Procedimiento para el incremento de produccion de lipasa en cultivos de Halomonas
mediante induccion qui'mica y biologica.
SECTOR DE LA TECNICA
La presente invencion se enmarca en el campo de la microbiologia industrial, mas especificamente en la produccion de biomoleculas a partir de microorganismos extremofilos. Debido a que uno de los mayores problemas de la sintesis enzimatica a partir de este tipo de microorganismos radica en los bajos niveles de actividad logrados, 10 se pretende incrementar, mediante induccion quimica y/o biologica, los bajos niveles de produccion de lipasa de una cepa halofila aislada recientemente en el sur de Espana, Halomonas sp LM1C (Gutierrez-Arnillas et al., 2016, New sources of halophilic lipases: Isolation of bacteria from Spanish and Turkish saltworks, Biochem. Eng. J. 109, 170-177) , demostrando su viabilidad a escala matraz y biorreactor. La lipasa producida mediante 15 este procedimiento puede ser empleada en la industria alimentaria, textil, farmaceutica, de detergentes y de papel, en la produccion de biodiesel y de cosmeticos y en el tratamiento de aguas residuales (Daiha et al., 2015, Are Lipases Still Important Biocatalysts? A Study of Scientific Publications and Patents for Technological Forecasting, PLoS ONE 10 (6) ).
ESTADO DE LA TECNICA
El informe "Lipase Market by Source (Microbial Lipases, Animal Lipases) , Application (Animal Feed, Dair y , Baker y , Confectioner y , Others) , & by Geography (North America, Europe, Asia-Pacific, Latin America, RoW) - Global Forecast to 2020", elaborado por MarketsAndMarkets®, preve que el mercado de lipasas llegue a casi 600 millones de 25 dolares en el ano 2020, con una tasa de crecimiento anual compuesto (CAGR, Compound annual growth rate) de 6, 5% entre 2015 y 2020. Las lipasas (EC 3.1.1.3) son catalizadores con un alto grado de especificidad y velocidad de reaccion, cuya principal funcion es la hidrolisis de trigliceridos. Ademas, en medios con baja actividad de agua, ejercen su funcion catalitica en reacciones de esterificacion, transesterificacion e
interesterificacion. La versatilidad de estas enzimas permite su diversification en numerosos sectores industrials, impulsando su exito mundial. El desarrollo industrial promueve la demanda de lipasas por parte de la industria de detergentes, alimentaria, textil, farmaceutica, cosmetica, petroquimica, entre otras. Del mismo modo, nuevos sectores emergentes, como el de los biocombustibles, estan desarrollando nuevas tecnicas de produccion mas sostenibles gracias al empleo de las lipasas {Houde et al., 2004, Lipases and their industrial applications: An overview, Appl. Biochem. Biotechnol. Part A Enzym. Eng. Biotechnol. 118, 155-170).
Las empresas h'deres en el mercado de lipasas como Novozymes® (Dinamarca) , Koninklijke DSM N.V.®, (Holanda) , Chr. Hansen Holdings A/S® {Dinamarca) , y £. I. Du Pont de Nemours and Company® (Estados Unidos) , orientan sus esfuerzos a la busqueda de nuevas fuentes de produccion mas competitivas asi como nuevas aplicaciones. Aunque existen lipasas de origen animal y vegetal, se ha demostrado que las lipasas microbianas presentan un mayor interes debrdo a ventajas tales como su gran diversidad catali'tica, sus elevados rendimientos, y la posibilidad de mejorar la competitividad de los procesos de produccion mediante la modification genetica o la utilizacion de residuos como sustratos (Sangeetha et al., 2011, Bacterial lipases as potential industrial biocatalysts: An overview, Res. J. Microbiol., 1-24).
La necesidad de nuevas enzimas mas resistentes, que mantengan su capacidad de catalisis en condiciones extremas habitualmente encontradas en los procesos industriales, ha promovido el interes de buscar nuevos organismos productores entre los extremofilos. La mayoria de ellos son microorganismos que pueden ser clasificados atendiendo al tipo de condiciones extremas en las que habitan. Asi, los organismos termofilos o psicrofilos son aquellos con un optimo de temperatura de crecimiento superior a 60 °C o por debajo de 15 °C, respectivamente. De igual modo, se han encontrado organismos sobreviviendo a presiones por encima de 130 MPa (piezofilos) , mientras que los organismos radiofilos como Deinococcus radiodurans soportan elevados niveles de radiacion (Rothschild and Mancinelli, 2001, Life in extreme environments, Nature 409, 1092-1101). Atendiendo a su supervivencia en habitats con niveles altos (> 9) y bajos (cerca de 0) de pH, son tipicos los alcalofilos y acidofilos, respectivamente, y aquellos organismos que son capaces de crecer en ambientes con
bajo contenido en agua se clasifican como xerofllos. Por ultimo, los organismos halofilos se desarrollan a concentraciones elevadas de sal (entre 2 y 5 M de NaCI) {Kamekura et al., 1998, Diversity of extremely halophilic bacteria, Extremophiles 2, 289-295).
Como ya se ha mencionado, el principal atractivo de estos microorganismos radica en su capacidad de sintetizar enzimas que permanecen activas al operar en las condiciones extremas en las que el microorganismo es capaz de desarrollarse. En este sentido, las haloenzimas ejercen su accion catalftica no solo a altas concentraciones de sal sino tambien en presencia de disolventes organicos y temperaturas elevadas (Oren, 2010, Industrial and environmental applications of halophilic microorganisms, Environ. Technol. 31, 825-834). Aparte de estas caracteristicas, la diversidad filogenetica observada en halofilos, que induye desde archaeas, bacterias y hongos hasta protistas, protozoos y algas, es otro atractivo para asegurar la existencia de enzimas con caracteristicas adecuadas para una determinada aplicacion.
Una de las ventajas de la produccion microbiana de lipasa es que el medio de cultivo y las condiciones operacionales pueden ser optimizados para maximizar la biosintesis enzimatica. Sin embargo, en la mayoria de los casos los niveles de produccion son bajos y es necesario el empleo de agentes inductores que generan aumentos en la produccion enzimatica en los cultivos microbianos (Benjamin and Pandey, 1996, Optimization of liquid media for lipase production by Candida rugosa, Bior.Technol., 55, 167-170). La eleccion del agente inductor se realiza en base a la enzima de interes. La mayoria de las sustancias empleadas utilizadas como inductores en cultivos microbianos son quimicas o bien de naturaleza organica, de cualquier modo, se trata de un aumento en los costes de produccion. En el caso de las lipasas, diversos estudios muestran buenos resultados de induccion con compuestos de naturaleza lipidica.
Los agentes inductores se pueden diferenciar en funcion del mecanismo de accion. En la mayoria de los casos el inductor empleado tiene efecto directo en la actividad catalftica. De modo que, los inductores ampliamente utilizados en la produccion de lipasas son fos acidos grasos, los trigliceridos y algunos esteres. En el caso de los acidos grasos, existe una relacion entre el tamano de cadena y la produccion enzimatica. Se observa una mayor actividad lipolitica con el aumento de la longitud de la cadena, pudiendo estar relacionada con la solubilidad de los acidos grasos en el agua y el fenomeno de la activacion interfacial. Tambien, se ha observado que los acidos grasos inducen mayores niveles de produccion en comparacion con otros compuestos de naturaleza lipidica (Obradors et al., 1993, Effects of different fatty acids in lipase 5 production by Candida rugosa, Biotechnol. Letters, 15, 357-360). Los trigliceridos como el aceite de oliva, de girasol, de palma, de coco, de mai'z, etc., exhiben buenos resultados en cultivos para la produccion de lipasas {Gulati R, Saxena RK, Gupta et al., 1999, Parametric optimisation of Aspergillus terreus lipase production and its potential in ester synthesis, Proc. Biochem., 35, 459-464). Por otro lado, otros compuestos que 10 pueden contribuir a aumentar la actividad lipolitica extracelular debido a su capacidad para aumentar la permeabilidad de la membrana celular y facilitar la liberacion de las enzimas al medio, son los surfactantes (Dominguez et al., 2003, Effect of lipids and surfactants on extracellular lipase production by Yarrowia lipolytica, J. Chem. Technol. and Biotechnol., 78, 1166-1170).
Este tipo de induccion mediante un agente quimico es ampliamente utilizada y en muchos casos el aumento de los costes es equilibrado con los resultados obtenidos de produccion enzimatica. Sin embargo, existe otro metodo de induccion que puede sustituir o bien coexistir con la induccion quimica. La induccion biologica ha sido ampliamente estudiada en la produccion de lacasas y permite un aumento de los niveles 20 de produccion de lacasas mediante cultivo mixtos (Consejo Superior de Investigaciones Cientificas. Metodo para el incremento de la produccion de lacasa en Coriolopsis mediante un inductor biologico. Patente espahola 2 365 460, ). Sin embargo, no existe referencia acerca de procesos de induccion biologica en cultivos microbianos para la produccion de lipasas. En realidad, la ausencia de estudios centrados en el campo 25 de las lipasas halofilas ha impedido hasta la fecha su comercializacion a gran escala. Por ello, la investigation de agentes inductores de la actividad lipolitica y la implementation a escala biorreactor de cultivos de produccion de lipasa halofila es crucial para contribuir al desarrollo de nuevos procesos cataliticos con menor impacto ambiental que los metodos convencionales.
En un aspecto de la presente invention se refiere a un proceso de production de lipasa por la bacteria del genero Halomonas mediante la induction qui'mica comprende las siguientes etapas:
a) diseno del medio de cultivo mediante la adicion del agente quimico;
b) preparacion del inoculo de Halomonas;
c) crecimiento de un cultivo puro de Halomonas y produccion de lipasa en presencia del agente quimico.
La composition base del medio de cultivo es (CECT 17 modificado) :
7, 5 g/L de peptona de caseina, 10, 0 g/L de extracto de levadura, 3, 0 g/L de citrato
trisodico, 2, 0 g/L de KCI, 20g/L de MgSCV7H20, 0, 05 g/L de FeS04-7H20, 0, 25 mg/L de MnS04-4H20 y 150, 0 g/L NaCI.
Es conveniente destacar que la composicion base del medio de cultivo puede sufrir ciertas modificaciones en funcion del tipo de induccion elegida, es decir, dependiendo 15 del tipo de induccion, qui'mica o biologica, se puede optar por el empleo de otras composiciones base del medio de cultivo distintas al listado en el parrafo anterior.
En una realization particular de la invencion, la induccion quimica se realizara mediante un agente quimico, que esta presente en una concentration entre 0, 5-2 gr de inductor por litro de disolucion de medio de cultivo. Los agentes quimicos empleados pueden ser:
a) acidos grasos de formula I, como por ejemplo el acido pentadecanoico que corresponde al acido con n = 13.
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b) Tambien se puede utilizar glicerol o variantes como los trigliceridos con formula II. La composicion de los trigliceridos en terminos de acidos saturados (x) , 25 monoinsaturados (y) y polinsaturados (z) implica mas o menos efecto inductor en la
produccion de lipasas. Por ejemplo, el aceite de girasol con mayor porcentaje de acidos saturados que insaturados exhibe un elevado grado de induccion.
** (Ver fórmula) **
Atendiendo a la naturaleza hidrofobica de la mayorla de estas sustancias lipi'dicas, se 5 utiliza un surfactante que permita elevar la biodisponibilidad del inductor en el medio. Los agentes surfactantes seleccionados y de los cuales tambien se emplean como agentes inductores de forma individual son los surfactantes no ionicos de formula (III) , donde n es un numero entero que se selecciona de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, que contienen la estructura polioxietilen 4- (tert-octil) -fenil eter. Algunos de ellos son conocidos por su 10 nombre comercial, por ejemplo el eter con n = 9 o 10 es conocido comercialmente como Triton® X-100, Nonidet® P-40 o IGEPAL®.
(Ill)
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c) 0 bien, surfactantes no ionicos de formula (IV) conocidos comercialmente como polisorbato 80 6 Tween® 80, o surfactantes de formula (V) , comercialmente 15 conocidos como polisorbato 20 o Tween® 20
** (Ver fórmula) **
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Durante el procedimiento de produccion de lipasas mediante induccion qut'mica, al medio CECT17 modificado se afiade el agente qui'mico seleccionado y se lleva a cabo la esterilizacion a 120 °C durante 20 mrnutos.
En otro aspecto de la invention, la induccion biologica comprende las siguientes etapas:
a) preparation del medio de cultivo;
b) preparation del inoculo de Halomonas;
c) crecimiento de un cultivo y produccion de lipasa en un cultivo mixto compuesto de Halomonas y del agente microbiano inductor;
donde el cultivo mixto de Halomonas y agente inductor se prepara en la etapa b) de preparation del inoculo o bien en la etapa c) de crecimiento del cultivo donde el microorganismo inductor se anade tras un tiempo de crecimiento del microorganismo Halomonas.
En una realization preferente, para la induccion biologica se pueden emplear especies 15 de microorganismo pertenecientes a los generos Acinetobacter, Actinopolyspora, Alteromonas, Arhodomonas, Bacillus, Chromohalobacter, Dichotomicrobium, Dunaliella, Exiguobacterium, Flavobacterium, Haloarcula, Halobacillus, Halobacterium, Halobaculum, Halococcus, Haloferax, Halomonas, Halorhabdus, Halorubum, Haloterrigena, Halothermothrix, Halovibrio, Marinobacter, Marinococcus, Natrialba, 20 Natronobacterium, Natronococcus, Natronomonas, Nesterenkonia, Nocardiopsis, Ocenoabacillus, Pelagibacterium, Pseudalteromonas, Pseudomonas, Salinicoccus, Salinivibrio, Spirochaeta, Staphylococcus, Tetragenococcu, Vibrio u otro microorganismo capaz de crecer en concentraciones elevadas de sal: 10-15% de NaCI.
Durante el procedimiento de produccion de lipasas mediante induccion biologica, el 25 medio CECT17 modificado se esteriliza a 120 °C durante 20 minutos.
En una realizacion mas preferente, el inoculo de microorganismos del genero Halomonas (2-5 % v/v) se afiade al medio de cultivo seleccionado, esterilizado y atemperado. En el caso de la induccion biologica, se puede hacer un cultivo mixto inoculando celulas activas del genero Halomonas y del microorganismo inductor con 5 una concentration 2-5 % v/v, o bien se puede anadir inoculo del organismo inductor (25 % v/v) tras un tiempo de crecimiento del organismo del genero Halomonas.
El crecimiento del cultivo de celulas del genero Halomonas se puede realizar en matraces Erlenmeyer de 50-2.000 mL, los cuales seran tapados con tapon de celulosa que permita la aireacion pasiva. El cultivo realizado en este tipo de recipientes se llevara 10 a cabo en shakers que permitan controlar la temperatura (10-40 °C) y la agitacion (50200rpm). Otro tipo de vasija para el cultivo de Halomonas puede ser un biorreactor con diferentes configuraciones: tipo air-lift o tipo tanque con agitacion mecanica. En ambos casos, el volumen de trabajo puede ser de 1-10 L y estar conectados a una unidad de control que permite fijar la velocidad de agitacion (50-700 rpm) , la aireacion (0, 25-1 15 wm) y la temperatura de operation (10-40 °C).
Para evitar la formation de espuma se adiciona un antiespumante que puede ser del tipo emulsion de un polimero de silicona activa y un emulsionante no ionico. La adicion de dicho antiespumante se puede realizar de forma automatica mediante una sonda de detection de espuma en el interior de las vasijas de cultivo conectada a un controlador 20 que permita regular los ciclos de bombeo del antiespumante a la vasija de reaccion.
Durante crecimiento del cultivo y produccion de lipasa en presencia del agente qui'mico o biologico, el control de la biomasa y la actividad lipolitica comprende:
a) medir la biomasa y la actividad lipolitica tomando muestras de las vasijas de cultivo
b) si la actividad lipolitica en la vasija de cultivo se encuentra alrededor de la
actividad optima, se detiene la reaccion biologica y proceder a la separation de la biomasa del medio de cultivo por centrifugation y conservar la disolucion sobrenadante a 20 °C, ya que su produccion es extracelular.
La herramienta utilizada para determinar la biomasa y la actividad lipoh'tica es la espectrofotometria ultravioleta, considerando tanto los valores de concentracion celular por calibrado de peso seco (turbidimetn'a a 600 nm) como los de produccion enzimatica. En este ultimo caso, se monitoriza la hidrolisis de p-nitrofenil laurato (2, 5 5 mM) para obtener p-nitrofenol, siguiendo el proceso detallado previamente (Fucinos et a!., 2005, Production of thermostable lipolytic activity by Thermus species, Biotechnol. Prog. 21, 1198-1205) y considerando una unidad de actividad como la cantidad de enzima que produce un 1 pmol de p-nitrofenol por minuto.
Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se 10 pretende que sean limitativos de la presente invencion.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. Seguimiento de la actividad lipoh'tica (U/L) Halomonas sp. LM1C en cultivo matraz mediante induccion biologica de Staphylococcus equorum AMC7. Se muestra la 15 actividad lipoh'tica de un cultivo puro de Halomonas sp. LM1C como referencia. Las barras de error expresan la desviacion estandar.
Figura 2. Seguimiento de la actividad lipoh'tica (U/L) y de la biomasa (g/L) de Halomonas sp. LM1C en cultivo en biorreactor de tanque agitado mediante induccion qui'mica por Triton X-100®. Las barras de error expresan la desviacion estandar. Las li'neas 20 representan el ajuste de los datos a un modelo logi'stico.
EJEMPLOS DE UNA REALIZACION DE LA INVENCION Ejemplo 1
Produccion de lipasa por Halomonas sp. LM1C mediante induccion biologica por 25 Staphylococcus equorum AMC7 en matraz Erlenmeyer de 250 mL
En primer lugar se prepara un cultivo de Halomonas sp. LMICy Staphylococcus equorum AMC7 de 50 mL con medio CECT17 modificado (pH 6, 9) a 14 °C y 150 rpm durante 24
horas, que servira de inoculo para el matraz (3 % v/v). A continuacion, se esteriliza (120 °C durante 20 minutos) 50 mL de medio CECT17 modificado (pH 6, 9) junto con el matraz Erlenmeyer de 250 mL. El matraz se llena con el medio manteniendo las condiciones de esterilidad y se inocula en una proporcion del 3% v/v. Se utiliza un shaker (Thermo 5 Fischer Scientific® MAxQ 8000) para regular los parametros operacionales a 14 °C de temperatura y 150 rpm de agitacion.
Transcurridas 144 horas y verificados los niveles maximos de produccion en torno a las 3.000 U/L (Figura 1) , se detiene el proceso biologico para proceder a la eliminacion de las celulas del medio de cultivo por centrifugacion a 10.000 rpm, y conservandose el 10 caldo de cultivo libre de celulas a -20 "C.
Ejemplo 2
Produccion de lipasa por Halomonas sp. LM1C mediante induccion quimica por acido pentadecanoico en matraz Erlenmeyer de 250 mL
En primer lugar se prepara un cultivo de Halomonas sp. LM1C de 50 mL con medio 15 CECT17 modificado (pH 6, 9) a 21, 6 °C y 150 rpm durante 24 horas, que servira de inoculo para el matraz (3 % v/v). A continuation, se esteriliza (120 °C durante 20 minutos) 50 mL de medio CECT17 modificado y 10 mg/L de acido pentadecanoico (pH 6, 9} junto con el matraz Erlenmeyer de 250 mL. El matraz se llena con el medio manteniendo las condiciones de esterilidad y se inocula en una proporcion del 3% v/v. Se utiliza un shaker 20 (Thermo Fischer Scientific® MAxQ 8000) para regular los parametros operacionales a 21, 6 °C de temperatura y 150 rpm de agitacion.
Transcurridas 144 horas y verificados los niveles maximos de produccion en torno a las 700 U/L (Tabla 1) , se detiene el proceso biologico para proceder a la eliminacion de las celulas del medio de cultivo por centrifugacion a 10.000 rpm, y conservandose el caldo 25 de cultivo libre de celulas a -20 °C.
Tabla 1
Biomasa (g/L)
Actividad (U/L)
Cultivo sin inductor (CONTROL)
2, 7±0, 3
120, 7±15, 8
Acido pentadecanoico
3, 0±0, 08
690, 5±84, 2
Ejemplo 3
Production de lipasa por Halomonas sp. LM1C mediante induction quimica por aceite de 5 girasol en matraz Erlenmeyer de 250 mL
En primer iugar se prepara un cultivo de Halomonas sp. LM1C de 50 mL con medio CECT17 modificado (pH 6, 9) a 21, 6 °C y 150 rpm durante 24 horas, que servira de inoculo para el matraz (3 % v/v). A continuacion, se esteriliza (120 °C durante 20 minutos) 50 mL de medio CECT17 modificado y 1 g/L de aceite de girasol que es homogenizado mediante 10 agitacion con Ultra Turrax® despues de anadir 1 g/L de Tween 80® (pH 6, 9) , junto con el matraz Erlenmeyer de 250 mL. El matraz se llena con el medio manteniendo las condiciones de esterilidad y se inocula en una proporcion del 3% v/v. Se utiliza un shaker (Thermo Fischer Scientific® MAxQ 8000) para regular los parametros operacionales a 21, 6 °C de temperatura y 150 rpm de agitacion.
Transcurridas 144 horas y verificados los niveles maximos de produccion en torno a las 1.400 U/L (Tabla 1) , se detiene el proceso biologico para proceder a la eliminacion de las celulas del medio de cultivo por centrifugacion a 10.000 rpm, y conservandose el caldo de cultivo libre de celulas a -20 °C.
Tabla 2
Biomasa (g/L)
Actividad (U/L)
Cultivo sin inductor (CONTROL)
2, 8±0, 4
212, 2±1, 6
Aceite de girasol
2, 8±0, 02
1.381184
Ejemplo 4
Production de lipasa por Halomonas sp. LM1C mediante induction quimica en biorreactor de tanque agitado
En primer lugar se prepara un cultivo de Halomonas sp. LM1C de 50 mL con medio CECT17 modificado1 (pH 6, 9) a 21, 6 °C y 150 rpm durante 24 horas, que servira de inoculo para el biorreactor (3 % v/v). A continuation, se esteriliza (120 °C durante 20 minutos) 1, 5 Lde medio CECT17 modificado conteniendo 1 g/Lde Triton X-100® (pH 6, 9) 5 junto con el biorreactor de tanque agitado equipado con un impulsor dual tipo Rushton. El biorreactor se llena con el medio manteniendo las condiciones de esterilidad. Se utiliza una unidad de control (Biostat B, Braun Melsungen, Germany) para regular los parametros operacionales. Es importante conectar la sonda de espuma para evitar los efectos negativos originados por la formacion de espuma en el medio antes de fijar las 10 condiciones operacionales en 300 rpm de agitacion mecanica y de 0, 3 vvm de aireacion. Esta sonda esta conectada a un deposito que contiene antiespumante SE-15 de Sigma Aldrich®. Una vez fijada la temperatura del biorreactor a 21, 6 °C se Neva a cabo la inoculacion con 50 mL de celulas viables (24 horas) de Halomonas sp. LM1C.
Transcurridas 196 horas y verificados los niveles maximos de produccion en torno a las 15 3.000 U/L (Figura 2) , se detiene el proceso biologico para proceder a la eliminacion de
las celulas del medio de cultivo por centrifugacion a 10.000 rpm, y conservandose el caldo de cultivo libre de celulas a -20 °C.
