SISTEMAS DE LIBERACIÓN DE FARMACOS PE ACIDO POLISIALICO Y METOPOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere generalmente a particulas, incluyendo nanocapsulas u otras nanoentidades, que comprenden acido polisialico, para actuar como vehiculos para liberar farmacos u otras sustancias activas al interior de las celulas. u otras aplicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La liberación de farmacos al organismo de foima setecnva na sioo un reto continuo. Por ejemplo, muchos farmacos no pueden ejercer su action de forma eficaz debido a su dificil acceso a las celulas diana.
Por lo tanto, se necesitan mejoras en la liberación farmacos.
RESUMEN
La presente invención se refiere generalmente a particulas, incluyendo nanocapsulas u otras nanoentidades, que comprenden acido polisialico. Las particulas pueden ser capaces de acceder al interior de las celulas donde liberaran su contenido. El objeto de la presente invención implica, en algunos casos, productos interrelacionados, soluciones altemativas a un problema particular, y/o una pluralidad de usos diferentes de uno o mas sistemas y/o articulos.
En un aspecto, la presente invención se dirige generalmente a una composición. De acuerdo con un conjunto de realizaciones, la composición comprende una pluralidad de nanoentidades, por ejemplo, nanocapsulas, que comprenden una portion interna (o nucleo) rodeada por una cubierta. En algunos casos, la cubierta puede comprender acido polisialico. En algunas realizaciones, la cubierta comprende un grupo de direccionamiento (targeting moiety) , que es un grupo que permite el direccionamiento u orientation selectiva de la nanoestructura. En algunas realizaciones, la cubierta comprende un peptido facilitador de la penetración celular y/o tumoral/tisular. En algunas realizaciones, el grupo de direccionamiento, y/o el peptido facilitador de la penetración celular y/o el peptido facilitador de la penetración tumoral/tisular esta unido quimicamente al acido polisialico. En algunas realizaciones, la porción interna comprende al menos un compuesto hidrofobico.
La composición, en otro conjunto de realizaciones, incluye una pluralidad de nanocapsulas que comprenden una portion interna rodeada por una cubierta. En algunas realizaciones, la cubierta comprende acido polisialico y un grupo de direccionamiento unido quimicamente al acido polisialico. En algunos casos, el grupo de direccionamiento comprende un peptido que tiene una secuencia Z'x'X2Z2, donde Z1 es R o K, Z2 es R o K, y X y X son cada uno un residuo aminoacido. En algunos casos, el peptido puede comprender una secuencia RGD, o una secuencia NGR. Por ejemplo, el peptido puede comprender una secuencia j'RGD, j'RGDJ2, RGDJ2, j'NGR, j'NGRJ2, NGRJ2, etc. (Estas abreviaturas K, R, N, G, D, etc. son los codigos estandar de una letra para nombrar residuos aminoacidos utilizadas por los expertos en la tecnica; veanse mas adelante los detalles) . En algunos casos, el grupo de direccionamiento comprende un peptido que tiene ambas secuencias Z X X Z y RGD (por ejemplo un peptido iRGD) o las secuencias Z'x'X2Z2 y NGR (por ejemplo un peptido iNGR) .
En otro conjunto de realizaciones, la composición comprende una pluralidad de nanoentidades que comprenden una portion interna rodeada por una cubierta externa, la cubierta comprende acido polisialico, al menos algunas de las nanoentidades ademas comprenden un anticuerpo monoclonal.
De acuerdo con otro conjunto de realizaciones, la composición comprende entidades, que tienen un diametro medio maximo de menos de aproximadamente 1 micrometro. Las entidades, en algunas realizaciones, pueden tener una superficie que comprende acido polisialico y un grupo de direccionamiento. En algunos casos, las entidades no son liposomas (vease mas adelante una discusion sobre liposomas) .
Todavia otro conjunto de realizaciones esta dirigido generalmente a una composición que comprende una pluralidad de nanoentidades, por ejemplo, nanocapsulas, que comprenden una parte interna rodeada por una cubierta. La cubierta puede comprender acido polisialico, opcionalmente unido a un grupo o resto hidrofobico. La portion interna puede comprender al menos un compuesto hidrofobico en algunos casos. En algunas realizaciones, la cubierta comprende acido polisialico, un grupo de direccionamiento y un grupo hidrofobico. En algunos casos, al menos una parte del acido polisialico esta unido al grupo de direccionamiento y/o al grupo hidrofobico. En algunas realizaciones, el grupo hidrofobico es un grupo alquilo, tal como C2-C24, o C12.
En otro conjunto de realizaciones, la composición comprende una pluralidad de nanoentidades, por ejemplo, nanocapsulas, que comprenden una portion interna rodeada or una cubierta. tin algunos casos, la eubierta consiste esencialmente en acido polisialico. En ciertos casos, la parte interna comprende al menos un compuesto hidrofobico.
En otro conjunto de realizaciones, la composición es una composición farmaceutica.
Realizaciones adicionales de la invención se dirigen generalmente al uso de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente, o cualquier composición descrita aqui, para la fabricación de un medicamento. Ademas, algunas realizaciones de la invención se dirigen generalmente a un método de administración de la composición de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente, o cualquier composición de la presente invención, a un organismo vivo, tal como un humano. En algunos casos, el organismo vivo puede ser un sujeto con cancer u otras enfermedades. Por ejemplo, cualquiera de las composiciones descritas anteriormente (o cualquier composición descrita aqui) puede incluir ademas un farmaco terapeutico adecuado, tal como un farmaco anticancerigeno.
Otro aspecto de la invención se dirige generalmente a un metodo. En algunas realizaciones, el método incluye la acción de hacer reaccionar un grupo carboxilato de un acido polisialico con una aminoalquil (C1-C4) maleimida y/o con una aminoalquil (C1-C4) metacrilamida, y hacer reaccionar la aminoalquil (C1-C4) maleimida y/o la aminoalquil (C1-C4) metacrilamida resultante con un grupo tiol (por ejemplo procedente de un grupo cisteina) presente en una molecula de direccionamiento para producir una composición acido polisialico-aminoalquil (C1-C4) succinimida-peptido y/o acido polisialicoaminoalquil (C1-C4) amido-isopropil-peptido. En algunas realizaciones, el método incluye la acción de hacer reaccionar un grupo fimcional carboxilato de un acido polisialico con una N-hidroxisuccinimida, una triazina o una carbodiimida y hacer reaccionar el compuesto intermedio formado con un grupo amino (por ejemplo procedente de lisina o arginina) de un grupo de direccionamiento para producir un acido polisialico-amidapeptido.
Se describen aqui varios metodos de administración a un sujeto de un compuesto para la prevención 0 el tratamiento de una afección particular. Debe entenderse que en cada uno de dichos aspectos de la invención, la invención incluye especificamente, tambien, el compuesto para uso en el tratamiento o prevención de esa condición particular, asi como el uso del compuesto para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de esa condición particular.
En otro aspecto, la presente invención abarca metodos para hacer una o mas de las realizaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, una nanocapsula. En aun otro aspecto, la presente invención abarca metodos de utilization de una o mas de las realizaciones descritas en la presente memoria, por ejemplo, una nanocapsula.
Otras ventajas y caracteristicas novedosas de la presente invención resultaran evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias realizaciones no limitativas de la invención cuando se consideren en conjunción con las figuras adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las realizaciones no limitantes de la presente invención se describiran a modo de ejemplo con referencia a las figuras adjuntas, que son esquematicas y no han de ser extrapoladas a otra escala. En las figuras, cada componente identico o casi identico ilustrado se representa tipicamente mediante un unico numero. Con fines de claridad, no se marca cada componente en cada figura, ni se muestra cada componente de cada realización de la invención en la que la ilustración no es necesaria para permitir que los expertos en la técnica comprendan la invención. En las figuras:
Fig. 1 ilustra una reaction de acoplamiento del acido sialico a un peptido destinado a actuar como grupo de direccionamiento;
Figs. 2A-2B ilustran los datos que muestran la administración de nanocapsulas a ratones, de acuerdo con ciertas realizaciones de la invencion;
Fig. 3 ilustra la comparación entre la administración de ciertas nanocapsulas, como se describen aqui, con la administración de Abraxane® (nab-paclitaxel) ;
Fig. 4 ilustra la evolution del peso corporal de ratones tratados con ciertas nanocapsulas en todavia otra realización de la invencion;
Fig. 5 ilustra un método para producir un acido polisialico modificado, de acuerdo con otra realización de la invencion; y
Fig. 6 ilustra el espectro de 'H-RMN del acido polisialico (PSA) , el tLypl y el conjugado PSA-tLypl en DjCFFLO 10:90 a 25 °C.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención se refiere generalmente a particulas, incluyendo nanocapsulas u otras nanoentidades, que comprenden acido polisialico. Las particulas pueden ser capaces de acceder al interior de las celulas, y/o procurar la liberación intracelular de los farmacos asociados. En un aspecto, la presente invención esta dirigida a nanocapsulas u otras entidades que tienen un exterior o superficie que comprende acido polisialico. En algunos casos, grupos de direccionamiento tales como el peptido Lyp-1 o tLyp-1 pueden unirse al acido polisialico, por ejemplo, usando aminoalquil (C1-C4) succinimida u otros espaciadores. Estos pueden ser creados, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo carboxilato de un acido polisialico con una aminoalquil- (Cj-C4) -maleimida 0 una aminoalquil- (Cj-C4) -metacrilarnida, y la reacción de la aminoalquil- (Ci-C4) -maleimida o la aminoalquil- (Ci-C4) -metacrilamida resultante con un grupo cisteina u otro grupo azuffe. Los grupos de direccionamiento pueden estar unidos al acido polisialico, por ejemplo, haciendo reaccionar un grupo carboxilato de un acido polisialico con una N-hidroxisuccinimida o una carbodiimida, y haciendo reaccionar el compuesto intermedio formado con un grupo lisina o arginina del peptido de direccionamiento para producir acido polisialico-amida-peptido. Otros aspectos de la invención se refieren generalmente a metodos para fabricar o usar tales composiciones, kits que incluyen tales composiciones, o similares.
En un aspecto, la presente invención se refiere generalmente a particulas u otras entidades que comprenden acido polisialico. Tales particulas o entidades pueden usarse, por ejemplo, para aplicaciones de liberación de farmacos. Por ejemplo, tales particulas pueden ser suministradas a un sujeto de manera que alcancen un tumor que el sujeto padezca. Las particulas pueden ser liberadas dentro de las celulas tumorales, por ejemplo, lo que puede ser facilitado a traves de un grupo de direccionamiento que tambien tiene capacidad como promotor o facilitador de la penetración celular o tisular tales como Lyp-1 o tLyp-1, u otros peptidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, peptidos CendR) . Otros peptidos, anticuerpos (por ejemplo anticuerpos completos, nanoanticuerpos, fragmentos variables de cadena sencilla, etc.) , o grupos de direccionamiento de aptameros, tambien se pueden usar en ciertas realizaciones, por ejemplo, como se discute en la presente memoria. Una vez administradas, las particulas pueden acceder a las celulas diana, por ejemplo celulas tumorales, y liberar el farmaco contenido en su interior (por ejemplo, farmacos terapeuticos o anticancerigenos, etc) . Las particulas u otras entidades ue comprenden acido polisialico modificado con un grupo de direccionamiento, no han sido previamente utilizadas para la liberation selectiva e intracelular de farmacos.
En algunos casos, las entidades pueden estar presentes dentro de un vehiculo farmaceuticamente aceptable, como se discute en la presente memoria; por ejemplo, las entidades pueden suspenderse en un liquido o un gel, por ejemplo, para la administration a un sujeto. Las entidades pueden ser sustancialmente solidas, o en ellas se pueden definir espacios intemos, por ejemplo, como en una capsula. Las entidades tambien pueden ser una micela o un liposoma en algunas realizaciones, aunque en ciertos casos, las entidades descritas en la presente memoria no son liposomas.
En algunos casos, la entidad puede ser una nanoentidad. Una "nanoentidad", como se usa en el presente documento, es tipicamente una entidad que tiene un diametro medio de menos de 1000 nm, por ejemplo, menos de 750 nm, inenos de 500 nm, menos de 300 nm, menos de 250 nm, menos de 200 nm, menos de 150 nm, o menos de 100 nm. En algunos casos, las entidades tambien pueden tener un diametro medio de al menos 1 nm, 5 nm, 10 nm, 50 nm, 100 nm, 500 nm, o 1000 nm. Las combinaciones de cualquiera de estos diametros son tambien posibles, por ejemplo, la entidad puede tener un intervalo medio de diametros entre 100 nm y 300 nm entre 1000 nm y 1 nm, entre 1000 nm y 10 nm, entre 750 nm y 1 nm, entre 500 nm y 10 nm, entre 300 nm y 10 nm, entre 250 nm y 10 nm, entre 200 nm y 10 nm, entre 150 nm y 10 nm, entre 100 nm y 10 nm, o similares. Mas de una entidad tambien puede estar presente en algunas realizaciones, y en tales casos, el diametro medio (aritmetico) de la pluralidad de entidades puede tener las dimensiones descritas aqui. En algunos casos, las entidades que tienen un rango de diametros estan presentes. Tales entidades pueden ser determinadas por una variedad de metodos, tales como tecnicas de difraction laser o dispersion de luz dinamica. Ejemplos no limitativos de nanoentidades incluyen nanoparticulas, nanocapsulas, micelas u otras entidades tales como las descritas en la presente memoria. Tales entidades pueden tener, en algunos casos, las dimensiones dadas en este parrafo.
En algunos casos, la entidad puede incluir una porción interna rodeada por una cubierta externa, por ejemplo, expuesta al medio que rodea a la entidad. La porción interna puede estar simetricamente o asimetricamente posicionada dentro de la entidad. La parte interna puede contener, por ejemplo, un liquido (que puede ser, por ejemplo, no acuoso o acuoso) , un solido y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la parte nterna puede contener tambien uno o mas agentes farmaceuticos o farmacos, por ejemplo, cualquiera de los descritos en la presente memoria.
En algunos casos, la entidad es una capsula (por ejemplo, una nanocapsula) . La capsula puede ser sustancialmente solida, o tener una cubierta de tipo goma o tipo gel. Ademas, en algunos casos, la entidad puede ser una particula, tal como una nanoparticula. La particula puede ser solida y tener una forma bien definida. En algunos casos, la particula puede ser una entidad que tiene una porción interna rodeada por una cubierta exterior, por ejemplo, la particula puede ser una capsula. La nanocapsula puede tener un tarnano en el rango de nanometros. Si la nanoparticula es generalmente esferica, tambien se puede referir a nanoesfera. Una nanocapsula puede ser sustancialmente uniforme, aunque puede tener caracteristicas superficiales adicionales, tales como grupos de direccionamiento, promotores de la penetration, anticuerpos, o similares, incluyendo los descritos en la presente memoria.
En algunos casos, la particula puede ser una entidad que tiene una porción interna rodeada por una cubierta exterior, por ejemplo, la particula puede ser una capsula o una nanocapsula. En algunos casos, una nanocapsula puede tener un tarnano en el rango de los nanometros que comprende un nucleo intemo y una cubierta exterior que tiene una composition distinguible del nucleo intemo. El nucleo intemo puede ser, por ejemplo, un material liquido o solido. A menudo, pero no siempre, el nucleo intemo es un aceite. La cubierta externa puede estar formada por un material continuo, y tipicamente esta unido de un modo no covalente al nucleo intemo. En algunos casos, la cubierta externa tiene un grosor medio de al menos 1 nm, al menos 2 nm, al menos 3 nm, al menos 5 nm, al menos 10 nm, al menos 20 nm, al menos 30 nm, al menos 50 nm, al menos 100 nm, o al menos 200 nm.
En algunos casos, la entidad comprende no mas de una cubierta externa.
En algunos casos, la entidad puede ser una micela. Tipicamente, una micela se forma a partir de una pluralidad de tensioactivos o moleculas anfifilicas que definen una parte interna y una exterior. Por ejemplo, las moleculas de tensioactivo pueden estar dispuestas para tener un exterior relativamente hidrofilo y una porción interna relativamente hidrofoba, por ejemplo, formada a partir de una unica capa de tensioactivo o moleculas anfifilicas. En algunos casos, la micela puede tener un tarnano en el rango de nanometros. La micela puede estar, en algunas realizaciones, compuesta por moleculas anfifilicas a una concentración superior a la CMC (concentración micelar critica) cuando as micelas se dispersan en una fase externa. Si la fase liquida externa es acuosa, la parte hidrofila de las moleculas anfifilicas pueden estar orientadas hacia la parte externa. Dependiendo de la concentration de las moleculas anfifilicas, las micelas pueden organizarse por ellas mismas formando estructuras grandes, que son clusteres de micelas. Las micelas pueden estar formadas por moleculas de tensioactivos, por ejemplo, tener sus porciones hidrofilas en la superficie y sus porciones hidrofobas apuntando hacia adentro (o viceversa en algunos casos) .
Un liposoma puede tener una estructura similar, pero se forma tipicamente a partir de una doble capa de tensioactivo o moleculas anfifilicas (por ejemplo, una bicapa lipidica) , y puede asi definir una parte interna, una porción media y una parte exterior; por ejemplo, la porción interna puede ser relativamente hidrofila, la parte media (por ejemplo, la cubierta del liposoma, formada por la estructura bicapa del tensioactivo o moleculas anfifilicas) puede ser relativamente hidrofoba, y el exterior al liposoma puede ser una solución acuosa o un medio hidrofilo.
Como se usa en la presente memoria, la propiedad de ser ``hidrófilo, , se entiende como una propiedad constitucional de una molecula o un grupo funcional para penetrar en una fase acuosa o para permanecer en ella. En consecuencia, la propiedad de ser "hidrofobo" se entiende como una propiedad constitucional de una molecula o un grupo funcional para exhibir un comportamiento exofilico con respecto al agua, por ejemplo, muestran la tendencia de no penetrar en el agua, o de salir de la fase acuosa. Para mayores detalles se referencia a Rompp Lexikon Lacke und Druckfarben, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, N.Y., 1998, "Hydrophilicity", "Hydrophobicity", paginas 294 y 295. En algunos casos, una entidad hidrofila (o hidrosoluble) es una que exhibe un logP de menos de 1, 5, mientras que una entidad hidrofoba (o liposoluble) es una que exhibe un logP mayor que 1, 5, donde logP es el coeficiente de partition octanol-agua de la entidad.
La parte interior, si esta presente dentro de una entidad, puede contener un liquido, y en algunos casos, el liquido puede ser acuoso o no acuoso. En algunos casos, el liquido contiene una solución salina o solución de una sal en agua. Opcionalmente, el liquido puede contener un farmaco u otro agente farmaceutico, por ejemplo, para su administración a un sujeto. Ejemplos no limitantes de farmacos u otros agentes farmaceuticos se discuten aqui.
En algunas realizaciones, la nanoentidad comprende una cubierta que consiste esencialmente en una unica capa de material que comprende acido polisialico. En otras ealizaciones, la nanoentidad comprende una unica capa que comprende acido polisialico. En otras realizaciones, la cubierta comprende multiples capas, donde una de las capas comprende acido polisialico. En realizaciones adicionales, la capa comprende acido polisialico en la capa mas externa.
En algunas realizaciones, la parte interna de la nanoentidad, por ejemplo, nanocapsula, nanoparticula, micela, o liposoma, puede comprender un solido, semi-solido (ejemplo gel) , liquido, gas, o una combination de los mismos. La parte interna puede ser acuosa, no acuosa o comprender ambas, una porción acuosa y una portion no acuosa. En algunas realizaciones, la parte interna comprende uno o mas agentes farmaceuticos, farmacos, o similares.
En otras realizaciones, la parte interna comprende una porción no acuosa. En realizaciones adicionales, la porción no acuosa es un liquido no acuoso. En realizaciones adicionales, el liquido no acuoso comprende un compuesto hidrofobo, por ejemplo, un aceite. En realizaciones adicionales, el liquido no acuoso comprende un aceite y un tensioactivo. En realizaciones adicionales, la parte interna comprende un acido graso. En realizaciones adicionales, la parte interna comprende un monoglicerido. En realizaciones adicionales, la parte interna comprende un diglicerido. En realizaciones adicionales, la parte interna comprende un triglicerido. En realizaciones adicionales, la parte interna comprende un triglicerido de cadena media. En realizaciones adicionales, la parte interna comprende un triglicerido de cadena larga.
Si la parte interna de una entidad (por ejemplo, capsulas, particulas, micelas u otras nanoentidades tales como las discutidas en este documento) no es acuosa, el liquido no acuoso que forma la parte interna puede comprender uno o mas compuestos hidrofobos, por ejemplo, seleccionados de entre aceites, acido grasos, alcanos, cicloalcanos, sales biliares, derivados de sales biliares, terpenoides, terpenos, restos derivados de terpeno y vitaminas liposolubles, y/o al menos un surfactante. Estos aceites pueden seleccionarse de entre aceites naturales, semi-sinteticos y sinteticos para uso farmaceutico, tales como aceites de origen vegetal o animal, aceites de hidrocarburos o aceites de silicona. Aceites adecuados para llevar a cabo ciertas realizaciones de la presente invention incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, aceite de escualeno, aceites aromatizados, aceites de silicona, aceites esenciales, vitaminas insolubles en agua, estearato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de octilo, palmitato de cetilo, tridecilo behenato, adipato de diisopropilo, sebacato de dioctilo, antranilato de mentilo, octanoato de cetilo, salicilato de ctilo, miristato de isopropilo, cetoles de neopentilglicol dicaprato, oleato de decilo, lactatos de alquilo C12-C15, lactato de cetilo, lactato de laurilo, neopentanoato de isoestearilo, lactato de miristilo, estearato de estearoil isocetilo, estearato de estearoil octildodecilo, aceites de hidrocarburos, isoparafma, parafmas h'quidas, isododecano, vaselina, aceite de argan, aceite de colza, aceite de chile, aceite de coco, aceite de maiz, aceite de semilla de algodon, aceite de linaza, aceite de semilla de uva, aceite de mostaza, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de palma fraccionado, aceite de cacahuete, aceite de ricino, aceite de pihones, aceite de semilla de amapola, aceite de semilla de calabaza, aceite de salvado de arroz, aceite de cartamo, aceite de arbol de te, aceite de trufa, aceite vegetal, aceite de albaricoque, aceite de jojoba, aceite de nuez de macadamia, aceite de germen de trigo, aceite de almendras, aceite de soja, aceite de semilla de sesamo, aceite de avellana, aceite de girasol, aceite de canamo, aceite de palo de rosa, aceite de nuez de Kukui, aceite de aguacate, aceite de nuez, aceite de pescado, aceite de bayas, aceite de especias, aceite de enebro, aceite de semillas, aceite de semilla de almendras, aceite de semilla de anis, aceite de semilla de apio, aceite de semilla de comino, aceite de semilla de nuez moscada, aceite de hoja de albahaca, aceite de hoja de laurel, aceite de hoja de canela, aceite de hoja de salvia comun, aceite de hoja de eucalipto, aceite de hoja de limon, aceite de oregano, aceite de hoja de pachuli, aceite de hoja de pimienta, aceite de hoja de menta, aceite de pino, aceite de hoja de romero, aceite de hierbabuena, aceite de la hoja del arbol de te, aceite de tomillo, aceite de flores, aceite de camomila, aceite de salvia, aceite de clavo, aceite de flor de geranio, aceite de la flor del hyssop, aceite del jazmin, aceite de la lavanda, aceite de la flor del mauka, aceite de la flor del naranjo, aceite de rosas, aceite de flor de ylang-ylang, aceite de corteza, aceite de corteza de cassia, aceite de corteza de canela, aceite de corteza de sasafras, aceite de madera, aceite de madera de alcanfor, aceite de madera de cedro, aceite de palo de rosa, aceite de madera de sandalo, aceite de madera de jengibre, aceite de sebo, aceite de ricino, aceite de mirra, aceite de cascara, aceite de cascara de bergamota, aceite de cascara de pomelo, aceite de cascara de limon, aceite de cascara de lima, aceite de cascara de naranja, aceite de cascara de mandarina, aceite de raiz, aceite de valeriana, acido oleico, acido linoleico, alcohol oleilico, alcohol isoestearilico, oleato de etilo, trigliceridos de cadena media tales como mezclas de decanoil- y octanoil gliceridos (Miglyol® 8ION, Miglyol® 812N, Kollisolv® MCT, Captex® 300, Captex® 355, Labrafac® lipofilo WL1349) , Labrafil® M 2125 CS (linoleoil macrogol -6 gliceridos) , Labrafil® M2130 CS (lauroil macrogol-6 gliceridos) , Labrafil® M 1944 CS (oleoil olioxil-6 gliceridos) , Labrafac® PG (dicaprilocaprato de propilenglicol) , Rylo® (mezcla de acidos grasos) , Peceol® (Monooleato de glicerol) y Maisine® (monolinoleato de glicerina) , derivados sinteticos o semisinteticos de los mismos y combinaciones de los mismos.
En algunos casos, el aceite es uno o mas de entre aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de soja, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de maiz, aceite de palma, alfa-tocoferol (vitamina E) , miristato de isopropilo, escualeno, Miglyol®, Labrafil®, Labrafac®, Peceol®, Captex®, Kollisolv® MCT y Maisine® o mezclas de los mismos. Otros aceites adecuados incluyen aceites de la familia de los terpenos formados por unidades de isopreno (2-metilbuta-l, 3-dieno) y subdivididos según sus atomos de carbono: hemiterpenos (C5) , monoterpenos (C10) , sesquiterpenos (C15) , diterpenos {C20) , sesterterpenos (C25) , triterpenos (C30) , tetraterpenos (C40, carotenoides) y politerpenos, vitamina A, escualeno, etc. En algunas realizaciones, el liquido no acuoso que forma la parte interna puede contener estabilizantes insolubles en agua, conservantes, tensioactivos, disolventes organicos y mezclas de los mismos para proporcionar la maxima estabilidad a la formulación. Tambien son posibles combinaciones de uno o mas de estos y/u otros aceites en diversas realizaciones.
Si la porción interna de una entidad (por ejemplo, capsulas, particulas, micelas u otras nanoentidades tales como las aqui discutidas) es acuosa, el liquido acuoso que fonna la porción interna puede estar formado por agua que contiene al menos una sal, en ciertas realizaciones.
Ademas, en algunas realizaciones, el liquido acuoso que fonna la porción interna puede contener uno 0 mas agentes estabilizantes, conservantes, tensioactivos, glicoles, polioles, azucares, agentes espesantes, y gelificantes solubles en agua y mezclas de estos y/u otros excipientes adecuados. Estos excipientes pueden ser utilizados, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la formulación, ajustar la viscosidad de la composition final, controlar la velocidad de liberation desde la fase acuosa interna, o similares.
En un conjunto de realizaciones, las entidades (por ejemplo, capsulas, particulas, micelas u otras nanoentidades tales como aquellas discutidas en este documento) comprenden acido polisialico. El acido polisialico puede distribuirse uniformemente por toda la entidad o concentrarse en ciertas regiones de la entidad, por ejemplo, en la cubierta de una capsula u otra superficie externa de una entidad. En algunos casos, al menos el 50% en peso de una porción de una entidad, tal como una cubierta, comprende acido polisialico, en ciertos casos, al menos el 60% en peso, al menos el 70% en peso, al menos el 75% en peso, al menos el 80% en peso, al menos el 85% en peso, al menos el 90% en peso, al menos el 95% en peso, o al menos el 99% en peso de la portion de la entidad puede comprender acido polisialico. En algunos casos, una parte de la entidad puede consistir esencialmente en acido polisialico.
El acido polisialico se compone generalmente de una pluralidad de unidades de acido sialico, a menudo unidas entre si para formar un polimero mediante union 2> 8 y/o 2 > 9, aunque tambien son posibles otras posiciones en las uniones. Tipicamente, hay al menos 2, al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, o al menos 500 unidades de acido sialico unidas entre si para formar acido polisialico. En algunos casos, el acido polisialico puede tener no mas de 1000, no mas de 500, no mas de 200, no mas de 100, no mas de 50, no mas de 30 unidades de acido sialico o no mas de 10 unidades de acido sialico unidas entre si para formar acido polisialico. Tambien son posibles combinaciones de cualquiera de estos, por ejemplo, un acido polisialico puede tener entre 2 y 100 unidades de acido sialico que estan unidas entre si. Debe observarse que las unidades de acido sialico no necesitan ser identicas, y pueden ser independientemente iguales o diferentes, incluso dentro de la misma molecula de acido polisialico. Tambien debe observarse que un acido polisialico no tiene necesariamente que ser una cadena lineal y tambien son posibles varias disposiciones de ramificación. Por ejemplo, una unidad de acido sialico puede estar unida a 3 o mas unidades de acido sialico diferentes, creando de este modo un punto de ramificación dentro de la molecula de acido polisialico.
Como ejemplos no limitantes, el acido polisialico puede tener pesos moleculares diferentes, por ejemplo, 4 kDa, 30 kDa, 95 kDa, etc. En algunos casos, el acido polisialico puede contener mas de 300 unidades de acido sialico. Como ejemplos adicionales no limitativos, el acido polisialico puede tener un peso molecular de al menos 1 kDa, al menos 3 kDa, al menos 5 kDa, al menos 10 kDa, al menos 20 kDa, al menos 25 kDa, al menos 30 kDa, al menos 40 kDa, al menos 50 kDa, al menos 60 kDa, al menos 70 kDa, al menos 75 kDa, al menos 80 kDa, al menos 90 kDa, al menos 100 kDa, etc . En algunos casos, el acido polisialico puede tener un peso molecular de no mas de 100 kDa, no mas de 90 kDa, no mas de 80 kDa, no mas de 75 kDa, no mas de 70 kDa, no mas de 60 kDa, no mas de 50 kDa, no mas de 40 kDa, no mas de 30 kDa, no mas de 25 kDa, no mas de 20 kDa, no mas e 10 kDa, no mas de 5 kDa, no mas de 3 kDa o no mas de 1 kDa. Tambien son posibles combinaciones de cualquiera de estos, por ejemplo, el acido polisialico puede tener un peso molecular entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 80 kDa, o entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 50 kDa, etc. (A menos que se indique lo contrario, los pesos moleculares aqui descritos son pesos moleculares promedio en numero) .
Tambien debe observarse que los acidos polisialicos no siempre son identicos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los acidos polisialicos pueden tener numeros diferentes de unidades de acido sialico, y / o pueden existir diferentes unidades de acido sialico en diferentes moleculas de acido polisialico que estan presentes. En algunos casos pueden estar presentes uno o varios tipos de moleculas de acido polisialico, por ejemplo, una o mas formas pueden comprender al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, o mas, de las moleculas de acido polisialico que estan presentes, es decir, sobre una base molar.
Ejemplos no limitantes de unidades de acido sialico que pueden estar presentes dentro de un acido polisialico incluyen, pero no se limitan a, acido N-acetilneuraminico (Neu) , acido 2-ceto-3-desoxinonico (Kdn) , acido lactaminico, acido N-sialico, y/o acido O-sialico. Otros ejemplos incluyen acido N-glicolilneuraminico (Neu5Gc) , acido 9-O-acetil-8-O-metil-N-acetilneuraminico (Neu5, 9Ac28Me) y acido 7, 8, 9-tri-O-acetil-N-glicolilneuraminico (Neu5Gc7, 8, 9Ac3) . "Sia" indica generalmente una unidad de acido sialico indeterminada. En algunas realizaciones, las unidades de acido sialico incluyen cualquier derivado de acido neuraminico (un azucar de 9 carbonos) , incluyendo los 43 derivados tipicamente encontrados en la naturaleza. Estos incluyen, pero no se limitan a, Neu; Neu5Ac; Neu4, 5Ac2; Neu5, 7Ac2; Neu5, 8Ac2; Neu5, 9Ac2; Neu4, 5, 9Ac3; Neu5, 7, 9Ac3; Neu5, 8, 9Ac3; Neu5, 7, 8, 9Ac4; Neu5Ac9Lt; Neu4, 5Ac29Lt; Neu5Ac8Me; Neu5, 9Ac28Me; Neu5Ac8S; Neu5Ac9P; Neu2en5Ac; Neu2en5, 9Ac2; Neu2en5Ac9Lt; Neu2, 7an5Ac; Neu5Gc; Neu4Ac5Gc; Neu7Ac5Gc; Neu8Ac5Gc; Neu9Ac5Gc; Neu7, 9Ac25Gc; Neu8, 9Ac25Gc; Neu7, 8, 9Ac35Gc; Neu5Gc9Lt; Neu5Gc8Me; Neu9Ac5Gc8Me; Neu7, 9Ac25Gc8Me; Neu5Gc8S; NeuSGcAc; NeuSGcMe; Neu2en5Gc; Neu2en9Ac5Gc; Neu2en5Gc9Lt; Neu2en5Gc8Me; Neu2, 7an5Gc; Neu2, 7an5Gc8Me; Kdn; y Knd9Ac. En un conjunto de realizaciones, cada una de las unidades de acido sialico (antes de la polimerización para formar acido polisialico) puede tener independientemente la siguiente estructura:
R1 puede ser H; un enlace alfa a Gal (3/4/6) , GalNAc (6) (N-acetilgalactosamina) , GlcNAc (4/6) , Sia (8/9) , o 5-0-Neu5Gc; un oxigeno unido a C-7 en una molecula 2, 7-anhidro; o un hidroxilo anomerico eliminado en Neu2en5Ac (doble enlace a C-3) . R: puede ser H; un enlace alfa a Gal (3/4/6) , GalNAc (6) , GlcNAc (4/6) , Sia (8/9) , o 5-0-Neu5Gc; un oxigeno unido a C-7 en una molecula 2, 7-anhidro; o un hidroxilo anomerico eliminado en Neu2en5Ac (doble enlace a C-3) . R4 puede ser H; -acetilo; un anhidro a C-8; Fuc (fucosa) ; o Gal (galactosa) . R5 puede ser un amino; N-acetilo; N-glicolilo; Hidroxilo; N-acetimidoilo; N-glicolil-O-acetilo; N-glicolil-O-metilo; o N-glicolil-0-2-Neu5Gc. R7 puede ser H; -acetilo; un anhidro a C-2; o estar sustituido por un amino y N-acetilo en Leg (acido legionaminico) . Rx puede ser H; -acetilo; un anhidro a C-4.- metilo; -sulfato; Sia (acido sialico) ; o Glc (glucosa) . R4 puede ser -H; -acetilo; -lactilo; -fosfato; -sulfato; Sia; o un OH sustituido por H en Leg. En algunos casos, el acido polisialico es el acido colominico (donde solo la union 2 > 8 esta presente) .
Como se usa en el presente documento, el acido sialico incluye sales solubles en agua y derivados de acido sialico solubles en agua. Por ejemplo, la sal de acido sialico puede ser la sal de sodio, la sal de potasio, la sal de magnesio, la sal de calcio o la sal de cine. En una realización, al menos parte del acido sialico esta presente como una sal sodica. Tambien se pueden usar combinaciones de multiples tipos de acidos sialicos tales como, por ejemplo, subunidades de un acido polisialico y/o diferentes moleculas de acido polisialico.
En un conjunto de realizaciones, al menos parte del acido sialico dentro del acido polisialico puede estar modificado (sin embargo, debe entenderse que en otras realizaciones, el acido polisialico no se encuentra necesariamente modificado) . Por ejemplo, en algunos casos, una o mas unidades de acido sialico pueden ser modificadas, por ejemplo, mediante union a polietilenglicol, alquilo u otros grupos hidrofobicos, o imilares. Los grupos hidrofobicos pueden incluir moleculas hidrofobicas o porciones de las mismas, por ejemplo, un grupo alquilo, tal como los discutidos en el presente documento.
En algunas realizaciones, las nanoentidades no comprenden poliarginina o protamina.
En algunas realizaciones, el acido polisialico esta unido a un grupo hidrofobico. En algunos casos, la nanoentidad es una micela. En algunos casos, la nanoentidad tiene una superficie exterior hidrofila y una parte interna hidrofoba. El grupo hidrofobico puede comprender un grupo alquilo, por ejemplo un grupo alquilo de cadena lineal. En algunas realizaciones, el grupo hidrofobico comprende al menos 2 atomos de carbono. En otras realizaciones, el grupo hidrofobico comprende al menos 3 atomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo hidrofobico comprende un grupo alquilo C2-C24 de cadena lineal (por ejemplo, C2, C3, C4, C5, C6, C7, Cg, C9, Ciq, Cm, C12, C13, C|4, C) 5, C |6, C]7, Cig, C]9, C20, C21, C22, C23 y / 0 C24) . En una realization particular, el grupo hidrofobico comprende un grupo alquilo C12 de cadena lineal. En algunas realizaciones, la composition de la invention comprende ademas una cadena de carbono alifatica unida covalentemente al acido polisialico. En algunas realizaciones, la cadena alifatica de carbono comprende una cadena carbonada alifatica C2-C24 (por ejemplo, C2, C3, C4, C5, C6, C7, Cg, C9, C10, Cn, C12, C13, C 14, C15, Ci6, C17, C, g, C19, C20, C21, C22, C23 y / o C24) .
Ejemplos no limitantes de grupos hidrofobicos incluyen C3, C4, C5, Cf, , C7, Cg, C9, Cio, Cn, C12, C13, C14, C 15, Cj6, C]7, C18, C (9, C20, C21, C22, C23, C24 u otro grupo alquilo (por ejemplo, un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada, por ejemplo, un grupo isoalquilo) . En algunos casos, el grupo hidrofobico comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23 o al menos 24 atomos de carbono. Los grupos hidrofobicos pueden estar saturados o insaturados, por ejemplo, conteniendo uno o mas enlaces dobles o triples carbono-carbono. Una técnica para unir un grupo hidrofobico se discute en el Ejemplo 3, usando C 12 como un ejemplo no limitante. En algunos casos, los grupos hidrofobicos pueden estar unidos usando activation a traves de una sal de amonio cuatemaria (por ejemplo, hidroxido de tetrabutilamonio) y un tetrafluoroborato (por ejemplo tetrafluoroborato de 2-bromo-l-etil piridinio) , previo a la reaction con un grupo hidrofobico (por ejemplo, una amina alquilica, tal como dodecilamina para C 12) . Otros metodos para unir grupos hidrofobicos se pueden usar ambien en otras realizaciones, por ejemplo, usando qui'mica "click", reacciones de Grignard, o similares.
Ejemplos adicionales no limitantes de grupos hidrofobicos que pueden ser anadidas incluyen cicloalcanos (por ejemplo, ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano, etc.) , sales biliares, terpenoides, terpenos, grupos derivados de terpenos y vitaminas lipofilas tales como vitaminas A, D, E, K, y sus derivados. Ejemplos no limitantes de sales biliares incluyen sales biliares no derivatizadas tales como colato, desoxicolato, quenodesoxicolato, y ursodesoxicolato, etc. Ejemplos no limitativos de sales biliares derivatizadas incluyen taurocolato, taurodesoxicolato, tauroursodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato, glicolato, glicodesoxicolato, glicoursodesoxicolato, glicoquenodesoxicolato, taurolitocolato y glicolitocolato, etc.
En otro conjunto de realizaciones, al menos parte del acido sialico se puede unir al polietilenglicol (PEG) , aunque debe entenderse que el PEG no es un requisito en todas las realizaciones. El polietilenglicol (PEG) , en su forma mas comun, es un polimero de la siguiente formula:
H- (0-CH2-CH2) p-0H,
donde p es un numero entero que representa el grado de polimerización del PEG. En algunos casos, el PEG tambien puede ser modificado, por ejemplo, para incluir:
X3- (0-CH2-CH2) p-X4,
donde X3 es hidrogeno o un grupo protector de hidroxilo que bloquea la función OH para reacciones posteriores. Los grupos protectores de radicales hidroxilo son ampliamente conocidos en la tecnica; grupos protectores representatives (que incluyen ya el oxigeno a proteger) incluyen, pero no se limitan a eteres de sililo tales como trimetilsilil eter, trietilsilil eter, terc-butildimetilsilil eter, terc-butildifenilsilil eter, triisopropilsilil eter, dietilisopropilsilil eter, texildimetilsilil eter, trifenilsilil eter, di-terc-butilmetilsilil eter, eteres alquilicos tales como eter metilico, eter terc-butilico, eter bencilico, eter pmetoxibencilico, eter 3, 4-dimetoxibencilico, eter tritilico, eter alilico; alcoximetil eteres tales como metoximetil eter, 2-metoxietoximetil eter, benciloximetil eter, pmetoxibenciloximetil eter, 2- (trimetilsilil) etoximetil eter, tetrahidropiranil eter y eteres relacionados; metiltiometil eter, esteres tales como ester de acetato, ester de benzoato, ester de pivalato, metoxiacetato, ester de cloroacetato, ester de levulinato, carbonatos tales como carbonato de bencilo, carbonato de p-nitrobencilo, carbonato de terc-butilo, carbonato de 2, 2, 2 tricloroetilo, carbonato de 2- (trimetilsilil) etilo, carbonato de alilo. En una realización, el grupo protector es un eter de alquilo, tal como metil eter.
X4 puede indicar el anclaje al acido sialico, y puede ser un enlace covalente o un grupo puente, tal como la N-hidroxi-succinimida (NHS) , grupo maleimida, biotina, o similares (que pueden, por ejemplo, unirse a aminas tales como aminas primarias, grupos sulfhidrilo, o avidina o estreptavidina, respectivamente, de un acido sialico modificado) . En algunos casos, X3 tambien puede ser un grupo que permita el anclaje. Ademas, en algunos casos, X3 puede incluir un acido polisialico modificado hidrofobicamente, tal como se discute en la presente memoria. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, puede utilizarse un grupo hidrofobico, tal como C3, C4, C5, C6, C7, Cg, C9, C10, Cn, Ci2, C13, C[4, C15, C |6, C[7, C|g, C|9, C20, C2\, C22, C23, C24 u otro grupo alquilo (por ejemplo, un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada, por ejemplo, un grupo isoalquilo) , unido al acido polisialico. En algunos casos, el grupo hidrofobico comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23 o al menos 24 atomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo hidrofobico puede ser tan hidrofobico que, comparado con el acido polisialico no modificado sin el grupo X4, el acido polisialico con X4 es mas hidrofobico, por ejemplo, con mayores grados de parti ción en octanol en un sistema de partition octanol/agua que sin el grupo X4.
En un conjunto de realizaciones, los PEG se unen al acido sialico a traves de grupos amina y /o grupos de acido carboxilico. La pegilación se puede realizar utilizando cualquier método adecuado disponible en la técnica. Vease, por ejemplo, Gonzalez y Vaillard, "Evolution of Reactive mPEG Polymers for the Conjugation of Peptides and Proteins", Curr. Org. Chem., 17 (9) : 975-998, 2013 y Giorgi, et al., "Carbohydrate PEGylation, an approach to improve pharmacological potency", Beilstein J. Org. Chem., 10: 143.- 44, 2014. Los PEG estan disponibles en una variedad de pesos moleculares, y el peso molecular apropiado para un uso dado se determina facilmente por un experto en la técnica. Asi, por ejemplo, un peso molecular adecuado de PEG puede estar entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 80 kDa, 0 entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 50 kDa, por ejemplo, aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 15 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 25 kDa, aproximadamente 30 kDa, 0 aproximadamente 35 kDa.
En algunas realizaciones, el grado de pegilación puede definirse como el porcentaje de grupos funcionales o grupos funcionales en el acido sialico que estan funcionalizados con PEG. Ejemplos de grados de pegilación adecuados pueden estar entre aproximadamente 0, 1% y aproximadamente 10%, entre aproximadamente 0, 2% y aproximadamente 5%, o entre aproximadamente 0, 5% y aproximadamente 2%, por ejemplo, aproximadamente 0, 5%, aproximadamente 0, 6%, aproximadamente 0, 7%, aproximadamente 0, 8 %; aproximadamente 0, 9%, aproximadamente 1%, aproximadamente 1, 1%; aproximadamente 1, 2%, aproximadamente 1, 3%, aproximadamente 1, 4%; aproximadamente 1, 5%, aproximadamente 1, 6%, aproximadamente 1, 7%; aproximadamente !, 8%; aproximadamente 1, 9%; aproximadamente 2%;
En algunas realizaciones, la proportion de PEG en el acido polisialico puede estar entre aproximadamente 10% y 90% (p /p) con respecto al peso total del acido polisialico, entre aproximadamente 15% y 80%, entre aproximadamente 20% y 70%, o entre aproximadamente el 20% y 60%, por ejemplo, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 24%, aproximadamente el 26%, aproximadamente el 28%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 32%, aproximadamente el 34%, aproximadamente el 36%, aproximadamente el 38%, aproximadamente el 40%, aproximadamente 42%, aproximadamente 44%, aproximadamente 46%, aproximadamente 48%, aproximadamente 50%, aproximadamente 52%, aproximadamente 54%, aproximadamente 56%, aproximadamente 58%, o aproximadamente 60%.
En un aspecto, la entidad tambien puede comprender un grupo de direccionamiento, aunque debe observarse que en algunas realizaciones, puede no estar presente dicho grupo de direccionamiento. El grupo de direccionamiento (si esta presente) puede usarse para dirigir la liberation de las entidades, por ejemplo, a determinadas poblaciones celulares dentro de un sujeto. Por ejemplo, dicho grupo puede facilitar el acceso de las nanoentidades a un tipo de celula, por ejemplo, una celula cancerosa, una celula endotelial o una celula inmune. En algunas realizaciones, el grupo de direccionamiento permite dirigir la nanoentidad a una localization especifica dentro de un sujeto, por ejemplo, un organo especifico o un tipo de celula especifica (por ejemplo, a un tumor o a una celula cancerosa) . En algunos casos, las entidades pueden ser intemalizadas por las celulas sin necesidad de grupos de direccionamiento y, en otros casos, la internalization puede ser facilitada por el grupo de direccionamiento (por ejemplo, el rupo de direccionamiento puede ser un peptido que facilite la penetración a nivel tisular y/o celular, por ejemplo Lyp-1 o tLyp-1, o un peptido CendR u otros peptidos como se discute en la presente memoria) . Sin embargo, debe de entenderse que en ciertas realizaciones, el grupo de direccionamiento puede no facilitar la internalization necesariamente. En algunas realizaciones, pueden estar presentes mas de un tipo de grupo de direccionamiento. En algunas realizaciones, un grupo de direccionamiento puede incluir un peptido que facilita la penetración celular y/o tumoral/tisular.
El sujeto puede ser un humano o un animal no humano. Ejemplos de sujetos incluyen, pero no se limitan a, un mamifero tal como una vaca, oveja, cabra, caballo, conejo, cerdo, raton, rata, perro, gato, un primate (por ejemplo, un mono, un chimpance, etc.) o similar. En algunos casos, el sujeto no es un mamifero tal como un pajaro, un anfibio o un pez.
En diversas realizaciones se puede usar una amplia variedad de grupos de direccionamiento. Por ejemplo, los grupos de direccionamiento pueden incluir peptidos, proteinas, aptameros, anticuerpos (incluyendo anticuerpos monoclonales, nanoanticuerpos y fragmentos de anticuerpos) , acidos nucleicos, moleculas organicas, ligandos, o similares. Ejemplos especificos no limitativos incluyen la insulina o la transferrina.
Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, el grupo de direccionamiento es un peptido que, por ejemplo, tiene una longitud de no mas de 50 aminoacidos, no mas de 40 aminoacidos, no mas de 30 aminoacidos o no mas de 10 aminoacidos. En ciertas realizaciones, el grupo de direccionamiento puede comprender una secuencia de reconocimiento celular, tal como una secuencia que comprende RGD (arginina-glicinaacido aspartico) . En ciertas realizaciones, el grupo de direccionamiento puede comprender una secuencia de reconocimiento celular, tal como una secuencia que comprende NGR (asparagina-glicina-arginina) .
Un "aminoacido" se define en su sentido ordinario tal como se utiliza en el campo de la bioquimica. Tipicamente pero no siempre (por ejemplo, como en el caso de la prolina) , un aminoacido aislado tiene una estructura general:
En esta estructura, alfa (a) puede ser cualquier grupo adecuado; por ejemplo, alfa (a) puede ser un atomo de hidrogeno, un grupo metilo o un grupo isopropilo. Una serie de minoacidos aislados pueden estar conectados para formar un peptido o una proteina por reacción del -NH2 de un aminoacido con el -COOH de otro aminoacido para formar un enlace peptldico (-CO-NH-) . En estos casos, cada uno de los grupos R del peptido o la proteina puede referirse como un residuo de aminoacido. Los "aminoacidos naturales", tal como se usan aqui, son los 20 aminoacidos comunmente encontrados en la naturaleza, tipicamente en el isomero L, es decir, alanina ("Ala" o "A") , arginina ("Arg" o "R" ) , asparagina ("Asn" o "N") , acido aspartico ("Asp" o "D") , cisteina ("Cys" o "C") , glutamina ("Gin" o "Q") , acido glutamico ("Glu" o "E") , glicina ("Gly" o "G") , histidina ("His" o "H") , isoleucina ("lie" o "I") , leucina ("Leu" o "L") , lisina ("Lys"o "K") , metionina (" Met "o"M") , fenilalalina ("Phe" o"F") , prolina ("Pro" o "P") , serina ("Ser" o "S") , treonina ("Thr " o "T") , triptofano (" Trp" o "W") , tirosina (" Tyr" o "Y") y valina ("Val" o "V") .
En un conjunto de realizaciones, el grupo de direccionamiento es un peptido promotor de la penetración celular y/o tisular. Se dispone de una diversidad de peptidos promotores de la penetración celular/tisular. Por ejemplo, el peptido puede incluir un grupo funcional C-terminal conocido como "C-end Rule" (CendR) (R/K) XX (R /K) . En algunos casos, el peptido promotor de la penetración celular y/o tisular tambien puede facilitar el direccionamiento de las nanoentidades a las celulas. Cada X en esta secuencia puede ser independientemente un aminoacido o no.
En algunos casos, el grupo de direccionamiento puede comprender una secuencia Z1X IX2Z2, donde Z1 es R o K, Z2 es R o K, y X1 y X2 son cada uno independientemente un residuo de aminoacido o no. En algunos casos, uno o ambos extremos del peptido pueden comprender otros aminoacidos, por ejemplo, como en las estructuras J Z X X"Z, Z`x 'X 2Z2J2º j ' z 'x 'X ^ J 2, en donde cada J1 y J2 es independientemente una secuencia de aminoacidos (por ejemplo, que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, o mas residuos de aminoacidos) o una cadena de carbono alifatica. La cadena alifatica de carbono puede contener atomos de carbono e hidrogeno en cualquier secuencia adecuada, por ejemplo, de cadena lineal o ramificada, y puede ser saturada o insaturada. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, la cadena de carbono alifatica puede ser una cadena de alquilo lineal que tiene una formula, por ejemplo, - (CH2) n-, siendo n 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 u otro numero entero positivo. Ademas, en algunos casos, la secuencia puede tenninar con un residuo de cisteina, por ejemplo, como en CJIZIX 1X2Z2, CZx 'X ^ 'J 2, o Cjz'x'X'Z'J".
Ejemplos no limitantes de peptidos CendR incluyen Lyp-1, tLyp-1, iNGR, cLypl, iRGD, RPARPAR, TT1 o TT1 lineal. Opcionalmente, tambien pueden estar resentes en el peptido otros aminoacidos. Lyp-1 tiene una secuencia CGNKRTRGC (SEQ ID NO: 1) . En algunas realizaciones, los dos restos Cys pueden estar unidos entre si a traves de un puente disulfuro, formando de este modo una estructura circular. En algunos casos, solo puede estar presente una parte de la secuencia Lyp-1, por ejemplo, como en el caso de tLyp-1 (CGNKRTR) (SEQ ID NO: 2) . cLypl tiene una secuencia CGNKRTRGC (SEQ ID NO: 3) , donde las dos cisteinas pueden estar unidas entre si. iNGR tiene una secuencia CRNGRGPDC (SEQ ID NO: 4) , donde las dos cisteinas pueden estar unidas entre si. iRGD tiene una secuencia (CRGDKGPDC) (SEQ ID NO: 5) o una secuencia CRGDRGPDC (SEQ ID NO: 6) , donde las dos cisteinas pueden estar unidas entre si. RPARPAR tiene una secuencia RPARPAR (SEQ ID NO: 7) . TT1 tiene una secuencia CKRGARSTC (SEQ ID NO: 8) , donde las dos cisteinas pueden estar unidas entre si. El TT1 lineal tiene una secuencia AKRGARSTA (SEQ ID NO: 9) .
En algunas realizaciones, el grupo de direccionamiento puede comprender una secuencia RGD. Opcionalmente, tambien pueden estar presentes otros aminoacidos en el peptido. Ejemplos no limitativos de peptidos RGD incluyen RGD, RGD-4C, cRGD o Cilengitide. Opcionalmente, tambien pueden estar presentes otros aminoacidos en el peptido. RGD tiene una secuencia RGD (SEQ ID NO: 10) . RGD-4C tiene una secuencia CDCRGDCFC (SEQ ID NO: 11) . cRGD tiene una secuencia cRGDf (NMeV) (SEQ ID NO: 12) o c (RGDyK) (SEQ ID NO: 13) . Cilengitide tiene una secuencia ciclica- (N-Me-VRGDf-NH) (SEQ ID NO: 14) .
En algunas realizaciones, el grupo de direccionamiento puede comprender una secuencia NGR. Opcionalmente, tambien pueden estar presentes otros aminoacidos en el peptido.
Algunos grupos de direccionamiento se pueden ver en, por ejemplo, Bertrand N., et al., Cancer Nanotechnology: The impact o f passive and active targeting in the era o f modern cancer biology, Advanced Drug Deliver y Reviews 66 (2014) 2-25, Gilad Y, , et al., Recent innovations in peptide based targeted deliver y to cancer cells, Biomedicines, 4 (2016) y Zhou G., et al. Aptamers: A promising chemical antibody for cancer therapy, Oncotarget, 7 (2016) 13446-13463. Los grupos de direccionamiento se pueden seleccionar de entre, aunque no esta limitado a, peptidos, como por ejemplo, peptidos CendR (por ejemplo, Lypl, cLypl, tLypl, iRGD, iNGR, TT1, linear TT1, RPARPAR, F3, etc.) , peptidos RGD (por ejemplo, 9-RGD, RGD4C, Delta 24-RGD, Delta 24-RGD4C, RGD-K5, cilengitide, RGD4C aciclico, RGD4C biciclico, c (RGDfK) , c (RGDyK) , E[c (RGDfK) 2], E[c (RGDyK) ]2, ) , peptidos NGR, KLWVLPKGGGC, CDCRGDCFC, LABL, angiopeptin-2; proteinas, como por ejemplo, transferrina, proteinas con repeticiones de Ankirina (ankyrin repeat protein) , affibodies, pequenas moleculas, como por ejemplo, acido folico, trifenilfosfonio, ACUPA, PSMA, restos de carbohidratos (por ejemplo, manosa, glucosa, galactosa y sus derivados) ; anticuerpos y aptameros.
Los peptidos, incluyendo cualquiera de las secuencias descritas anteriormente, pueden exhibir, en algunas realizaciones, actividad promotora de la penetración en celulas o tejidos, y de forma particular en el tejido tumoral. Un conjunto de realizaciones esta generalmente dirigido a la asociación de peptidos promotores de penetración celular sin propiedades de direccionamiento, por ejemplo, para proporcionar a al menos algunas de las nanoentidades de actividad de penetración celular o tisular cuando no se administran sistemicamente a un sujeto (por ejemplo, intratumoral, nasal, topica, intra-peritoneal, vaginal, rectal, oral, pulmonar, ocular, etc.) , o cuando se administra in vivo o ex vivo, por ejemplo a celulas vivas o tejidos. En algunos casos, algunos de los acidos polisialicos estan unidos a un peptido promotor de la penetración celular, por ejemplo, mediante una asociación no covalente.
Algunos peptidos promotores de la penetración celular se pueden encontrar, por ejemplo, en Zhang D. et al., Cell- penetrating peptides as noninvasive transmembrane vectors for the development o f novel multifunctional drug-deliver y systems, Journal of Controlled Release, Volume 229 (2016) Pages 130-139, y Regberg J., et al. Applications o f cell-penetrating peptides for tumor targeting and future cancer therapies, Pharmaceuticals, 5 (2012) 991-1007. Peptidos promotores de la penetración celular utiles para ciertas realizaciones de la presente invención se pueden seleccionar de entre, aunque no se limitan a, TAT, mTAT (C-5H-TAT-5H-C) , G3R6TAT, TAT (49-57) , TAT (48-60) , MPS, VP22, Antp, gH625, CPPs ricos en arginina (por ejemplo, octarginina, poliarginina, estearilpoliarginina, HIV-1 Rev34-50, FHV coat35-49) penetratin, penetratin-Arg, penetratin-Lys, SR9, HR9, PR9, H (7) K (R (2) ) , Pep-1, Pep-3, transportan, transportan 10, pepFect, pVEC, JB577, TD-1, MPG8, CADY, YTA2, YTA4, SynBl, SynB3, PTD-4, GALA, SPACE, o similares. Peptidos promotores de la penetración celular que estan asociados a grupos de direccionamiento se seleccionan de entre, aunque no se limitan a, PEGA, CREKA, RVG, DV3, DEVDG, ACPP-MMP-2/9, ACPP-MMP-2, R8-GRGD, penetratin-RGD.
Algunos peptidos promotores de la penetración tumoral/tisular se pueden encontrar, por ejemplo, en Ruoslahti E., Tumor penetrating peptides for improved drug deliver y , Advanced Drug Deliver y Reviews, Volumes 110-111 (2017) Pages 3-12. Peptidos promotores de la penetración tumoral/tisular utiles para ciertas realizaciones de la presente invention se pueden seleccionar de entre, aunque no se limitan a, peptidos CendR, por ejemplo, iRGD (CRGDKGPDC) , LyP-1 (CGNKRTRGC) , tLyp-1 (CGNKRTR) , TT1 (CKRGARSTC) , Linear TT1 (AKRGARSTA) , iNGR (CRNGRGPDC) , RPARPAR, F3 (KDEPQRRSARLSAK.PAPPKPEPKPKKAPAKK) . En algunos casos, anticuerpos (incluyendo nanoanticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos monoclonales u otros anticuerpos) se pueden unir a la superficie o a la cubierta externa de una entidad, tal como una nanocapsula u otras entidades descritas en la presente memoria.
En ciertos aspectos, parte del acido polisialico esta unido a una molecula de direccionamiento, por ejemplo, covalentemente. El acido polisialico puede unirse directa o indirectamente a un grupo de direccionamiento, por ejemplo, a traves de un espaciador, tal como un ligando aminoalquil (C1-C4) succinimida (incluyendo C|, C2, C3 y C4) , o aminoalquil (C1-C4) amido-iso-propilo (incluyendo Cj, C2, C3 y C4) . En algunos casos, pueden usarse otros espaciadores de aminoalquilsuccinimida o aminoalquilamido-isopropilo. En algunas realizaciones, el grupo de direccionamiento puede comprender un extremo C, por ejemplo, para la union. En algunos casos, el espaciador aminoalquil (C j-C4) succinimida puede ser un espaciador aminoetilsuccinimida, aminopropilsuccinimida, aminobutilsuccinimida, o similares. El espaciador aminoalquil (C1-C4) succinimide puede ser creado, por ejemplo, usando una reaction de acoplamiento EDC/NHS (hidrocloruro de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida /N-hidroxisuccinimida) para unir un grupo maleimida a un grupo de acido carboxilico de una unidad de acido sialico. En algunos casos, un grupo N-aminoalquil (C1-C4) maleimida, tal como un grupo N-aminoetil maleimida, se puede hacer reaccionar con un grupo de acido carboxilico de una unidad de acido sialico para producir un enlace amida, uniendose de este modo el grupo maleimida al polisialico. El espaciador aminoalquil (C1-C4) amido-iso-propilo puede ser creado, por ejemplo, usando aminoetilmetacrilamida o N- (3-aminopropil) metacrilamida en presencia de BOP/TBA (benzotriazol-l-iloxi-tris (dimetilamino) fosfonio hexafluorofosfato/ hidroxido de Tetra-n-butilamonio) . El grupo maleimida o el grupo metacriloilo pueden reaccionar a continuation, por ejemplo, mediante adición de tipo Michael, con una cisteina, un grupo tiol u otro grupo que contenga azufre dentro del peptido para unir el peptido al acido polisialico a traves de una aminoalquil (C1-C4) succinimida, tales como el spaciador aminoetilsuccinimida (vease, por ejemplo, Fig. 1) , o a traves de un espaciador aminoalquil (C1-C4) amido-iso-propilo.
En algunas realizaciones, el acido polisialico puede unirse a un grupo de direccionamiento directamente a traves de un grupo amida. Vease, por ejemplo, Mojarradi, "Coupling of substances containing a primar y amine to hyaluronan via carbodiimidemediated amidation, " Master's Thesis, Universidad de Uppsala, marzo de 2011. El grupo amida puede crearse, por ejemplo, haciendo reaccionar un grupo de acido carboxilico del acido sialico y una porción de lisina, arginina u otro grupo que contenga una amina primaria dentro del peptido, en particular la amina primaria esta en un aminoacido lisina o arginina del grupo de direccionamiento. En algunas realizaciones, un activador esta presente en la reacción para formar un producto intermedio, como por ejemplo una carbodiimida o N-hidroxisuccinimida 0 DMTMM (cloruro de 4- (4, 6-dimetoxi-1, 3, 5-triazin-2-il) -4-metilmorfolinio) (D'Este et al., A systematic analysis o f DMTMM vs EDC/NHS for ligation o f amines to Hyaluronan in water, Carbohydrate Polymers, 108, (2014) , 239-246) .
Ademas, en ciertas realizaciones de la invention, una entidad puede incluir un promotor de la penetration capaz de facilitar la internalization celular o la penetration en los tejidos.
Por lo tanto, un conjunto de realizaciones se refiere en general a un método de hacer reaccionar un grupo carboxilato del acido polisialico con un aminoalquil (C1-C4) maleimida y/o un aminoalquil (C1-C4) metacrilamida, y hacer reaccionar la aminoalquil (C1-C4) maleimida y/o la aminoalquil (C1-C4) metacrilamida resultante con un grupo cisteina de un peptido para producir un acido polisialico-aminoalquil (C1-C4) succinimidepeptido y/o una composition acido polisialico-aminoalquil (C1-C4) amidoisopropilpeptido.
Otro conjunto de realizaciones se refiere a un método de hacer reaccionar un grupo carboxilato de un acido polisialico con una N-hidroxisuccinimida 0 una carbodiimida, y hacer reaccionar el producto intermedio formado con un grupo lisina o arginina de un peptido para producir un acido polisialico-amida-peptido.
Las nanoentidades pueden incluir cualquier variedad de agentes farmaceuticos o farmacos, en diversas realizaciones, los cuales pueden ubicarse intemamente y/o en la superficie de las nanoentidades, dependiendo de la realización. En algunos casos, los agentes farmaceuticos pueden incluir cualquier sustancia o mezcla de ustancias con la intención de ser usadas en la fabrication del medicamento y que, cuando se usan en la production de un medicamento, resulta ser un ingrediente activo en el medicamento. Tales sustancias pueden proporcionar actividad farmacologica y/u otro efecto directo en diagnosis, cura, mitigation, tratamiento o prevention de enfermedades o afectar a la estructura y función del organismo. Ejemplos de agentes farmaceuticos incluyen cualquier compuesto quimico o biologico farmaceuticamente activo, cualquier sal farmaceuticamente aceptable del mismo y cualquier mezcla de los mismos, que proporciona algun efecto farmacologico y se usa para tratar o prevenir una afección. Ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, clorhidrico, sulfurico, nitrico, fosforico, bromhidrico, malerico, malico, ascorbico, citrico, tartarico, pamoico, laurico, estearico, palmitico, oleico, miristico, lauril sulfurico, naftalensulfonico, linoleico, linolenico y similares. En algunos casos, la sal farmaceuticamente aceptable puede ser una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de litio, una sal de calcio, una sal de magnesio, una sal de amonio o similares.
Los farmacos o agentes farmaceuticos pueden ser considerados liposolubles, hidrosolubles o anfifilicos (contienen simultaneamente grupos no polares y grupos polares y en medio acuoso tienden a formar micelas) . Dada la complejidad de clasificar los farmacos o agentes farmaceuticos unicamente en función de su solubilidad, a modo de simplificar y en ningun caso limitar, se refieren a continuation dos clases de farmacos: liposolubles (compuestos con un cierto grado de solubilidad en medios que contienen aceites, y/o lipidos y/o disolventes organicos y logP > 1, 5) e hidrosolubles (compuestos con un cierto grado de solubilidad en medio acuoso y logP < 1, 5) , donde el logP se define como el coeficiente de reparto octanol-agua.
En ciertas realizaciones, los farmacos o agentes farmaceuticos pueden ser liposolubles, de modo que, por ejemplo, puedan estar contenidos dentro de una portion interna no acuosa de una nanocapsula u otra entidad, por ejemplo, dentro de un aceite, un lipido y/o un disolvente organico, por ejemplo, un disolvente organico mezclado con un aceite. Ademas, en algunos casos, un farmaco o agente farmaceutico liposoluble puede estar presente en la superficie externa o cubierta de la entidad. Ejemplos no limitantes de disolventes organicos incluyen, pero no se limitan a, etanol, butanol, 2-etilhexanol, isobutanol, isopropanol, metanol, propanol, propilenglicol, acetona, metil etilcetona, metilisobutilcetona, metilisopropilcetona, oxido de mesitilo, tricloroetileno, bromuro de etileno, cloroformo, cloruro de etileno, diclorometano, tetracloroetileno, tetracloruro de arbono, dimetilformamida, 1, 4-dioxano, eter butilico, eter dietilico de dimetilformamida, eter diisopropilico, tetrahidrofurano, eter terc-butilmetilico, sulfoxido de dimetilo, piridina, ciclohexano, hexano, acetonitrilo, acetato de etilo, tolueno, xileno, asi como combinaciones de estos y/u otros disolventes organicos. En algunos casos, el farmaco liposoluble puede ser generalmente de naturaleza hidrofobica, por ejemplo, teniendo un log P mayor que 1, 5, donde P es el coeficiente intrinseco de reparto octanol-agua.
Ejemplos no limitantes de agentes farmaceuticos liposolubles o farmacos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: agentes quimioterapeuticos o anticancerigenos tales como taxoides (por ejemplo, docetaxel, paclitaxel, cabazitaxel) , tomudex, daunomicina, aclarrubicina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, rapamicina, epirrubicina, valrrubicina, idarrubicina, mitomicina C, mitoxantrona, elesclomol, ingenol mebutato, plicamicina, caliqueamicina, esperamicina, degarelix, emtansina, maitansina, maitansinoides (por ejemplo, maitansinoide DM1, maitansinoide 2, maitansinoide DM4) , mitomicina, auristatinas, vinorelbina, vinblastina, vincristina, vindesina, estramustina, derivados hidrofobicos de cisplatino, clorambucil, bendamustina, carmustina, amantadina, rimantadina, lomustina, semustina, amsacrina, ladribina, citarabina, (C^-Cis) -gemcitabina, tegafur, trimetrexato, epotilonas A-E (por ejemplo, sagopilona, ixapebilona, patupilona) , eribulina, camptotecinas, aminoglutetimida, diaziquona, levamisol, metil-GAG, mitotano, mitozantrona, testolactona, michellamina B, briostatina-1, halomon, didemninas (por ejempo, plitidepsina) , trabectedina, lurbinectedina, vorinostata, romidepsina, irinotecan, bortezomib, erlotinib, getifmib, imatinib, vemurafenib, crizotinib, vismodegib, tretinoina, alitretinoina, bexaroteno, y similares; o inmunomoduladores / inmunosupresores tales como imiquimod, ciclosporina, tacrolimus, pimecrolimus, everolimus, sirolimus, tensirolimus, azatioprina, leflunomida, micofenolato, y similares; o farmacos esteroides tales como enzalutamida, abiterona, exemestano, fulvestrant, 2-metoxiestradiol, formestano, atamestano, gymnesterol, protodioscin metilo, Physalin B, Physalin D, Physalin F, witaferina A, ginsenosidos, azaesteroides, cinobufagin, bufalin, dienogest, y similares; o conjugados esteroideos con farmacos citotoxicos (por ejemplo, nucleosidos, paclitaxel, clorambucilo y complejos metalicos) , tales como paclitaxel-estradiol, y similares; o el conjugado Trastuzumabemtansina.
Otros ejemplos ilustrativos no limitantes, de moleculas biologicamente activas de naturaleza liposoluble incluyen los siguientes: analgesicos y agentes anti-inflamatorios (por ejemplo, aloxiprina, auranofina, azapropazona, benorilato, diflunisal, etodolac, fenbufeno, fenoprofeno calcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, acido meclofenamico, diclofenaco, acido mefenamico, nabumetona, naproxeno, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, etc.) ; antihelminticos (por ejemplo, albendazol, hidroxinaftoato de befenio, cambendazol, diclorofeno, ivermectina, mebendazol, oxamniquina, oxfendazol, embonato de oxantel, prazicuantel, embonato de pirantel, tiabendazol, etc.) ; antidiabeticos (por ejemplo, acetohexamida, clorpropamida, glibenclamida, gliclazida, glipizida, tolazamida, tolbutamida, etc.) ; antidepresivos (por ejemplo, amoxapina, maprotilina, mianserina, nortriptilina, trazodona, trimipramina, etc.) ; agentes antifungicos (por ejemplo, anfotericina, nitrato de butoconazol, clotrimazol, nitrato de econazol, fluconazol, flucitosina, griseofulvina, itraconazol, ketoconazol, miconazol, natamicina, nistatina, nitrato de sulconazol, terbinafina, terconazol, tioconazol, acido undecenoico, etc.) ; antipaludicos (por ejemplo, amodiaquina, cloroquina, clorproguanil, halofantrina, mefloquina, proguanil, pirimetamina, sulfato de quinina, etc.) ; agentes antimigranosos (por ejemplo, dihidroergotamina, ergotamina, metisergida, pizotifeno, sumatriptano, etc.) ; agentes antiprotozoarios (por ejemplo, benznidazol, clioquinol, decoquinato, diyodohidroxiquinolina, furoato de diloxanida, dinitolmida, fiirzolidona, metronidazol, nimorazol, nitrofurazona, omidazol, tinidazol, etc.) ; agentes antitiroideos (por ejemplo, carbimazol, propiltiouracilo, etc.) ; agentes antiarritmicos (por ejemplo, amiodarona, disopiramida, acetato de flecainida, sulfato de quinidina, etc.) ; agentes antibacterianos (por ejemplo, penicilina benetamina, cinoxacina, ciprofloxacino, claritromicina, clofazimina, cloxacilina, demeclociclina, doxiciclina, eritromicina, etionamida, imipenem, acido nalidixico, nitrofiirantoina, rifampicina, espiramicina, sulfabenzamida, sulfadoxina, sulfamazina, sulfoacetamida, sulfadiazina, sulfafurazol, sulfametoxazol, sulfapiridina, tetraciclina, trimetoprim, etc.) ; anticoagulantes (por ejemplo, dicumarol, dipiridamol, nicoumalona, fenindiona, etc.) ; ansioliticos, neurolepticos, sedantes e hipnoticos (por ejemplo, alprazolam, amilobarbital, barbitona, bentazepam, bromazepam, bromperidol, brotizolam, butobarbitona, carbromal, clordiazepoxido, clormetiazol, clorpromazina, clobazam, clotiazepam, clozapina, diazepam, droperidol, etinamato, flunanisona, flunitrazepam, fluopromazina, decanoato de flufmazina, decanoato de flupentixol, flurazepam, haloperidol, lorazepam, lormetazepam, medazepam, meprobamato, methaqualona, midazolam, nitrazepam, oxazepam, pentobarbitona, perfenazina pimozida, proclorperazina, sulpirida, temazepam, tioridazina, triazolam, opiclona, etc.) ; corticosteroides (por ejemplo, beclometasona, betametasona, budesonida, acetato de cortisona, desoximetasona, dexametasona, acetato de fludrocortisona, flunisolida, flucortolona, propionato de fluticasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona, etc.) ; agentes antigotosos (por ejemplo, alopurinol, probenecid, sulfinpirazona, etc) ; diureticos (por ejemplo, acetazolamida, amilorida, bendrofluazida, bumetanida, clorotiazida, clortalidona, acido etacrinico, tlirosemida, metolazona, espironolactona, triamtereno, etc.) ; beta bloqueantes (por ejemplo, acebutolol, alprenolol, atenolol, labetalol, metoprolol, nadolol, oxprenolol, pindolol, propranolol, etc.) ; agentes inotropicos cardiacos (por ejemplo, amrinona, digitoxina, digoxina, enoximona, lanatoside C, medigoxina, etc.) ; agentes antiparkinsonianos (por ejemplo, bromocriptina, lisurida, etc.) ; antagonistas de receptores de histamina (por ejemplo, acrivastina, astemizol, cinarizina, ciclizina, ciproheptadina, dimenhidrinato, flunarizina, loratadina, meclozina, oxatomida, terfenadina, etc.) ; agentes reguladores de lipidos (por ejemplo, bezafibrato, clofibrato, fenofibrato, gemfibrozil, probucol, etc.) ; nitratos y otros agentes antianginosos (por ejemplo, nitrato de amilo, trinitrato de glicerilo, dinitrato de isosorbida, mononitrato de isosorbida, tetranitrato de pentaeritritol, etc.) ; agentes nutricionales (por ejemplo, betacaroteno, vitamina A, vitamina B2, vitamina D, vitamina E, vitamina K, etc.) ; analgesicos opioides (por ejemplo, codeina, dextropropioxifeno, diamorfina, dihidrocodeina, meptazinol, metadona, morfina, nalbufma, pentazocina, etc.) ; hormonas sexuales (por ejemplo, citrato de clomifeno, danazol, etinilestradiol, acetato de medroxiprogesterona, mestranol, metiltestosterona, noretisterona, norgestrel, estradiol, estrogenos conjugados, progesterona, estanozolol, estibestrol, testosterona, tibolona, etc.) ; y similares. Naturalmente, en ciertas realizaciones en las que son terapeuticamente eficaces, se pueden usar mezclas de farmacos liposolubles.
En otras realizaciones, sin embargo, los agentes farmaceuticos o farmacos pueden ser hidrosolubles pudiendo estar, por ejemplo, contenidos dentro de una porción interna acuosa de una nanocapsula o asociados a su superficie. En algunos casos, el farmaco hidrosoluble puede presentar un cierto grado de solubilidad en medio acuoso (por ejemplo, teniendo un log P inferior a 1, 5, donde P es el coeficiente intrinseco de reparto octanolagua) . Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, todas las sales farmaceuticamente aceptables de los farmacos liposolubles antes mencionados, por ejemplo, docetaxel o trihidrato de docetaxel; por ejemplo, la sal puede ser sal cloruro, una sal sulfato, una sal bromuro, una sal mesilato, una sal maleato, una sal citrato, una sal fosfato, una sal idrocloruro; una sal de sodio, una sal de calcio, una sal de potasio, una sal de magnesio, una sal de meglumina, una sal de amonio, etc. En diversas realizaciones, se puede usar cualquier agente o farmaco adecuado que pueda estar contenido dentro de un disolvente apropiado dentro de una nanocapsula, según se ha discutido aqui.
Otros ejemplos de agentes farmaceuticos o farmacos hidrosolubles que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapeuticos (por ejemplo, topotecan, teniposido, etoposido, pralatrexato, omacetaxina, doxorrubicina, dacarbazina, procarbazina, hidroxidaunorrubicina, hidroxiurea, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, floxuridina o 5-fluorodeoxiuridina, fludarabina, 5-fluorouracilo, metotrexata, tiotepa, gemcitabina, pentostatina, mecloretamina, pibobroman, ciclofosfamida, ifosfamida, busulfan, carboplatin, picoplatin, tetraplatin, satrapalin, platinum-DACH, ormaplatin, oxaplatin, melfalan, aminoglutetimida, etc.) ; agentes antimicrobianos (por ejemplo, triclosan, cloruro de cetilpiridio, bromuro de domifen, sales de amono cuatemarias, compuestos de zinc, sanguinarina, fluorida, alexidina, octonidina, EDTA, etc.) ; agentes anti-inflamatorios no esteroideos y reductores de dolor (por ejemplo, aspirina, acetaminofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, diflunisal, fenoprofeno calcio, flurbiprofeno sodico, naproxeno, tolmetina sodica, indometacina, celecoxib, valdecoxib, parecoxib, rofecoxib, etc.) ; antitusivos (por ejemplo, benzonatato, caramifen edisilato, mentol, hidrobromuro de dextrometoríano, hidrocloruro de clofedianol, etc.) ; antihistaminas (por ejemplo, maleato de bromfeniramina, maleato de clorfeniramina, maleato de carbinoxamina, fumarato de clemastina, maleato de dexclorfeniramina, hidrocloruro de difenilhidramina, maleato de azatadina, citrato de difenidramina, hidrocloruro de difenidramina, hidrocloruro de difenilpiralina, succinato de doxilamina, hidrocloruro de prometazine, maleato de pirilamina, citrato de tripelenamina, hidrocloruro de triprolidina, acrivastina, loratadina, desloratadina, bromfeniramina, dexbrofeniramina, fexofenadina, cetirizina, montelukast sodico, etc.) ; expectorantes (por ejemplo, guaifenesina, ipecac, yoduro potasico, terpina hidrato, etc.) ; analgesicos-antipireticos (por ejemplo, salicilatos, fenilbutazona, indometacina, fenacetina, etc.) ; farmacos anti-migrana (por ejemplo, sumitriptan succinato, zolmitriptan, acido valproico, eletriptan hidrobromuro, etc.) ; H2-antagonistas y/o inhibiodores de la bomba de protones (por ejemplo, ranitidina, famotidina, omeprazol, etc.) ; o similares.
En algunos casos, la parte interna puede incluir un peptido, una proteina o un nucleotido, muchos de los cuales son de naturaleza hidrofilica. Adernas, en algunos casos, un farmaco o agente farmaceutico puede estar presente en la superficie externa o cubierta de la entidad. El peptido, proteina o nucleotido puede tener cualquier tipo de actividad, tal como antineoplasica, anti-angiogenica, inmunomoduladora/inmunosupresora, antigenica, antiinflamatoria, analgesica, antimigranosa, antiobesidad, antidiabetica, antimicrobiana, cicatrizante, antihelmintica, antiarritmica, antiviral, anticoagulante, antidepresiva, antiepileptica, antifungica, antigotosa, antihipertensiva, antipaludica, antimuscarinica, antiprotozoaria, antitiroidea, ansiolitica, sedante, hipnotica, neuroleptica, betabloqueante, inotropica cardiaca, inhibidora de la adhesion celular, corticosteroide, moduladora de la actividad de los receptores de citoquinas, diuretica, anti-Parkinsoniana, antagonista de los receptores H de la histamina, queratolitica, reguladora de lipidos, relajante muscular, anti angina, nutricional, estimulante, anti-disfiinción erectil, etc.
Ejemplos de peptidos y proteinas incluyen, pero no se limitan a interleuquina IL-27, interferones (por ejemplo, interferon alfa II, interferon alfacon-l, interferon alfa-n3, interferon gamma) , parasporina 2, fragmento de endostatina, macromomicina, actinoxantina, glicoproteina rica en histidina, carboxipeptidasa G2, ribonucleasa pancreatica, mitomalcina, arginina deiminasa, proteina P-30 u onconasa, inhibidor de la metaloproteinasa, guanilato quinasa, beclin-1, aloferon, mitogilina ribonucleasa, aureinas, antigeno CD276, dermaseptina- B2, lactoferricina B, plantaricina A, maximinas, cecropinas, peptidos de neutrofilos humanos, caerinas, nisinas, maculatinas, mCRAMP, BMAP-27, BMAP-28, citropinas, insulina humana, insulina recombinante, analogos de insulina (por ejemplo, insulina lispro, aspart insulina, insulina glulisina, insulina detemir, degludec insulina, insulina glargina, insulina NPH, etc.) , analogos de GLP-1 (por ejemplo, exenatida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida, taspoglutida, semaglutida, etc.) , analogos de GLP-2 (por ejemplo, teduglutida) , somatropina, anakinra, domasa alfa, proteinas acidas de suero de leche, SPARC o proteinas de osteonectina, proteina C, subfamilia A de queratina, hormona del crecimiento humano o somatotropina, gonadotropina, angiopoyetina, factores estimulantes de colonias (por ejemplo, factor estimulante de colonias de macrofagos, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos, etc.) , factor de crecimiento epidermico, eritropoyetina, factor de crecimiento de fibroblastos, familia de ligandos GDNF, factor-9 de diferenciación del crecimiento, factor de crecimiento de hepatocitos, actor de crecimiento derivado de hepatoma, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, proteina estimulante de macrofagos, neurotrofinas, factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento derivado de plaquetas, trombopoyetina, factores de crecimiento transformantes, factor de crecimiento del endotelio vascular, quimiocinas, interleucinas, linfoquinas, factores de necrosis tumoral (por ejemplo, el factor alfa de necrosis tumoral) , proteinas de fusion Fc, peptidos contulakina-G y derivados, antiflaminas, peptidos opioides, lipopeptidos (por ejemplo surotomicina) , antigenos, tales como toxoides tetanico y difterico, hepatitis B, y anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales (mAb) . En consecuencia, como ejemplo no limitante, una nanoentidad tal como una nanocapsula puede contener un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, dentro de una porción interna de la entidad, dentro de la porción externa o en ambas. Mezclas de farmacos hidrosolubles pueden, por supuesto, ser usados en ciertas realizaciones en que sean terapeuticamente efectivos.
Como se usa en la presente memoria, un "anticuerpo" se refiere a una proteina o glicoproteina que tiene uno o mas polipeptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o ffagmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la region constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, asi como una miriada de genes de region variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Se sabe que la unidad estructural tipica de una inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetramero, Cada tetramero esta compuesto por dos pares identicos de cadenas polipeptidicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente de 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente de 50-70 kD) . El N-terminal de cada cadena define una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos que son los principales responsables del reconocimiento del antigeno. Los terminos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren respectivamente a estas cadenas ligera y pesada. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como una serie de ffagmentos bien caracterizados producidos por digestion con diversas peptidasas. Asi, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo (es decir, hacia el dominio Fc) de los enlaces disulfuro en la region bisagra para producir F (ab) '2, un dimero de Fab que es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace disulfuro. El F (ab) '2 puede reducirse bajo ondiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la region bisagra convirtiendo de este modo el dimero (Fab') 2 en un monomero Fab El monomero Fab 'es esencialmente un Fab con parte de la region bisagra. Mientras que varios fragmentos de un anticuerpo se definen en terminos de la digestion de un anticuerpo intacto, tales fragmentos tambien pueden sintetizarse de novo, por ejemplo, quimicamente, utilizando metodologia de ADN recombinante, mediante metodos de "presentación en fagos" (Phage display) o similares. Ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo, anticuerpos Fv (scFv) de cadena sencilla en los que una cadena pesada variable y una cadena ligera variable se unen (directamente o a traves de un espaciador peptidico) para formar un polipeptido continuo. Ejemplos adicionales no limitantes de anticuerpos incluyen nanocuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quimericos, anticuerpos quimericos inversos, etc. Fragmentos que se unen a antigenos pueden incluir Fab, Fab', F (ab) 2, dsFv, sFv, unicuerpos, minicuerpos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, nanocuerpos, procuerpos, dominios de cuerpos, unicuerpos, bifragmento variable de cadena sencilla bi-especifica (bi-scFv) , y similares.
Ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, rituximab, gemtuzumab, alemtuzumab, ibritumomab, cetuximab, panitumumab, pertuzumab, tositumomab, trastuzumab, bevazizumab, durvalumab, nivolumab, inotuzumab, avelumab, pembrolizumab, olaratumab, atezolizumab, daratumumab, elotuzumab, necitumumab, dinutuximab, blinatumomab, ramucirumab, obinutuzumab, denosumab, ipilimumab, brentuximab, ofatumumab y combinaciones de los mismos.
Ejemplos de nucleotidos incluyen, pero no se limitan a, ADN, ARN, siARN, ARNm, miARN, PNA, o similares. Los nucleotidos pueden ser sentido o antisentido en diversas realizaciones.
Los agentes farmaceuticos pueden estar presentes hasta aproximadamente un 50% en peso con respecto al peso seco total de los componentes del sistema. Sin embargo, la proportion apropiada dependent de una diversidad de factores tales como los agentes farmaceuticos que se han de incorporar, la indication para la que se utiliza, la eficada de la administration, etc. Por ejemplo, en algunos casos, los agentes farmaceuticos pueden estar presentes hasta aproximadamente el 10% en peso, o hasta aproximadamente el 5% en peso. En ciertas realizaciones, puede estar presente mas de un agente farmaceutico, que puede disolverse en la misma solution o por separado, dependiendo de la naturaleza del ingrediente farmaceutico activo a incorporar.
En algunas realizaciones, la nanoentidad puede comprender uno o mas tensioactivos. En algunas realizaciones, la cubierta de la nanoentidad comprende uno o mas tensioactivos. En otras realizaciones, la portion interna de la nanoentidad comprende uno o mas tensioactivos. Los tensioactivos {si estan presentes) incluyen cualquiera de entre una variedad de componentes que poseen estructuras y/o grupos funcionales que les permiten interactuar simultaneamente con la parte lipofilica e hidrofilica de la formulación. Ejemplos de tensioactivos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: monooleato de polioxietilensorbitano (polisorbato 80; Tween 80®; HLB 15) , monoestearato de polioxietilensorbitano (Tween® 60, HLB 14, 9 y Tween 61®; HLB 9, 6) , monooleato de polioxietilensorbitano (Tween 81®; HLB 10) , triestearato de polioxietilensorbitano (Tween 65®; HLB 10, 5) , trioleato de polioxietilensorbitano (Tween 85®; HLB 11) , monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween® 20, HLB 16.7 y Tween 21®; HLB 13.3) , monopalmitato de polioxietilenosorbitan (Tween® 40, HLB 15.6) ; esteres pegilados de acidos grasos y mezclas con PEG, como el monoestearato de polietilenglicol (HLB 11.6) , estearato de polietilenglicol, estearato de polietilenglicol 40 (HLB 17) , estearato de polietilenglicol 100 (HLB 18.8) , dilaurato de polietilenglicol 400 (HLB 9.7) , dilaurato de polietilenglicol 200 (HLB 5.9) , monopalmitato de polietilenglicol (HLB 11.6) , Kolliphor HS15® (HLB 15) , polietilenglicol-15-hidroxiestearato (HLB 14-16 ) , D-alfa-tocoferil polietilenglicol succinato (TPGS; HLB 13.2) , oleato de trietanolamonio (HLB 12) , oleato sodico (HLB 18) , colato sodico (HLB 18) , desoxicolato sodico (HLB 16) , lauril sulfato sodico (HLB 40) , glicocolato sodico (HLB 16-18) , oleato de trietanolamina (HLB 12) , goma de tragacanto (HLB 11.9) y dodecilsulfato sodico (HLB 40) ; Poloxamer 124 (HLB 16) , Poloxamer 188 (HLB 29) , Poloxamer 237 (HLB 29) , Poloxamer 238 (HLB 28) , Poloxamer 278 (HLB 28) , Poloxamer 338 (HLB 27) , y Poloxamer 407 (HLB 22) , monooleato de sorbitano (Span® 80, HLB 4.3) , monolaurato de sorbitano (Span® 20, HLB 8.6) , monoestearato de sorbitano (Span® 60, HLB 4.7) , trioleato de sorbitano (Span® 85, HLB 1.8) , sesquiolato de sorbitano ® 83, HLB 3.7) , monopalmitato de sorbitano (Span® 40, HLB 6.7) , isoestearato de sorbitano (Span® 120, HLB 4.7) , macrogolgliceridos de lauroilo (por ejemplo Gelucire® 44/14, HLB 14 y Labrafil® M2130CS, HLB 4) , macrogolgliceridos de estearoilo (por ejemplo Gelucire® 50/13, HLB 13) , macrogolgliceridos de linoleoilo (por ejemplo, Labrafil® M2125CS, HLB4) , macrogolgliceridos de oleoilo (Labrafil® M1944CS, HLB 4) , macrogolgliceridos de caprilocaproilo (Labrasol®, HLB 14) , lecitinas (por ejemplo, lecitina de huevo, lecitina de oja, lecitina de organismos no modificados geneticamente, lecitina de colza, lecitina de girasol, lisolecitina, etc) , fosfolipidos (por ejemplo, fosfolipidos de huevo, fosfolipidos de soja, fosfolipidos sinteticos, fosfolipidos hidrogenados, fosfolipidos PEGilados, fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, etc.) , Phosal®, Phospholipon®, o cualquier combinación de cualquiera de estos y/u otros tensioactivos. En algunos casos, el tensioactivo puede ser cationico, por ejemplo, cloruro de bencetonio, cloruro de benzalconio, CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) , cetrimida, bromuro de tetradeciltrimetilamonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, o similares. En algunos casos, el agente tensioactivo cationico puede contener una sal de amonio, por ejemplo, como grupo de cabeza. Por ejemplo, el grupo de cabeza puede comprender una sal de amonio primario, secundario, terciario o cuatemario. Ademas, debe entenderse que dichos tensioactivos no son necesarios en todas las realizaciones.
En algunas realizaciones, las entidades comprenden al menos un tensioactivo cationico, tal como los descritos anteriormente. Por ejemplo, ciertas realizaciones de la invención generalmente dirigidas a nanocapsulas pueden, en algunos casos, contener tensioactivos tales como tensioactivos cationicos. Por ejemplo, ciertas realizaciones de la invención generalmente dirigidas a nanocapsulas que tienen un grupo direccional pueden ademas comprende tensioactivos cationicos.
Varios aspectos de la invención tambien son dirigidos de forma general a sistemas y metodos para producir composiciones tales como las descritas en la presente memoria, por ejemplo, nanoparticulas, nanocapsulas, micelas u otras nanoentidades. En algunos casos, la composición es una composición farmaceutica.
Como ejemplo, en un conjunto de realizaciones, se puede usar un método de difusion de disolvente en una sola etapa para producir las nanoentidades, por ejemplo nanocapsulas. En algunos casos, esto puede incluir preparar una solución acuosa que comprende acido polisialico y opcionalmente uno o mas tensioactivos solubles en agua, preparar una solución oleosa (por ejemplo, que comprende un aceite y uno o mas tensioactivos y un disolvente organico, etc.) y mezclar ambas soluciones. En algunos casos, el disolvente organico puede evaporarse total o parcialmente.
En otro conjunto de realizaciones, puede usarse un método de difusion del disolvente en dos etapas. Por ejemplo, en algunos casos, el método puede incluir preparar una solución oleosa (por ejemplo, que comprende un aceite y uno o mas tensioactivos y un disolvente organico, etc.) y anadirla a una fase acuosa (o añadir la fase acuosa sobre la fase leosa) . La fase acuosa puede contener opcionalmente uno o mas tensioactivos solubles en agua Las soluciones pueden ser mezcladas mediante agitación (stirring) para formar una nanoemulsion. En algunos casos, el disolvente organico puede evaporarse completa o parcialmente. Una vez que la nanoemulsion se forma, una solución acuosa que comprende acido polisialico se puede adicionar bajo agitación para producir las nanocapsulas.
En aun otro conjunto de realizaciones, puede usarse un método de sonicación. Por ejemplo, en algunos casos, el método puede incluir preparar una solución oleosa que comprende un aceite y uno o mas tensioactivos y, opcionalmente, un disolvente organico, y anadirla a una fase acuosa (o añadir la fase acuosa sobre la fase oleosa) . La fase acuosa puede contener opcionalmente uno o mas tensioactivos solubles en agua. Las soluciones pueden combinarse mientras se exponen a sonicación para formar una nanoemulsion. En algunos casos, el disolvente organico puede evaporarse completa o parcialmente. Como se describio previainente para el método de difusion de disolvente, el acido polisialico se puede disolver en la fase acuosa antes de la sonicación (formación de nanocapsulas en una unicu etapa) o despues de obtener la nanoemulsion mediante sonicación (proceso en dos etapas) .
En aun otro conjunto de realizaciones, puede usarse un método de homogeneización. Por ejemplo, en algunos casos, el método puede incluir preparar una solución oleosa, que comprende un aceite y uno o mas tensioactivos, y opcionalmente un disolvente organico, y anadirla a una fase acuosa (o añadir la fase acuosa sobre la fase oleosa) . La fase acuosa puede contener opcionalmente uno o mas tensioactivos solubles en agua. Las soluciones pueden combinarse mientras se homogeneiza para fonnar una nancemulsion. En algunos casos, el disolvente organico puede evaporarse completa o parcialmente. Como se describio previamente para ambos metodos de difusion de disolvente y de sonicación, el acido polisialico se puede disolver en la fase acuosa antes de homogeneizar (formación de nanocapsulas en una unica etapa) o despues de obtener la nanoemulsion por homogeneización (proceso en dos etapas) .
En otra realización, se puede usar un método de auto-emulsificación para producir la emulsion, por ejemplo, como se discute aqui. Por ejemplo, en algunos casos, el método puede incluir preparar una solución oleosa, que comprende un aceite y uno o mas tensioactivos (y opcionalmente un co-solvente) y adicionar lo a una fase acuosa (o adicionar la fase acuosa sobre la fase oleosa) . La fase acuosa puede opcionalmente contener uno o mas tensioactivos solubles en agua. En un conjunto de realizaciones, la mulsion puede ser preparada sin el uso de co-solventes (por ejemplo, etanol, PEG, glicerina, propilenglicol, etc) . Como se describio previamente el acido polisialico puede disolverse en la fase acuosa antes de la auto-emulsificación (formación de nanocapsulas en una unica etapa) o despues de obtener la nanoemulsion (proceso en dos etapas) .
En otra realization, la presente invención se refiere a un método para producir nanoentidades, que comprende una etapa adicional de liofilización, que puede hacer que se conserven durante el almacenamiento. En algunos casos, no es necesario usar crioprotectores durante la liofilización. En algunas realizaciones, no es necesario diluir el sistema coloidal antes de la liofilización, ya que las nanoentidades pueden no formar agregados durante la reconstitution del liofilizado. En algunos casos, es posible afiadir uno o mas azucares, por ejemplo, azucares que ejercen un efecto crioprotector. Ejemplos de crioprotectores incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: trehalosa, glucosa, sacarosa, manitol, maltosa, polivinilpirrolidona (PVP) , glicerol, polietilenglicol (PEG) , propilenglicol, 2-metil-2, 4-pentanodiol (MPD) , rafinosa, dextrano, ffuctosa, estaquiosa o similares. En algunos casos, los crioprotectores u otros aditivos pueden tener otros efectos, por ejemplo, como tampones para controlar el pH. En forma liofilizada, las nanoentidades pueden almacenarse durante largos periodos de tiempo, y pueden regenerarse, por ejemplo, anadiendo agua.
Otro aspecto proporciona un método para administrar cualquier composition comentada en la presente memoria a un organismo vivo. Cuando se administran, las composiciones de la invención se aplican en una cantidad terapeuticamente eficaz y en una formulación farmaceuticamente aceptable. En la presente memoria, el termino "fannaceuticamente aceptable" significa que la formulación contiene agentes o excipientes compatibles con la forma requerida para su administración a un ser vivo, sin causar efectos perjudiciales. Cualquiera de las composiciones de la presente invención puede ser administradas al organismo vivo en una dosis terapeuticamente eficaz. El termino "terapeuticamente eficaz" o "eficaz" tal como se usa en la presente memoria significa aquella cantidad necesaria para retrasar la aparición de, inhibir la progresion de, detener completamente la aparición o progresion de, diagnosticar una condición particular que esta siendo tratada o, de otro modo, lograr un resultado medicamente deseable. Los terminos "tratar", "tratado", "tratando", y similares, generalmente se refieren a la administración de las composiciones de la invención a un organismo vivo. Cuando se administran a un organismo vivo, las cantidades efectivas dependeran de la condición particular que se esta ratando y del resultado deseado. Una dosis terapeuticamente eficaz puede ser determinada por los expertos en la técnica, por ejemplo, empleando factores tales como los descritos adicionalmente a continuation y utilizando no mas que una experimentation rutinaria. Por ejemplo, en una realization, las composiciones son usadas aqul para tratar el cancer, por ejemplo, mediante la administración de docetaxel al organismo vivo, por ejemplo, por via intravenosa.
Algunas realizaciones de la invención se dirigen generalmente al uso de una composición como se describe en el presente documento para la preparation de un medicamento. Por ejemplo, ciertas realizaciones se refieren a las composiciones descritas en la presente memoria para uso en el tratamiento del cancer.
Al administrar las composiciones de la invención a un organismo vivo, se pueden selet cionar las dosis, pautas de dosificación, vias de administración y similares para influir en las actividades conocidas de estas composiciones. Las dosis se pueden estimar basandose en los resultados de modelos experimentales, opcionalmente en combination con los resultados de ensayos de composiciones de la presente invención. La dosificación puede ajustarse apropiadamente para conseguir los niveles de farmaco deseados, locales o sistemicos, dependiendo del modo de administración. Las dosis pueden administrarse en una o varias administraciones por dia, semana o mes.
La dosis de la composición administrada al organismo vivo puede ser tal que una cant) dad terapeuticamente eficaz de la composición alcance el lugar de acción de la composición dentro del organismo vivo. La dosis puede administrarse en algunos casos a la cantidad maxima evitando o minimizando cualquier efecto secundario potencialmente peijudicial dentro del organismo vivo. La dosificación de la composición que se administra depende de factores tales como la concentración final deseada en el lugar de acción, el método de administración al organismo vivo, la eficacia de la composición, la permanencia de la composición dentro del organismo vivo, el momento de la administración, el efecto de tratamientos concurrentes. La dosis administrada tambien puede depender de condiciones asociadas con el organismo vivo y puede variar en algunos casos de organismo a organismo. Por ejemplo, la edad, el sexo, el peso, el tamano, el medio ambiente, las condiciones fisicas o el estado actual de salud del organismo vivo tambien pueden influir en la dosis requerida y/o en la concentración de la composición en el lugar de acción. Pueden producirse variaciones en la dosificación entre diferentes individuos o ncluso dentro del mismo individuo en dias diferentes. En algunos casos, puede utilizarse una dosis maxima, es decir, la dosis segura mas alta de acuerdo con un criterio medico solido. En algunos casos, la forma de dosificación es tal que no afecta perjudicialmente de manera sustancial al organismo vivo.
En ciertas realizaciones, se administra una composición de la invención a un organismo vivo que tiene cancer. La administración de una composición de la invención puede realizarse por cualquier método medicamente aceptable que permita que la composición alcance su objetivo. El modo particular seleccionado dependera, por supuesto, de factores tales como los descritos anteriormente, por ejemplo, la composición particular, la gravedad del estado del organismo vivo que se esta tratando, la dosificación requerida para la eficacia terapeutica, etc. Segun se usa aqui, un modo de tratamiento "medicamente aceptable" es un modo capaz de producir niveles efectivos de la composición dentro del organismo vivo sin provocar efectos adversos clinicamente inaceptables.
Cualquier método medicamente aceptable puede ser usado para administrar la composición al organismo vivo. La administración puede ser localizada (es decir, en una region particular, sistema fisiologico, tejido, organo o tipo celular) o sistemica, dependiendo de la afección a tratar. Por ejemplo, la composición puede administrarse por via mtravenosa, o a traves de otras tecnicas, tales como oral, vaginal, rectal, bucal, pulmonar, ocular, topica, nasal, transdermica, intratumoral, peritoneal, mediante inyección parenteral o implantation, mediante administración quirurgica o cualquier otro método de administración donde el acceso al objetivo por la composición de la invención sea alcanzado. Las composiciones adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como capsulas duras o blandas, pildoras, sobres, tabletas, grageas o pastillas, conteniendo cada una, una cantidad predeterminada del compuesto activo. Otras composiciones orales adecuadas para su uso con la invención incluyen soluciones o suspensiones en liquidos acuosos o no acuosos tales como un jarabe, un elixir o una emulsion. En otro conjunto de realizaciones, la composición puede usarse para reforzar un alimento o una bebida. La administración rectal puede utilizarse en algunas realizaciones, por ejemplo, en forma de enema, supositorio o espuma.
En un conjunto de realizaciones, la administración de la composición es parenteral, intratumoral u oral. En algunas realizaciones, la composición se administra por inyección o infusion. En una realization, la inyección se selecciona de entre inyección ntratumoral, subcutanea, intramuscular o intravenosa. En otra realización, la composición se administra mediante inyección o infusion intratecal.
En ciertas realizaciones de la invención, la administración de una composición de la invención puede disenarse de manera que resulte en exposiciones secuenciales a una composición durante un cierto periodo de tiempo, por ejemplo, horas, dias, semanas, meses o anos. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante administraciones repetidas de una composición de la invención por uno de los metodos descritos anteriormente. La administración de una composición puede ser sola, o en combination con otros agentes terapeuticos y/o composiciones.
En ciertas realizaciones de la invención, una composición puede combinarse con un vehiculo adecuado farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, incorporado en un sisteua de liberation polimerico, o suspendido en un liquido, por ejemplo, disuelto o en suspension coloidal. En general, los vehiculos adecuados farmaceuticamente aceptables para su uso en la invención son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "vehiculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un material no toxico que no interfiere significativamente con la eficacia de la actividad biologica del compuesto o compuestos activos a administrar, sino que se utiliza como ingrediente de la formulación, por ejemplo, para estabilizar o proteger el (los) compuesto (s) activo (s) dentro de la composición antes de su uso. El termino "vehiculo" indica un ingrediente organico o inorganico, que puede ser natural o sintetico, con el que se combinan uno o mas compuestos activos de la invención para facilitar la aplicación de una composición como se describe en la presente memoria. El vehiculo puede ser entremezclado o de otro modo mezclado con una o mas composiciones de la presente invención, y entre si, de una manera tal que no haya interaction que perjudique sust&ncialmente la eficacia farmaceutica deseada. El vehiculo puede ser soluble o insoluble, dependiendo de la aplicación. Ejemplos de vehiculos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasa, celulosa natural y modificada, poliacrilamida, agarosa y magnetita. La naturaleza del vehiculo puede ser soluble o insoluble. Los expertos en la técnica sabran de otros vehiculos adecuados, o seran capaces de determinarlos, usando solo experimentation rutinaria.
En algunas realizaciones, una composición de la invención puede incluir vehiculos farmaceuticamente aceptables con ingredientes de formulación tales como sales, vehiculos, agentes tamponantes, emulsionantes, diluyentes, excipientes, agentes quelantes, gentes de relleno, agentes secantes, antioxidantes, antimicrobianos, conservantes, agentes aglutinantes, agentes de carga, silices, solubilizantes o estabilizadores que se pueden ser usados con el compuesto activo. Por ejemplo, si la formulación es un liquido, el vehiculo puede ser un disolvente, un disolvente parcial o un no disolvente, y puede ser acuoso u organico. Ejemplos de ingredientes de formulación adecuados incluyen diluyentes tales como carbonato calcico, carbonato sodico, lactosa, caolin, fosfato calcico o fosfato sodico; agentes para granulation y desintegrantes tales como almidon de maiz o acido alginico; agentes aglutinantes tales como almidon, gelatina o acacia; agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, acido estearico o talco; materiales retardantes tales como monoestearato de glicerol o diestearato de glicerol; agentes suspensores tales como carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sodico, poli\inilpirrolidona; agentes dispersantes o humectantes tales como lecitina u otros fosfatidos naturales; agentes espesantes tales como alcohol cetilico o cera de abejas; agentes tamponantes tales como acido acetico y sales de los mismos, acido citrico y sales de los mismos, acido borico y sales de los mismos, o acido fosforico y sales de los mismos; o conservantes tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabenos o timerosal. Las eoncentraciones adecuadas del vehiculo pueden ser determinadas por los expertos en la técnica, utilizando no mas que una experimentación rutinaria. Una composition como la descrita en la presente memoria puede formularse en preparaciones de formas solidas, semisolidas, liquidas o gaseosas tales como tabletas, capsulas, elixires, polvos, granulos, unguentos, soluciones, depositos, inhalantes o inyectables. Los expertos en la técnica sabran de otros ingredientes de formulación adecuados, o seran capaces de determinarlos, utilizando solo experimentación rutinaria.
Las preparaciones incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas esteriles, que pueden ser isotonicas con el suero sanguineo en ciertas realizaciones. Ejemplos de disolventes no acuosos son polipropilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, aceite de sesamo, aceite de coco, aceite de cacahuete, aceite mineral, esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo, o aceites no volatiles, incluyendo mono o di-gliceridos. Los vehiculos acuosos incluyen agua, soluciones alcoholicas /acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehiculos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, 1, 3-butandiol, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, soluciones de lactato de Ringer o aceites no volatiles. Los vehiculos intravenosos incluyen reabastecedores de liquidos y utrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) , y similares. Tambien pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Los expertos en la técnica pueden determinar facilmente los diversos parametros para la preparation y formulation de una composición tal como se describe en la presente memoria sin recurrir a una experimentation excesiva.
La presente invention tambien proporciona cualquiera de las composiciones meneionadas anteriormente en kits, incluyendo opcionalmente instrucciones para el uso de la composición para el tratamiento de cancer u otras enfermedades. Tambien se pueden proporcionar instrucciones para administrar una composición por cualquier técnica adecuada como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, de forma oral o intravenosa.
Las composiciones de la invención pueden presentarse bajo la forma de un kit. El kit define tipicamente un paquete que incluye una o mas composiciones de la invención y otros ingredientes como se ha descrito anteriormente. Los kits tambien pueden incluir otros recipientes con uno o mas disolventes, agentes tensioactivos, conservantes y/o diluyentes (por ejemplo, solution salina comun (NaCl al 0, 9%) o dextrosa al 5%) asi como recipientes para mezclar, diluir o administrar la composición a un organismo vivo.
Las composiciones del kit pueden presentarse como soluciones liquidas o como polvos secos. Cuando una composición se presenta como un polvo seco, puede reconstituirse mediante la adición de un disolvente adecuado. En realizaciones en las que se usan formas liquidas de una composición, la forma liquida puede concentrarse o estar lista para su uso. El disolvente dependera de una composición y del modo de uso o administration.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar ciertas realizaciones de la presente invención, pero no ejemplifican el alcance completo de la misma.
EJEMPLO 1
Este ejemplo ilustra las nanocapsulas de acido polisialico funcionalizadas con el peptido de penetration tumoral tLyp-1.
La composición de las nanocapsulas fue la siguiente. Las nanocapsulas fueron formadas por un nucleo oleoso rodeado por una cubierta polimerica de acido polisialico (PSA, 30 kDa) funcionalizado con el peptido tLypl y estabilizado por tensioactivos. Las anocapsulas se formaron debido a la interaction del PSA con un tensioactivo cargado positivamente en la interfase de una emulsion de aceite en agua.
La union covalente de PSA utilizada permite una union covalente selectiva entre los grupos tiol del peptido tLypl y los grupos carboxilato del PSA. En esta estrategia de sintesis se utilizo el espaciador heterobifuncional aminoetil maleimida que permite, en primer lugar, la union a traves del grupo amina del grupo espaciador a los grupos carboxilato de PSA (usando quimica carbodiimida) y, en segundo lugar, la union del peptido mediante la adición del grupo tiol del peptido (residuo de cisteina) al grupo maleimida del espaciador (adición de tipo Michael) , siguiendo un proceso de dos etapas (Figura 1) . Esta estrategia permitio la preservation de los grupos biologicamente activos del peptido tLypl. Ademas, el grado de sustitución puede controlarse facilmente.
Las nanocapsulas de PSA pueden producirse mediante una variedad de tecnicas. El numero de moleculas tLypl presente en la superficie de las nanocapsulas podria modificarse de acuerdo con las diferentes proporciones (ratios) molares utilizadas en la reaction quimica (vease la Tabla 1 como ejemplos variables no limitativos, que muestran la proportion molar del acido carboxilico (COOH) de PSA: EDC: NHS: AEM) . Una de ellas es una técnica de difusion del disolvente, que implica la mezcla de un disolvente polar en una fase acuosa. Otra técnica es una técnica de autoemulsificación, que no requiere el uso de disolventes organicos.
Las nanocapsulas de PSA pudieron ser funcionalizadas con tLypl. El numero de moleculas tLypl en la superficie de las nanocapsulas pudo ser controlado. Las nanocapsulas tLypl funcionalizadas que se fonnaron tenian un tamano alrededor de 130 nm y un potencial zeta negativo (-44 mV) . Las nanocapsulas funcionalizadas con tLypl resultaron estables tras la incubation en plasma a 37°C. Las nanocapsulas funcionalizadas con tLypl podrian cargarse con cualquier farmaco hidrofobico adecuado y tambien con moleculas hidrosolubles. Por ejemplo, en un experimento, las nanocapsulas funcionalizadas con tLypl se cargaron con docetaxel. Ademas de tLypl, otros peptidos de penetration en tejidos, tales como peptidos CendR (por ejemplo, Lypl e iRGD) , pueden estar unidos a la cadena de PSA.
Tabla 1
EDC: Hidrocloruro de N- (3-Dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida; NHS: N-Hidroxisuccinimida; AEM: sal trifluoroacetato de N- (2-Aminoetil) maleimida.
En un ex peri men to, se prepararon las nanocapsulas de polisialico de la forma que se explica a continuación. Los resultados se presentan como media +/- S.D. de 3 replicados.
Mediante una técnica de difusion del disolvente se prepararon nanocapsulas con una cubierta polimerica de PSA o PSA-tLypl de diferentes ratios. La fase organica se compuso de 4, 75 ml de acetona y 0, 25 ml de etanol, conteniendo 0, 75 mg/ml de lecitina (Epikuron 145V) , 0, 15 mg/ml de CTAB, 2, 96 mg/ml de Miglyol® 812 y 150 pg/ml de docetaxel, en el caso de nanocapsulas cargadas con docetaxel, y una fase acuosa de 10 ml de solución de PSA o PSA-tLypl a una concentración de 0, 25 mg/ml. La fase organica se anadio gota a gota a la fase acuosa bajo agitation magnetica, dando lugar a la formation inmediata de las nanogoticulas y a la deposition del polimero a su alrededor. Despues de la formación de las nanocapsulas, los disolventes organicos se eliminaron por rotaevaporación.
Las nanocapsulas se aislaron por ultracentrifugation (Ultracentrifuga Optima™ L-90K, Beckman Coulter, Fullerton, CA) a 84035 g durante 0, 5 h a 15°C. A continuación se retiro el bajonadante del medio. Las nanocapsulas (en el sobrenadante) se recogieron y diluyeron hasta una concentración conocida.
Las nanocapsulas fueron caracterizadas en terminos de tamano medio de particula e indice de polidispersion (PI) por espectroscopia de correlation fotonica (PCS) . Las muestras se diluyeron en agua MilliQ y el analisis se llevo a cabo a 25°C utilizando un angulo de 173°. Las mediciones del potencial zeta se realizaron mediante anemometria de laser Doppler (LDA) , para lo que se diluyeron las muestras en solución acuosa de KC1 1 M. Los analisis de PCS y LDA se realizaron por triplicado usando un equipo NanoZS® (Malvern Instruments, Malvern, UK) .
Tabla 2
*n=l; PSA: acido polisialico; PSA-tlypl: acido polisialico funcionalizado con el peptido tlypl; NCs: nanocapsulas
Los experimentos de RMN se realizaron utilizando los espectrometros Varian Inova 750. Los desplazamientos quimicos se reportan en ppm. Los espectros se obtuvieron en una mezcla de oxido de deuterio: agua MilliQ 10:90 a una concentración de polimero entre 0, 4-0, 8 mg/ml. El analisis de *H-RMN se realizo a 750 MHz con 256 scans y 10 s de retardo entre cada scan. Para el procesamiento de los espectros se utilizo el Software MestreNova (Mestrelab Research) . La formación del conjugado PSA-tLypl se confirmo verificando la presencia de senales jH- RMN caracteristicas del peptido en los espectros correspondientes al PSA-tLypl. Ademas, se observo la presencia de senales de protones de aminas caracteristicas de los aminoacidos del peptido tLypl en el espectro 'H-NMR del PSA-tLypl entre 6, 5 y 8, 5 ppm (Figura 6) , confirmando asi la union covalente entre PSA y tLypl.
EJEMPLO 2
Este ejemplo ilustra datos in vivo usando ciertas particulas según se describe en el Ejemplo 1. La funcionalización del PSA con tLypI dio como resultado un efecto de direccionamiento activo en un modelo de tumor ortotopico de pulmon (alta acumulación del farmaco antitumoral docetaxel en el pulmon) . Los datos de biodistribución presentados en la Fig. 2A indican que este efecto de direccionamiento es marcadamente pronunciado cuando el peptido se encuentra unido covalentemente al PSA en comparación con la administración de nanocapsulas de PSA y tLypl no unidos entre si (nanocapsulas de PSA y tLypl) y nanocapsulas de PSA no modificadas (sin tLypl) .
En este ejemplo, la eficacia de las nanocapsulas de PSA funcionalizadas con tLypl se compare con la de la formulación comercial Abraxane® (paclitaxel) en un modelo PDX (Xenograft Derivado de Paciente) de cancer pancreatico en ratones. Los resultados representados en la Figura 3 muestran que las nanocapsulas de PSA funcionalizadas con tLypl (Ratio 2) fueron mas eficaces que el Abraxane®. El crecimiento del tumor se redujo significativamente y la supervivencia de los ratones se prolongo tambien significativamente (42 ffente a 56 dias) . Ademas, las nanocapsulas mostraron una baja toxicidad in vivo en terminos de perdida de peso en ratones sanos (Figura 4) y toxicidad sanguinea.
La Figura 2 muestra la acumulación de docetaxel a lh (Figura 2A) y 24 h (Figura 2B) tras la administración intravenosa de Taxotere® (docetaxel comercial) , nanocapsulas de PSA, nanocapsulas de PSA-tlypl y nanocapsulas de PSA + tlypl, a una dosis equivalente de 7, 5 mg/kg. Los datos se muestran como la media +/- la desviación estandar (SD) de 5 replicados. Diferencias significativas entre tratamientos (*) p<0, 01.
La Figura 3 muestra el volumen tumoral relativo tras la administración intravenosa de Abraxane® (dosis de paclitaxel de 150 mg/kg) y nanocapsulas de PSA-tlypl cargadas con docetaxel (dosis de docetaxel de 60 mg/kg) . Todos los datos se muestran como la media +/- el error estandar (SEM) de 5 replicados. Los ratones o bien murieron o bien fueron sacrificados a dia 42 (grupo control y los tratados con Abraxane®) o a dia 56 debido al avanzado estado de la enfermedad.
La Figura 4 muestra la evolution del peso corporal de los ratones tratados con nanocapsulas de PSA-tlypl a una dosis equivalente total de 75 mg/kg. Todos los datos se muestran como la media +/- la desviación estandar (SD) de 5 replicados.
EJEMPLO 3
Un ejemplo de preparation de acido polisialico funcionalizado con C12 se realizo como sigue. El C12 (dodecilo) se utiliza aqui como un ejemplo no limitativo, aunque otros grupos alquilo pueden usarse de manera similar en otros experimentos. Haciendo referencia a la Figura 5, una sal sodica de acido polisialico (30 kDa) se trato con Dowex y luego con hidroxido de tetrabutilamonio. Despues de la concentracion/purificación por ultrafiltración y de la liofilización del concentrado, se obtuvo una sal de tetrabutilamonio de acido polisialico facilmente soluble en DMF.
El acido se activo luego con tetrafluoroborato de 2-bromo-l-etil-piridinio y posteriormente se hizo reaccionar con dodecilamina. Despues del aislamiento del producto por precipitation, el cation de tetrabutilamonio fue reemplazado por un cation de sodio. La concentracion/purificación por ultrafiltración y la liofilización del concentrado originaron la sal de sodio de acido polisialico funcionalizado con dodecilamida, que era el objetivo. El analisis por 'H-RMN confirmo la estructura y el grado de sustitución en el rango del 4%.
Algunas reacciones de prueba fueron realizadas para optimizar mejor la cantidad de tetrafluoroborato de 2-bromo-l-etil-piridinio. Una prueba inicial con un 5% de tetrafluoroborato de 2-bromo-l-etilpiridinio dio lugar a una incorporation muy baja (<1%) de dodecilamina en el polimero. Un experimento con 1 equivalente de tetrafluoroborato de 2-bromo-l-etil-piridinio dio lugar a un producto que era menos soluble en agua. Con un 30% de tetrafluoroborato de 2-bromo-l-etilpiridinio, se obtuvo un grado de sustitución en el rango del 4%. A continuation, la reaction se escalo a 1 gramo de polimero funcionalizado.
Ultrafiltración. La ultrafiltración se uso para concentrar (y desalar) la sal de tetrabutilamonio de acido polisialico y el acido polisialico derivatizado. La ultrafiltración se llevo a cabo usando un sistema de filtration de flujo tangencial (TFF) Minim II de Pall usando un casete (Pall) 10K Omega Centramate T-series 0.019 m
(articulo OS010T02, numero de serie 36049076R, numero de lote de membrana H5257E) . Para la diafiltración, el agua se introdujo de fonna continua en el deposito, liberandose un flujo de permeado. Las sales y las impurezas de bajo peso molecular permearon a traves de la membrana y, por tanto, fueron eliminadas.
Sal de tetrabutilamonio de acido polisialico (2) . La sal sodica de acido polisialico (100 g) fue disuelta en 100 ml de agua pura, se agito durante 30 minutos con Dowex 50 WX8 (200-400, forma H +, recien lavado con agua, seguido de metanol y despues con agua) (20 ml) y la resina resultante se separo por filtración y se lavo con agua desionizada.
El pH de la solución fue menor de 4. La solución se trato con hidroxido de tetrabutilamonio (solución al 40% en peso en agua) hasta que el pH fue aproximadamente 12. El procedimiento completo se repitio dos veces y el pH final se ajusto posteriormente a 7.5- 8 mediante burbujeo de CO2 seguido por burbujeo de N2.
Ultrafiltración. La solución de sal de tetrabutilamonio de acido polisialico se coloco en el deposito (400 ml) y se concentro hasta un volumen de 100 ml. Para la diafiltración, el agua se introdujo de forma continua en el deposito (300 ml) . El flujo de permeado fue de 12 ml/min. Cuando se termino la diafiltración, la solución se concentro adicionalmente hasta un volumen minimo y se retiro del deposito. La presion transmembrana durante la diafiltración file 0, 6 bar, P1 = 1, 2 bar. El concentrado se liofilizo para dar lugar al compuesto (1, 6 g) en forma de un solido bianco.
Sal de tetrabutilamonio de acido polisialico funcionalizada con dodecilamida (3) . A una solución de sal de tetrabutilamonio de acido polisialico 2 (1, 3 g, 2, 43 mmol eq.) en DMF (30 ml) bajo N2 a temperatura ambiente se le anadio tetrafluoroborato de 2-bromo-letilpiridinio (233 mg, 0, 85 mmol, 0, 35 eq.) en DMF (1 ml) y la solución se agito durante 1 h. A continuation se anadio a la reaction una solución de 1-aminododecano (270 mg, 1, 46 mmol) y Et2N (0, 576 ml, 4, 13 mmol) en DMF (1 ml) y la mezcla se agito durante 40 h. La mezcla de reacción se anadio gota a gota a una solución de Et20 (150 ml) y acetona (15 ml) . El precipitado se recogio por filtration, se lavo con Et20 y se seed bajo presion reducida.
Sal sodica de acido polisialico funcionalizado con dodecilamida (4) . El precipitado bianco se disolvio en agua desionizada (100 mL) y la solución se agito durante 30 minutos con Dowex 50WX8 (200-400, forma H +, recien lavado con agua seguido de metanol y luego agua) (20 mL) y la resina se filtro y lavo con agua desionizada. La solución se trato con una solución acuosa de hidroxido sodico (1 M) hasta que el pH fue 12. El procedimiento completo se repitio dos veces y el pH final se ajusto posteriormente a 7.5- 8 por burbujeo de C02 seguido de burbujeo de N2.
Ultrafiltración. La solución de sal de sodio del acido polisialico derivatizado se coloco en el deposito (500 ml) y la solución se concentro hasta un volumen de 100 ml por diafiltración.. La presion transmembrana durante la diafiltración fue de 0, 6-0, 7 bar (PI = 1, 2-1, 3 bar) .
El concentrado se liofilizo para dar lugar la sal de sodio del acido polisialico fimcionalizada con dodecilamida 4 (800 mg) en forma de un solido bianco. El espectro de `H-RMN indico un grado de sustitución de alrededor del 4%.
EJEMPLO 4
Este ejemplo ilustra la formulación, por la técnica de autoemulsificación, de nanocapsulas de acido polisialico (PSA, 30 kDa) y la asociación adicional de un anticuerpo IgG completo (Mw 160 kDa, punto isoelectrico 6, 5 - 8, 1) a dichas nanocapsulas. A menos que se indique lo contrario, los resultados se presentan como media +/- desviación estandar (SD) de un minimo de 3 replicados.
Por ejemplo, en un experiment, la fase oleosa se compuso de 500 pi de los trigliceridos Caprilico/caprico (Mygliol® 812) y 438 pi de una mezcla previamente preparada de Polisorbato 80 (Tween® 80) y Bromuro de Cetil Trimetil Amonio (CTAB) (5, 5 mg de CTAB en 2 mL de Tween® 80, calentando a 50°C durante 1 h para su completa disolucion) . La fase acuosa se compuso de una mezcla de 11, 25 mg de Macrogol 15 Hidroxiestearato (Kolliphor® HS15) y una solución acuosa previamente preparada de PSA (13, 5 mg de PSA en 3975 pi de agua ultrapura) .
Las nanocapsulas de PSA se formaron espontaneamente despues de la adición de 175 pi de la fase oleosa sobre 1325 pi de la fase acuosa bajo agitación magnetica (20 min, 900 rpm) . A continuación, por ejemplo en un experiment, la IgG se asocio incubando 150 pi de nanocapsulas de PSA con 150 pi de IgG (1, 47 mg/ml) durante 4 h a temperatura ambiente y bajo agitación horizontal.
El tamano, indice de polidispersion (PI) y la carga superficial (potencial zeta) de las nanocapsulas de PSA y de las nanocapsulas de PSA cargadas con IgG fueron determinados mediante las tecnicas de espectroscopia de correlación fotonica y anemometria de laser Doppler (instrument Nano-ZS, Malvern, UK) (Tabla 3) .
La eficacia de asociación de IgG a las nanocapsulas a PSA se evaluo por ultrafiltración utilizando membranas Nanosep® 300K (Pall Corporation, Espana) . Asi, 250 pi de las nanocapsulas cargadas con IgG se cargaron en la membrana de filtración y se centrifugaron (4 minutos, 4°C, 14.000 g) . Despues de este proceso de aislamiento, se recogio el filtrado que contenia el anticuerpo libre y se analizo mediante un ensayo de Bradford. La eficiencia de la asociación se calculo indirectamente como: (IgG total- IgG libre) /IgG total* 100. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
* n=2; PSA: acido polisialico; NCs: nanocapsulas
En un experimento, se evaluo la estabilidad de las nanocapsulas de PSA (sin IgG) en medio de cultivo celular RPMI (medio Roswell Park Memorial Institute) , suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de piruvato. Las muestras se diluyeron 1/10 (v/v) en el medio y se incubaron a 37°C, y el tamano se evaluo en diferentes momentos (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h y 72 h) utilizando la técnica de espectroscopia de correlation fotonica (instrumento Nano-ZS, Malvern, UK) . Las nanocapsulas de PSA resultaron ser estables durante al menos 72 h (tamano inicial: 156 +/- 2 nm; tamano tras 72h: 157 +/- 3 nm) .
En otro experimento, por ejemplo, se evaluo la estabilidad de las nanocapsulas de PSA (con y sin la IgG asociada) en plasma a 37°C midiendo el tamano a diferentes tiempos (Oh, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, Y 24h) . Las nanocapsulas de PSA resultaron ser estables durante al menos 24 h (tamano inicial: 152 +/- 7 nm; tamano tras 24h: 137 +/- 5 nm) . Ademas, se observo que las nanocapsulas de PSA cargadas con IgG eran tambien estables durante al menos 24 h (tamano inicial: 147 +/- 10 run: tamano tras 24 h: 143 +/- 17 nm) .
Si bien se han descrito e ilustrado varias realizaciones de la presente invention, los expertos en la técnica apreciaran facilmente una variedad de medios y/o estructuras altemativas para realizar las funciones y/u obtener los resultados y/o una o mas de las ventajas descritas en la presente memoria, y cada una de dichas variaciones y/o modificaciones se considera que esta dentro del alcance de la presente invención. Mas generalmente, los expertos en la técnica apreciaran facilmente que todos los parametros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en la presente memoria se consideran lustrativos y que los parametros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependeran de la aplicación o aplicaciones especifieas para los cuales se usan las ensenanzas de la presente invención. Los expertos en la técnica reconoceran, o seran capaces de determinar, utilizando no mas que la experimentation rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones espedficas de la invención descritas en la presente memoria. Por lo tanto, debe entenderse que las realizaciones anteriores se presentan solo a modo de ejemplo y que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y equivalentes a las mismas, la invención se puede poner en practica de maneras altemativas a las descritas y reivindicadas espedficamente. La presente invención esta referida a cada caracteristica, sistema, articulo, material, kit y/o método individual descritos en la presente memoria. Ademas, cualquier combination de dos o mas de tales caracteristicas, sistemas, articulos, materiales, kits y/o metodos, si tales caracteristicas, sistemas, articulos, materiales, kits y/o metodos no son mutuamente inconsistentes, esta incluida dentro del alcance de la presente invención.
En los casos en los que la presente memoria descriptiva y documentos incorporados por referencia incluyan información contradictoria y/o incoherente, la presente description prevalecera. Si dos o mas documentos incorporados por referencia incluyen información contradictoria y/o incoherente entre ellos, entonces el documento que tenga la fecha de vigencia posterior prevalecera.
Todas las definiciones, tal como se definen y utilizan en el presente documento, deben entenderse que prevaleceran sobre definiciones de diccionario, definiciones de documentos incorporados por referencia y/o significados ordinarios de los terminos definidos.
Los articulos indefinidos "un" y "una", tal como se usan aqui en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, debe entenderse que significa "al menos uno".
La frase "y/o", tal como se usa aqui en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse que significa "cualquiera o ambos" de los elementos asi conectados, es decir, elementos que estan presentes conjuntamente en algunos casos y disyuntivamente en otros casos. Los elementos multiples enumerados con "y/o" deben interpretarse de la misma manera, es decir, "uno o mas" de los elementos asi conectados. Opcionalmente, pueden estar presentes otros elementos distintos de los elementos identificados espedficamente por la clausula "y/o", esten relacionados o no relacionados on los elementos espedficamente identificados. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, una referencia a "A y/o B", cuando se usa junto con un lenguaje abierto como "que comprende" puede referirse, en una realization, a A solamente (opcionalmente incluyendo elementos distintos de B) ; en otra realization, a B solamente (opcionalmente incluyendo elementos distintos de A) ; en otra realization mas, tanto a A como B (opcionalmente incluyendo otros elementos) ; Etc.
Tal como se usa en el presente documento, en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "o" debe entenderse que tiene el mismo significado que "y/o" como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, al separar los elementos de una lista, "o" o "y/o" se interpretaran como inclusivos, es decir, la inclusion de al menos uno, pero tambien mas de uno, de un numero o lista de elementos, y, opcionalmente, elementos no listados adicionales. Solo los terminos claramente indicados en sentido contrario, como "solo uno de" o "exactamente uno de", o cuando se utiliza en las reivindicaciones, "que consiste en" se referira a la inclusion de exactamente un elemento de un numero o lista de elementos. En general, el termino "o", tal como se usa aqui, solo se interpretara como altemativa excluyente (es decir, "uno u otro, pero no ambos") cuando este precedido por terminos de exclusividad, como "cualquiera", "solo uno de", o "exactamente uno de".
Como se usa en el presente documento, en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la frase "al menos uno", en referencia a una lista de uno o mas elementos, debe entenderse que significa al menos un elemento seleccionado entre uno o mas de los elementos de la lista de elementos, pero no necesariamente incluyendo al menos uno de cada uno de los elementos enumerados especificamente en la lista de elementos y sin excluir ninguna combination de elementos en la lista de elementos. Esta definition tambien permite que los elementos esten opcionalmente presentes aparte de los elementos identificados especificamente dentro de la lista de elementos a los que se refiere la frase "al menos uno", esten relacionados o no relacionados con los elementos especificamente identificados. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, "al menos uno de A y B" (o, equivalentemente, "al menos uno de A o B" o, equivalentemente "al menos uno de A y/o B") puede referirse, en una realization, a al menos uno, incluyendo opcionalmente mas de uno, A, sin B presente (y opcionalmente incluyendo elementos distintos de B) ; en otra realization, a al menos uno, incluyendo opcionalmente mas de uno, B, sin A presente (y opcionalmente incluyendo elementos distintos de A) ; en otra realization mas, a al menos no, incluyendo opcionalmente mas de uno, A, y al menos uno, incluyendo opcionalmente mas de uno, B (y opcionalmente incluyendo otros elementos) , etc..
Cuando la palabra "aproximadamente" se utiliza aqui en referenda a un numero, debe entenderse que todavia otra realization de la invention incluye ese numero no modificado por la presencia de la palabra "aproximadamente".
Tambien debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método reivindicado aqui que incluya mas de una etapa o action, el orden de las etapas o acciones del método no se limita necesariamente al orden en que se describen dichas etapas o acciones del metodo.
En las reivindicaciones, asi como en la memoria descriptiva anterior, todas las frases de transición tales como "que comprende", "que incluye", "que lleva", "que tiene", "que contiene", "que implica", "que incorpora", "que esta compuesto por", y similares se entiende que son de composition abierta, es decir, para significar que incluyen, pero sin limitarse a ellos. Solo las frases de transición "que consistente en" y "que consistente esencialmente en" seran frases de transición cerradas o semi-cerradas, respectivamente, tal como se establece en el Manual de la Oficina de Patentes de Estados Unidos de Procedimientos de Examen de Patentes, Section 2111.03.
