de catión divalente para inducir la formación de agregados de la proteína muNS son, por ejemplo, al menos 0, 01 mM, al menos 0, 1 mM, al menos 1 mM, al menos 2 mM, al menos 3 mM, al menos 4 mM, al menos 5 mM o superiores. En una realización
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particular, dichas condiciones comprenden la inbucación con un tampón que comprende Mg2+, preferiblemente a una concentración de 5 mM.
De acuerdo al presente método, cuando las microesferas se vuelven a formar el componente (ii) de la proteína de fusión se integra de nuevo en dichas microesferas, quedando libre el componente (i) de la proteína de fusión. Por tanto, este es un método adecuado para la purificación de IGRP o su variante funcionalmente equivalente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con la proteína IGRP o una variante funcionalmente equivalente de la misma obtenible según el método para obtener IGRP o una variante funcionalmente equivalente de la misma de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con la proteína IGRP o una variante funcionalmente equivalente de la misma en donde dicha proteína o dicha variante carece de modificaciones post-traduccionales de eucariotas.
El término "modificaciones post-traduccionales de ecuariotas" ha sido previamente descrito.
Composición farmacéutica
Las microesferas son potentes inductores de respuesta inmune. Los inventores han comprobado que en un ensayo con epítopos del virus de la lengua azul (BTV) la vacunación con microesferas de muNS-Mi cargadas con tres epítopos de BTV (VP2, VP7 y NS1) protege contra un desafío letal con el virus en ausencia de ningún adyuvante añadido, mientras que la vacunación con las microesferas sin dichos epítopos, o con los epítopos solos, sin estar integrados en microesferas, no proporcionan protección alguna (Marín-López, A. et al., VP2, VP7, and NS1 proteins of bluetongue virus targeted in avian reovirus muNS-Mi microspheres elicit a protective immune response in IFNAR (-/-) mice. Antiviral Research 110, 42-51 (2014) ) .
Por otra parte, se ha descrito que péptidos derivados de IGRP así como modificaciones de los mismos son capaces de prevenir el desarrollo de diabetes tipo 1 en un modelo murino (Han, B. et al., Nature Medicine 2005, 11:645-652) y que el
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empleo de antígenos completos, péptidos o modificaciones derivados de estos autoantígenos permite inducir tolerancia en lugar de una respuesta pro-inflamatoria bajo determinadas condiciones (Clemente-Casares X et al. Cold Spring Harb Perspect Med 2012, 2 (2) : a007773) .
Por tanto, las microesferas de la invención se pueden emplear como vacuna para inducir tolerancia frente al antígeno IGRP y, de este modo, prevenir la diabetes tipo 1.
Por tanto, en otro aspecto la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende la microesfera de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Tal como se usa en la presente invención, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una formulación que se ha adaptado para administrar una dosis predeterminada de uno o varios agentes terapéuticos útiles a una célula, un grupo de células, un órgano, un tejido o un animal.
La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en el presente documento, se entiende como una cantidad capaz de proporcionar un efecto terapéutico, y que puede ser determinada por la persona experta en la técnica por medios comúnmente utilizados. En particular, la cantidad terapéuticamente eficaz de las microesferas de la invención es aquella capaz de indicar tolerancia frente a IGRP en el paciente. La cantidad de microesferas de la invención que puede incluirse en las composiciones farmacéuticas según la invención variará dependiendo del sujeto y el modo particular de administración. Los expertos en la materia apreciarán que las dosificaciones también pueden determinarse con orientación de The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Goldman, novena edición (1996) , apéndice II, páginas 1707-1711 y de The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Goldman, Décima Edición (2001) , Apéndice II, pp. 475-493.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también contienen uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables. Se entiende por "excipiente farmacéuticamente aceptable" una sustancia terapéuticamente inactiva que se usa para incorporar el ingrediente activo y que es aceptable para el paciente desde un punto de vista farmacológico/toxicológico y para el químico farmacéutico que la fabrica esde un punto de vista físico/químico con respecto a la composición, formulación, estabilidad, aceptación del paciente y biodisponibilidad. El excipiente o vehículo también incluye cualquier sustancia que sirva para mejorar la administración y la efectividad del principio activo dentro de la composición farmacéutica. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que aumentan la vida útil o la eficacia de las microesferas o de las composiciones que forman parte de las composiciones farmacéuticas. Ejemplos de vehículos apropiados se conocen bien en la bibliografía (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995) . En algunos casos, puede agregarse un desintegrante tal como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o alginato de sodio. El número y la naturaleza de los excipientes farmacéuticamente aceptables dependen de la forma de dosificación deseada. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos por los expertos en la técnica (Faulí y Trillo C. (1993) "Tratado de Farmacia Galénica", Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid) .
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por cualquier vía adecuada, tal como oral, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular.
Usos médicos de la invención
En otro aspecto, la invención se refiere a la microesfera de la invención para su uso en medicina.
En otro aspecto, la invención se relaciona con la microesfera de la invención para el tratamiento y/o prevención de diabetes tipo 1. Alternativamente, la invención se relaciona con la microesfera de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de diabetes tipo 1. Alternativamente, la invención se relaciona con un método para prevenir diabetes tipo 1 que comprende administrar a un
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paciente en riesgo de desarrollar diabetes tipo 1 una cantidad terapéuticamente eficaz de la microesfera de la invención.
El término "diabetes tipo 1" o "diabetes mellitus tipo I" o "diabetes juvenil" o "diabetes mellitus insulino-dependiente", tal y como aquí se utiliza, se refiere a una enfermedad metabólica caracterizada por una destrucción selectiva de las células beta del páncreas causando una deficiencia absoluta de insulina. Se diferencia de la diabetes tipo 2 porque es un tipo de diabetes caracterizada por darse en época temprana de la vida, generalmente antes de los 30 años. Sólo 1 de cada 20 personas diabéticas tiene diabetes tipo 1, la cual se presenta más frecuentemente en jóvenes y niños. La diabetes tipo 1 se clasifica en casos autoinmunesla forma más comúny en casos idiopáticos. El término "diabetes tipo 1", tal y como aquí se utiliza, incluye tanto diabetes tipo 1 clásica, que se diagnostica generalmente antes de los 30 años y precisa tratamiento con insulina desde que se hace el diagnóstico, como diabetes autoinmune latente del adulto, que se diagnostica a partir de los 30 años y no suele requerir tratamiento con insulina en los 3-6 meses tras el diagnóstico.
En una realización particular, la diabetes tipo 1 es diabetes tipo 1 autoinmune. El término "diabetes tipo 1 autoinmune", tal y como aquí se utiliza, se refiere a enfermedad autoinmune en la que existe una destrucción selectiva de las células B del páncreas mediada por linfocitos T activados en sujetos con haplotipos HLA de predisposición. Después de un período preclínico de duración variable, durante el cual el paciente permanece asintomático, cuando la masa de células productoras de insulina llega a un valor crítico el paciente presenta la sintomatología clásica: poliuria, polidipsia, polifagia, pérdida de peso y una progresiva cetosis que puede acabar en cetoacidosis, si no se instaura tratamiento con insulina exógena.
En una realización más particular, la diabetes tipo 1 es "diabetes autoinmune latente del adulto" o "LADA" (del inglés, "latent autoinmune diabetes of the adult") , tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un tipo de diabetes autoinmune que se diagnostica en la edad adulta, normalmente a partir de los 30 años, en sujetos que son positivos para al menos un autoanticuerpo de los que están normalmente presentes en pacientes con diabetes tipo 1 clásica, por ejemplo, anticuerpos anti islotes pancreáticos (ICA, del inglés "islet cell antibodies) , anticuerpos anti-decarboxilasa del ácido glutámico (GADA, del inglés "glutamic acid decarboxylase antibodies) ,
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anticuerpos asociados a isulinoma (IA-A2, del inglés "islet antigen-2 antibodies") o anticuerpos anti-insulina (IAA, del inglés "insulin autoantibodies") , y que no requieren tratamiento con insulina en los primeros 3 o 6 meses tras el diagnóstico. La diabetes autoinmune del adulto se diferencia de la diabetes tipo 1 por el fallo lentamente progresivo de las células p y la consecuente dependencia gradual de insulina. En pacientes con LADA la función de las células p normalmente se ve afectada dentro de los seis años posteriores al diagnóstico.
El término "tratamiento", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de la microesfera de la invención para aliviar o eliminar la enfermedad diabetes tipo 1 o para reducir o eliminar uno o más síntomas asociados a diabetes tipo 1.
El término "prevención", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de la microesfera de la invención para prevenir, minimizar u obstaculizar el desarrollo de diabetes tipo 1 en un paciente.
El término "paciente" o "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal, preferiblemente un mamífero e incluye, entre otros, animales domésticos y de granja, primates y seres humanos, por ejemplo, seres humanos, no humanos primates, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores como ratas y ratones. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano de cualquier edad o raza. En una realización particular, el sujeto está en riesgo de desarrollar diabetes tipo 1. Un sujeto que presenta riesgo de desarrollar diabetes tipo 1 es aquel individuo con un familiar directo (hermano/a) con diabetes tipo 1 diagnosticada y que, además, presenta múltiples (>2) autoanticuerpos en suero dirigidos contra islotes pancreácticos (ICA) , anti-decarboxilasa del ácido glutámico 65 (GADA65) , antígeno de islotes 2 (IA-2) o el transportador de ZnT8 (ZnT8) .
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" ha sido descrito previamente. En una realización particular, la cantidad terapéuticamente eficaz es aquella que consiga conservar los niveles séricos de péptido C, y/o conservar/reducir los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c) , y/o reducir la dosis media de insulina, y/o inducir la generación de linfocitos T reguladores. "Cantidad terapéuticamente eficaz" hace eferencia a la cantidad de antígeno administrada con las microesferas, que se puede determinar mediante métodos habituales de cuantificación de proteínas.
En una realización particular, la vía de administración de las microesferas de la invención es oral, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular.
En una realización particular, las microesferas se administran en ausencia de un adyuvante. Sin querer estar vinculado a una teoría en particular, se considera que la administración de antígenos en ausencia de adyuvante favorece el desarrollo de una respuesta de tolerancia en el organismo, en lugar de una respuesta inflamatoria. El término "adyuvante", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente inmunológico que modifica el efecto de un inmunógeno, mientras que tiene pocos, si alguno, efectos directos cuando se administra por sí mismo. Con frecuencia se incluye en vacunas para aumentar la respuesta inmune del receptor al antígeno suministrado, al tiempo que mantiene el material exógeno inyectado a un mínimo. Los adyuvantes se añaden a las vacunas para estimular la respuesta del sistema inmune al antígeno diana, pero no confieren inmunidad por sí mismos. Ejemplos no limitantes de adyuvantes útiles incluyen sales minerales, polinucleótidos, poliargininas, ISCOM, saponinas, monofosforil lípido A, imiquimod, inhibidores de CCR5, toxinas, polifosfacenos, citoquinas, proteínas inmunorreguladoras, proteínas de fusión inmunoestimuladoras, moléculas coestimuladoras y combinaciones de los mismos. Las sales minerales incluyen, pero no están limitadas a, AlK (SO4) 2, AlNa (SO4) 2, AlNH4 (SO4) , sílice, alumbre, Al (OH) 3, Ca3 (PO4) 2, caolín o carbono. Los polinucleótidos inmunoestimuladores útiles incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos de CpG con o sin complejos inmunoestimuladores (ISCOM) , oligonucleótidos de CpG con o sin poliarginina, ácidos poli IC o poli AU. Las toxinas incluyen toxina del cólera. Las saponinas incluyen, pero no están limitadas a, QS21, QS17 o QS7. Un ejemplo de una proteína de fusión inmunoestimuladora útil es la proteína de fusión de IL-2 con el fragmento Fc de inmunoglobulina. Las moléculas inmunorreguladoras útiles incluyen, pero no están limitadas a, CD40L y ligando CD1a. Las citoquinas útiles como adyuvantes incluyen, pero no están limitadas a, IL-1, IL-2, IL-4, GMCSF, IL-12, IL-15, IGF-1, IFN-a, IFN-p e interferón gamma. Además, ejemplos de adyuvantes son muramil dipéptidos, tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también denominado nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-
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3-hidroxifosforiloxi) -etilamina (CGP 19835A, también denominado MTP- PE) , RIBI (MPL+TDM+CWS) en una emulsión al 2% de escualeno/TWEEN® 80, lipopolisacáridos y sus varios derivados, incluyendo lípido A, adyuvante completo de Freund (FCA) , adyuvante incompleto de Freund, Adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AU) , cera D de Mycobacterium tuberculosis, sustancias encontradas en Cor y nebacterium parvum, Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella, Titermax, Quil A, ALUN, derivados de lípido A, derivados de la toxina del cólera, derivados de HSP, derivados de LPS, derivados de MPL, matrices de péptidos sintéticos o GMDP, Montanide ISA-51 y QS-21, oligonucleótido CpG, poli I:C y GMCSF.
Método para inducir diabetes en un modelo animal
Se ha descrito previamente que la administración a ratones NOD de una vacuna de ADN incluyendo la secuencia codificante de la proteína IGRP acelera el desarrollo de diabetes tipo 1 (Fuchs, V.F. et al., Clin Exp Immunol 2014, 176 (2) :199-206) .
Por tanto, en otro aspecto la invención se relaciona con un método para inducir diabetes tipo 1 en un modelo animal que comprende administrar a dicho animal una cantidad eficaz de la microesfera de la invención.
El término "diabetes tipo 1" ha sido previamente definido. En una realización particular, la diabetes tipo 1 es una diabetes autoinmune. En una realización particular, la diabetes tipo 1 es diabetes autoinmune latente del adulto.
El término "modelo animal", tal y como aquí se utiliza, se refiere a un animal de experimentación que padece una enfermedad o es capaz de desarrollar una enfermedad similar a dicha enfermedad en humanos, y que se puede usar como el modelo para el estudio de dicha enfermedad. Un modelo animal debe ser fácil y reproducible. Además, la enfermedad del modelo animal debería tener la misma etiología que en los humanos, o debería progresar en un patrón similar al de los humanos. Por consiguiente, los vertebrados de mamíferos, que son similares en estructura corporal a los humanos, por ejemplo con respecto a los órganos internos, sistema inmune y temperatura corporal, y que padecen enfermedades tales como hipertensión, cáncer, inmunodeficiencia, etc. son adecuados como modelos animales.
Los animales de los modelos son particularmente mamíferos, tales como caballos, ovejas, cerdos, cabras, camellos, antílopes, perros, conejos, ratones, ratas, conejillos de indias y hámsteres, y más particularmente roedores tales como ratones, ratas, conejillos de indias y hámsters. Un ratón se usa con mayor frecuencia en el estudio de las enfermedades humanas debido a sus diversas ventajas, que incluyen su pequeño tamaño, fertilidad potente, manejo fácil de la alimentación, alta resistencia a las enfermedades, uniformidad hereditaria y variedad de cepas. Otra ventaja para la aceptación del uso como modelo animal es que los ratones pueden transformarse para mostrar enfermedades o síntomas idénticos o similares a los de los seres humanos.
En una realización particular, el modelo animal es murino o de ratón.
En una realización más particular, el animal está modificado genéticamente para favorecer el desarrollo de diabetes tipo 1. Ejemplo de animales, particularmente ratones, modificados genéticamente para favorecer el desarrollo de diabetes son los ratones transgénicos que expresan B7-1 y una glicoproteína viral en sus células beta pancreáticas junto con células T que expresan el receptor de células T transgénico específico de glicoproteína viral (Harlan, D.M. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91 (8) : 3137-41) o ratones transgénicos que expresan la glicoproteína viral (GCV) de la coriomeningitis linfocítica (GPM) en las células del islote beta del páncreas (Ohashi, P.S. et al., Cell 1991, 65 (2) : 305-17) .
Cuando el modelo animal es murino, la microesfera preferiblemente comprende la proteína IGRP murina.
El término "cantidad eficaz", tal y como aquí se utiliza, se refiere a la cantidad de microesferas necesarias para inducir una respuesta inmune frente a la proteína IGRP y, en última instancia, el desarrollo de diabetes. En una realización particular, cuando el animal es un ratón, la cantidad eficaz de microesferas es aquella que comprende entre 1 y 5 ^g de proteína IGRP/animal.
En una realización particular, la administración se hace por vía subcutánea o intramuscular.
En una realización particular, las microesferas se administran junto con un adyuvante. El término "adyuvante" ha sido previamente definido. En una realización más articular, el adyuvante es adyuvante completo de Freund. El término "adyuvante completo de Freud" o "CFA" (del inglés, "complete Freund adyuvant) , tal y como aquí se utiliza, se refiere a una solución de aceite mineral que comprende micobacterias, generalmente (M. tuburculosis) inactivadas y secas.
La invención se describe a continuación mediante los siguientes ejemplos, que deben ser considerados como meramente ilustrativos y en ningún caso limitativos del ámbito de la presente invención.
Ejemplos
Materiales y métodos
Células y bacterias
Las células de insecto Sf-9 se crecieron mediante cultivo en suspensión a 28°C en medio SF-900 II (Thermo Fisher) suplementado con 5% FBS, 2% de glutamina y 1% de antibióticos (Thermo Fisher) . Las bacterias utilizadas para la obtención del bácmido fueron DH10Bac (Invitrogen) que se transformaron por choque térmico y posteriormente se sembraron en placas de LB agar con gentamicina (7 ^g/ml) (Sigma-Aldrich, Madrid, España) , tetraciclina (10 ^g/ml) (Sigma-Aldrich, Madrid, España) y kanamicina (50 ^g/ml) . Las bacterias utilizadas para la propagación de plásmidos fueron XL1-Blue (Stratagene) , que igualmente se transformaron por choque térmico y se sembraron en placas de LB agar con ampicilina (100 ^g/ml) (Sigma-Aldrich, Madrid, España) . Las bacterias utilizadas para la expresión de proteína a través del promotor de T7 fueron las BL21 DE3 C+ (Sigma-Aldrich, Madrid, España) .
Clonaje y obtención de baculovirus recombinantes
Para la obtención del baculovirus que expresa la proteína de fusión IC-IGRP se amplificó por PCR la secuencia de IGRP a partir del ADN complementario comercializado por Ambion (PCR-Ready Human Pancreas cADN) utilizando los siguientes cebadores: sentido 5'-GCGAAGCTTGGCATGGATTTCCTTCACAGGAATGG - 3' (SEQ ID NO: 12) y antisentido 5'- GCGAAGCTTCTACTGACTCTTCTTTCCGCTTTGTTTC -3' (SEQ ID NO: 13) (diana HindIII subrayada codón stop doblemente subrayado) . El PCR resultante fue sometido a digestión con la enzima HindIII y posteriormente ligado en el plásmido pFastBac-1 obteniendo el plásmido pFastBac IGRP. Para introducir la
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secuencia del tag IC antes de la IGRP se amplificó por PCR la secuencia del IC a partir de un plásmido pGEMT-M3 (Brandariz-Nuñez, A. et al., PLoS ONE 2010, 5, e13785) usando los siguientes cebadores: sentido 5'-GCATAAGAATGCGGCCGCTATCATGGCGGAAGATCACTTGTTGGCTTATC -3' (SEQ ID NO: 14) y cebador antisentido 5'-GCGTCTAGACGCTTCCACACGGGGTTCCCACTCAG -3' (SEQ ID NO: 15) (diana Notl y XbaI subrayadas, ATG iniciador doblemente subrayado) . El producto de PCR fue digerido con las enzimas NotI y XbaI y clonado dentro del plásmido pFastBac IGRP para crear el plásmido pFastBac IC-IGRP. Las secuencias fueron confirmadas por secuenciación de ADN (STABVIDA, Portugal) .
La obtención del bácmido a partir de bacterias DH10Bac y el posterior baculovirus por transfección de células SF9 con los bácmidos recombinantes se hizo como recomienda el proveedor del sistema bac-to-bac (Invitrogen) .
Para comprobar la expresión de proteínas con los baculovirus recombinantes, se infectaron con ellos células Sf-9 sembradas en monocapa a 600.000 células/ml. Tras 3 días post infección se recogieron las células y se centrifugaron a 16000Xg, 2 minutos.
Se lavaron 2 veces con PBS 1X y se cargaron en un gel de poliacrilamida que posteriormente se tiñó con azul de Coomasie.
Adaptación del sistema IC-Tagging a bacterias
Para la expresión de las proteínas en bacterias se utilizó el plásmido de expresión dual pET Duet-1 que tiene dos MCS bajo el control del promotor de la polimerasa T7. Lo primero que se hizo fue clonar la secuencia de muNS-Mi en el MCS1 del plásmido pET Duet-1. Para ello se amplificó por PCR la secuencia utilizando como molde el plásmido pGEMT-M3 (Touris-Otero, F. et al., J Mol Biol 2004, 341: 361-374) y los siguientes cebadores: sentido 5'- CATGCCATGGCACCAGCCGTACTGCTGTC -3' (SEQ ID NO: 16) y reverse 5'- TTGCGGCCGCAATCACAGATCATCCACC -3' (SEQ ID NO: 17) (diana NcoI y NotI subrayada y codon stop doblemente subrayado) . Se digirió el producto de amplificación con las enzimas NcoI y NotI y se ligó en el MCS1 del plásmido pET Duet-1 para generar pET Duet-1 1.muNS-Mi. Lo segundo fue introducir la secuencia de IC-IGRP en el MCS2 del plásmido pET Duet-1 1.muNS-Mi. Para ello se amplificó por PCR la secuencia de IC-IGRP usando los siguientes cebadores: entido 5'- GGAGATCTCGCGGAAGATCACTTGTTGGC- 3' (SEQ ID NO: 18) y antisentido 5'- GGGATATCCTACTGACTCTTCTTTCCGC -3' (SEQ ID NO: 19) (diana BglII y EcorRV subrayada y codon stop doblemente subrayado) . El producto de PCR fue digerido con las enzimas correspondientes y ligado en el MCS2 del plásmido pET Duet-1 1.muNS-Mi para generar pET Duet-1 1.muNS-Mi 2.IC-IGRP.
Expresión y purificación de proteínas en bacterias
Para la expresión de proteínas en bacterias, se transformaron bacterias BL21 DE3 C+ con el plásmido correspondiente. Una vez obtenidas colonias, se creció una colonia en LB con el antibiótico correspondiente y se incubó durante 12 horas a 37°C en agitación. A continuación se diluyó ese pre-cultivo 25 veces en un volumen total de 100 ml de LB y se incubó durante 2 horas y 30 minutos a 37°C con agitación. Posteriormente se indujo la expresión con 1mM de IPTG y se incubó durante 3 horas a 37°C con agitación. Se recogieron las bacterias por centrifugación a 3200Xg, 30min y 4°C. Se lavó el pellet 2 veces con PBS 1X y se resuspendió en tampón de lisis de bacterias con lisozima e inhibidor de proteasas, dejándolo a -20°C un mínimo de 12 horas. Posteriormente se descongelaron y lisaron las bacterias mediante sonicación y se centrifugaron a 2700 g, 5min, 4°C, descartando el sobrenadante. El sedimento se lavó 1 vez con TRB+ con 0, 5% Triton X-100, 3 veces con TRB+ y se resuspendió finalmente en 1 ml de TRB+. Para analizar por SDS-PAGE, la muestra se desmontó previamente por incubación con 10% SDS durante 15 min a temperatura ambiente.
Western-blot
Para el análisis por Western-blot, los extractos proteicos se sometieron a SDS-PAGE y a continuación las proteínas se transfirieron a membranas PVDF (Immobilion-P Millipore) durante 1 hora a 100 mA. Las proteínas se detectaron con anticuerpos específicos usando Immobilion Western Chemiluminiscent HRP Substrate (Millipore) .
Disoluciones y tampones
PBS: 137 mM NaCl; 2, 7 mM KCl; 8 mM Na2PO4 y 1, 5 mM KH2PO4.
PBST: 137 mM NaCl; 2, 7 mM KCl; 8 mM Na2PO4; 1, 5 mM KH2PO4 y 0, 05% Tween-20.
PBST-Leche: 137 mM NaCl; 2, 7 mM KCl; 8 mM Na2PO4; 1, 5 mM KH2PO4; 0, 05% Tween-20 y 5% de leche desnatada.
Tampón de electroforesis para SDS-PAGE 1X (Tris-glicina-SDS) : 25 mM Tris-HCl (pH 8, 3) ; 192 mM glicina y 0, 1 % SDS.
Tampón de muestra para ADN (6X) : 0, 25% azul de bromofenol; 0, 25% xileno cianol y 30% glicerol.
Tampón de muestra de Laemmli: 60 mM Tris-HCl (pH 6, 8) ; 2% SDS; 5% pmercaptoetanol; 10% glicerol y 0, 024% azul de bromofenol.
Tampón de transferencia: 25 mM Tris-HCl (pH 8, 3) ; 192 mM glicina y 20% metanol. Tampón Tris-EDTA (TE) : 10 mM Tris-HCl (pH 8, 0) y 1 mM EDTA.
Tampón Tris-acetato-EDTA (TAE) : 0, 004 M Tris-acetato y 0, 001 M EDTA.
TRB +: 10 mM Hepes pH 7, 9; 10 mM KCl; 5 mM MgCfe.
Tampón de lisis bacterias: 0, 25% Tween 20, 1mM DTT, 200mM NaCl, 20 mM Tris pH 7, 5, 2mM MgCl2.
Resultados
En principio se intentó la expresión de la proteína IGRP con sistemas convencionales sin utilizar el sistema IC-Tagging: expresión en bacterias y baculovirus/células de insecto. En ninguno de los casos se pudo detectar la presencia de la proteína (datos no mostrados) .
A continuación se decidió intentar expresarla usando IC-Tagging en el sistema de expresión baculovirus/células de insecto que los inventores tienen caracterizado. Para ello, se co-infectaron células Sf9 con dos baculovirus recombinantes: uno que expresaba la proteína muNS-Mi y otro que tenía la secuencia de la proteína IGRP fusionada al extremo C-terminal del tag IC, bajo el control del promotor de polihedrina. De esta manera, dicho baculovirus debería expresar la proteína de fusión IC-IGRP. Tres días post-infección, se analizaron extractos totales de las células infectadas en geles de poliacrilamida que se tiñeron con azul de Coomassie. En el gel puede verse perfectamente que cuando las células Sf9 se infectaban solo con el baculovirus que dirige la expresión de la expresión de muNS-Mi, aparece una banda prominente que corresponde al tamaño de la proteína esperada (Fig.2, canal 3) . Por el contario, no se observó expresión alguna de la proteína IGRP, ni cuando se intentaba expresar sola (Fig.2, canal 2) ni en combinación con muNS-Mi (Fig.2, canal 4) . Es más, en este último caso no sólo no se obtuvo expresión alguna de IGRP, sino que la inclusión del baculovirus recombinante para IGRP provocaba también la anulación de la expresión
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de muNS-Mi (Fig.2, canal 4) . Se hicieron diversos intentos de optimización de la expresión variando las multiplicidades relativas de los dos baculovirus utilizados, pero no se tuvo éxito alguno.
Se decidió entonces intentar adaptar el método IC-tagging a los sistemas de expresión bacterianos, para ver si se podía mejorar la expresión de esta y otras proteínas. En primer lugar, dado que este sistema requiere la expresión simultánea de dos proteínas diferentes, se decidió utilizar el plásmido pET Duet-1, diseñado para estos fines, que tiene dos lugares de clonaje múltiple diferentes (MCS) , donde introducir las secuencias de dos proteínas diferentes. Cada una de ellas queda bajo el control de un promotor independiente de la polimerasa T7 y el ARNm generado poseerá un sitio de unión a ribosoma. En primer lugar se introdujo la secuencia de muNS-Mi en uno de los MCS, y se comprobó la corrección de la construcción mediante secuenciación. Para comprobar la correcta expresión de la proteína, se indujo con IPTG un cultivo fresco de bacterias BL21 DE3 C+ transformadas con la construcción y se analizaron extractos de las células sin inducir e inducidas mediante geles de poliacrilamida. En la figura 3 se puede comprobar el aumento de intensidad de una banda de 21 kD, correspondiente a muNS-Mi, en los extractos de bacterias inducidas con IPTG (canal 2) , en comparación con las no inducidas (canal 1) .
A continuación se decidió comprobar si muNS-Mi era capaz de formar microesferas en el interior de las bacterias, de igual modo que lo hace en las células eucariotas. En primer lugar se diseñó un protocolo adaptado de purificación, consistente en: i) lavar las bacterias con PBS, ii) lisarlas en un tampón típico de lisis bacteriano (0, 25% Tween 20, 1mM DTT, 1mg/ml lisozima, 200mM NaCl y 20mM TrisHCL pH 7, 5) , con ayuda de sonicación y iii) lavar los sedimentos repetidas veces con un tampón que contenía magnesio (10mM Hepes pH 7, 9, 10 mM KCl, 5mM MgCl2 y 0, 5% Triton X-100) con ayuda de centrifugación, dejándolas finalmente en el tampón de lavado sin detergente. En los carriles 3 y 4 de la figura 3, puede verse como no queda apenas proteína en los sobrenadantes de los lavados (3) , mientras que el sedimento final muestra un alto grado de purificación de la proteína muNS-Mi (4) . El material que se muestra en el canal 4 de la figura 3 fue también analizado por microscopía. Se puso una gota del material sobre un portaobjetos al que se le puso un cubreobjetos encima y se visualizó con un objetivo 100X en un microscopio Olympus BX51, comprobando la presencia de partículas que rozaban el límite de detección del microscopio (Figura 4A) . Aunque abía partículas individualizadas, la mayor parte de ellas parecían asociarse en grupos de dos. Analizando este material por DLS (dynamic light scattering) , se confirmó un pequeño pico alrededor de media micra y uno mayor correspondiente a una micra, lo que coincide con partículas individuales o agregados de dos (datos no mostrados) . Para lograr una mejor caracterización de estas partículas se decidió analizar por microscopía electrónica la presencia de microesferas en el interior de bacterias transformadas e inducidas con IPTG. En la figura 4B se muestran fotos representativas, donde puede apreciarse la presencia de inclusiones esféricas dentro de las bacterias inducidas que no están presentes en las no inducidas (no mostrado) . Las estructuras observadas tienen un diámetro aproximado de 400-500 nm, coincidiendo con lo observado al microscopio óptico y DLS.
Para descartar que las esferas observadas y purificadas representasen simplemente cuerpos de inclusión típicos bacterianos, decidimos explotar una de las características de las microesferas de muNS-Mi y que no es compartida en absoluto por los cuerpos de inclusión: su inestabilidad en ausencia de magnesio. Para ello se incubaron microesferas purificadas de bacterias en un tampón carente de magnesio durante 4 hr. A continuación se centrifugaron las muestras y se separó sobrenadante de sedimento, analizando ambos en geles de poliacrilamida. Se pudo así comprobar que la mayor parte de la proteína se solubilizaba fácilmente en ausencia de magnesio quedando en el sobrenadante (Figura 4C, canal 1) , mientras que en el sedimento sólo quedaba una cantidad residual (Figura 4C, canal 2) , que podía eliminarse totalmente añadiendo más tampón (no mostrado) .
Tras comprobar la correcta construcción del plásmido recombinante, la adecuada expresión de muNS-Mi y la produción de microesferas en el interior de las bacterias, se procedió a la introducción de la secuencia de IGRP en el segundo MCS. Una vez confirmada la correcta construcción del plásmido recombinante por secuenciación, se analizó la expresión conjunta de muNS-Mi e IGRP. Para ello, al igual que se ha descrito antes, se prepararon cultivos frescos de bacterias BL21 DE3 C+ transformadas con el plásmido doble recombinante (muNS-Mi/IC-IGRP) cuya expresión se indujo con IPTG. No parecía observarse expresión apreciable de IGRP ni tras 3 horas post-inducción (Fig. 5, comparar canal 1 con el 2) , ni tras 18 horas de inducción a temperatura ambiente (no mostrado) , aunque sí se veía la presencia de muNS-Mi en ambos casos, lo que indicaba que al contrario de lo que sucedía con los ntentos de expresión con el sistema de baculovirus/células de insecto, la expresión de IGRP no tenía efectos negativos sobre la expresión de muNS-Mi en bacterias. Se decidió entonces concentrar las microesferas producidas tras la inducción del plásmido doble recombinante para intentar recuperar la proteína IGRP que pudiera estar expresándose en las bacterias, pero que quizás coincidiese con alguna proteína bacteriana o estuviese a una concentración muy baja para poder ser detectada en los geles de poliacrilamida sin purificación y/o concentración. Para ello, tras inducir un cultivo fresco de bacterias transformadas con el recombinante doble, se concentraron las microesferas como se ha indicado antes para los resultados mostrados en la figura 3. Tras concentrar por centrifugación las microesferas producidas dentro de las bacterias, se obtuvo una banda visible tras tinción con azul de Coomassie, que correspondía con el tamaño esperado para IGRP-IC (Figura 5, canal 3) . La identidad de dicha banda fue doblemente confirmada por Western-Blot contra muNS, que detecta el tag IC (Figura 6b, canal X) y por espectrometría de masas (nLC-MS/MS) .
Conclusiones
Tal y como se ha mostrado, utilizando el sistema IC-Tagging en bacterias los inventores son capaces de producir IGRP en cantidad apreciable, en contra de lo que sucedía cuando se intentó hacer en el sistema de baculovirus. Esto indica que los dos métodos no son equivalentes sino complementarios, tanto estructuralmente, donde las micoresferas producidas con baculovirus son más grandes y estables, como funcionalmente. De esta manera, con el método bacteriano, proteínas como IGRP cuya expresión es inicialmente indetectable pueden producirse en cantidades utilizables, abriendo la posibilidad de producirla a mayor escala. Este sistema permite además, desmontar las microesferas por simple incubación con un tampón si existiese interés en la posterior purificación de la proteína. En este sentido, puede incluso diseñarse una diana para proteasas específicas, como enterokinasa o Factor Xa, que comunique la secuencia de la proteína de interés (IGRP en este caso) y muNS-Mi, de manera que tras desmantelar la microesfera, puedan separarse el tag IC de la proteína de interés por proteolisis específica de secuencia. A continuación bastará con volver a cambiar el tampón para reconstituir la esfera que capturará al tag pero no a la proteína, constituyendo un sistema de purificación extremadamente sencillo y además, perfectamente escalable.
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4
Los términos "Sequence listing y "Artificial sequence del listado de secuencias se traducen, respectivamente, como "Listado de secuencias" y "Secuencia artificial".
