La presente descripción se refiere a productos farmaceuticos que incluyen agentes, compuestos, composiciones y formulaciones para la modulación, preferentemente para la inhibición, de uniones en hendidura (gap-junctions, GJ) y hemicanales que son utiles, por ejemplo, para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades degenerativas de las articulaciones, tales como artritis, osteoartritis, artritis reumatoide y osteoporosis. Por lo tanto, la presente invención pertenece al campo de la medicina, en particular al campo de las enfermedades degenerativas del cartllago.
TECNICA ANTERIOR
La osteoartritis (OA) es una enfermedad degenerativa de las articulaciones que afecta principalmente al cartllago y al hueso. La osteoartritis es especialmente frecuente en personas mayores y afecta generalmente a una articulación en un lado del cuerpo. En la osteoartritis el cartllago se destruye y se desgasta, causando dolor, hinchazon y perdida de movilidad de la articulación.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistemica que, cuando se manifiesta en las articulaciones, afecta principalmente a la membrana sinovial. La artritis reumatoide comienza a edades mas tempranas que la osteoartritis, se presenta por lo general bilateralmente en las articulaciones y en ocasiones produce sensación de malestar, cansancio y fiebre.
Aunque la OA y la AR presentan etiologlas diferentes, ambas enfermedades se caracterizan por inflamación de la articulación sinovial, degeneración del cartllago y perdida de la función articular. Las causas de la OA y la AR no se entienden por completo. Mientras que la AR es una enfermedad articular autoinmune, el riesgo de desarrollar OA aumenta sustancialmente con la edad, por mediadores de la nflamación, traumatismos repetidos, diabetes, obesidad y enfermedades congenitas y de desarrollo, entre otros factores sistemicos y locales .
Los condrocitos son celulas altamente especializadas integradas en la matriz extracelular (MEC) del cartllago articular. Estas celulas confieren al cartllago articular importantes propiedades mecanicas y son responsables de la formation y remodelación del tejido durante toda la vida adulta. En el cartllago normal existe un equilibrio entre la slntesis y la degradation de la matriz. En el cartllago artrltico, en cambio, la degradación supera a la slntesis.
Los condrocitos se encuentran en pequenas cavidades conocidas como lagunas. Esta caracterlstica ha dado origen a la idea de que los condrocitos no estan conectados directamente entre si y que se comunican con otros condrocitos principalmente por difusion de sustancias en la matriz. Sin embargo, una comunicación intercelular adecuada es esencial para la organization de una respuesta oportuna y uniforme a estlmulos flsicos o biologicos o al dano celular, o simplemente para mantener la homeostasis del tejido. Se ha propuesto que la escasa capacidad regenerativa del cartllago se debe a la ausencia de vasos sangulneos y linfaticos y al aislamiento relativo de las celulas. Este, sin embargo, muy probablemente no es el caso del cartllago articular, ya que el envejecimiento reduce la densidad celular y el grosor del cartllago, el cual permite al tejido mantener su estructura y función.
El mantenimiento del equilibrio homeostatico y el funcionamiento normal de los tejidos son controlados por la interaction entre las redes comunicativas extracelulares e intercelulares. La comunicación intercelular directa, que incluye el intercambio directo de metabolitos, nutrientes, segundos mensajeros, RNA pequenos e iones, se consigue mediante uniones en hendidura (gap-junctions, GJ) , que desempenan papeles crlticos en la función y el desarrollo. Las GJ son estructuras de la membrana celular que facilitan la comunicación directa celula-celula. Un canal de union en hendidura esta formado por dos hemicanales de conexinas (Cx) , compuestos cada uno por seis subunidades de conexina. Cada hemicanal de conexinas hexamerico se acopla con un hemicanal de conexinas en la membrana opuesta para formar una unica union en hendidura. Se ha comunicado que los anales de union en hendidura estan distribuidos por todo el cuerpo. En general, las conexinas constituyen una familia de protemas denominadas usualmente de acuerdo con su peso molecular o clasificadas en función de su filogenia en las subclases alfa, beta y gamma. Se han identificado al menos hasta 21 conexinas humanas y 19 isoformas de conexinas murinas. Se ha comunicado que los diferentes tejidos y tipos celulares poseen patrones caracteristicos de expresion proteica de las conexinas.
De hecho, los cambios en los niveles proteicos de las conexinas, el estado de ensamblaje o la localization son caracteristicos de una variedad de enfermedades en las que las conexinas estan desreguladas, como trastornos degenerativos e inflamatorios, lesiones neuronales inducidas por hipoxia-isquemia, enfermedad renal cronica o fisiopatologia cardiaca. Hay algunos estudios que sugieren que las conexinas podrian desempenar un papel crucial en la curación y reparation de heridas en los tejidos conectivos. En este sentido, los cebadores de sentido contrario de la conexina 43 (Cx43) impidieron el aumento de los niveles proteicos de la conexina 43 y la regulation por aumento anormal de la conexina 43; asimismo se restablecieron las tasas normales de cierre de heridas en las celulas endoteliales de la piel y de la cornea.
En realidad, no se dispone actualmente de terapias probadas para enfermedades degenerativas de las articulaciones. Existen solo unos pocos tratamientos paliativos para controlar el dolor y la inflamación. Asi pues, los pacientes sufren de un dolor cronico intenso progresivo junto con un deterioro de la función diaria. En la terapia actual se usa una clase de farmacos conocidos como antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) para tratar las enfermedades articulares musculoesqueticas, tales como la osteoartritis, pero estas terapias presentan una serie de inconvenientes, que incluyen, en particular, enfermedades gastrointestinales, y pueden interferir tambien con la reparación y formation de cartflago. Otras alternativas recurren a intervenciones quirurgicas, tales como artroscopia y cirugia de sustitución total de la articulation con material artificial, como las protesis. Estos tratamientos paliativos, cirugias y terapias fisicas convierten a las enfermedades degenerativas de las articulaciones en una de las enfermedades mas costosas en los paises desarrollados. Pese a los avances en la comprension de los principios de los mecanismos subyacentes a las enfermedades degenerativas de las articulaciones, igue habiendo una importante demanda insatisfecha de opciones terapeuticas nuevas para el tratamiento y/o la prevención de (por ejemplo la progresion de) las enfermedades degenerativas de las articulaciones.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Con el fin de proporcionar una opción terapeutica nueva para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades degenerativas de las articulaciones, los inventores describen en la presente memoria compuestos anti-conexina para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades degenerativas de las articulaciones. De forma alternativa, la presente invención tambien se refiere al uso de un compuesto anti-conexina para la preparation de un medicamento o de una composición para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades degenerativas de las articulaciones.
Como se usa en la presente memoria, el termino "conexina" se refiere a una familia de protelnas transmembranales relacionadas estructuralmente que se ensamblan para formar uniones en hendidura en vertebrados. Cada union en hendidura se compone de dos hemicanales, o conexones, que a su vez estan formados por seis moleculas de conexina. En un aspecto, la conexina es una conexina presente de forma natural en un ser humano o animal o presente de forma natural en el tejido en el que se ha de reducir la expresion o actividad de la conexina. Como se usa en la presente memoria se entiende, pues, que la referencia a una conexina concreta es una referencia a todas las variantes de la misma en las diferentes especies, incluso aunque sus pesos moleculares sean diferentes. Asl, por ejemplo, la referencia a la "conexina 43" no solo se refiere a la conexina 43 humana sino tambien a la conexina analoga de cualquier otra especie, independientemente de si tambien pesa 43 Kd o no. De forma similar, la referencia a una "conexina 43" no humana es una referencia al analogo o la variante de conexina 43 en esa especie. Asl, por ejemplo, la referencia a la "conexina 43 de caballo" es una referencia al analogo o la variante correspondiente de la conexina 43 humana en el caballo, aun cuando no presente un peso molecular de 43 Kd. El gen de la conexina (incluida la secuencia codificante) generalmente presenta homologla con la secuencia codificante de una o mas de las conexinas especlficas mencionadas en la presente memoria, por ejemplo homologla on la conexina 43. La conexina es tlpicamente una conexina a o p. Preferentemente, la conexina es una conexina a y se expresa en el tejido que se ha de tratar. La Tabla 1 muestra las secuencias de nucleotidos y polipeptldicas de diferentes conexinas adecuadas para la presente invención.
Tabla 1. Lista de las conexinas humanas usadas en la presente invención.
Como se usa en la presente memoria, el termino "protelna" se refiere a cualquier pollmero de dos o mas aminoacidos individuales (tanto si son naturales como si no) unidos mediante enlaces peptldicos. Ademas, tal y como se usa en la presente memoria, se entiende que el termino "protelna" incluye los terminos "polipeptido" y "peptido" (que a veces se pueden usar indistintamente en la presente memoria) . De forma similar, los fragmentos, analogos, derivados y variantes de una protelna se pueden denominar "protelnas" en la presente memoria y deberan considerarse una "protelna" salvo que se indique lo contrario. El termino "fragmento" de una protelna se refiere a un polipeptido que comprende menos que todos los restos aminoacido de la protelna. Un "dominio" de una protelna tambien es un fragmento y comprende los restos aminoacido de la protelna que se requieren a menudo para conferir la actividad o función.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "compuesto anti-conexina" se refiere a aquellos compuestos que afectan o modulan la actividad, expresion o formación de una conexina, un hemicanal de conexinas (conexon) o una union en hendidura. Estos compuestos anti-conexina generalmente van dirigidos a conexinas y/o hemicanales de conexinas (conexones) o a las uniones en hendidura propiamente dichas. Los hemicanales y las uniones en hendidura resultantes que omprenden conexinas estan implicados independientemente en la liberation o el intercambio de moleculas pequenas entre el citoplasma celular y un espacio o tejido extracelular cuando estan abiertos los hemicanales, y entre el citoplasma de celulas contiguas cuando estan abiertas las uniones en hendidura. Los compuestos anticonexina incluyen, sin limitation, compuestos de sentido contrario (p.ej. polinucleotidos de sentido contrario) , anticuerpos y fragmentos de union de los mismos, asl como peptidos y polipeptidos que incluyen peptidos "peptidomimeticos" y "mimeticos" y otros compuestos, que incluyen compuestos de fosforilación de conexinas, tales como inhibidores de las Ser/Thr-fosfatasas PP1 y PP2A, tales como acido okadaico, caliculina A, dragmacidinas, microcistinas, nodularinas, tautomicina, tautomicetina, citostatinas, fosfolina, leustroducsinas, foslactomicinas, fostriecina y cantaridina, tacrolimus, ciclosporina A, tirsiferil-23-acetato, nodularina V (motuporina) , 2H-microcistina-LA, nodularina R, microcistina LR, dinofisistoxina 1 y dinofisistoxina 2; compuestos de beonzoilamino-benzopirano tales como tonabersat (sb-220453) y carabersat (sb-204269) ; fenotiazinas tales como mesoridazina, tioridazina, paroxetina, risperidona, metilfenidato, raloxifeno, minoxidil, tioridazina, haloperidol, droperidol, mesoridazina, meperidina, melperona, ditran B (JB-329) , bencilato de N-metil-3-piperidilo, promazina, triflupromazina, levomepromazina, metotrimeprazina, flufenazina, perfenazina, proclorperazina y trifluperazina; fenamatos tales como acido flufenamico y derivados, el derivado de quinina mefloquina, acido meclofenamico.
Los terminos "modulador" o "modulation" o "modular" de la actividad o expresion de conexinas, tal y como se usan en la presente memoria en sus diversas formas, se refieren a la inhibition total o, preferentemente, parcial de la expresion o action o actividad de una conexina o de un hemicanal de conexinas o de una union en hendidura de conexinas, y pueden funcionar como agentes anti-conexina.
Como se usa en la presente memoria, los "compuestos de sentido contrario" incluyen diferentes tipos de moleculas que actuan inhibiendo o disminuyendo la expresion genica, la traduction o la función, incluidos aquellos que estan dirigidos a una secuencia especlfica de mARN para aplicaciones terapeuticas. Los compuestos de sentido contrario incluyen compuestos de ADN de sentido contrario y compuestos de ARN de sentido contrario. Los oligo- y polinucleotidos anti-conexina adecuados incluyen oligo- y polinucleotidos de ARNi y oligo- y polinucleotidos de siARN. Los xpertos en la técnica conocen la slntesis de oligo- y polinucleotidos de sentido contrario y de otros oligo- y polinucleotidos anti-conexina, tales como ARNi, siARN y oligo- y polinucleotidos de ribozimas, asl como de oligo- y polinucleotidos con esqueletos modificados y mixtos. Las secuencias de sentido contrario dirigidas a dianas seleccionadas pueden o no unirse de forma no especlfica a secuencias distintas de la diana. Se prefieren las secuencias de sentido contrario con una union no especlfica minima, ausente o no detectable a secuencias distintas de la diana.
Aunque los nucleotidos de sentido contrario constituyen una forma preferida de compuestos de sentido contrario, la presente invention abarca otros compuestos oligomericos de sentido contrario que incluyen, sin limitation, mimeticos de oligonucleotidos. Los compuestos de sentido contrario incluyen ribozimas, oligonucleotidos de secuencias gula externas (EGS) (oligozimas) y otros ARN catallticos cortos u oligonucleotidos catallticos que hibridan con el acido nucleico diana y modulan su expresion. Asimismo incluyen oligodesoxinucleotidos fosforotioato (S-ODN) . Asl, los compuestos de sentido contrario incluyen, por ejemplo, las principales moleculas silenciadoras de genes basadas en acidos nucleicos, como, por ejemplo, acidos oligodesoxirribonucleicos de sentido contrario modificados qulmicamente (UUJNs;, ribozymes and siARNs (Scherer, L. J. and Rossi, J. J. Nature Biotechnol. 21: 1457-1465 (2003) . Los compuestos de sentido contrario tambien pueden incluir moleculas de sentido contrario como, por ejemplo, acidos peptidonucleicos (PNA) , morfolino-fosforodiamidatos, ADNzimas y los ARN nucleares pequenos UI mutados en el extremo 5'. El polinucleotido de sentido contrario generalmente es de sentido contrario con respecto a un mRNA de conexina, preferentemente mRNA de conexina 43, mARN de conexina 45, mARN de conexina 46, mARN de conexina 26 o mARN de conexina 32. Con mas preferencia, el polinucleotido de sentido contrario es de sentido contrario con respecto al mARN de conexina 43. Un polipeptido de este tipo puede ser capaz de hibridar con el mARN de la conexina y, por tanto, puede inhibir la expresion de la conexina interfiriendo con uno o mas aspectos del metabolismo del mARN de conexina, incluidos la transcription, el procesamiento del mARN, el transporte del mARN desde el nucleo, la traduction o la degradation del mARN. El polinucleotido de sentido contrario hibrida tlpicamente con el mARN de conexina para formar un duplex, que uede producir la inhibition directa de la traduction y/o la desestabilización del mARN.
El uso de un oligonucleotido de sentido contrario como agente terapeutico con el fin de regular por disminución la expresion genica de la conexina induciendo la degradation dependiente de enzimas del mARN complementar y se puede administrar preferentemente con ARNi suministrado mediante tecnicas nanotecnologicas y nanopartlculas y/o mediante el uso de un vector de expresion, un vector vlrico o no vlrico.
Tambien se contempla el uso combinado de polinucleotidos dirigidos a protelnas de conexina separadas (por ejemplo, dirigidos a 1, 2, 3, 4 o mas conexinas diferentes) . Por ejemplo, se pueden usar en combination polinucleotidos dirigidos a la conexina 43 y a uno o mas miembros de la familia de conexinas.
De forma alternativa, los polinucleotidos de sentido contrario pueden formar parte de composiciones que pueden comprender polinucleotidos contra mas de una protelna de conexina. Preferentemente, una de las protelnas de conexina a las que se dirigen los polinucleotidos es la conexina 43. Otras protelnas de conexina a las que se dirigen los oligodesoxinucleotidos pueden incluir, por ejemplo, las conexinas 26, 32, 45 y 46. Aunque la secuencia exacta del polinucleotido de sentido contrario usado en la invention dependera de la protelna de conexina diana, han resultado especialmente adecuados para la conexina 43 los polinucleotidos que presentan las secuencias siguientes (Tabla 2) .
Tabla 2. Secuencias del gen de la Cx43 usadas para disenar las secuencias oligonucleotldicas de sentido contrario de ARNi de Cx43.
Asimismo se contempla el uso de opligopeptidos o polipeptidos de sentido contrario contra peptidos de conexina como agentes terapeuticos, con el fin de regular por disminución la actividad del gen de la conexina. Los oligopetidos o polipeptidos de sentido contrario generalmente son de sentido contrario con respecto a una protelna de conexina, preferentemente una protelna de conexina 43, una protelna de conexina 45, una protelna de conexina 46, una protelna de conexina 26 o una protelna de conexina 32. Con mas preferencia, los oligopeptidos o polipeptidos de sentido contrario son de sentido contrario con respecto a la protelna de conexina 43. Tambien se contempla el uso combinado de polipeptidos dirigidos a protelnas de conexina separadas (por ejemplo, dirigidos a 1, 2, 3, 4 o mas conexinas diferentes) . Por ejemplo, se pueden usar en combination polipeptidos dirigidos a la conexina 43 y a uno o mas miembros de la familia de conexinas.
De forma alternativa, los polipeptidos de sentido contrario pueden formar parte de composiciones que pueden comprender polipeptidos contra mas de una protelna de conexina. Preferentemente, una de las protelnas de conexina a las que se dirigen los polipeptidos es la conexina 43. Otras protelnas de conexina a las que se dirigen los polipeptidos pueden incluir, por ejemplo, las conexinas 26, 32, 45 y 46. Aunque la secuencia exacta del polipeptido de sentido contrario usado en la invención dependera de la protelna de conexina diana, han resultado especialmente adecuados para la conexina 43 los polinucleotidos que presentan las secuencias siguientes (tablas 2) . AVESAWGDEQSAFRCN (SEQ ID NO: 31) , TQQPGCENVCY (SEQ ID NO: 32) , DKSFPISHVRFWV (SEQ ID NO: 33) , YTCKRDPCPHQVDC (SEQ ID NO: 34) y FLSRPTEKTIFIIF (SEQ ID NO: 35) .
Los terminos "peptidomimetico" y "mimetico" incluyen compuestos qulmicos naturales y sinteticos que pueden presentar sustancialmente las mismas caracterlsticas estructurales y funcionales que las regiones proteicas que mimetizan. En el caso de las conexinas, estos pueden mimetizar, por ejemplo, los bucles extracelulares de conexinas opuestas implicadas en el acoplamiento conexinaconexina y la formación del canal celula-celula y/o los bucles extracelulares de las conexinas de los hemicanales. Por ejemplo, una composition mimetica puede ser util como agente modulador de la union en hendidura si es capaz de regular por disminución las acciones o actividades biologicas de las conexinas, como, por ejemplo, impedir el acoplamiento de las conexinas para formar comunicaciones celula-celula mediadas por uniones en hendidura o evitar la apertura de las conexinas para exponer el citoplasma celular al medio extracelular. Los peptidomimeticos engloban los descritos en la presente memoria as! como los que puedan ser conocidos en la técnica, ya sean los conocidos hasta ahora o los desarrollados posteriormente.
En una realization mas preferida, el peptidomimetico se selecciona del grupo que consiste en GAP27 (SRPTEKTIFII SEQ ID NO: 52) y rotigaptide (ZP123) .
En otra realización preferida, el anticuerpo anti-conexina o el fragmento de union al antlgeno del mismo es un anticuerpo, un fragmento F (v) , un fragmento Fab, un fragmento Fab' o un fragmento F (ab') 2.
En una realization mas preferida, el anticuerpo anti-conexina se selecciona del grupo formado por anti-conexina 43, anti-conexina 45, anti-conexina 46, anti-conexina 26 o anti-conexina 32. En una realization mas preferida, el anticuerpo anti-conexina es anti-conexina 43.
En una realization preferida, los compuestos anti-conexina descritos en la presente memoria para su uso de acuerdo con la presente invention se seleccionan del grupo que consiste en un inhibidor de uniones en hendidura y/o un inhibidor de hemicanales.
Los terminos "trastorno" o "enfermedad", usados indistintamente en todo este documento, se refieren a cualquier estado patologico que se beneficiarla del tratamiento con una molecula o un compuesto o una composition de la invention, incluidos los descritos o reivindicados en la presente memoria.
La expresion "enfermedad degenerativa de las articulaciones" se refiere a un deterioro paulatino del cartllago articular que cubre las articulaciones. Una enfermedad degenerativa de las articulaciones es una enfermedad progresiva no infecciosa de las articulaciones de carga. El cartllago articular normal es liso, blanco y traslucido. Se compone de celulas cartilaginosas (condrocitos) integradas en una matriz esponjosa hecha de colageno, polisacaridos proteicos y agua. En la fase temprana de la artritis primaria el cartllago se vuelve amarillo y opaco con areas localizadas de ablandamiento y arrugamiento de las superficies. A medida que la degeneration avanza, las areas blandas se agrietan y se desgastan, exponiendo el hueso debajo del cartllago. El hueso comienza entonces a remodelarse y a aumentar su densidad mientras que el cartllago restante empieza a crisparse. Finalmente, se forman osteofitos (espolones de hueso nuevo) cubiertos por cartllago en el borde de la articulation. El cartllago necesita repararse a medida que aumenta el desgaste mecanico. Las celulas cartilaginosas son incapaces de producir suficiente matriz esponjosa y, por tanto, el cartllago danado no se puede reparar por si solo. El cartllago carece de suministro sangulneo para fomentar la curación. La mayorla de las enfermedades degenerativas de las articulaciones se deben a inestabilidades mecanicas o cambios en la articulation a causa del envejecimiento. Estas incluyen la rtritis degenerativa del anciano y, en individuos mas jovenes, pueden ser el resultado de lesiones, contusiones, configuration anormal de las articulaciones (es decir, displasia de cadera) o desgaste mecanico causado por la ruptura del ligamento cruzado anterior, luxation patelar u osteocondritis disecante, por ejemplo. La enfermedad degenerativa de las articulaciones puede aparecer en cualquier articulation del cuerpo, incluyendo sin limitation rodilla, cadera, hombro, mano y columna vertebral. Los estados incluidos en las enfermedades degenerativas de las articulaciones se seleccionan del grupo formado por osteoartritis, artritis, lesion flsica, osteoporosis, enfermedad de Paget y artritis reumatoide.
Como se usa en la presente memoria, "sujeto" se refiere a cualquier animal clasificado como mamlfero que incluye seres humanos, animales domesticos y de granja, as! como animales deportivos, de zoologicos o de companla, tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. El mamlfero preferido en este caso es un ser humano, incluidos adultos, ninos y ancianos.
Como se usa en la presente memoria, "prevention", "prevenir" significa prevenir total o parcialmente, o mitigar o controlar, o reducir o detener el progreso de un estado patologico. Como se usa en la presente memoria, una "cantidad efectiva" o "dosis efectiva" o "cantidad terapeuticamente efectiva" o "dosis terapeuticamente efectiva" en relation con las moleculas, los compuestos o las composiciones de la presente invention se refiere a la cantidad suficiente para inducir un resultado biologico, farmaceutico o terapeutico deseado. Ese resultado puede ser el alivio de los signos, slntomas o causas de una enfermedad o enfermedad o estado patologico o de cualquier otra alteration deseada de un sistema biologico. En la presente invención, el resultado implicara fomentar la curación, previniendo y/o reduciendo el dolor y/o la inflamación y los procesos degenerativos. Las invenciones descritas y reivindicadas en la presente memoria tambien pueden favorecer la reparación y regeneración del cartllago en estados patologicos tales como las enfermedades degenerativas de las articulaciones, o despues de una lesion articular.
Como se usa en la presente memoria, el termino "tratar" o "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas.
En una realization mas preferida, la enfermedad degenerativa de las articulaciones se selecciona del grupo formado por artritis, osteoartritis, artritis reumatoide, lesion flsica, enfermedad de Paget y osteoporosis.
Otro aspecto de la presente invention se refiere a una composition para su uso en el tratamiento y/o la prevention de una enfermedad degenerativa de las articulaciones, comprendiendo la composition al menos un compuesto anti-conexina como se describe en la presente memoria. De forma alternativa, la presente invention tambien describe el uso de una composition que comprende al menos un compuestos anticonexina de acuerdo con la presente invention en la production de un medicamento para la prevention y/o el tratamiento de una enfermedad degenerativa de las articulaciones.
El termino "medicamento", "composition" o "composition farmaceutica" hace referencia a una composition que comprende al menos un principio activo, siendo la composición susceptible de investigación en cuanto a un efecto especificado y eficaz en un mamlfero (por ejemplo y sin limitation, un ser humano) . Los expertos normales en la técnica entenderan y reconoceran las tecnicas apropiadas para determinar, en función de las necesidades del experto, si un principio activo presenta el efecto eficaz deseado.
El compuesto anti-conexina puede estar presente en una forma sustancialmente aislada. Se entendera que el producto puede mezclarse con portadores o diluyentes que no interfieran con el fin para el cual esta previsto el producto y considerarse todavla sustancialmente aislado. Los terminos "portador" y "diluyente" se refieren a cualquier portador y diluyente farmaceutico que no induzca por si mismo la production de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composition y que se pueda administrar sin excesiva toxicidad.
En una realization preferida, la composition de la invention comprende asimismo un excipiente, vehlculo o adyuvante farmaceutico aceptable.
La expresion "excipiente farmaceutico aceptable" o "vehlculo farmaceutico aceptable" o "adyuvante farmaceutico aceptable" como se usa en la presente memoria se refiere aditivos utiles para convertir los compuestos farmacologicamente activos en formas farmaceuticas que sean adecuadas para la administration a los pacientes. Los excipientes, vehlculos o adyuvantes adecuados incluyen cargas, aglutinantes, disgregantes, agentes tensioactivos, lubricantes, fluidificantes y colorantes. Tambien se pueden incluir otros excipientes, vehlculos o adyuvantes farmaceuticamente aceptables.
Los compuestos y composiciones anti-conexina se pueden administrar solos o en combinación con otros agentes terapeuticos o principios activos en o alrededor del lugar afectado, por ejemplo por aplicación topica, instilación o inyección, por ejemplo inyección peritendinal, inyección en tejido blando, inyección intraarticular e inyección periarticular. Los compuestos y composiciones anti-conexina tambien se pueden administrar solos o en combination con otros agentes terapeuticos usando tecnicas interoperatorias. La administración tambien puede realizarse por inyección o de forma interoperatoria en capsulas articulares o cavidades oseas. Las composiciones de agentes anti-conexina se pueden administrar en monoterapia, concomitantemente o de forma intraoperatoria.
En una realization mas preferida, la composition de la invention comprende asimismo un segundo principio activo. En una realización mas preferida, el segundo principio activo se selecciona del grupo formado por: analgesicos, antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) y terapias intraarticulares, como corticosteroides y acido hialuronico. En una realización mas preferida, el segundo principio activo se selecciona de la lista que comprende: paracetamol, inhibidores especlficos de la ciclooxigenasa-2, tramadol, opiaceos, AINE, AINE topicos, capsaicina, salicilato topico, esteroides intraarticulares, acido hialuronico intraarticular y glucosamina y condroitina.
Los compuestos anti-conexina y la composición de la invención se pueden administrar en dosis unicas o divididas. Las dosis se pueden administrar una sola vez, o la aplicación se puede repetir. Tlpicamente, la aplicación se repetira semanalmente o cada dos semanas, o mensualmente o con otra frecuencia que podra ser determinada por los expertos. La administración de el/los agente (s) anticonexina, por ejemplo para la regulation por disminución de la expresion de onexina o el bloqueo o la inhibition de la apertura o la actividad de la conexina, modula, por tanto, la comunicación entre celulas, o la perdida hacia el espacio extracelular en el caso de regulation de las conexinas, y minimiza las perdidas o lesiones adicionales de celulas o las consecuencias de las lesiones.
Las vlas de administration y las dosificaciones descritas en la presente memoria solo pretenden ser orientativas, puesto que un medico experto determinara la via de administración y la dosificación optimas para cada paciente y estado patologico concreto. En cualquiera de los procedimientos para el tratamiento de un sujeto con una enfermedad degenerativa de las articulaciones mencionada o descrita en la presente memoria se puede usar la administración de cualquiera de las dosis, formas farmaceuticas, formulaciones y/o composiciones descritas en la presente memoria.
En otra realization preferida, las composiciones proporcionadas en la presente memoria se encuentran preferentemente en solution o suspension esteril, o en otras formulaciones farmaceuticamente aceptables. La composition proporcionada en la presente memoria se puede aplicar directamente sobre el tejido afectado o enfermo, o preferentemente se adapta para la administración intraarticular y/o sistemica o parenteral. Las administraciones sistemicas pueden incluir, sin limitation, inyecciones intramusculares, intravenosas o subcutaneas, o la adsorción directa hacia la circulation sangulnea por administración no gastrointestinal transmucosal, por ejemplo sublingual.
En la realización mas preferida, los compuestos o las composiciones proporcionados en la presente memoria se adaptan para la inyección directa en un tejido diana, por ejemplo un tendon, un ligamento o un hueso, o se pueden adaptar para la aplicación directa sobre el tejido diana, por ejemplo en un gel o un material pastoso, para mejorar y/o prolongar el contacto con el tejido diana.
En otra realización preferida, la composición de la invention se formula para la inyección directa en el tejido enfermo. En una realización mas preferida, el tejido enfermo se selecciona del grupo formado por: cartllago articular, membrana sinovial y hueso subcondral.
El agente terapeutico se puede administrar por inyección intraarticular, periarticular, peritendinal o en tejido blando. El agente terapeutico se puede inyectar en dosis unica o en dosis multiples. Se contempla que los procedimientos y la composition descritos en la presente memoria incluyan la administration usando diversos procedimientos conocidos en la técnica o desarrollados posteriormente, incluyendo, por ejemplo, tecnicas laparoscopicas. Ejemplos de estas tecnicas pueden incluir tecnicas intraoperatorias y/o inyección directa. Estas tecnicas pueden facilitar el suministro del farmaco en forma de liberation prolongada, logrando una mejor biodisponibilidad y/o distribution, lo cual mejora la eficacia terapeutica.
En otra realization preferida, la composición de la invention se usa para la prevention y/o el tratamiento de la enfermedad degenerativa de las articulaciones. En una realización mas preferida, la enfermedad degenerativa de las articulaciones se selecciona del grupo formado por artritis, osteoartritis, lesion flsica, enfermedad de Paget, artritis reumatoide y osteoporosis.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad degenerativa de las articulaciones, que comprende la administración de una dosis terapeuticamente efectiva de un compuesto anti-conexina o de la composición descrita en la presente memoria a un paciente que lo necesite.
En una realización preferida, el procedimiento de la invención puede ser preferentemente la administración directa en el tejido enfermo. En una realización mas preferida, la administración es intraarticular, periarticular o peritendinal.
En otra realización preferida del procedimiento de la invención, la enfermedad degenerativa de las articulaciones se selecciona del grupo formado por artritis, osteoartritis, lesion flsica, enfermedad de Paget, artritis reumatoide y osteoporosis.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades degenerativas de las articulaciones. El kit puede incluir una o mas composiciones descritas en la presente memoria. Por ejemplo, el kit puede incluir una composición que comprende al menos una cantidad terapeuticamente efectiva e un compuesto anti-conexina como se describe en la presente memoria o combinaciones de los mismos.
A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En la practica de la presente invención se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones, no pretende excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o etapas. Objetos, ventajas y caracterlsticas adicionales de la invención se haran evidentes para los expertos en la técnica tras el examen de la description, o pueden aprenderse por la practica de la invención. Los siguientes ejemplos, dibujos y listado de secuencias se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Fotograflas de cortes de cartllago congelados de donantes sanos y de sujetos afectados por OA, que muestran que la protelna Cx43 se expresa en exceso en el cartllago articular de los pacientes con OA. La expresion de Cx43 se analizo mediante ensayos inmunohistoqulmicos (IHC) .
Figura 2. Fotografla de una muestra de cartllago de un paciente con OA tenida con safranina O/verde solido. El grafico muestra la expresion de ARN de Col2AIIB, Col2AIIA, MMP3 y MMP9 en muestras de cartllago del paciente con OA. Se muestra que la inhibition de los canales de conexina en el cartllago del paciente con OA conduce a la expresion del gen de colageno tipo II anabolico y a la disminución de la expresion de los factores catabolicos tales como MMP3 y MMP9.
La figura 3 muestra que la inhibición de los canales de conexina regula el fenotipo de los condrocitos osteoartrlticos inhibiendo la proliferation celular y reduciendo la expresion de mediadores catabolicos (A) , y provoca una disminución de la expresion de la ciclina D1 (CCND1) y un aumento de la expresion de los inhibidores del ciclo celular p21 (Cip1) de los condrocitos osteoartrlticos (B y C) . Ademas, el tratamiento e los condrocitos primarios humanos con 1-octanol aumenta la expresion de colageno tipo II y reduce la expresion de MMP3 (B y C) .
EJEMPLOS
La presente invention se describira con mas detalle mediante ejemplos. Los ejemplos pretenden ser ilustrativos y el alcance de la presente invención como se expone en las reivindicaciones adjuntas no esta limitado a o por los ejemplos.
Materiales y metodos
1.1 Obtención y procesamiento del cartilago
Se obtuvieron muestras de cartilago articular de rodilla y de la cabeza del femur de sujetos adultos sometidos a cirugla articular. Todos los sujetos firmaron un formulario de consentimiento informado y el comite de etica de la institution aprobo el estudio (codigo de registro del CAEIG de Galicia: 2012/094-PI13/00591 y 2016/349-PI16/00035) . Las muestras de cartilago se congelaron inmediatamente in situ en Cr y omold® Standard usando el compuesto Tissue-Tek® O.C.T.™ (Sakura Finetec, Holanda) e isopentano en nitrogeno llquido y se almacenaron a -80 °C. El cartilago de sujetos sanos se obtuvo in situ de individuos sin antecedentes de enfermedad articular que hablan sufrido una fractura de rodilla o de cadera. Las muestras sanas se asignaron en base a los datos de sus historiales medicos y el estudio histologico. Las muestras histologicas (sanas y OA con diagnostico radiologico) se clasificaron según la escala de Mankin modificada. Las muestras (pacientes con OA y sujetos sanos de la misma edad) se dividieron en cuatro grupos: normal/sano (puntuación = 0-1) ; OA temprana (puntuación 2-3) , denominada de grado I; OA leve (puntuación = 4-5) , denominada de grado II; OA moderada (puntuación = 6-7) , denominada de grado III; y OA grave, denominada de grado IV (puntuación = 8-13) . Se prepararon muestras de cartilago de 4 mm a partir de explantes de cartilago que se cortaron en el quirofano inmediatamente despues de la cirugla. Las muestras se cultivaron durante la noche en placas de cultivo de 48 pocillos en DMEM con 15% de FCS que contenla 1-octanol 1 mM (Sigma) como compuesto anti-canales de conexina y se incubaron durante 17 horas. Para el aislamiento y el cultivo de los condrocitos rimarios se lavo un cartliago recien extraldo con solución salina y se aislaron las celulas. Brevemente, las celulas (2, 5 millones) se sembraron en matraces de 162 cm2 y se incubaron a 37 °C en 5% de CO2 y aire en DMEM suplementado con 100 pg/ml de Primicin™ (InvivoGen, San Diego, EE.UU.) y 15% de FCS hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente 80-90%. Los condrocitos se usaron en los experimentos durante la tercera o cuarta semana de cultivo primario.
El 1-octanol es un alcanol de cadena larga y un conocido bloqueante de canales de conexina que reduce la conductancia intercelular e inhibe rapidamente los canales y hemicanales de las uniones en hendidura.
1.2 Procesamiento del tejido y ensayos inmunohistoquimicos (IHC)
Los cortes de cartllago se cortaron en serie (4 mm) a -20°C en un criostato (Leica CM 1510) . Los cortes de tejido se fijaron con acetona durante 10 min a 4°C, se secaron a temperatura ambiente (TA) y se lavaron durante 10 min con PBST (PBS con 0, 1% de Tween 20, pH 7, 6) . Antes de la tinción se inhibio la actividad peroxidasa endogena por incubación con H2O2 y metanol durante 10 min. A continuation, las celulas se lavaron una vez con PBST y se aplico durante 1 h a TA el anticuerpo primario anti-Cx43 (sc-6560) obtenido de Santa Cruz Biotechnology. Despues de lavarlos tres veces con PBST durante 10 min cada vez, los cortes se incubaron durante 1 h con un pollmero marcado con peroxidasa y conjugado con una Ig de cabra dirigida contra Ig de raton/conejo (Dako, Dinamarca) . Despues de tres lavados con PBST se revelo la actividad peroxidasa usando una solución recien preparada de cromogeno como sustrato que contenla tetrahidrocloruro de 3, 3-diaminobenzidina y H2O2 (Dako, Dinamarca) . Los cortes se lavaron en agua destilada, se contratineron con hematoxilina de Gill, se deshidrataron paulatinamente con alcohol de diferentes grados y se montaron en xileno con Depex (Serva, Alemania) . Se realizaron controles negativos (omitiendo el anticuerpo primario) para probar la especificidad de cada anticuerpo. Los cortes de tejido tambien se contratineron con hematoxilina de Gill. Los portaobjetos se visualizaron usando un microscopio Olympus BX61 y una camara digital DP71 (Olympus) . El calibrado de las imagenes se efectuo con el software AnalySISD V.5.0 (Olympus Biosystems, Hamburgo, Alemania) .
1.3 Ensayo de proliferation celular
La progresion del ciclo celular se midio mediante citometria de flujo usando tinción con yoduro de propidio (PI) para detectar el contenido total de ADN. Las celulas se recogieron con tripsina, se fijaron en etanol frio al 70% y se almacenaron a 4°C durante 12-24 horas. Las celulas se lavaron por centrifugación (2000 rpm, 15 minutos) en PBS frio. Tras la centrifugación, el sobrenadante se desecho y el sedimento se resuspendio en una solución que contema 4 mg/ml de RNasa, 1 mg/ml de PI y se incubo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se analizaron 20 x 104 celulas mediante BD FACScalibur™ de BD biosciences.
1.4 Aislamiento de ARN y ensayo de PCR en tiempo real
Los condrocitos primarios cultivados se recuperaron por tripsinización. Por otra parte, las muestras de cartflago articular se digirieron en tampon de digestion (200 mmol/l de Tris-HCl, 200 mmol/l de NaCl, 5% de SDS y 100 mmol/l de citrato sodico) que contema proteinasa K. Se anadio a la muestra el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total se trato con DNasa (DNasa libre de RNasa, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para asegurar la degradation completa del DNA en la muestra. Se sintetizo cDNA a partir de 1 qg de ARN mediante el kit de smtesis de cDNA Superscript® VILO™ (Invitrogen) . El cADN se diluyo 10 veces y la PCR en tiempo real se realizo con 5 ql de cDNA con los cebadores enumerados en la tabla 3 y SyBR-Green (Roche) en el LightCycler 480 Instrument Roche Applied Science. El cADN se amplifico a 95°C durante 10 minutos, a 95°C durante 10 segundos, a 60°C durante 10 segundos y a 72°C durante 12 segundos a lo largo de 45 ciclos, y seguidamente a 72°C durante 5 minutos.
Tabla 3. Cebadores usados en los ensayos de PCR en tiempo real
Ejemplo 1. Identificación de Cx43 como factor inductor de la degeneración del cartilago.
La Cx43 se expresa normalmente en varios tejidos normales, que incluyen osteocitos, osteoblastos, condrocitos y celulas sinoviales. Como se muestra en la Figura 1, la Cx43 se localizo alrededor de los condrocitos y en todas las capas de cartilago articular. Se analizaron las muestras de cartilago con diferentes grados de OA. Los ensayos IHC del cartilago OA mostraron que la Cx43 se localiza en la membrana (zona circundante) y en todo el citoplasma y el nucleo. El cartilago OA mostro niveles de la protelna Cx43 mayores que el cartilago sano. Los portaobjetos se visualizaron bajo un microscopio Olympus BX61 con una camara digital DP71 (Olympus) . El calibrado de las imagenes se efectuo con el software AnalySIS 5.0 (Olympus Biosystems, Hamburgo, Alemania) . La tinción se examino bajo el microscopio optico a 100x aumentos con barras de escala a 50 pm.
Ejemplo 2. La inhibición de la comunicación intercelular a traves de uniones en hendidura (GJIC) ejerce un efecto protector frente a la producción de factores catabolicos en los condrocitos articulares.
La perdida progresiva de cartilago articular incluye la regulación por aumento de las nzimas que degradan la matriz extracelular, tales como las metaloproteinasas (MMP) . La MMP9 y la MMP3, al degradar colageno y otras protelnas de la matriz extracelular, desempenan un papel crltico en la homeostasis de la MEC.
Con el fin de demostrar que la regulation por disminución de la Cx43 o de las GJ protege frente a los factores catabolicos en el cartllago OA, se prepararon muestras de cartllago de 4 mm a partir de explantes obtenidos de pacientes con OA que se cortaron en el quirofano inmediatamente despues de la cirugla. Las muestras se cultivaron durante la noche en placas de cultivo tisular de 48 pocillos con 1 ml de DMEM con 15% de FCS que contenla 1-octanol 1 mM (Sigma) como compuesto anticonexina 43 y se incubaron durante 17 horas. La imagen proviene de un explante de cartllago articular de un paciente con OA de grado I. Los resultados presentados en la Figura 2 muestran que la inhibition de los canales de conexina induce una disminución de la expresion de MMP3 y MMP9 y un aumento de la expresion de colageno tipo II de mas del doble. La zona superficial danada, afectada por la perdida de proteoglicanos, se tine de verde por la absorción de safranina O/verde solido.
En el analisis de expresion genica mediante RT-PCR en tiempo real del RNA aislado de explantes de cartllago se observa que el 1-octanol aumenta la expresion de colageno tipo II y reduce la expresion de MMP3 y MMP9. Estos resultados muestran los efectos beneficiosos del compuesto anti-conexina en los condrocitos articulares de pacientes con OA.
Ejemplo 3. La inhibición de los canales de uniones en hendidura reduce la proliferation celular de los condrocitos.
Las celulas se aislaron de explantes de cartllago de pacientes con OA y se cultivaron durante 3-4 semanas a 37 °C como se ha descrito en materiales y metodos. Los condrocitos se cultivaron durante 48 horas sin suero para aumentar la proportion de celulas en la fase G0/G1 (70-80%) . Al cabo de 48 horas se anadieron al medio 1-octanol 1 mM y suero (15% de suero fetal bovino, FCS) como se muestra en la Figura 3.
La distribution durante las diversas fases del ciclo celular (contenido de ADN) se midio despues de 17 horas de tratamiento por citometrla de flujo usando 1 mg/ml de yoduro de propidio (IP) . El numero de celulas en cada fase del ciclo celular se muestra en porcentajes (Figura 3A) . En ausencia de 1-octanol, las celulas atraviesan el ciclo celular. Sin embargo, el ~ 60% de las celulas tratadas con octanol permanecieron durante 17 horas en un estado de detention del ciclo celular en G0/G1. Los resultados mostrados en la Figura 3 demuestran que la inhibition de la GJIC usando 1-octanol 1 mM durante 17 horas inhibe la progresion del ciclo celular de los condrocitos en cultivo primario.
Ademas, el analisis de la expresion de reguladores del ciclo celular en G1 revelaron que el 1-octanol aumenta la expresion del inhibidor p21 de cdk y reduce la expresion de la protelna nuclear necesaria para la progresion del ciclo celular, la ciclina D1 (CCND1) . El analisis de la expresion de factores anabolicos/catabolicos confirmo que el 1-octanol aumenta la expresion de colageno tipo II y reduce la expresion del gen de MMP3 (Figura 2B) .
En la Figura 3C se muestran asimismo los resultados obtenidos cuando las celulas se cultivaron previamente en ausencia de suero. La Figura 3C muestra el analisis de la expresion genica de las celulas cultivadas durante 17 horas en presencia de 15% de FCS y 1-octanol.
En resumen, los datos mostrados en la presente memoria han demostrado que los individuos que sufren de artritis o presentan una lesion articular y/o dano del cartllago experimentan un aumento continuo de la expresion de Cx43 que desencadena cambios fenotlpicos, proliferation celular y un aumento de la slntesis de protelnas, acompanado por un aumento de las MMP y otras enzimas que degradan la matriz extracelular. La action continuada de MMP, ADAMTS y otras proteasas produce la degradation y/o la perdida del cartllago. El tratamiento de pacientes susceptibles de sufrir artritis y/o degeneration del cartllago con compuestos anti-conexina, preferentemente con compuestos anti-conexina 43, induce la recuperation del fenotipo original y la activation de los mecanismos implicados en la regeneration del cartllago y la reparation del tejido, inactivando la proliferation celular, la slntesis de actores catabolicos y la propagation y transmision de mediadores de la inflamación y otras senales toxicas a traves de los canales GJ.
