Uso de licores de lavado de maíz como fuente de fosfolípidos y lecitina
Sector de la técnica
La presente invención pertenece al sector de sustancias naturales con capacidad emulsionante y regenerativa de células entre las que se incluyen los fosfolípidos y/o lecitina.
El objeto principal de la invención es la obtención de un extracto natural a base de lecitina y/o fosfolípidos, a partir de una corriente residual acuosa, procedente del proceso de fraccionamiento del maíz por vía húmeda, con usos potenciales en la industria farmacéutica, cosmética, alimentaria y agroquímica, como coadyuvantes en sus formulaciones, con el fin de mejorar sus propiedades emulsionantes y regenerativas así como para mejorar la permeabilidad de los compuestos activos a través de las membranas celulares.
Antecedentes de la invención
La lecitina es un extracto oleoso formado por fosfolípidos (PL) de distinta naturaleza entre los que se incluyen la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, el fosfatiditil inositol, el ácido fosfatídico y la fosfatidilserina. Generalmente estos fosfolípidos forman parte de las membranas de células animales y vegetales. Habitualmente la lecitina es obtenida a partir de huevo o de cereales como la soja, existiendo amplia información y evidencias al respecto (Wagner and Richling, 2010; John et al., 2015; Ishii, 2016; Simedru et al., 2016; Akashi et al., 2017) . Sin embargo, no existen evidencias de la extracción de lecitina y fosfolípidos a partir de los licores de lavado de maíz. La única información que relaciona la lecitina y fosfolípidos con el maíz, establece la presencia de lecitina y fosfolípidos con el germen o la fracción oleosa del mismo (Kwiatkowski and Cher y an, 2005; Bilbie, James; Blaszczyk, 2009; Liu et al., 2018) .
Liu et al., 2018 han descrito un proceso para la producción de fosfolípidos y lecitina a partir de germen de maíz, tras una etapa de maceración húmeda. El germen de maíz representa alrededor de un 11-12% del peso del grano y contiene un 45-50% de aceite. Liu et al., 2018 han descubierto que el germen de maíz, además, es rico en lecitina y que esta puede ser obtenida tras moler el germen de maíz hasta un tamaño de partícula de 0.30-0.45 mm, seguido de un proceso de extracción supercrítica con CO2 utilizando una presión de 30 MPa, una temperatura de 50°C y un caudal de 25 L/h, para eliminar el aceite. Este paso supone una reducción de aceite en el germen de maíz del 95% y una pérdida de fosfolípidos del 6% respecto al total.
Posteriormente, el germen de maíz libre de aceite, es sometido a una extracción con etanol al 95% utilizando microondas y ultrasonidos, obteniéndose un sobrenadante y una fracción sólida. Esta última es disuelta en dietiléter, produciéndose la precipitación de sólidos que son eliminados mediante filtración con papel whatman. A continuación, los fosfolípidos son precipitados con acetona fría y posteriormente lavados cuidadosamente con la misma. Finalmente el precipitado es secado con N2 a temperatura ambiente, obteniéndose un 2.92% de lecitina a partir del germen de maíz libre de aceite. La lecitina obtenida por estos autores presenta un contenido en N del 1.77% y un contenido en fósforo del 3.47%.
Kwiatkowski and Cher y an, 2005 han propuesto la utilización de membranas para la concentración de una solución de aceite de maíz disuelta en etanol, obteniéndose un retentato o fracción sólida compuesto por sólidos, aceite de maíz concentrado, proteínas y lecitina.
Bilbie, James; Blaszczyk, 2009 han patentado la extracción de lecitina a partir de una fracción oleosa procedente del procesado de maíz.
Por otra parte, en estudios anteriores, se ha demostrado que a partir de los licores de lavado de maíz, procedentes del procesado de maíz por vía húmeda, se puede obtener un extracto con capacidad surfactante utilizando diferentes disolventes orgánicos. En él se ha detectado la presencia de lipopéptidos, (Vecino et al., 2014, 2015; Rodríguez-López et al., 2016) , aunque no hay evidencias hasta el momento de la posibilidad de que este extracto contenga lecitina o fosfolípidos.
No existen evidencias hasta el momento de la obtención de fosfolípidos y/o lecitina a partir de los licores de lavado de maíz, obtenidos tras el proceso de maceración del mismo. En la Figura 1 se muestran las etapas del proceso de fraccionamiento del maíz por vía húmeda para obtener distintos productos, siendo la corriente acuosa un subproducto sin mucho valor añadido.
Explicación de la invención
Se propone el uso de licores de lavado de maíz, también denominados "corn steep liquid" como fuente de lecitina y fosfolípidos para su uso en la industria alimentaria y cosmética como emulsionante, humectante o excipiente que favorezca la permeabilidad de sustancias activas.
Explicación detallada de la invención
Se analizaron varias corrientes acuosas de licores de lavado de maíz, entre las que se incluyen, aquellas proporcionadas por FeedStimulants y SantaCruz Biotechnology, obteniéndose un extracto con un rendimiento, en base al precipitado obtenido, consistente en lecitina y fosfolípidos de 2 g/Kg y 1 g/Kg, respectivamente.
Hay que tener en cuenta que la lecitina y/o fosfolípidos son muy poco solubles en agua (Kass, Gus; Skokie, 1981) y que, probablemente, la presencia de la misma en los licores de lavado de maíz está favorecida por los surfactantes existentes en esta misma corriente, con capacidad solubilizante y cuya existencia hemos demostrado con anterioridad (Vecino et al., 2014, Vecino et al., 2015; Rodríguez-López et al., 2016) .
Debido a su baja solubilidad en agua la lecitina y/o fosfolípidos se extraen fácilmente de corrientes acuosas utilizando disolventes orgánicos como el cloroformo o acetato de etilo, los cuales son eliminados del extracto objeto de estudio mediante destilación. Destacar que, durante este proceso de extracción con disolventes orgánicos, se extraen también ácidos grasos y biosurfactantes de elevado peso molecular coincidentes estos últimos con lipopéptidos. Por ello, es necesario una etapa posterior de precipitación y lavado con acetona, de tal forma que se obtiene un extracto a base de fosfolípidos y/o lecitina, separada de los otros componentes (ácidos grasos y biosurfactantes de elevado peso molecular) , que se obtienen también en la primera etapa de extracción con disolventes orgánicos.
La Figura 2 muestra, a modo de ejemplo, el espectro de masas del extracto obtenido tras la primera etapa realizada para la obtención de fosfolípidos y lecitina a partir de los licores de lavado de maíz, consistente en una extracción con acetato de etilo o cloroformo, observándose en los extractos obtenidos una masa a 758 Da en ambos casos, que se corresponderse con lecitina y/o fosfolípidos.
Además, la Figura 3 recoge el espectro de masas completo del precipitado y del sobrenadante, obtenidos tras la segunda etapa llevada a cabo para la obtención de lecitina y fosfolípidos a partir de los licores de lavado de maíz, consistente en la precipitación de la lecitina y fosfolípidos con acetona.
Atendiendo al espectro de masas del precipitado (Figura 3a) se observa que este está formado principalmente por un compuesto de masa de 758 Da, coincidente con la masa mayoritaria que más veces se repite en los patrones de fosfolípidos.
Por otra parte, en el sobrenadante (Figura 3b) se observa una desaparición de la señal correspondiente con los fosfolípidos y/o lecitina, de peso molecular de 758 Da, concentrándose en este sobrenadante otros compuestos entre los que se ha identificado el ácido hidroxinámico, de masa molecular 441 Da, con una abundancia relativa del 80.6%, correspondiéndose con un compuesto antioxidante, que ha sido identificado en trabajos previos en diferentes fracciones del maíz (LeClere, Schmelz and Chourey, 2007; Rodríguez-López et al., 2016) .
Además, en la Figura 4 se muestra la similitud de las masas encontradas, entre 700-800 Da, del precipitado objeto de estudio, obtenido a partir de los licores de lavado de maíz, con diferentes patrones de lecitina y fosfolípidos. En esta misma Figura 4, se incluye también, el espectro del sobrenadante, observándose que tras el proceso de precipitación apenas se aprecia la presencia de fosfolípidos y/o lecitina, en el mismo, no existiendo señal en el rango de masas estudiado.
Asimismo, la señal correspondiente a la masa molecular de 758 Da, obtenida a partir de los licores de lavado de maíz, en sus respectivos iones moleculares (Figura 5a) , se ha comparado con la descomposición de las masas moleculares de las muestras patrón de lecitina (Figura 5b) y fosfatidiletanolamina (Figura 5c) . Se ha observado que los iones moleculares obtenidos a partir de las masas precursoras son muy similares.
Por otra parte en las Tablas 1 y 2 se muestra la abundancia relativa de las masas según los espectros de masas obtenidos para el precipitado y sobrenadante procedente de los licores de lavado de maíz, recogidos en la Figura 3. Como se puede observar en la Figura 3a, el pico de mayor intensidad relativo al precipitado, se corresponde con la masa de lecitina y/o fosfolípidos, por lo que la abundancia relativa de todos los demás picos fue calculada en base a esta masa en la muestra de precipitado (Tabla 1) . En el caso del sobrenadante (Tabla 2, Figura 3b) , la abundancia relativa se determinó en base a la señal de máxima intensidad, siendo esta la masa de 933 Da.
Tabla 1. Abundancia relativa de las señales obtenidas mediante ESI-MS para el precipitado obtenido de los los licores de lavado de maíz formado principalmente por lecitina y/o fosfolípidos.
_______________ A. Precipitado_______________________
m/z___________________________ Abundancia relativa (%)
302.30677 10.2
395.22287 12.1
516.01794 14.9
614.04531 46.4
758.57853 100.0
Tabla 2. Abundancia relativa de las señales obtenidas mediante ESI-MS para el sobrenadante resultante de la extracción de fosfolípidos y/o lecitina.
B. Sobrenadante
m/z Abundancia relativa (%)
211.14502 10.7
309.28078 74.8
441.20591 80.6
617.52081 92.6
758.56957 0
933.79001 100
Asimismo, la Tabla 3 recoge los iones moleculares obtenidos de la descomposición del compuesto de mayor abundancia relativa y más representativo tanto para el precipitado, obtenido a partir de los licores de lavado de maíz, como para todos los patrones de lecitina y fosfolípidos empleados. Cabe destacar que la lecitina utilizada como patrón fue extraída de las semillas de soja, considerándose por lo tanto un conjunto de fosfolípidos de naturaleza variada. Esto puede provocar pequeñas variaciones en los iones moleculares cuando se comparan muestras similares de fosfolípidos procedentes de otras fuentes como el maíz.
Tabla 3. Iones moleculares obtenidos de la descomposición de la señal mayoritaria y/o característica para el precipitado obtenido de los licores de lavado de maíz, y los patrones de lecitina y fosfolípidos.
Compuesto m/z Descomposición Precipitado de licores de lavado de maíz 758 575; 184
Lecitina 782 599; 184 Lecitina 758 184 Fosfatidilcolina 760 184 Fosfatidilserina 685 601; 440; 194 Fosfatidiletanolamina 758 577; 182
En base a la descomposición de las masas mayoritarias del precipitado procedente de los licores de lavado de maíz, se corrobora la existencia de evidencias de que el precipitado obtenido a partir de los licores de lavado de maíz presenta mayoritariamente fosfolípidos coincidentes con la lecitina, y similares a la fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina.
Breve descripción de los dibujos
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Figura 1. Esquema de los principales productos y subproductos obtenidos del procesado de maíz por vía húmeda, donde tras la maceración del maíz en agua, se separa el germen de maíz de la fase acuosa, siendo esta última sometida a un proceso de evaporación, obteniéndose los licores de lavado de maíz, como subproducto, los cuales son objeto de esta patente. Además en este esquema se recogen las fracciones principales obtenidas a partir del maíz mediante procesado por vía húmeda, que son el germen de maíz, el salvado de maíz y el luten de maíz, a partir de los que se obtienen distintas harinas, aceite y pienso, como productos principales.
Figura 2. Espectros de masas obtenidos aplicando Ionización mediante Electro Spray de alta resolución (ESI-HR) a los extractos con capacidad biosurfactante obtenidos a partir de los licores de lavado de maíz, tras extracción con acetato (A) y cloroformo (B) , previamente al proceso de precipitación con acetona. En este extracto están contenidos los fosfolípidos y lecitina cuya señal se corresponde con la masa de 758 Da que se observan en ambos ESI-MS. Cabe destacar que cuando la extracción se produce con acetato de etilo la señal correspondiente con 758 Da es más intensa, lo que indica que se extrae mayor cantidad de lecitina y fosfolípidos.
Figura 3. Espectros de masas obtenidos aplicando Ionización mediante Electro Spray de alta resolución (ESI-HR) al precipitado objeto de estudio (formado por fosfolípidos y/o lecitina) (A) , así como del sobrenadante (B) obtenidos a partir de los licores de lavado de maíz, tras someterlos a un proceso de extracción con cloroformo seguido de precipitación con acetona. En la Figura 3 (A) , se observa una señal muy intensa correspondiente con la masa de 758 Da, que representa a los fosfolípidos y lecitina precipitados, mientras que en la Figura 3 (B) esta señal no se aprecia, ya que la mayor parte de los fosfolípidos y lecitina han sido precipitados. Figura 4. Espectros de masas ampliado en la zona entre 700 y 800 Da, obtenidos aplicando Ionización mediante Electro Spray de alta resolución (ESI-HR) al precipitado (formado por fosfolípidos y lecitina) y al sobrenadante (exento de fosfolípidos y lecitina) , obtenidos a partir de los licores de lavado de maíz, en comparación con los patrones de fosfolípidos y lecitina comerciales, empleados a modo de control. Se observa en esta Figura que el precipitado presenta señales correspondientes a un rango de masas entre 708 y 784 Da, comparables a las que se han encontrado en distintos patrones comerciales de lecitina así como de fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, con señales entre los 715 y 786 Da.
Figura 5. Espectros de masa-masa, obtenidos aplicando Ionización mediante Electro Spray de alta resolución (ESI-HR) , a la masa de 758 Da presente en el precipitado obtenido a partir de los licores de lavado de maíz, (A) , en comparación con la descomposición de la misma masa en la lecitina comercial (B) y la fosfatidiletanolamina comercial (C) . En ambos casos se puede observar fragmentos comunes en torno a los 182-184 Da, comparables a los encontrados en la descomposición de la masa de 758 Da encontrada en el precipitado obtenido a partir de los licores de lavado de maíz.
Figura 6. Diagrama general de obtención de lecitina y/o fosfolípidos a partir de los licores de lavado de maíz. Para llevar a cabo la extracción de fosfolípidos y lecitina a partir de los licores de lavado de maíz, estos se sometieron a un proceso de extracción con disolventes orgánicos, en un agitador orbital, utilizando por ejemplo cloroformo o acetato de etilo. Posteriormente el extracto obtenido es lavado con acetona y sometido a un proceso de precipitación con acetona a -80°C durante 24 h, obteniendo tras este periodo un precipitado consistente en fosfolípidos y lecitina que es recogido mediante filtración a vacío y analizado.
Realización preferente de la invención
Se realizaron extracciones a licores de lavado de maíz de varias procedencias para corroborar su uso como fuente de fosfolípidos y lecitina, entre los que se incluyen, a modo de ejemplo, los licores suministrados por Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, EE.Uu ) o los suministrados por FeedStimulants (Utrecht, Países Bajos) .
El extracto objeto de esta invención se obtuvo, de los licores de lavado de maíz, mediante una extracción con disolventes orgánicos, entre los que se incluyen cloroformo o acetato de etilo. Tras esta extracción, el disolvente fue eliminado mediante destilación y el extracto obtenido fue sometido a una precipitación con acetona, utilizando por ejemplo una relación 20:1 (acetona:extracto) , a -80°C durante 24 h y seguidamente, el sólido obtenido se filtró a vacío y se analizó. En la Figura 6 se puede observar uno de los protocolos seguidos para la obtención de los fosfolípidos y/o lecitina donde los licores de lavado de maíz son sometidos a extracción con cloroformo o acetato de etilo. Cabe destacar que la extracción con acetato de etilo se puede llevar a temperatura ambiente sin pérdida de rendimiento mientras que con la extracción con cloroformo se obtienen mejores rendimientos a temperaturas en torno a 56°C.
En Tabla 4, se recoge a modo de ejemplo algunas de las condiciones empleadas con acetato de etilo y cloroformo que conducen a buenos rendimientos de extracción, donde se observa que la extracción con acetato de etilo implica mayores dosis de disolvente orgánico en comparación con el cloroformo.
Tabla 4. Condiciones de obtención del extracto a partir de licores de lavado de maíz.
Disolvente Proporción disolvente Tiempo (min) Temperatura (°C) : residuo (v/v)
Cloroformo 2:1 60 56
Acetato de etilo 3:1 45 25
Tras la extracción, el análisis de fosfolípidos se llevó a cabo utilizando la técnica de Ionización mediante Electro Spray de alta resolución (ESI-HR) . Además para corroborar la presencia de fosfolípidos y lecitina en la muestra obtenida a partir de los licores de lavado de maíz, se utilizaron los siguientes patrones de fosfolípidos y lecitina: Lecitina de soja (Scharlau Microbiology, España) , L-alfa-fosfatidilcolina de yema de huevo >99% y L-alphafosfatidiletanolamina de yema de huevo >97% (Sigma-Aldrich, EE.UU) , fosfatidil-L-serina (Carbosynth, Reino Unido) .