PREPARATION OF NEW BIOCONJUGATES AND ANTIBODIES FOR THE IMMUNODETECTION OF OCRATOXIN A (Machine-translation by Google Translate, not legally binding*)

Abstract

Preparation of new bioconjugates and antibodies for the immunodetection of ochratoxin A.

The present invention relates to bioconjugates and labeled derivatives of ochratoxin A by different positions of the molecule, suitable for the production of high affinity antibodies to ochratoxin A. Likewise, the present invention also relates to the use of ochratoxin A bioconjugates and Ochratoxin-A-labeled derivatives as test antigens. In addition, the present invention also relates to methods of analysis, concentration and extraction of ochratoxin A using the antibodies obtained, sometimes in conjunction with test antigens that are bioconjugated or labeled derivatives. This invention also provides a kit for analyzing ochratoxin A comprising antibodies to this mycotoxin, sometimes in conjunction with test antigens that are bioconjugated or labeled derivatives of ochratoxin A.

Description

ES-2672945_B1

PREPARACIÓN DE NUEVOS BIOCONJUGADOS Y ANTICUERPOS PARA LA

INMUNODETECCIÓN DE OCRATOXINA A

La presente invention se refiere a bioconjugados y derivados marcados de ocratoxina A por posiciones diferentes de la molecula, adecuados para la production de anticuerpos de elevada afinidad para ocratoxina A. Asimismo, la presente invención tambien se refiere al uso de bioconjugados de ocratoxina A y de derivados marcados de ocratoxina A como antlgenos de ensayo. Ademas, la presente invención tambien se refiere a metodos de analisis, concentration y extraction de ocratoxina A utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antlgenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados. Esta invención tambien proporciona un kit para analizar ocratoxina A que comprende anticuerpos frente a esta micotoxina, en ocasiones junto con antlgenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la ocratoxina A.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las biotoxinas son un tipo de contaminante cuya presencia en alimentos, aguas y piensos representa un verdadero problema para la salud humana y el bienestar animal, ocasionando importantes perdidas economicas a los sectores agroalimentario, agropecuario y pisclcola. La clase de biotoxinas mas frecuentemente detectadas en alimentos son las producidas por hongos, o micotoxinas. Aunque se han identificado mas de 400 diferentes micotoxinas con una gran diversidad estructural, es sobre las toxicologicamente mas relevantes sobre las que existe una reglamentación mas definida en cuanto a los llmites maximos permitidos en alimentos.

La ocratoxina A es la micotoxina mas importante de la familia de las ocratoxinas. Estructuralmente consiste en una molecula de L-fenilalanina unida, a traves de un puente amida, a un grupo p-clorofenolico que contiene un grupo de dihidroisocumarina (Figura 1) . Los principales efectos nocivos de esta micotoxina son nefrotoxicos, aunque tambien se ha observado actividad hepatotoxica, neurotoxica, teratogenica, inmunotoxica y carcinogenica en diferentes especies animales. La ocratoxina A es sospechosa de ser la causa de enfermedades cronicas de desenlace fatal, como la efropatla endemica de los Balcanes (BEN) y la nefropatla de Tunez (TCIN) . Ademas, dado que el consumo de alimentos contaminados con OTA esta asociado con una mayor incidencia de tumores en el tracto urinario superior en el hombre, esta micotoxina ha sido clasificada como posible carcinogeno por la International Agency for Research on Cancer (IARC) . Dos especies del genero Penicillium producen ocratoxina A: P. verrucosum, la principal fuente de contamination en grano almacenado, y P. nordicum, el mayor productor encontrado en productos carnicos. No obstante, la mayorla de los hongos ocratoxigenicos son del genero Aspergillus, y particularmente uno de los principales productores es A. carbonarius, el cual se encuentra frecuentemente en vinedos. Por orden de aporte de ocratoxinas totales a la dieta encontramos los cereales (58%) , el vino (21%) , el zumo de uva (7%) , el cafe (5%) y la carne de cerdo (3%) .

Las tecnicas anallticas para la determination de ocratoxina A en alimentos son fundamentalmente de dos tipos: cromatograficas y de reconocimiento molecular. Entre las primeras, la que goza de mas aceptación actualmente es HPLC-MS/MS, mientras que entre las segundas la mayorla emplea anticuerpos como elemento de detection. Las tecnicas cromatograficas constituyen la metodologla de referencia, debido a su elevada sensibilidad, reproducibilidad y fundamentalmente por su capacidad de determinar varias micotoxinas simultaneamente (K. F. Nielsen et al., J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 1029-1034) . Por su parte, las tecnicas basadas en la interaction anticuerpo-analito (inmunoensayos, cromatografla de afinidad, tiras inmunorreactivas) se consideran la mejor option cuando es necesario realizar un elevado numero de analisis en poco tiempo y/o en entornos poco dotados tecnicamente. De hecho, las micotoxinas, y en particular la ocratoxina A, constituyen probablemente el grupo de contaminantes en donde estos metodos rapidos inmunoqulmicos han alcanzado un mayor grado de aceptación e implantation, existiendo un gran numero de empresas de inmunodiagnostico que comercializan ensayos tipo kit para la detección de estos contaminantes (E. P. Meulenberg, Toxins 2012, 4, 244-266) .

Los metodos inmunoanallticos se basan en la union selectiva, reversible y no covalente entre la sustancia a detectar (analito) y un anticuerpo que la reconoce especlficamente. La ocratoxina A, debido a su bajo peso molecular, no es nmunogenica, y por tanto es incapaz de generar una respuesta inmune por si misma cuando se inyecta en un animal de experimentation. Para poder generar anticuerpos para ocratoxina A es necesario acoplarla covalentemente a una protelna, de forma que el conjugado obtenido si resulte inmunogenico y permita la production de anticuerpos frente a la micotoxina. Para conseguir obtener estos conjugados, a menudo es necesario recurrir al diseno y slntesis ex novo de un derivado, a traves de estrategias que permitan la incorporación, en la posición deseada de la molecula, de una cadena hidrocarbonada con un grupo funcional terminal, respetando su estructura y grupos qulmicos caracterlsticos. Esta estrategia posibilita presentar la molecula al sistema inmune de la manera mas adecuada para lograr anticuerpos de gran afinidad y especificidad. Sin embargo, la ocratoxina A posee en su estructura un grupo carboxilato que posibilita el anclaje directo a la protelna, por lo que, debido a las dificultades sinteticas que conlleva la slntesis total de derivados potencialmente mas adecuados desde el punto de vista estructural, todos los anticuerpos obtenidos hasta la fecha capaces de reconocer a ocratoxina A se han obtenido empleando dicho grupo carboxilato para la obtención de los conjugados. La efectividad de esta estrategia ha sido muy variable (X. Li et al., Food Anal. Methods 2013, 6, 1433-1440) . En todo caso, la generation de anticuerpos para ocratoxina A a partir de haptenos en los que el grupo carboxilato se encuentre libre y por tanto pueda interaccionar con el anticuerpo, constituye una via no explorada que podrla permitir la generación de anticuerpos con caracterlsticas diferentes a las de los actualmente disponibles, adecuados no solo para el desarrollo de inmunoensayos mas sensibles y especlficos, sino tambien para su implementation en nuevas plataformas anallticas basadas en tecnologlas avanzadas, tales como biosensores de diferente tipo, ensayos multiplex y metodos basados en transferencia de energla por resonancia de fluorescencia (FRET) .

Existe por tanto la necesidad de obtener derivados funcionalizados de ocratoxina A no explorados anteriormente que permitan la generación de anticuerpos de mayor afinidad que los producidos hasta la fecha. Estos anticuerpos mejorados obtenidos a partir de haptenos innovadores constituiran la base para desarrollar nuevos metodos inmunoanallticos para la determination, detection, concentration o extraction de ocratoxina A, preferentemente mediante la utilization de un kit que pueda ser utilizado por la industria alimentaria, agricola, cllnica y/o medioambiental.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona bioconjugados y derivados marcados de ocratoxina A, y el uso de los bioconjugados para la obtención de anticuerpos para ocratoxina A.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un bioconjugado de formula general (I) :

[T -L-Z ]ⁿ-P

(I)

donde:

T se selecciona del grupo que consiste en R-I y R-II;

Preferiblemente T es R-I.

L es una cadena hidrocarbonada de 0 a 40 atomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende la sustitución de entre 0 y 10 atomos de carbono por heteroatomos, que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N; preferiblemente L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 atomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O y N, y mas preferiblemente L es una cadena hidrocarbonada lineal saturada d e l a 10 atomos de carbono y opcionalmente la cadena hidrocarbonada comprende entre 1 y 4 heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; y

Z es un grupo funcional seleccionado entre:

- (C=O) NH- -NH (C=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=O) O-, -O (C=O) -, -O (C=O) O-, -O (S=O) O-, -O (SO²) O-, -NH (S=O) O-, -O (S=O) NH-, -NH (SO²) O-, -O (SO²) NH-, - (SO²) NH-, -NH (SO²) -, -O (C=O) NH-, -NH (C=O) O-, -NH (C=O) NH-, -NH (C=S) NH-, -NH-, -N (alquilo Cⁱ -C^a) -, -S -, -S -S -, -NH-NH-, -N=C-, -C=N-, -NH (C=NH) -, -N=N-, -O -, -CH=CH-,

En una realization preferida, Z se selecciona del grupo que consiste en - (C=O) NH-, -NH (C=O) -, -O (C=O) NH-, -NH (C=O) O-, -NH (C=O) NH-, -NH-, -S -,

Mas preferentemente, Z es - (C=0) NH-

P es un peptido o polipeptido, natural o sintetico, de peso molecular mayor de 2000 daltons. El peptido o polipeptido P puede estar o no unido, mediante interaction covalente, electrostatica o de otro tipo, a un soporte. Dicho soporte puede ser un pollmero sintetico o no, o estar compuesto por nanomateriales como nanotubos de carbono, zeolitas o sllice mesoporosa.

Segun otra realización preferida de la presente invention, el bioconjugado de formula (I) descrito en esta solicitud de patente se caracteriza porque P se selecciona del grupo que consiste en albumina, tiroglobulina, hemocianina, beta-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. Mas preferiblemente P es peroxidasa o albumina, que puede ser albumina de huevo o albumina serica; y

n es un numero con un valor entre 1 y 500; preferiblemente n es un valor entre 1 y 100.

El valor de n indica el grado de conjugation, es decir, la relation molar entre la fraction derivada del fragmento T -L-Z y el peptido o polipeptido P, en el bioconjugado de formula (I) resultante.

Segun otra realización preferida de la presente invención, el bioconjugado de formula (I) es un bioconjugado de formula (la)

a

donde:

P y n se han definido anteriormente. Preferiblemente P es albumina o peroxidasa y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

Segun otra realización preferida, el bioconjugado de formula (I) es un bioconjugado de formula (lb)

donde:

P y n se han definido anteriormente. Preferiblemente P es albumina o peroxidasa y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

El bioconjugado de formula (I) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un derivado funcionalizado (hapteno) de la ocratoxina A con P, un polipeptido natural o sintetico de peso molecular mayor a 2000 daltons, por metodos ampliamente conocidos en la técnica.

En otra realización de la presente invención, cuando el material portador es un marcador no isotopico detectable, el derivado es un compuesto de formula (II) : [T -L-Z ]m-Q

(II)

donde T, L y Z tienen el mismo significado definido anteriormente para el bioconjugado de formula (I) ;

Q es un marcador no isotopico detectable; y

m es un numero con un valor entre 1 y 1000; preferiblemente m es un valor seleccionado entre 1 y 100.

En la presente invention se entiende por "marcador" cualquier molecula o fragmento que de lugar a una senal medible por cualquier tipo de técnica analltica. En la presente invención, Q identifica un fragmento o una molecula qulmica detectora, marcadora o trazadora no isotopica.

En una realization preferida, Q es una enzima, biotina, un compuesto luminiscente, un fluoroforo, un marcador acoplado a un sistema de detection indirecta, micro o nanopartlculas u otros. Preferentemente, Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, fosfatasa alcalina, biotina, fluorescelna o uno cualquiera de sus derivados, un fluoroforo de cianina, un fluoroforo de rodamina, un fluoroforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un ester de acridinio, nanoparticulas cuanticas (en ingles quantum dots) , y micro- o nanopartlculas de oro coloidal, de carbon o de latex.

Preferiblemente, en el compuesto de formula (II) , Z se selecciona del grupo que consiste en - (C= O) NH-, -NH (C=O) -, -O (C=O) NH-, -NH (C=O) O-, -NH (C=O) NH-, -NH-, -S -,

Preferiblemente L, en el compuesto de formula (II) , es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 atomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 4 heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O y N, y mas preferiblemente L es una cadena hidrocarbonada lineal saturada de 1 a 10 atomos de carbono y opcionalmente la cadena hidrocarbonada comprende entre 1 y 4 heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O y N;

Este compuesto de formula (II) puede utilizarse con un anticuerpo de ocratoxina A para determinar o detectar esta micotoxina en una muestra mediante la tecnologla de inmunoensayo.

Segun una realización preferida, el derivado de formula (II) es un derivado de formula (IIa)

donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluorescelna o nanopartlculas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.

Segun otra realización tambien mas preferida, el derivado de formula (II) es un derivado de formula (IIb)

donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluorescelna o nanopartlculas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.

El derivado marcado de formula (II) de la presente invention se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un derivado funcionalizado (hapteno) de la ocratoxina A con Q, un marcador no isotopico, por metodos ampliamente conocidos en la técnica.

El bioconjugado de formula (I) de la presente invención puede utilizarse para la production de anticuerpos, o junto con un anticuerpo de ocratoxina A para determinar o detectar esta micotoxina en una muestra mediante la tecnologla de inmunoensayo. Ademas, los derivados marcados de formula (II) pueden utilizarse junto con un anticuerpo de ocratoxina A para determinar o detectar esta micotoxina en una muestra mediante la tecnologla de inmunoensayo.

Para obtener anticuerpos frente a ocratoxina A se han preparado derivados funcionalizados de dicha micotoxina (haptenos) , es decir, analogos estructurales de ocratoxina A que incorporan un grupo funcional susceptible de ser utilizado para la conjugation a un portador P o marcador Q. Este grupo funcional esta separado del esqueleto de la molecula de ocratoxina A por un espaciador L. La position de incorporation del grupo funcional a la estructura de ocratoxina A para la conjugación no es un aspecto obvio y puede ser determinante para la viabilidad de los bioconjugados de formula (I) como inductores de la producción de anticuerpos de afinidad y selectividad adecuadas frente a ocratoxina A, e incluso para la viabilidad de los bioconjugados de formula (I) o de derivados marcados de formula (II) para actuar como moleculas competidoras que permitan el desarrollo de un inmunoensayo sensible y especlfico para dicha micotoxina.

En el contexto de esta invención el termino "anticuerpo" se refiere a la inmunoglobulina que un animal o una celula hlbrida (como un hibridoma) sintetiza de forma especlfica contra el inmunogeno de la invención (bioconjugado de la invencion) .

Por tanto, un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un anticuerpo (a partir de ahora anticuerpo de la invencion) generado en respuesta a un bioconjugado de la invención, en particular al bioconjugado de formula (I) . Mas preferiblemente los anticuerpos son generados en respuesta al bioconjugado de formula (Ia) o (Ib) , mas preferiblemente al bioconjugado de formula (Ia) .

Un cuarto aspecto de la invention se refiere al uso del bioconjugado anteriormente descrito para la obtención de anticuerpos.

El procedimiento de obtención de los anticuerpos de la invención a partir de bioconjugados de la invención se puede llevar a cabo por metodos de inmunización ampliamente conocidos en la técnica, como por ejemplo a partir de la inmunización de un animal. Los anticuerpos generados a partir de un bioconjugado de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos de la invención tienen alta afinidad y especificidad hacia ocratoxina A.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un antisuero (a partir de ahora antisuero de la invencion) que comprende los anticuerpos de la invención.

El termino "antisuero" se refiere a un suero obtenido tras la inmunización de un animal con un inmunogeno. El antisuero comprende anticuerpos especlficos de dicho inmunogeno generados tras la respuesta inmune producida en el animal. En el contexto de la presente invención, el inmunogeno es el bioconjugado de la invención y el antisuero comprende anticuerpos especlficos generados frente al bioconjugado de la invención, los anticuerpos de la invención.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método de analisis in vitro de ocratoxina A en una muestra que comprende el uso del anticuerpo anteriormente descrito. Preferiblemente, este método comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo o el antisuero de la invencion; b) incubar la muestra y el anticuerpo (o el antisuero) de la etapa (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reaction inmunoqulmica; y

c) determinar la existencia de reacción inmunoqulmica tras la incubation de la etapa (b) .

El método de la presente invención permite la determination cuantitativa o analisis cualitativo del contenido de la micotoxina ocratoxina A en una muestra. Asimismo, el método de la presente invención permite analizar el contenido de ocratoxina A en diferentes tipos de muestras, por ejemplo, muestras de alimentos, como cereales, frutas y vinos, muestras medioambientales tales como agua, suelo o superficie, y uestras biologicas aisladas tales como orina. Preferentemente, la presente invention proporciona un método de analisis in vitro de ocratoxina-A en vinos, cervezas y zumos.

Segun una realization preferida, la determination de la reaction inmunoqulmica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un bioconjugado de formula (I) o un derivado marcado de formula (II) . Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de tipo ELISA.

El termino inmunoensayo hace referencia a un ensayo analltico en el que ocurre una reacción inmunoqulmica para la detection o cuantificación de un analito. Los inmunoensayos competitivos son aquellos en los que el analito compite con otra molecula por la union con el anticuerpo.

El termino "antlgeno" en esta solicitud de patente se refiere a una molecula capaz de interaccionar especlficamente con un anticuerpo. La interaction o reacción inmunoqulmica consiste en la union especlfica y no covalente entre un anticuerpo y un antlgeno, pudiendo ser este el analito o un antlgeno de ensayo.

En la presente memoria el termino "antlgeno de ensayo", "antlgeno enzimatico" o "trazador" se refiere a un bioconjugado de formula (I) o a un derivado marcado de formula (II) que se utiliza en el ensayo competitivo.

Un sexto aspecto de la presente invención tambien se refiere a un kit de detección de ocratoxina A que utiliza al menos un anticuerpo de la invención. Adicionalmente, el kit de detección de ocratoxina A puede comprender un bioconjugado de formula (I) o un derivado marcado de formula (II) tal como se describen en la presente solicitud de patente.

Un septimo aspecto de la presente invención tambien se refiere a un método de purification y/o concentration de ocratoxina A de una muestra que comprende el uso del anticuerpo anteriormente descrito. Particularmente, este método se basa en inmovilizar al menos un anticuerpo de la invención sobre un soporte cualquiera y hacer pasar una muestra a traves de dicho soporte para que retenga la ocratoxina A presente en dicha muestra. La elución posterior de la ocratoxina A retenida en el oporte por metodos ampliamente conocidos en la técnica (cambio de pH, modification de la fuerza ionica, utilization de agentes caiotropicos) permitira su purification y/o concentration, en un sistema conocido como cromatografla de inmunoafinidad. En una realization preferida, este método comprende las siguientes etapas:

a) inmovilizar al menos un anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 sobre un soporte;

b) hacer pasar la muestra a traves de dicho soporte para que retenga la ocratoxina A presente en dicha muestra; y

c) eluir la ocratoxina A retenida en el soporte.

Los terminos "inmunogeno" e "inmunogenico" tal como se utilizan en la presente invention se refieren a una sustancia que es reconocida como extrana al organismo vivo y por lo tanto es capaz de producir o de generar una respuesta inmune en un huesped. En la presente invención el inmunogeno es un bioconjugado de formula (I) .

A lo largo de la description y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invención se desprenderan en parte de la descripción y en parte de la practica de la invención.

A continuation se ilustra con algunos ejemplos y figuras la forma en que puede efectuarse la preparation de varios derivados funcionalizados de ocratoxina A (haptenos) y los correspondientes bioconjugados de formula (I) , que no pretenden que sean limitativos de la presente invención, y que sirven para mostrar no solo la forma en que puede efectuarse la preparación de los mismos sino tambien la importancia que puede tener la naturaleza estructural del bioconjugado de formula (I) para la production de anticuerpos de afinidad adecuada hacia el analito, aptos para el desarrollo de un eficaz método inmunoanalltico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Estructura de la ocratoxina-A.

Fig. 2. Esquema de la smtesis del ester activo del hapteno OTA-1 (NHS-OTA-1) . Fig. 3. Esquema de la smtesis del ester activo del hapteno OTA-2 (NHS-OTA-2) . Fig. 4. Esquema de la smtesis del ester activo del hapteno OTA-3 (NHS-OTA-3) . Fig.5. Esquema de la preparación de un bioconjugado de formula (I) a partir del correspondiente derivado funcionalizado (ester activo) de ocratoxina A.

Fig. 6. Curvas estandar para ocratoxina A en el formato de ELISA competitivo homologo directo obtenidas con el mejor anticuerpo monoclonal producido a partir del bioconjugado BSA-OTA-1 (mAb Ia#310b; triangulos) y con el mejor anticuerpo monoclonal producido a partir del bioconjugado BSA-OTA-2 (mAb Ib#115; drculos) .

EJEMPLOS

A continuation, se ilustrara la invention mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de los bioconjugados de formula (I) para la obtención de anticuerpos frente a ocratoxina A y el desarrollo de un inmunoensayo de elevada sensibilidad para la misma. Los numeros en negrita hacen referencia a la correspondiente estructura que se muestra en los esquemas. Estos ejemplos se presentan a modo de demostración, pero de ningun modo pueden suponer un limite a la invención.

1. Preparación de bioconjugados de formula (I)

Ejemplo 1: Preparación de bioconjugados de formula (I) para T = R-I, L = CH2CH2CH2CH2CH2, Z = - (C=O) NH- y P = BSA (seroalbumina bovina) , OVA (ovalbumina) y HRP (peroxidasa de rabano picante) .

1.1. Preparación del ester de N-hidroxisuccinimidilo del hapteno OTA-1 (NHS-OTA-1) .

Preparation de 4-cloro-2, 6-diyodo-3-metilfenol (2) . EtOH absoluto (31 mL) se anadio sobre una mezcla de 4-cloro-3-metilfenol (1) (1, 78 g, 12, 5 mmol) , iodo (6, 93 g, 27, 3 mmol, 2, 2 equiv) y AgSO4 (7, 76 g 24, 9 mmol, 2 equiv) y la mezcla se mantuvo bajo agitación durante 3 horas a temperatura ambiente. Una vez finalizada la reacción, la mezcla se filtro para separar las sales, utilizando CHCl3 para lavar. El filtrado se lavo con una disolución acuosa al 10% de Na2S2O3 y salmuera. Tras secar sobre MgSO4 anhidro y evaporar el disolvente a vaclo, el residuo obtenido se purifico a traves de una columna de gel de sllice, utilizando hexano como eluyente, para obtener el compuesto 2 como un solido blanco (3, 72 g, 75%) . Pf. 91, 0-92, 0 °C (cristalizado de hexano en frlo) .

Datos espectroscopicos de 21H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 2.59 (s, 3H, Me-3) , 5.83 (s, 1H, OH) , 7.72 (s, 1H, H-5) . 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz) : 5 (ppm) 26.8 (Me-3) , 77.6 (C-6) , 90.5 (C-2) , 125.2 (C-4) , 137.9 (C-5) , 140.3 (C-3) , 152.6 (C-1) . EMAR (TOF ESI-) : calculado para C7H4ClI2O [M-H]" 392.8046, encontrado 392.8042.

Preparation de 5-cloro-2-hidroxi-4-metilbenceno-1, 3-dicarboxilato de dimetilo (3) . Una mezcla del fenol 2 (300 mg, 0, 76 mmol) y PdCl2 (dppf) CH2Cl2 (64, 0 mg, 0, 08 mmol, 0, 1 equiv) en MeOH anhidro (9 mL) en un reactor tiny Buchi se purgo exhaustivamente por ciclos repetidos de vaclo-purga con argon, enfriando a 0 °C. Tras esto, y bajo una corriente de argon, se r aañpaiddiaómente Et3N (0, 53 mL, 3, 8 mmol, 5 equiv) y se volvio a someter el sistema a ciclos de purga a 0 °C, primero con argon y luego con CO. A continuation, se ajusto la presion de CO de 90 psi y la mezcla de reacción se agito a 90 °C durante 2, 5 horas. Transcurrido este tiempo se enfrio el reactor y se enteo, la mezcla de reacción se transfierio a un matraz de fondo redondo con la ayuda de CH2Cl2 y se concentro a sequedad a presion reducida. El residuo se suspendio en Et2O y se filtro, el filtrado se lavo con una disolución acuosa 1M de HCl y salmuera, se seco sobre MgSO4 anhidro y se evaporo el disolvente a vaclo. El residuo obtenido se purifico por cromatografla sobre gel de sllice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt (95:5 y 90:10) , para obtener el compuesto 3 como un solido de color blanco (158, 4 mg, 82%) . Pf.66, 1-67, 1 °C (cristalizado de hexano en frlo) .

Datos espectroscopicos de 3: 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 2.35 (s, 3H, Me-4) , 3.96 (s, 6H, 2xOMe) , 7.87 (s, 1H, H-6) , 10.96 (s, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz) : 5 (ppm) 18.0 (Me-4) , 52.7 (2xOCH3) , 111.5 (C-3) , 124.9 (C-5) , 125.1 (C-1) , 130.6 (C-6) , 141.5 (C-4) , 156.8 (C-2) , 166.8 (CO2-3) , 169.1 (CO2-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C11H12ClO5 [M+H]+ 259.0368, encontrado 259.0356.

Preparation de 5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxilato de metilo (4) . Una disolución del dicarboxilato de dimetilo 3 (82, 4 mg, 0, 32 mmol) en THF anhidro (200 ^L) se adiciono gota a gota, a -78 °C bajo nitrogeno, sobre una disolución de diisopropilamiduro de litio (LDA) en THF, generada a partir de diisopropilamina (130 ^L, 0, 88 mmol, 2, 75 equiv) , BuLi (500 ^L de una disolución 1, 6 M en hexano, 0, 8 mmol, 2, 5 equiv) y THF anhidro (1, 15 mL) . La mezcla se mantuvo con agitación 30 minutos a -78 °C y a continuation se acet aañldadeihóldo (150 ^L, 2, 55 mmol, 8 equiv) . La mezcla de reacción se agito a la misma temperatura durante 10 minutos y a 0 °C durante 1, 5 horas. Una vez finalizado el tiempo de reacción se anadio 1 mL de una disolución 1:2 de AcOH en Et2O a 0 °C, se diluyo con AcOEt y se lavo con agua y salmuera, se seco sobre MgSO4 anhidro y se concentro a vaclo para obtener un residuo que se purifico por cromatografla de columna, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0, 3 y 95:5:0, 3) para obtener el compuesto 4 como un semisolido de color blanco (51, 7 mg, 82%) .

Datos espectroscopicos de 4 (una mezcla racemica) : ¹ H-RMN (CDCI³, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.58 (d, J = 6.4 Hz, 3H, Me-3) , 2.84 (dd, J = 17.4, 11.6 Hz, 1H, H-4) , 3.27 (dd, J = 17.3, 3.2 Hz, 1H, H-4) , 3.95 (s, 3H, CO²CH³) , 4.42-4.92 (m, 1H, H-3) , 8.11 (s, 1H, H-6) , 12.19 (s, 1H, OH) . ¹³C-RMN (CDCI³ , 75 MHz) : 5 (ppm) 20.6 (Me-3) , 32.6 (C-4) , 52.6 (OCH³) , 75.1 (C-3) , 111.2 (C-7) , 118.4 (C-8a) , 121.7 (C-5) , 138.0 (C-6) , 142.2 (C-4a) , 161.1 (C-8) , 165.0 (C-1) , 167.9 (CO²-7) . EMAR (TOF ESI⁺) : calculado para C¹² H¹²CIO⁵ [M+H]⁺ 271.0368, encontrado 271.0371.

Preparation del acido 5-tioro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxllico (5) . Una disolución de LiOH H2O (115, 0 mg, 2, 73 mmol, 10 equiv) en agua (1, 20 mL) se adiciono sobre una suspension de la dihidroisocumarina 4 (74, 0 mg, 0, 27 mmol) en THF anhidro (910 pL) . La mezcla se calento a reflujo durante 3, 5 horas y a continuation se enfrio a 0 °C y se acidifico con una disolución acuosa 1M de HCl (4, 91 mL, 4, 91 mmol, 18 equiv) . La mezcla de reaction se agito a temperatura ambiente durante 2 horas, se diluyo con agua y se extrajo con AcOEt. Las fases organicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 anhidro y se concentraron a presion reducida para obtener el acido 5 (69, 9 mg, 100%) como un solido amorfo de color pardo claro.

Datos espectroscopicos de 5: ¹ H-RMN (DMSO-d⁶, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.44 (d, J = 6.2 Hz, 3H, Me-3) , 2.88 (dd, J = 17.3, 11.6 Hz, 1H, H-4) , 3.20 (dd, J = 17.3, 3.2 Hz, 1H, H-4) , 4.75 (ddd, J = 11.7, 6.2, 3.2 Hz, 1H, H-3) , 7.99 (s, 1H, H-6) . ¹³C-RMN (DMSO-d^a , 75 MHz) : 5 (ppm) 20.1 (Me-3) , 32.2 (C-4) , 74.4 (C-3) , 112.5 (C-7) , 117.8 (C-8a) , 120.6 (C-5) , 136.0 (C-6) , 143.4 (C-4a) , 160.5 (C-8) , 165.4 (C-1) , 167.3 (CO₂ H) . EMAR (TOF ESI⁺) : calculado para C¹¹ H¹⁰ClO⁵ [M+H]⁺ 257.0211, encontrado 257.0212.

Preparation de 2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano-7-carboxamido) -3- (4-yodofenil) propanoato de terc-butilo (7) . A una disolución del acido 5 (56, 3 mg, 0, 22 mmol) en DMF anhidra (1, 5 mL) se anadieron sucesivamente una disolución de HATU (125, 5 mg, 0, 33 mmol, 1, 5 equiv) en DMF anhidra (1, 5 mL) y DIEA (80 pL, 0, 44 mmol, 2 equiv) . La mezcla de reacción se agito durante 2 horas a temperatura ambiente y seguidamente se añadió una disolución de la amina 6 (153 mg, 0, 44 mmol, 2 equiv) y DIEA (80 pL, 0, 44 mmol, 2 equiv) en DMF anhidra y se agito a temperatura ambiente durante 4 horas, tras lo cual la reacción se diluyo con AcOEt y se lavo sucesivamente con disoluciones acuosas de HCl (1M) , LiCl (1, 5%) , NaHCO3 (5%) y salmuera, se seco sobre MgSO4 anhidro y se evaporo el disolvente en el rotavapor. El residuo obtenido se purifico por cromatografla de columna, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0, 3, 90:10:0, 3 y 80:20:0, 3) para obtener el compuesto 7 (107 mg, 83%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de 7 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.43 (dos s, 4.5H cada uno, CMe3 de cada diastereoisomero) , 1.61 (dos d, J = 6.4, 1.5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisomero) , 2.84 y 2.89 (cada uno dd, J = 17.4, 11.6 Hz, 0.5H cada uno, H-4 de cada diastereoisomero) , 3.07-3.24 (m, 2H, H2-3) , 3.30 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H-4) , 4.77 (m, 1H, H-3) , 4.94 (dt, J = 7.3, 6.0 Hz, 1H, H-2) , 6.96 (br d, J = 7.9 Hz, 2H, H-2 y H-6) , 7.56-7.62 (m, 2H, H-3 y H-5) , 8.44 (s, 1H, H-6) , 8.57 (m, 1H, NH) , 12.78 (s ancho, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCh, 75 MHz) : 5 (ppm) 20.7 (Me-3) , 28.0 (CMe3) , 32.3 (C-4) , 37.6 (C-3) , 54.3 (C-2) , 75.9 (C-3) , 82.6 (CMea) , 92.4 (C-4) , 110.0 (C-8a) , 120.7 (C-7) , 123.1 (C-5) , 131.5 (C-2 y C-6) , 136.1 (C-1) , 137.4 (C-3 y C-5) , 138.9 (C-6) , 140.7 (C-4a) , 159.0 (C-8) , 162.1 (CONH) , 169.7 (C-1) , 170.1 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C24H26NClIO6 [M+H]+ 586.0488, encontrado 586.0459.

Preparation de 6- (4- (3- (terc-butoxi) -2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano-7-carboxamido) -3-oxopropil) fenil) hex-5-inoato de metilo (9) . Una mezcla del derivado yodado 7 (36, 5 mg, 0, 062 mmol) , hex-5-ionato de metilo (8) (27, 4 mg, 0, 217 mmol, 3, 5 equiv) , PdCl2 (Ph3P) 2 (5, 1 mg, 7, 310-3 mmol, 0, 12 equiv) y CuI (2, 2 mg, 11, 510-3 mmol, 0, 18 equiv) se purgo con ciclos repetidos de vaclo-nitrogeno mientras se enfriaba a 0 °C. A continuation, se añad DióMF anhidra (730 pL) y se volvio a purgar el sistema, se anadio Et3N (540 pL, 3, 87 mmol, 62 equiv) y se volvio a purgar el sistema a baja temperatura. La mezcla de reaction se agito a temperatura ambiente durante 21 horas, tras lo cual se diluyo con AcOEt y se lavo sucesivamente con disoluciones acuosas de HCl (1M) , LiCl (1, 5%) , NaHCO3 (5%) y salmuera. La fase organica se seco sobre MgSO4 anhidro y se concentro a presion reducida para obtener un residuo que se purifico por cromatografla de columna sobre gel de sllice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt (80:20, 70:30 y 50:50) , para obtener el alquino 9 (22, 5 mg, 62%) como un aceite de color amarillento.

Datos espectroscopicos de 9 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : ¹ H-RMN (CDCI³, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.43 (s ancho, 9H, CMe³ de los dos diastereoisomero) , 1.60 (dos d, J = 6.3 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisomero) , 1.87-1.98 (m, 2H, H²-3) , 2.50 (m, 4H, H²-2 y H²-4) , 2.84 y 2.89 (dos dd, J = 17.5, 11.5 Hz, 0.5H cada uno, H-4 de cada diastereoisomero) , 3.19 (m, 2H, H²-1) , 3.30 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H-4) , 3.68 (s, 3H, CH³O) , 4.71-4.82 (m, 1H, H-3) , 4.96 (dt, J = 7.3, 6.0 Hz, 1H, H-2) , 7.14 (d, J = 7.9 Hz, 2H, H-3 y H-5) , 7.30 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 2H, H-2 y H-6) , 8.45 (s, 1H, H-6) , 8.56 (m, 1H, NH) , 12.76 (s, 1H, OH) . ¹³C-RMN (CDCI³, 75 MHz) : 5 (ppm) 18.9 (C-4) , 20.7 (Me-3) , 23.9 (C-3) , 28.0 (CMe³) , 32.3 (C-4) , 32.9 (C-2) , 38.0 (C-1) , 51.6 (CH³O) , 54.5 (C-2) , 75.8 (C-3) , 81.3 (C-6) , 82.5 (CMe³) , 88.8 (C-5) , 110.1 (C-8a) , 120.8 (C-7) , 122.3 (C-4) , 123.1 (C-5) , 129.4 (C2 y C-6) , 131.5 (C-3 y C-5) , 136.0 (C-1) , 139.0 (C-6) , 140.6 (C-4a) , 159.1 (C-8) , 162.1 (CONH) , 169.7 (C-1) , 170.2 (C-3) , 173.6 (C-1) . EMAR (TOF ESI⁺) : calculado para C³¹H³⁵CINO⁸ [M+H]⁺ 584.2046, encontrado 584.2029.

Preparation de 6- (4- (3- (terc-butoxi) -2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1 -oxoisocromano-7-carboxamido) -3-oxopropil) fenil) hexanoato de metilo (10) . Una disolución del alquino 9 (17, 6 mg, 0, 03 mmol) y RhCl (PPh3) 3 (4, 2 mg, 4, 510-3 mmol, 0, 15 equiv) en THF anhidro (1, 3 mL) contenida en un reactor tiny Buchi se purgo con hidrogeno. La presion de hidrogeno se ajusto a 4 atm y se mantuvo con agitación a temperatura durante 28 horas. A continuation, se venteo el reactor y la mezcla de reaction se oncentro a sequedad a vaclo para obtener un residuo que se purifico por cromatografla de columna, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt (90:10, 80:20 y 60:40) para obtener el compuesto 10 (13, 4 mg, 76%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de 10 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.31-1.38 (m, 2H, H2-4) , 1.42 (s ancho, 9H, CMe3 de ambos diastereoisomeros) , 1.54-1.71 (m, 4H, H2-3, H2-5) , 1.60 (dos d, J = 6.2 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisomero) , 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H, H2-2) , 2.57 (t, J = 7.6 Hz, 2H, H2-6) , 2.83 y 2.88 (dos dd, J = 17.4, 11.6, 0.5H cada uno, H-4' de cada diastereoisomero) , 3.17 (d, J = 6.0 Hz, 2H, H2-1) , 3.29 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H-4) , 3.66 (s, 3H, OMe) , 4.69-4.82 (m, 1H, H-3) , 4.94 (dt, J = 7.3, 6.0 Hz, 1H, H-2) , 7.03-7.16 (m, 4H, H-2, H-3, H-5 y H-6) , 8.46 (s, 1H, H-6) , 8.54 (m, 1H, NH) , 12.73 (s, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz) : 5 (ppm) 20.7 (Me-3) , 24.8 (C-5) , 28.0 (CMe3) , 28.7 (C-4) , 31.0 (C-3) , 32.3 (C-4) , 34.0 (C-2) , 35.3 (C-6) , 37.8 (C-1) , 51.4 (OMe) , 54.7 (C-2) , 75.8 (C-3) , 82.2 (CMe3) , 110.0 (C-8a) , 121.0 (C-7) , 123.0 (C-5) , 128.4 (C-2 y C-6) , 129.4 (C-3 y C-5) , 133.5 (C-1) , 139.0 (C-6) , 140.5 (C-4a) , 141.1 (C-4) , 159.1 (C-8) , 162.1 (CONH) , 169.8 (C-1) , 170.5 (C-3) , 174.2 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C31H39ClNO8 [M+H]+ 588.2359, encontrado 588.2358.

Preparation del acido 6- (4- (3- (terc-butoxi) -2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido) -3-oxopropil) fenil) hexanoico (11) . Una suspension del ester metllico 10 (13, 4 mg, 0, 023 mmol) y lipasa de Candida antarctica inmovilizada en resina acrllica macroporosa (Novozyme 435, 26, 4 mg) en THF (160 pL) en una disolución tampon fosfato con pH=7, 4 (630 pL) se agito suavemente a temperatura ambiente durante 7 horas, tras lo cual se filtro y la resina y el reactor se lavaron con agua y AcOEt. La fase acuosa se acidifico con una disolución acuosa 1M de HCl hasta pH=2 y se extrajo con AcOEt. Las fases organicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO⁴ anhidro y se concentraron a sequedad a presion reducida para obtener un residuo aceitoso que se purifico por cromatografla de columna sobre gel de sllice, empleando como eluyente mezclas de CHCl³-MeOH (100:0, 95:5 y 90:10) , para obtener el acido 11 (9, 9 mg, 75%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de 11 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : ¹ H-RMN (CDCl³, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.31-1.37 (m, 2H, H²-4) , 1.43 (s, 9H, CMe³) , 1.54-1.70 (m, 4H, H²-3, H²-5) , 1.60 (dos d, J = 6.2 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisomero) , 2.32 (t, J = 7.3 Hz, 2H, H²-2) , 2.57 (t, J = 7.5 Hz, 2H, H²-6) , 2.78­ 2.92 (m, 1H, H-4) , 3.17 (m, 2H, H²-1) , 3.29 (dd, J = 17.4, 3.3 Hz, 1H, H-4) , 4.68­ 4.82 (m, 1H, H-3) , 4.88-5.00 (m, 1H, H-2) , 7.02-7.16 (m, 4H, H-2, H-3, H-5 y H-6) , 8.45 (s, 1H, H-6) , 8.56 (m, 1H, NH) , 12.73 (s ancho, 1H, OH) . ¹³C-RMN (CDCI³, 125 MHz) : 5 (ppm) 20.7 (Me-3) , 24.5 (C-3) , 28.0 (CMe³) , 28.4 (C-4) , 30.9 (C-5) , 32.3 (C-4) , 33.8 (C-2) , 35.2 (C-6) , 37.8 (C-1) , 54.7 (C-2) , 75.9 (C-3) , 82.3 (CMe³) , 110.0 (C-8a) , 121.0 (C-7) , 123.0 (C-5) , 128.4 (C-2 y C-6) , 129.4 (C-3 y C-5) , 133.5 (C-1) , 139.0 (C-6) , 140.6 (C-4a) , 141.1 (C-4) , 159.1 (C-8) , 162.2 (CONH) , 169.8 (C-1) , 170.5 (C-3) , 179.3 (CO²H) . EMAR (TOF ESI⁺) : calculado para C³⁰H³⁷N C O [M+H]⁺ 574.2202, encontrado 574.2220.

Preparation de 6- (4- (3- (terc-butoxi) -2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano-7-carboxamido) -3-oxopropil) fenil) hexanoato de 2, 5-dioxopirrolidin-1-ilo (12) . Una disolución del acido 11 (10, 2 mg, 0, 018 mmol) , NHS (2, 2 mg, 0, 019 mmol, 1, 1 equiv) y EDCHCl (3, 7 mg, 0, 019 mmol, 1, 1 equiv) en CH3CN anhidro (1, 0 mL) se agito a temperatura ambiente durante 24 horas bajo atmosfera de nitrogeno. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se diluyo con AcOEt y se lavo sucesivamente con agua, una disolución acuosa al 5% de NaHCO3 y salmuera. Tras evaporar a sequedad, el residuo obtenido se paso a traves de una pequena columna de gel de sllice, empleando CH2Cl2 como eluyente, para obtener en ester de N-hidroxisuccinimidilo 12 (9, 6 mg, 79%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de 12 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz) : 5 (ppm) 1.42 (s ancho, 9H, CMe3 de ambos diastereoisomeros) , 1.43-1.49 (m, 2H, H2-5) , 1.58-1.67 (m, 2H, H2-4) , 1.60 (dos d, 1.5H cada uno, J = 6.4, Me-3 de cada diastereoisomero) , 1.77 (quint, J = 7.6 Hz, 2H, H2-3) , 2.59 (m, 4H, H2-2 y H2-6) , 2.79-2.90 (m, 5H, H-4, COCH2CH2CO) , 3.11-3.22 (m, 2H, H2-1) , 3.29 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H-4) , 4.69-4.81 (m, 1H, H-3) , 4.89-4.97 (m, 1H, H-2) , 7.06-7.16 (m, 4H, H-2, H-3, H-5 y H-6) , 8.45 (s, 1H, H-6) , 8.54 (m, 1H, NH) , 12.73 (s ancho, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCl3, 125 MHz) : 5 (ppm) 20.7 (Me-3) , 24.4 (C-3) , 25.6 (COCH2CH2CO) , 28.0 (CMe3) , 28.4 (C-4) , 30.8 (C-5) , 30.9 (C-2) , 32.3 (C-4) , 35.2 (C-6) , 37.8 (C-1) , 54.7 (C-2) , 75.9 (C-3) , 82.2 (CMe3) , 110.0 (C-8a) , 121.0 (C-7) , 123.0 (C-5) , 128.4 (C-2 y C-6) , 129.5 (C-3 y C-5) , 133.6 (C-1) , 139.0 (C-6) , 140.5 (C-4a) , 140.9 (C-4) , 159.1 (C-8) , 162.1 (CONH) , 168.6 (C-1) , 169.1 (COCH2CH2CO) , 169.8 (C-1) , 170.5 (C-3) .

Preparation del acido 2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido) -3- (4- (6- ( (2, 5-dioxopirrolidin-1-il) oxi) -6-oxohexil) fenil) propanoico (Ester de N-hidroxisuccimidilo del hapteno OTA-1, NHS-OTA-1) . Acido trifluoroacetico (370 pL, 4, 8 mmol, 370 equiv) se añadi góota a gota sobre una disolución del ester terc-butllico 12 (9, 0 mg, 0, 013 mmol) en CH2Cl2 anhidro (760 pL) y la mezcla resultante se mantuvo con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras esto, la mezcla de reacción se concentro a sequedad a presion reducida para proporcionar el ester NHS-OTA-1 (7, 9 mg, 99%) como un aceite de aspecto resinoso y color parduzco.

Datos espectroscopicos de NHS-OTA-1 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz) : 5 (ppm) 1.42 (m, 2H, H2-2) , 1.57-1.68 (m, 2H, H2-3) , 1.75 (m, 2H, H2-4) , 1.60 (dos d, 1.5H cada uno, J = 6.4, Me-3 de cada diastereoisomero) , 2.59 (m, 4H, H2-1 y H2-5) , 2.78-2.91 (m, 5H, H-4, COCH2CH2CO) , 3.16-3.34 (m, 3H, H2-3 y H-4) , 4.77 (m, 1H, H-3) , 5.00-5.04 (m, 1H, H-2) , 7.06-7.18 (m, 4H, H-2, H-3, H-5 y H-6) , 8.42 (m, 1H, H-6) , 8.51 y 8.58 (dos m, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisomero) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C30H32ClN2O10 [M+H]+ 615.1740, encontrado 615.1732.

1.2. Preparation de un bioconjugado del hapteno OTA-1 con BSA (BSA-OTA-1) .

100 |^jL de la disolución del ester activo NHS-OTA-1 (50 mM en DMF) obtenida en la reacción anterior se anadieron lentamente y con agitación constante sobre 0, 9 mL de una disolución de BSA (15 mg/mL) en tampon carbonato 50 mM, pH 9, 6. La reacción de conjugation se incubo durante 2 horas con agitación suave a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, los conjugados se purificaron por exclusion molecular en 3 columnas cromatograficas HiTrap Desalting Columns de 5 mL cada una, acopladas en serie, utilizando como tampon de elución fosfato sodico 100 mM, pH 7, 4. Finalmente, tras el proceso de purification, las fracciones recogidas que contenlan el bioconjugado de BSA se llevaron a una concentration final de 1 mg/mL con tampon de elución y se almacenaron a -20 °C.

Para determinar la carga haptenica (n) obtenida en el conjugado, una allcuota de 100 ^j L del bioconjugado BSA-OTA-1 purificado se dializo (dialisis contra 5 L de agua desionizada con al menos 2 a 3 cambios de agua cada 24 h a 4 °C) ; finalmente, el producto dializado se liofilizo y el numero de moleculas de hapteno (OTA-1) conjugadas por molecula de BSA se determino mediante MALDI-TOF-MS (n = 15, 2, ver Tabla 1, entrada 1) .

1.3. Preparation de un bioconjugado del hapteno OTA-1 con OVA (OVA-OTA-1) . A partir de una disolución 50 mM del hapteno activado NHS-OTA-1 en DMF, se tomaron 90 pL y se anadieron lentamente y con agitación constante a un volumen de 1, 7 mL de una disolución de OVA (15 mg/mL) en tampon carbonato 50 mM, pH 9, 6. Despues de 2 h de reacción en agitación suave y a temperatura ambiente, se procedio a la purification del bioconjugado como se ha descrito anteriormente para el conjugado de BSA. Las fracciones recogidas se llevaron a una concentration final de 1 mg/mL en tampon de elución con timerosal al 0, 01% (v/v) y, se almacenaron a -20 °C. Una allcuota del conjugado OVA-OTA-1 recien obtenido se dializo y liofilizo para calcular la eficiencia de la conjugation en terminos del numero de moleculas de hapteno (OTA-1) acoplados a la protelna mediante MALDI-TOF-MS (n = 9, 6, ver Tabla 1, entrada 2) .

1.4. Preparation de un bioconjugado del hapteno OTA-1 con HRP (HRP-OTA-1) . A partir de una disolución 5 mM del hapteno activado NHS-OTA-1 en DMF, se tomaron 80 pL y se anadieron lentamente y con agitación constante y suave sobre 0, 9 mL de una disolución de HRP a una concentration de 2, 5 mg/mL en tampon carbonato 50 mM, pH 7, 4. La reaction de conjugation se incubo durante 2 h a temperatura ambiente. Posteriormente, el bioconjugado se purifico siguiendo el procedimiento descrito previamente para los bioconjugados de BSA y OVA, y se llevo a una concentración de 400 pg/mL en tampon PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0, 02% (p/v) y se almacenaron a 4 °C. Una allcuota del conjugado HRP-OTA-1 recien obtenido se dializo y liofilizo para calcular la eficiencia de la conjugación en terminos del numero de moleculas de hapteno (OTA-1) acoplados a la protelna mediante MALDI-TOF-MS (n = 1, 1, ver Tabla 1, entrada 3) .

TABLA 1. Valores de la carga haptenica de los conjugados proteicos del hapteno OTA-1 determinados por MALDI-TOF-MS

RM0: relación molar inicial hapteno/protelna utilizada para la conjugation n: relación molar hapteno/protelna obtenida para cada conjugado

A (m/z) : (m/z conjugado) (m/z protelna de referencia)

Am/hapteno: incremento de masa por cada molecula de hapteno conjugada # correspondiente al ion doblemente cargado ([M+2H]2+)

Ejemplo 2: Preparation de bioconjugados de formula (I) para T = R-II, L = -CH²CH²CH²CH²-, Z = - (C=O) NH- y P = BSA, OVA y HRP.

2.1. Preparación del ester de N-hidroxisuccinimidilo del hapteno OTA-2 (NHS-OTA-2) .

Preparación de 3- (5- (benziloxi) pentil) -5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisocromano-7-carboxilato de metilo (14) . Una disolución del diester 3 (117, 0 mg, 0, 45 mmol) en THF anhidro (280 pL) se añadió gota a gota sobre una disolución de LDA en THF, generada a partir de diisopropilamina (185 pL, 1, 25 mmol, 2, 75 equiv) y 1, 6 M BuLi en hexano (710 pL, 0, 14 mmol, 2, 5 equiv) en THF (1, 4 mL) , a -78°C bajo nitrogeno. La mezcla se mantuvo a la misma temperatura durante 30 minutos y a continuation se una añ dadisióolución el aidehldo 13 (150 mg, 0, 73 mmol, 1, 6 equiv) en THF anhidro (150 pL) . La mezcla de reacción se agito a -78 °C durante 15 minutos y luego se dejo que se calentara lentamente hasta -5°C (aproximadamente 3 horas) . Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se trato con una mezcla 1:2 de AcOH-Et2O y se agito durante 10 minutos a 0°C, se diluyo con AcOEt y se lavo con agua, salmuera y se seco sobre MgSO4 anhidro para obtener, tras evaporar el disolvente a vaclo, un residuo que se purifico por cromatografla, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0, 3, 95:5:0, 3 y 85:15:0, 3) para obtener el compuesto 14 (109, 0 mg, 67%) como aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de 14 (una mezcla racemica) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.30-1.93 (m, 8H, H2-1, H2-2, H2-3 y H2-4) , 2.77 (dd, J = 17.3, 11.7 Hz, 1H, H-4) , 3.16 (dd, J = 17.3, 3.4 Hz, 1H, H-4) , 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 3H, H2-5) , 3.89 (s, 3H, OMe) , 4.44 (s, 2H, OCH2) , 4.45-4.58 (m, 1H, H-3) , 6.98-7.46 (m, 5H, Ph) , 8.05 (s, 1H, H-6) , 12.14 (s, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCh, 75 MHz) : 5 (ppm) 24.5 (C-2) , 25.9 (C-3) , 29.5 (C-4) , 30.9 (C-4) , 34.6 (C-1) , 52.5 (OMe) , 70.0 (C-5) , 72.8 (OCH2) , 78.5 (C-3) , 111.4 (C-7) , 118.2 (C-8a) , 121.7 (C-5) , 127.5 (C-4) , 127.6 (C-2 y C-6) , 128.3 (C-3 y C-5) , 137.9 (C-1) , 138.5 (C-6) , 142.3 (C-4a) , 161.0 (C-8) , 165.0 (C-1) , 167.9 (CO2) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C23H2aCl Oa [M+H]+ 433.1412, encontrado 433.1415.

Preparation del acido 3- (5- (benziloxi) pentil) -5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisocromano-7-carboxilico (15) . Una disolución de LiOH H2O (135, 0 mg, 3, 21 mmol, 10 equiv) en agua (1, 40 mL) se añad sióobre una disolución de la dihidroisocumarina 14 (139, 0 mg, 0, 32 mmol) en THF anhidro (1, 30 mL) y la mezcla se calento a reflujo durante 3, 5 horas. A continuation la mezcla de reaction se enfrio en un bano de hielo y se trato con una disolución acuosa 1M de HCl (5, 80 mL, 5, 80 mmol, 18 equiv) , se agito a 0 °C durante 2 horas, se diluyo con agua y se extrajo con AcOEt. Las fases organicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 anhidro y se concentraron a sequedad a presion reducida para obtener el acido 15 (130, 5 mg, 97%) como un semisolido amarillento, cuyo RMN de 1H muestra que tiene una pureza suficientemente elevada para ser utilizado en la siguiente etapa sin purification adicional.

Datos espectroscopicos de 15 (una mezcla racemica) : 1H-RMN (MeOD, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.42-1.91 (m, 8H, H2-1, H2-2, H2-3 y H2-4) , 2.87 (dd, J = 17.3, 11.7 Hz, 1H, H-4) , 3.21-3.29 (m, 1H, H-4) , 3.52 (t, J = 6.4 Hz, 2H, H2-5) , 4.50 (s, 2H, OCH2) , 4.56 (m, 1H, H-3) , 7.21-7.37 (m, 5H, Ph) , 8.12 (s, 1H, H-6) . 13C-RMN (MeOD, 75 MHz) : 5 (ppm) 25.8 (C-2) , 27.2 (C-3) , 30.7 (C-4) , 32.5 (C-4) , 35.7 (C-1) , 71.4 (C-5) , 74.0 (OCH2) , 79.7 (C-3) , 114.0 (C-7) , 118.6 (C-8a) , 122.8 (C-5) , 128.8 (C-4) , 129.0 (C-2 y C-6) , 129.5 (C-3 y C-5) , 138.2 (C-1) , 140.0 (C-6) , 145.4 (C-4a) , 163.0 (C-8) , 167.5 C-1) , 169.8 (CO2H) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C22H24 ClO6 [M+H]+ 419.1256, encontrado 419.1251.

Preparation de 2- (3- (5- (benziloxi) pentil) -5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisocromano-7-carboxa mido-3-fenilpropanoato de terc-butilo (17) . Una disolución de HATU (123, 5 mg, 0, 33 mmol, 1, 5 equiv) en DMF anhidra (1, 5 mL) y DIEA (80 pL, 0, 44 mmol, 2 equiv) se nadieron sobre una disolución del acido 15 (91, 0 mg, 0, 22 mmol) en DMF anhidra (1, 5 mL) bajo nitrogeno y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuation, se añadió una disolución del clorhidrato 16 (108 mg, 0, 44 mmol, 2 equiv) y DIEA (80 qL, 0, 44 mmol, 2 equiv) en DMF anhidra (1, 1 mL) y se agito a la misma temperatura durante 4 horas, se diluyo la mezcla de reaction con AcOEt y se lavo sucesivamente con disoluciones acuosas de HCl (1M) , LiCl (1, 5%) , NaHCO3 (5%) y salmuera, se seco sobre MgSO4 anhidro y se concentro a sequedad a presion reducida. El residuo obtenido se purifico por cromatografla sobre gel de sllice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0, 3, 90:10:0, 3, y 80:20:0, 3) para obtener la amida 17 como un aceite amarillento (87 mg, 65%) .

Datos espectroscopicos de 17 (una mezcla 1:1 de diasteroisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.28-1.91 (m, 8H, H2-1, H2-2, H2-3, H2-4) , 1.36 (s, 9H, CMe3) , 2.69-2.86 (m, 1H, H-4) , 3.08-3.23 (m, 3H, H-4 y H2-3) , 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 2H, H2-5) , 4.44 (s, 2H, OCH2) , 4.47-4.59 (m, 1H, H-3) , 4.86-4.96 (m, 1H, H-2) , 7.04-7.32 (m, 10H, Ph y PhBn) , 8.39 (s, 1H, H-6) , 8.50 (d, J = 5.3 Hz, 1H, NH) , 12.66 (s, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCl³, 75 MHz) : 5 (ppm) 24.5 (C-2) , 25.9 (C-3) , 27.9 (CMe3) , 29.5 (C-4) , 30.6 (C-4) , 34.6 (C-1) , 38.1 (C-3) , 54.6 (C-2) , 70.0 (C-5) , 72.9 (OCH2) , 79.2 (C-3) , 82.2 (CMe³) , 110.2 (C-8a) , 120.8 (C-7) , 123.0 (C-5) , 126.9 (C-4) , 127.5 (C-4 PhBn) , 127.6 (C-2 y C-6 PhBn) , 128.3 (C-3 y C-5) , 129.0 (C-3 y C-5 PhBn) , 129.5 (C-2 y C-6) , 136.3 (C-1) , 138.5 (C-1 PhBn) , 138.9 (C-6) , 140.6 (C-4a) , 159.0 (C-8) , 162.1 (CONH) , 169.7 (C-1) , 170.3 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C³⁵H⁴¹CINO⁷ [M+H]⁺ 622.2566, encontrado 622.2570.

Preparation de 2- (5-cloro-8-hidroxi-3- (5-hidroxipentil) -1-oxoisocromano-7-carbox amido) -3-fenilpropanoato de terc-butilo (18) . Una suspension de Pd (OH) ² (44 mg, 0, 04 mmol, 0, 3 equiv) y del eter bencllico 17 (85 mg, 0, 14 mmol) en AcOEt (4, 8 mL) se purgo con repetidos ciclos de vaclo-hidrogeno y posteriormente se agito vigorosamente bajo una presion de H² de 1 atm (globo) a temperatura ambiente durante 6 horas. La mezcla de reacción se filtro sobre una pequena columna de gel de sllice, utilizando AcOEt para lavar, y el filtrado y las aguas de lavado se concentraron a sequedad para proporcionar el alcohol 18 (65 mg, 90%) como un aceite, cuyo RMN de

¹ H muestra la presencia de un pequeno porcentaje (5-6%) del producto de hidrogenolisis del enlace C-Cl.

Datos espectroscopicos de 18 (una mezcla 1:1 de diasteroisomeros) : ¹ H-RMN (CDCl³ , 300 MHz) : ⁵ (ppm) 1.40-1.98 (m, 8H, H²-1, H²-2, H²-3, H²-4) , 1.42 (s, 9H, CMe³) , 2.78-2.94 (dos dd, J = 17.4, 11.8 Hz, 1H, H-4 de cada diastereoisomero) , 3.14-3.33 (m, 3H, H-4 y H²-3) , 3.67 (t, J = 6.4 Hz, 2H, H²-5) , 4.51-4.69 (m, 1H, H-3) , 4.96 (m, 1H, H-2) , 7.10-7.35 (m, 5H, Ph) , 8.44 (s, 1H, H-6) , 8.50-8.63 (dos d, J = 7.4 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diasteroisomero) , 12.72 (dos s, 0.5H cada uno, OH de cada diasteroisomero) . ¹³C-RMN (CDCI³ , 75 MHz) : ⁵ (ppm) 24.5 (C-2) , 25.5 (C-3) , 27.9 (CMe³) , 30.6 (C-4) , 32.4 (C-4) , 34.6 (C-1) , 38.1 (C-3) , 54.6 (C-2) , 62.6 (C-5) , 79.3 (C-3) , 82.3 (CMe³) , 110.1 (C-8a) , 120.8 (C-7) , 123.1 (C-5) , 126.9 (C-4) , 128.3 (C-2 y C-6) , 129.5 (C-3 y C-5) , 136.2 (C-1) , 138.9 (C-6) , 140.6 (C-4a) , 159.0 (C-8) , 162.1 (CONH) , 169.7 (C-1) , 170.4 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C²⁸H³⁵CINO^t [M+H]⁺ 532.2097, encontrado 532.2060.

Preparation de 2- (5-cloro-8-hidroxi- 1-oxo-3- (5-oxopentil) isocromano-7-carboxamido) -3-fenilpropanoato de terc-butilo (19) . Una suspension de Dess-Martin periodinano (DMP) (78, 0 mg, 0, 18 mmol, 1, 5 equiv) y NaHCO3 (82 mg, 0, 98 mmol, 8, 0 equiv) en CH2CI2 (1, 0 mL) se añad sióobre una mezcla del alcohol 18 (65, 0 mg, 0, 12 mmol) y NaHCO3 (82 mg, 0, 98 mmol, 8, 0 equiv) en CH2Cl2 (4 mL) enfriada a 0 °C. La mezcla resultante se agito 10 minutos a 0 °C y 1 hora a temperatura ambiente, se diluyo con AcOEt y se lavo sucesivamente con disoluciones acuosas de Na2S2O3 (10%) , NaHCO3 saturado y salmuera, se seco sobre MgSO4 anhidro y se concentro a sequedad a presion reducida para obtener el aldehldo 19 (59, 6 mg, 92%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de 19 (una mezcla 1:1 de diasteroisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.42 (s, 9H, CMe3) , 1.48-1.99 (m, 6H, H2-1, H2-2 y H2-3) , 2.52 (dt, J = 7.0, 1.1 Hz, 2H, H2-4) , 2.87 (dos dd, J = 17.3, 11.7, 0.5H cada uno, H-4 de cada diasteroisomero) , 3.14-3.31 (m, 3H, H-4 y H2-3) , 4.60 (ddt, J = 11.7, 7.7, 4.0 Hz, 1H, H-3) , 4.92-5.01 (dt, J = 7.3, 6.1 Hz, 1H, H-2) , 7.16-7.32 (m, 5H, Ph) , 8.45 (s, 1H, H-6) , 8.56 (dos d, J = 7.3 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisomero) , 9.80 (t, J = 1.4 Hz, 1H, CHO) , 12.69 (s, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCh, 75 MHz) : 5 (ppm) 21.6 (C-3) , 24.3 (C-2) , 27.9 (CMe3) , 30.6 (C-4) , 34.5 (C-1) , 38.1 (C-3) , 43.6 (C-4) , 54.6 (C-2) , 79.0 (C-3) , 82.3 (CMe3) , 110.1 (C-8a) , 120.9 (C-7) , 123.1 (C-5) , 126.9 (C-4) , 128.3 (C-2 y C-6) , 129.5 (C-3 y C-5) , 136.3 (C-1) , 139.0 (C-6) , 140.5 (C-4a) , 159.0 (C-8) , 162.3 (CONH) , 169.6 (C-1) , 170.4 (C-1) , 201.9 (C-5) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C28H33ClNO7 [M+H]+ 530.1940, encontrado 530.1920.

Preparation del acido 5- (7- ( (1- (terc-butoxi) -1-oxo-3-fenilpropan-2-il) carbamoil) -5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisocromano-3-il) pentan6ico (20) . Una disolución de NaH2PO4 (92, 7 mg, 0, 67 mmol, 6, 0 equiv) y NaClO2 (40, 5 mg, 0, 45 mmol, 4 equiv) en agua (620 pL) se adiciono sobre una disolución del aldehldo 19 (59, 6 mg, 0, 11 mmol) y 2-metilbut-2-eno (175 pL, 1, 57 mmol, 14 equiv) en tBuOH (1, 5 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuation, se añ uandaió disolución acuosa 1M de HCl (1, 5 mL) y se agito durante 3 minutos a temperatura ambiente, se diluyo con AcOEt, se lavo con salmuera y se concentro a sequedad a vaclo para obtener el acido 20 (62, 6 mg, 94%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de 20 (una mezcla 1:1 de diasteroisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.41 (dos s, 4.5H cada uno, CMe3 de cada diastereoisomero) , 1.53­ 2.00 (m, 6H, H2-3, H2-4 y H2-5) , 2.42 (t, J = 7.10 Hz, 2H, H2-2) , 2.80-2.92 (m, 1H, H-4) , 3.13-3.31 (m, 3H, H-4 y H2-3) , 4.55-4.65 (m, 1H, H-3) , 4.97 (dt, J = 7.3, 6.1 Hz, 1H, H-2) , 7.11-7.31 (m, 5H, Ph) , 8.44 (s, 1H, H-6) , 8.57-8.62 (m, 1H, NH) , 12.71 (s, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz) : 5 (ppm) 24.2 (C-4) , 27.9 (CMe3) , 29.6 (C-3) , 30.6 (C-4) , 33.6 (C-2) , 34.3 (C-5) , 38.1 (C-3) , 54.6 (C-2) , 79.0 (C-3) , 82.4 (CMe3) , 110.1 (C-8a) , 120.7 (C-7) , 123.1 (C-5) , 126.9 (C-4) , 128.3 (C-2 y C-6) , 129.5 (C-3 y C-5) , 136.2 (C-1) , 139.0 (C-6) , 140.6 (C-4a) , 159.0 (C-8) , 162.2 (CONH) , 169.6 (C-1) , 170.3 (C-1) , 178.6 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C28H33ClNO8 [M+H]+ 546.1889, encontrado 546.1867.

Preparation de 5- (7- ( (l- (terc-butoxi) - 1-oxo-3-fenilpropan-2-il) carbamoil) -5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisocromano-3-il) pentanoato de 2, 5-dioxopirrolidin-1-ilo (21) . Una isolución del acido 20 (31, 8 mg, 0, 058 mmol) , NHS (7, 3 mg, 0, 064 mmol, 1, 1 equiv) y EDC HCl (13, 4 mg, 0, 07 mmol, 1, 2 equiv) en CH3CN seco (1, 6 mL) se agito a temperatura ambiente durante 24 horas bajo nitrogeno, tras lo cual se diluyo con AcOEt y se lavo sucesivamente con agua, disolución acuosa del 5% de NaHCO3 y salmuera. Tras secar sobre MgSO4 anhidro y eliminar el disolvente a presion reducida se obtuvo el ester de N-hidroxisuccinimidilo 21 (33, 0 mg, 90%) como un aceite.

Datos espectroscopicos de 21 (una mezcla 1:1 de diasteroisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.41 (s, 9H, CMe³ ) , 1.50-1.91 (m, 6H, H2-3, H2-4 y H2-5) , 2.67 (t, J = 7.0 Hz, 2H, H2-2) , 2.83 (s, 4H, COCH2CH2CO) , 2.88-2.94 (m, 1H, H-4) , 3.14-3.24 (m, 2H, H2-3) , 3.27 (dd, J = 17.2, 3.3 Hz, H-4) , 4.54-4.68 (m, 1H, H-3) , 4.90-5.01 (m, 1H, H-2) , 7.12-7.34 (m, 5H, Ph) , 8.44 (s, 1H, H-6) , 8.55 (dos dd, J = 7.4 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diasteroisomero) , 12.69 (s, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz) : 5 (ppm) 24.2 (C-4) , 25.6 (COCH2CH2CO) , 27.9 (CMe3) , 29.6 (C-3) , 30.6 (C-2) , 30.7 (C-4) , 34.1 (C-5) , 38.1 (C-3) , 54.6 (C-2) , 78.9 (C-3) , 82.3 (CMe3) , 110.1 (C-8a) , 120.8 (C-7) , 123.1 (C-5) , 126.9 (C-4) , 128.3 (C-2 y C-6) , 129.5 (C-3 y C-5) , 136.2 (C-1) , 138.9 (C-6) , 140.5 (C-4a) , 159.0 (C-8) , 162.1 (CONH) , 168.3 (C-1) , 169.1 (COCH2CH2CO) , 169.6 (C-1) , 170.3 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C32H3aClN2O10 [M+H]+ 643.2053, encontrado 643.2050.

Preparation del acido 2- (5-cloro-3- (5- ( (2, 5-dioxopirrolidin-1-il) oxi) -5-oxopentil) -8-hidroxi-1-oxoisocroman-7-carboxamido) -3-fenilpropanoico (Ester de Nhidroxisuccimidilo del hapteno OTA-2, NHS-OTA-2) . Una disolución del ester terc-butllico 21 (33, 0 mg, 0, 051 mmol) y CF3CO2H (1, 5 mL, 19, 0 mmol, 370 equiv) en CH2Cl2 anhidro (2, 3 mL) se agito durante 2 horas a temperatura ambiente bajo nitrogeno. A continuation, los disolventes se eliminaron a sequedad a presion reducida para obtener NHS-OTA-2 (29, 8 mg, 99%) como un residuo de aspecto resinoso y color parduzco.

Datos espectroscopicos de NHS-OTA-2 (una mezcla 1:1 de diasteroisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.54-1.93 (m, 6H, H2-1, H2-2 y H2-3) , 2.68 (t, J = 6.69 Hz, 2H, H2-4) , 2.85 (s ancho, 4H, COCH2CH2CO) , 2.92 (m, 1H, H-4) , 3.17-3.43 (m, 3H, H2-3 y H-4) , 4.61 (m, 1H, H-3) , 5.03 (m, 1H, H-2) , 7.18-7.33 (m, 5H, Ph) , 8.39 (s, 1H, H-6) , 8.56 (s ancho, 1H, NH) , 12.73 (s ancho, 1H, OH) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C28H28ClN2O10 [M+H]+ 587.1427, encontrado 587.1425.

2.2. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-2 con BSA (BSA-OTA-2, ) . Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado BSA-OTA-1 a partir de 200 pL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-2 y 1, 8 mL de una disolución de BSA (15 mg/mL) en tampon carbonato 50 mM, pH 9, 6.

Tras la correspondiente purification cromatografica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentration final de 1 mg/mL en tampon de elución y se almacenaron a -20 °C. El numero de moleculas de OTA-2 conjugadas por cada molecula de BSA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 11, 8 (ver Tabla 2, entrada 1) .

2.3. Preparation de un bioconjugado del hapteno OTA-2 con OVA (OVA-OTA-2) . Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado OVA-OTA-1 a partir 100 pL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-2 y 1, 9 mL de una disolución de OVA (15 mg/mL) en tampon carbonato 50 mM, pH 9, 6. Tras la correspondiente purification cromatografica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentration final de 1 mg/mL en tampon de elución con timerosal al 0, 01% (v/v) y se almacenaron a -20 °C. El numero de moleculas de OTA-2 conjugadas por cada molecula de OVA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 3, 1 (ver Tabla 2, entrada 2) .

2.4. Preparation de un bioconjugado del hapteno OTA-2 con HRP (HRP-OTA-2) . Preparado a partir de 80 pL de una disolución 5 mM del hapteno activado NHS-OTA-2 en DMF y 0, 9 mL de una disolución de HRP (2, 5 mg/mL) en tampon carbonato 50 mM, pH 7, 4. Tras la purification cromatografica, las fracciones obtenidas conteniendo el bioconjugado se llevaron a una concentration de 460 pg/mL en tampon PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0, 02% (p/v) y se almacenaron a 4 °C. El numero de moleculas de OTA-2 conjugadas por cada molecula de HRP, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 0, 6 (ver Tabla 2, entrada 3) .

TABLA 2. Valores de la carga haptenica de los conjugados proteicos del hapteno OTA-2 determinados por MALDI-TOF-MS

RM0, n, (m /z) y Am/hapteno tienen el mismo significado que en pie de Tabla 1.

Ejemplo 3: Preparation de bioconjugados comparativos basados en el anclaje de la protelna a traves del grupo carboxilato de OTA donde L = CH2CH2CH2CH2CH2, Z = - (C=O) NH- y P = BSA, OVA y HRP.

3.1. Preparation del ester de N-hidroxisuccinimidilo del hapteno OTA-3 (NHS-OTA-3) .

Preparation de 2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano-7-carboxamido) -3-fenilpropanoato de terc-butilo (22) . A una disolución del acido 5 (40 mg, 0, 16 mmol) en DMF anhidra (1, 1 mL) se anadieron una disolución de HATU (91, 3 mg, 0, 24 mmol, 1, 5 equiv) en DMF anhidra (1, 1 mL) y DIEA (60 pL, 0, 32 mmol, 2 equiv) . La mezcla de reaction se agito durante 2 horas a temperatura ambiente y a continuation se anadio una disolución del clorhidrato 16 (82, 5 mg, 0, 32 mmol, 2 equiv) y DIEA (60 pL, 0, 324 mmol, 2 equiv) en DMF anhidra (1, 1 mL) . Se agito a temperatura ambiente durante 4 horas, tras lo cual se diluyo la mezcla de reaction con AcOEt y se lavo sucesivamente con disoluciones acuosas de HCl (1M) , LiCl (1, 5%) , NaHCO3 (5%) y salmuera, se seco sobre MgSO4 anhidro y se concentro a sequedad en el rotavapor. El residuo obtenido se purifico por cromatografla sobre gel de sllice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0, 3, 90:10:0, 3 y 80:20:0, 3) para obtener el compuesto 22 (67 mg, 65%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de 22 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.46 (s, 9H, CMe3) , 1.62-1.64 y 1.63-1.65 (dos d, J = 6.3, I . 5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisomero) , 2.84-2.89 y 2.90-2.95 (dos dd, J = I I . 7, 3.4 Hz, 0.5H cada uno, H-4 de cada diastereoisomero) , 3.25 (m, 2H, H2-3) , 3.33 (dd, J = 17.3, 3.4 Hz, 1H, H-4) , 4.80 (m, 1H, H-3) , 5.01 (dt, J = 7.4, 6.0 Hz, 1H, H-2) , 7.20-7.38 (m, 5H, Ph) , 8.49 (s, 1H, H-6) , 8.58-8.62 (dos d, J = 6.9 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisomero) , 12.77 (s, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz) : 5 (ppm) 20.6 (Me-3) , 27.9 (CMe3) , 32.2 (C-4) , 38.1 (C-3) , 54.5 (C-2) , 75.8 (C-3) , 82.3 (CMe3) , 110.0 (C-8a) , 120.8 (C-7) , 123.0 (C-5) , 126.9 (C-4) , 128.3 (C-2 y C-6) , 129.5 (C-3 y C-5) , 136.2 (C-1) , 138.9 (C-6) , 140.5 (C-4a) , 159.0 (C-8) , 162.1 (CONH) , 169.7 (C-1) , 170.3 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C24H27CINO6 [M+H]+ 460.1521, encontrado 460.1522.

Preparation del acido 2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido) -3-fenilpropanoico (23, OTA) . Acido trifluoroacetico (1, 27 mL, 16, 28 mmol, 370 equiv) se anadio sobre una disolución del ester 22 (20, 5 mg, 0, 045 mmol) en CH2Cl2 anhidro (2 mL) y la mezcla se mantuvo bajo agitación durante 2h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentro a sequedad a presion reducida para obtener 23 (17.6 mg, 99%) como un solido de color crema.

Datos espectroscopicos de 23 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.60 (d, J = 6.2 Hz, 3H, Me-3) , 2.82 y 2.88 (dos dd, J = 11.5, 3.2 Hz, 0.5H cada uno, H-4 de cada diastereoisomero) , 3.16-3.40 (m, 3H, H2-3 y H-4) , 4.75 (m, 1H, H-3) 4.99-5.08 (m, 1 H, H-2) 7.10-7.37 (m, 5H, Ph) 8.42 (s, 1H, H-6) , 8.50 (dos d, J = 6.8 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisomero) , 12.74 (s, 1H, OH) . 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz) : 5 (ppm) 20.6 (Me-3) , 32.2 (C-4) , 37.3 (C-3) , 54.3 (C-2) , 75.9 (C-3) , 110.0 (C-8a) , 120.2 (C-7) , 123.2 (C-5) , 127.3 (C-4) , 128.3 (C-2 y C-6) , 129.3 (C-3 y C-5) , 135.7 (C-1) , 138.9 (C-6) , 141.0 (C-4a) , 159.0 (C-8) , 163.1 (CONH) , 169.7 (C-1) , 175.1 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C20H19ClNO6 [M+H]+ 404.0895, encontrado 404.0901.

Preparation de 6- (2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano-7-carboxamido) -3-fenilpropanamido) hexanoato de metilo (25) . Sobre una disolución del acido 23 (18 mg, 0, 044 mmol) y cloruro de 6-metoxi-6-oxohexan-1-amonio (24, 9, 4 mg, 0, 052 mmol, 1, 1 equiv) en DMF anhidra (600 pL) bajo nitrogeno se añ DaIdEióA (25 pL, 0, 143 mmol, 3, 25 equiv) , la mezcla resultante se agito durante 10 minutos y seguidamente se anadio una disolución de PyAOP (34 mg, 0, 065 mmol, 1, 5 equiv) en DMF anhidra (600 pL) . Tras 4 horas de agitación a temperatura ambiente, la mezcla se diluyo con AcOEt y se lavo con disoluciones acuosas de LiCl (1, 5%) y NaHCO3 (5%) y salmuera, se seco sobre MgSO4 anhidro. El residuo obtenido tras la evaporation del disolvente a presion reducida se purifico por cromatografla sobre gel de sllice, empleando como eluyente mezclas de CHCl3-MeOH (100:0 y 99:1) para obtener la amida 25 (16, 8 mg, 72%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de 25 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) : 5 (ppm) 1.11-1.28 (m, 2H, H2-4) , 1.31-1.44 (m, 2H, H2-5) , 1.49-1.63 (m, 2H, H2-3) , 1.61 (dos d, J = 6.4 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada uno de los diastereoisomeros) , 2.17-2.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H, H2-2) , 2.86 (dos dd, J = 11.6, 1.6 Hz, 0.5H cada uno, H-4 de cada diastereoisomero) , 3.04-3.37 (m, 5H, H2-6, H2-3 y H4) , 3.66 (s, 3H, OMe) , 4.62-4.89 (m, 2H, H-3 y NH) , 5.83 (m, 1H, H-2) , 7.12-7.40 (m, 5H, Ph) , 8.41 (s, 1H, H-6) , 8.59 (d, J = 7.4 Hz, 1H, NH) , 12.81 (s, 1H, OH) .

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz) : 5 (ppm) 20.7 (Me-3) , 24.4 (C-3) , 26.2 (C-4) , 28.9 (C-5) , 32.2 (C-4) , 33.8 (C-2) , 38.4 (C-3) , 39.2 (C-6) , 51.5 (OMe) , 55.7 (C-2) , 75.9 (C-3) , 110.1 (C-8a) , 120.6 (C-7) , 123.1 (C-5) , 127.0 (C-4) , 128.6 (C-2 y C-6) , 129.3 (C-3 y C-5) , 136.8 (C-1) , 138.8 (C-6) , 140.8 (C-4a) , 159.0 (C-8) , 162.7 (CONH) , 169.7 (C-1) , 170.4 (C-1) , 173.9 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C27H32CIN2O7 [M+H]+ 531.1893, encontrado 531.1878.

Preparation del acido 6- (2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido) 3-fenilpropanamido) hexanoico (26) . Una disolución de LiOH H2O (13 mg, 0, 31 mmol, 10 equiv) en agua (700 qL) se aña sdoióbre una disolución del ester metllico 25 (16, 6 mg, 0, 031 mmol) en THF (700 qL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuation, la mezcla de reaction se enfrio en un bano de hielo y se acidifico con una disolución acuosa 1M de KHSO4 hasta pH=2, se diluyo con AcOEt, se lavo con salmuera y se seco sobre MgSO4 anhidro para obtener, tras evaporar el disolvente a presion reducida, un residuo que se disolvio en THF anhidro (1, 2 mL) sobre el que se añadió una gota de HCl 4M en dioxano. Tras 30 min de agitation a temperatura ambiente, el disolvente se elimino a vaclo hasta sequedad para obtener el acido 26 (15, 7 mg, 98%) como un semisolido amarillento.

Datos espectroscopicos de 26 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : 1H-RMN (DMSO-da, 500 MHz) : 5 (ppm) 1.18-1.28 (m, 2H, H2-4) , 1.30-1.40 (m, 2H, H2-5) , 1.42­ 1.52 (m, 2H, H2-3) , 1.46-1.47 (dos d, J = 6.4 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada uno de los diastereoisomeros) , 2.14-2.20 (t, J = 7.4 Hz, 2H, H2-2) , 2.88-3.08 (m, 6H, H-4, H2-3, H2-6 y NH) , 3.22 (dd, J = 17.2, 3.1 Hz, 1H, H-4) , 4.69-4.76 (m, 1H, H-3) , 4.84 (m, 1H, H-2) , 7.15-7.28 (m, 5H, Ph) , 8.08 y 8.09 (dos s, 0.5H cada uno, H-6 de cada diastereoisomero) , 8.14 y 8.60 (dos m, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisomero) .

13C-RMN (DMSO-^6, 125 MHz) : 5 (ppm) 20.0 (Me-3) , 24.2 (C-3) , 25.9 (C-4) , 28.6 (C-5) , 31.6 (C-4) , 33.56 (C-2) , 38.1 (C-3) , 38.4 (C-6) , 54.5 (C-2) , 75.4 (C-3) , 111.3 (C-8a) , 120.2 (C-7) , 121.4 (C-5) , 126.4 (C-4) , 128.1 (C-2 y C-6) , 129.2 (C-3 y C-5) , 136.0 (C-1) , 139.2 (C-6) , 141.6 (C-4a) , 158.4 (C-8) , 162.54 (CONH) , 169.9 (C-1) , 169.9 (C-1) , 174.3 (C-1) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C26H30CIN2O7 [M+H]+ 517.1736, encontrado 517.1731.

Preparation de 6- (2- (5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido) -3-fenil propanamido) hexanoato de 2, 5-dioxopirrolidin-1-ilo (Ester de W-hidroxisuccimidilo del hapteno OTA-3, NHS-OTA-3) . Una disolución de EDCHCl (7, 0 mg, 0, 037 mmol, 1, 2 equiv) en DMF anhidra (0, 5 mL) se adiciono sobre una disolución del acido 26 (16 mg, 0, 031 mmol) y NHS (3, 9 mg, 0, 034 mmol, 1, 1 equiv) en DMF anhidra (0, 5 mL) bajo nitrogeno. La mezcla se mantuvo bajo agitación a temperatura ambiente durante 24 horas y a continuation se trato con una disolución saturada de NH4Cl, se diluyo con AcOEt y se lavo con disoluciones acuosas de LiCl (1, 5%) , NaHCO3 (5%) y salmuera.

Tras secar sobre MgSO⁴ anhidro y evaporar el disolvente a presion reducida se obtuvo un residuo que se purifico por cromatografia sobre gel de sflice, empleando como eluyente mezclas de CH² Cl²-acetona (90:10, 85:15 y 80:20) , para obtener el ester NHS-OTA-3 (8, 5 mg, 45%) como aceite amarillento.

Datos espectroscopicos de NHS-OTA-3 (una mezcla 1:1 de diastereoisomeros) : ¹ H-RMN (DMSO-d^a , 500 MHz) : 5 (ppm) 1.29-1.37 (m, 2H, H²-4) , 1.39-1.47 (m, 2H, H² -5) , 1.60 (d, J = 6.4 Hz, 3H, Me-3) , 1.64-1.78 (m, 2H, H²-3) , 2.56 (t, J = 6.8 Hz, 2H, H²-2) , 2.76-2.93 (m, 5H, H-4, COCH² CH² CO) , 3.06-3.37 (m, 5H, H-4, H² -3 y H²-6) , 4.68­ 4.91 (m, 2H, H-3 y NH) , 6.04 (m, 1H, H-2) , 7.16-7.35 (m, 5H, Ph) , 8.38 (s, 1H, H-6) , 8.60 (d, J = 7.0 Hz, 1H, NH) , 12.79 (s, 1H, OH) . EMAR (TOF ESI+) : calculado para C³⁰ H³³ N³ ClO⁹ [M+H]⁺ 614.1900, encontrado 614.1892.

3.2. Preparation de un bioconjugado del hapteno OTA-3 con BSA (BSA-OTA-3) . Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado BSA-OTA-1 a partir de 178 pL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-3 y 1, 6 mL de una disolución de BSA (15 mg/mL) en tampon carbonato 50 mM, pH 9, 6.

Tras la correspondiente purification cromatografica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentration final de 1 mg/mL en tampon de elución y se almacenaron a -20 °C. El numero de moleculas de OTA-3 conjugadas por cada molecula de BSA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 14, 4 (ver Tabla 3, entrada 1) .

3.3. Preparation de un bioconjugado del hapteno OTA-3 con OVA (OVA-OTA-3) . Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado OVA-OTA-1 a partir de 100 pL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-3 y 1, 9 mL de una disolución de OVA (15 mg/mL) en tampon carbonato 50 mM, pH 9, 6.

Tras la correspondiente purification cromatografica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentration final de 1 mg/mL en tampon de elución con timerosal al 0, 01% (v/v) y se almacenaron a -20 °C. El numero de moleculas de OTA-3 conjugadas por cada molecula de OVA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 3, 0 (ver Tabla 3, entrada 2) .

3.4. Preparation de un bioconjugado del hapteno OTA-3 con HRP (HRP-OTA-3, ) . Preparado a partir de 80 pL de una disolución 5 mM del hapteno activado NHS-OTA-3 en DMF y 0, 9 mL de una disolución de HRP (2, 5 mg/mL) en tampon carbonato 50 mM, pH 7, 4. Tras la purification cromatografica, las fracciones obtenidas conteniendo el bioconjugado se llevaron a una concentration de 470 pg/mL en tampon PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0, 02% (p/v) y se almacenaron a 4 °C. El numero de moleculas de OTA-3 conjugadas por cada molecula de HRP, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 0, 9 (ver Tabla 3, entrada 3) .

TABLA 3. Valores de la carga haptenica de los conjugados proteicos del hapteno OTA-3 determinados por MALDI-TOF-MS

m /z proteins

RMo referenda ^m/z A (m/z) Am/hapteno n

1 BSA-OTA-3 24 66.428 73.642 7.214 500 14, 4

2 OVA-OTA-3 8 21.340# 22.079# 739 500 3, 0

3 HRP-OTA-3 8 43.928 44.382 454 500 0, 9

RM0, n, A (m /z) , Am/hapteno y # tienen el mismo significado que en pie de Tabla 1.

2. Procedimiento ELISA

Se emplearon placas de poliestireno de 96 pocillos. Cada anticuerpo se evaluo en los dos formatos clasicos de ELISA competitivo (el de antlgeno o conjugado inmovilizado con detection indirecta y el de anticuerpo inmovilizado con detection directa y pretapizado) usando antlgenos de ensayo homologos, es decir, un antlgeno de ensayo a partir del mismo bioconjugado de formula (I) o bioconjugado comparativo que el utilizado para obtener el inmunogeno pero en el que P = OVA o HRP. Despues de cada etapa de incubation, las placas se lavaron cuatro veces con una disolución de lavado, usando un lavador de 96 canales ELx405 (Biotek Instruments, Winooski, EE.UU.) . La senal producida por la peroxidasa utilizada como marcador se revelo con 100 pL por pocillo de una disolución 2 mg/mL de o-fenilendiamina en tampon citrato 25 mM, fosfato 62 mM, pH 5, 4, conteniendo 0, 012% (v/v) de H2O2. Este revelado se desarrollo durante 10 min a temperatura ambiente y se paro usando 100 pL por pocillo de acido sulfurico 2, 5 M. Al finalizar los ensayos, la absorbancia de cada pocillo se leyo a 492 nm usando una longitud de onda de referencia de 650 nm en un lector de microplacas PowerWave HT (Biotek Instruments, Winooski, EE.UU.) . Las curvas patron sigmoideas obtenidas al representar la absorbancia frente a la concentration de analito se ajustaron a una ecuación logistica de cuatro parametros usando el paquete informatico SigmaPlot de SPSS (Chicago, EE.UU.) .

La afinidad del anticuerpo (IC50) se estimo como la concentración de analito libre capaz de reducir a la mitad la senal maxima (Amax) .

2.1. Ensayos ELISA competitivos en formato de antlgeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta (ensayo indirecto)

Las placas se tapizaron con 100 pL por pocillo de una disolución de antlgeno de ensayo que es un bioconjugado de formula (I) o bioconjugado comparativo donde P es OVA, a diversas concentraciones en tampon carbonato 50 mM, pH 9, 6, mediante incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Despues de lavar las placas, en cada columna se dispenso 50 pL por pocillo de una curva estandar completa del analito en PBS seguido de 50 pL por pocillo de un determinado anticuerpo diluido en PBST (0, 05% Tween 20) . La reaction inmunoquimica se llevo a abo durante 1 h a temperatura ambiente y despues se lavaron las placas. A continuation, cada pocillo recibio 100 pL de una dilution 1/2000 de RAM-HRP (inmunoglobulinas de conejo anti-raton marcadas con peroxidasa) en PBST. Esta reaction se dejo a temperatura ambiente durante 1 h. Despues de lavar las placas, se revelo la actividad peroxidasa retenida y se leyo la absorbancia a 492 nm como se ha descrito anteriormente.

2.2. Ensayos ELISA competitivos en formato de anticuerpo inmovilizado con detection directa (ensayo directo)

Las placas se tapizaron con 100 pL por pocillo de una dilución de anticuerpo de captura en tampon carbonato 50 mM, pH 9, 6, por incubation durante toda la noche a temperatura ambiente. Despues de lavar las placas, se 100 pL por p aoñacdililóo de anticuerpo o antisuero en PBST a la concentration o dilución considerada como optima, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Despues de lavar de nuevo las placas, en cada columna se dispenso 50 pL por pocillo de una curva estandar completa del analito en PBS seguido de 50 pL por pocillo de una dilución concreta en PBST de bioconjugado enzimatico que es un bioconjugado de formula (I) o bioconjugado comparativo donde P es HRP. La reacción inmunoqulmica se llevo a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y despues se lavaron las placas. Finalmente, se revelo la actividad peroxidasa retenida y se leyo la absorbancia a 492 nm como se ha descrito.

3. Inmunización de conejos

Se inmunizaron, siguiendo protocolos estandarizados, 2 hembras de conejo de la raza New Zealand con cada bioconjugado de formula (I) o bioconjugado comparativo donde P es BSA. Cada animal recibio 0, 3 mg de uno de los bioconjugados de formula (I) o el bioconjugado comparativo disuelto en 1 mL de una mezcla 1:1 de tampon PB y adyuvante de Freund completo. La inmunización prosiguio con la inoculation de una dosis de recuerdo cada 21 dlas con la misma cantidad de conjugado pero empleando adyuvante de Freund incompleto. Diez dlas despues de la cuarta inyección, los animales fueron desangrados y la sangre obtenida se dejo coagular a 4 °C durante toda la noche. Al dla siguiente, se recuperaron los sueros por centrifugation, se diluyeron a % con PBS frlo y se les un volum añeadnió de una disolución saturada de ulfato amonico. El precipitado proteico resultante de cada suero se recogio por centrifugación y se redisolvio en tampon PBS frio. Finalmente, las protemas se reprecipitaron como anteriormente y se almacenaron en este estado a 4 °C. Este precipitado contiene una mezcla indeterminada de protemas que denominamos antisuero, anticuerpo policlonal o simplemente anticuerpo. Se obtuvieron dos anticuerpos de cada bioconjugado de formula (I) y del bioconjugado comparativo donde P es BSA, identificados como #1 y #2.

4. Producción de anticuerpos monoclonales de raton

4.1. Inmunización de ratones

Para la inmunización se emplearon los bioconjugados de formula (Ia) y (Ib) en los que P es BSA (conjugados inmunizantes) obtenidos en los ejemplos anteriores. Se utilizaron hembras de raton BALB/c, con una edad al inicio del proceso comprendida entre 6 y 8 semanas.

En cada dosis se administraron por via intraperitoneal 100 pg de bioconjugado por raton, siendo el volumen total administrado 200 pL. En la primera inmunización se suministro el bioconjugado en una emulsion preparada con adyuvante de Freund completo (1:1, v/v) . A intervalos de 3 semanas, los ratones recibieron dos inmunizaciones adicionales, en estos casos emulsionando los bioconjugados con adyuvante de Freund incompleto. Cuatro dias antes de cada fusion celular, los ratones seleccionados recibieron una ultima dosis de 100 pg del correspondiente bioconjugado diluido en PBS.

4.2. Fusiones celulares para la obtención de hibridomas

Las fusiones con los ratones inmunizados se llevaron a cabo basicamente siguiendo metodologias previamente descritas y bien establecidas en el estado de la técnica. Inmediatamente despues del sacrificio de los ratones se extrajo el bazo, que se homogeneizo con el embolo de una jeringa esteril. Tras lisar los globulos rojos por choque osmotico con 1 mL de tampon de lisis durante un minuto en frio, los linfocitos e lavaron 2 veces con medio completo (con suero) frlo y se filtraron para eliminar los coagulos formados.

La llnea de mieloma P3-X63-Ag8.653 fue cultivada los dlas previos a la fusion en medio DMEM suplementado [2 mM L-alanina-L-glutamina, 1 mM aminoacidos no esenciales, 25 pg/mL gentamicina, suero bovino fetal (SBF) 10% (v/v) ], manteniendo las celulas en fase de crecimiento exponencial, de manera que el dla de la fusion se dispuso de un numero suficiente de las mismas.

Tras dos lavados con medio sin suero, ambas poblaciones celulares se juntaron a una relación linfocito:mieloma 4:1. A continuation, las celulas se centrifugaron, para inmediatamente despues llevar a cabo la fusion celular. Para ello, se empleo el agente fusionante qulmico PEG1500 (1 mL por bazo, 1 min) , que al disolver parcialmente las membranas permite la fusion de las celulas. Una vez fusionadas ambas poblaciones, las celulas se resuspendieron en medio DMEM suplementado [SBF 15% (v/v) ] y se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (100 pL por pocillo) a una densidad celular de 150*103 linfocitos por pocillo, y se incubaron a 37 °C en una atmosfera con 5% de CO2 y un 95% de humedad. 24 h despues de la fusion, se 100 pL por añadió pocillo de medio HAT para selection de hibridomas [DMEM suplementado con 100 pM hipoxantina, 0, 4 pM aminopterina, 16 pM timidina, y SBF 20% (v/v) ] que contenla HFCS (High Fusion and Cloning Supplement) al 1% (v/v) .

4.3. Selección, clonaje y conservation de hibridomas

Aproximadamente 10-12 dlas despues de la fusion celular se llevo a cabo la evaluation de los sobrenadantes de los pocillos sembrados, con objeto de identificar cuales contenlan hibridomas secretores de anticuerpos capaces de reconocer ocratoxina A tanto en su forma conjugada como libre (clones competidores) .

Previamente, se determino por inspection visual la eficiencia de la fusion, definida como el porcentaje de pocillos que presentaban al menos un clon claramente visible al microscopio.

Para llevar a cabo la identification de clones competidores, los sobrenadantes de cultivo se analizaron mediante la técnica ELISA diferencial, que consiste en analizar aralelamente en pocillos adyacentes cada sobrenadante en ausencia de analito y en presencia de una concentration prefijada de analito, habitualmente 100 nM. Para ello, las placas se tapizaron con el conjugado homologo, que es un bioconjugado de formula (I) en el que P es OVA, a una concentración de 0, 1 pg/mL, y el ensayo se llevo a cabo anadiendo 50 pL del sobrenadante de cultivo. Las condiciones para el formato de ELISA indirecto se detallan en el apartado 2.1.

A continuation, se seleccionaron aquellos pocillos que contenlan hibridomas productores de anticuerpos capaces de proporcionar una senal de absorbancia igual o superior a 0, 5 en el ensayo en ausencia de ocratoxina A e inhibition de la senal igual o superior al 80% en el ensayo en presencia de ocratoxina A. Adicionalmente, para todos los pocillos positivos se llevo a cabo un segundo cribado mas exhaustivo en modo bidimensional competitivo con el fin de seleccionar con mayor seguridad los mejores hibridomas. Para ello, el sobrenadante de cada hibridoma se ensayo a 4 diluciones (1/8, 1/32, 1/128 y 1/512) en placas tapizadas con el bioconjugado homologo a 0, 01 y 0, 1 pg/mL, y utilizando como competidor ocratoxina A a 10 y 100 nM (en ensayo) . Asl, 200 pL del sobrenadante de cultivo se diluyeron en 600 pL de PBST y las siguientes diluciones se hicieron de forma seriada a partir de esta primera. El ensayo se realizo anadiendo 50 pL por pocillo de la correspondiente dilution de sobrenadante y 50 pL de la disolución de ocratoxina A en PBS a la concentración de 100, 10 y 0 nM.

Las celulas de los pocillos finalmente seleccionados se clonaron por el método de dilución llmite, sembrando a partir de cada pocillo una nueva placa de 96 pocillos a 2 celulas por pocillo en medio HT, de igual composition que el HAT pero sin aminopterina, y conteniendo HFCS al 1% (v/v) .

Generalmente, 7-10 dlas despues del primer clonaje, se identificaron por inspection visual los pocillos que contenlan un unico clon, evaluandose de nuevo el sobrenadante de cultivo de la misma forma que se ha descrito previamente para los sobrenadantes de fusion. Este proceso se realizo tantas veces como fue necesario (al menos dos) para asegurar la monoclonalidad de los hibridomas seleccionados, asl como su estabilidad. Finalmente, se procedio a la expansion de las llneas celulares seleccionadas, cultivando progresivamente el hibridoma en recipientes de mayor olumen. Una vez crecido el clon, las celulas se congelaron en nitrogeno llquido a una concentration de 107 celulas por vial (2-4 viales para cada hibridoma) en una disolución de SBF con DMSO 10% (v/v) como agente crioprotector. Los viales se mantuvieron a -80 °C en el interior de una caja de poliestireno durante 24 h antes de pasarlos al contenedor de nitrogeno llquido.

4.4. Production y purification de anticuerpos monoclonales

En la ultima fase de la expansion celular de los hibridomas, estos se dividieron progresivamente en placas de cultivo hasta alcanzarse un volumen final comprendido entre 100 y 200 mL de sobrenadante. Se dejaron crecer las celulas hasta alcanzar la confluencia, y una vez agotados los nutrientes del medio de cultivo se procedio a recoger el contenido de las placas. El volumen recogido se centrifugo para eliminar los restos celulares y el sobrenadante se precipito mediante la adición de un volumen de una disolución saturada de sulfato amonico, manteniendose a 4 °C hasta su purificación.

La purificación de los anticuerpos se realizo por cromatografla de afinidad con columnas de protelna G siguiendo las instrucciones del fabricante. Con este proposito, el anticuerpo precipitado se centrifugo durante 20 min a 5000 rpm (4000*g) y se descarto el sobrenadante. El precipitado que contenla los anticuerpos se redisolvio con tampon fosfato sodico 20 mM, pH 7, 4 y se filtro con membranas de nitrocelulosa (diametro de poro 0, 45 pm) para eliminar partlculas en suspension. La elución del anticuerpo de la columna se realizo con tampon citrato sodico 100 mM, pH 2, 5. Las fracciones que contenlan el anticuerpo se identificaron mediante espectrofotometrla UV y se recogieron. La disolución se neutralizo adicionando Tris-HCl 1 M, pH 9, 5. Finalmente, se determino por espectrofotometrla UV la concentración del anticuerpo purificado [A280 (1 mg/mL IgG) = 1, 4] y se preparo una disolución de trabajo a una concentración de 500 pg/mL en PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0, 01% (p/v) , que se almaceno a 4 °C. La disolución restante se precipito con sulfato amonico saturado [1:1, (v/v) ], lo cual garantiza su estabilidad a 4 °C durante anos.

5. Resultados

5.1. Respuesta inmune y determinación de la afinidad de los antisueros

Cada uno de los antisueros obtenidos se ensayo frente a su antlgeno de ensayo homologo usando el ensayo de tipo ELISA competitivo en el formato de anticuerpo inmovilizado. Se ensayaron diferentes concentraciones de antlgeno de ensayo frente a diferentes concentraciones de anticuerpo utilizando como competidor varias concentraciones de ocratoxina A preparadas por dilución seriada. Los tres inmunogenos produjeron respuestas inmunes adecuadas, con tltulos elevados y habituales para este tipo de analitos. Sin embargo, mientras los antisueros procedentes de animales inmunizados con los inmunogenos de formula Ia y Ib presentaron una elevada afinidad hacia ocratoxina A, con valores de IC50 cercanos o inferiores a 1 nM, los antisueros obtenidos a partir del inmunogeno comparativo mostraron afinidades hacia ocratoxina A claramente inferiores (mayor IC50) . Este resultado confirma que unas estructuras son mas idoneas que otras para el objetivo que se persigue, y que los haptenos funcionalizados a traves de posiciones alternativas al grupo carboxilato de la ocratoxina A, y que por tanto dejan dicho grupo libre, dan lugar a anticuerpos de mayor afinidad hacia la micotoxina diana. Los valores de la senal maxima, de la IC50 y de la pendiente de la curva de inhibición resultante para cada antisuero con antlgeno de ensayo homologo se han incluido en la Tabla 4.

TABLA 4 Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo de antisuero inmovilizado con detection directa

Antisuero Trazador Dilution

& (ng/mL) As. (x10³) A^_max Pendiente IC₅₀ (nM)

Ia#1 10 36 1, 632 0, 541 0, 735

Ia#2 30 36 1, 472 0, 442 1, 889

Ib#1 30 12 1, 523 0, 408 0, 445

Ib#2 10 36 1, 050 0, 709 0, 361 Comp.#1 10 12 1, 574 0, 394 9, 842 Comp.#2 100 36 1, 225 0, 359 >100

& Antisueros de conejo; inmunización con los conjugados BSA-OTA-1 (la) , BSA-OTA-2 (lb) y BSA-OTA-3 (Comp.) ,

5.2. Generación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente a ocratoxina-A

Para demostrar de manera mas concluyente la idoneidad de los bioconjugados de formula (Ia) y (Ib) para la obtención de anticuerpos anti-ocratoxina A, se inmunizaron ratones con ambos conjugados de formula (Ia) y (Ib) en los que P es BSA y se llevaron a cabo fusiones celulares encaminadas a la generación de hibridomas. Se consiguio obtener 4 llneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales con elevada afinidad hacia ocratoxina A a partir del bioconjugado de formula (Ia) , y 7 llneas celulares a partir del bioconjugado de formula (Ib) . Los anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de dichos hibridomas se han denominado a efectos de la presente invention y de los ejemplos aqul incluidos: mAb Ia#39, mAb Ia#41, mAb Ia#310a y mAb Ia#310b (anticuerpos monoclonales a partir del bioconjugado de formula Ia) ; y mAb Ib#16, mAb Ib#21, mAb Ib#27, mAb Ib#111, mAb Ib#114, mAb Ib#115 y mAb Ib#118 (anticuerpos monoclonales a partir del bioconjugado de formula Ib) . Estos resultados ponen de manifiesto que los bioconjugados de formula (Ia) y (Ib) son adecuados para obtener anticuerpos monoclonales de muy elevada afinidad frente a ocratoxina A.

5.3. Determinación de la afinidad de los anticuerpos

Una vez purificados por cromatografla de inmunoafinidad los 11 anticuerpos monoclonales obtenidos, se determino su afinidad hacia ocratoxina A mediante ELISA competitivo directo homologo. Cada anticuerpo monoclonal se ensayo a varias concentraciones (100, 300 y 1000 ng/mL) frente a diferentes concentraciones de trazador enzimatico (300, 100, 30 y 10 ng/mL) , que es un derivado marcado de formula II donde Q es peroxidasa. Los valores de Amax, pendiente e IC50 para cada anticuerpo monoclonal que se muestran en la Tabla 5 corresponden a la combination optima, es decir, a la concentration de inmunorreactivos que genero la curva de calibration con un menor valor de IC50, y por tanto una afinidad mayor para ocratoxina A. En dicho formato de ensayo los anticuerpos mostraron valores de IC50 para ocratoxina A comprendidos entre 0, 071 y 1, 457 nM, siendo el anticuerpo con mayor afinidad de entre los producidos a partir del bioconjugado de formula Ia el mAb Ia#310b (IC50=0, 071 nM) , y el anticuerpo con mayor afinidad de entre los producidos a partir del bioconjugado de formula Ib el mAb Ib#115 (IC50=0, 169 nM) .

TABLA 5 Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo homologo de anticuerpo inmovilizado con detection directa

Anticuerpo Trazador

monoclonal (ng/mL) mAb (ng/mL) A^max Pendiente IC50 (nM) Ia#38 10 100 1, 880 1, 309 0, 504 Ia#39 30 100 1, 907 0, 891 1, 457 Ia#310a 30 100 1, 013 1, 116 0, 088 Ia#310b 30 100 1, 054 1, 324 0, 071

Ib#16 30 100 1, 739 2, 003 0, 397 Ib#25 30 100 1, 639 1, 468 0, 394 Ib#27 30 100 1, 830 1, 128 1, 114 Ib#111 30 100 1, 679 2, 219 0, 321 Ib#114 30 100 1, 958 1, 442 0, 623 Ib#115 100 100 1, 245 1, 277 0, 169 Ib#118 100 100 2, 499 1, 646 0, 357

ES-2672945_A1

La presente invención se refiere a bioconjugados y derivados marcados de ocratoxina A por posiciones diferentes de la molécula, adecuados para la producción de anticuerpos de elevada afinidad para ocratoxina A. Asimismo, la presente invención también se refiere al uso de bioconjugados de ocratoxina A y de derivados marcados de ocratoxina A como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis, concentración y extracción de ocratoxina A utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar ocratoxina A que comprende anticuerpos frente a esta micotoxina, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la ocratoxina A.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las biotoxinas son un tipo de contaminante cuya presencia en alimentos, aguas y piensos representa un verdadero problema para la salud humana y el bienestar animal, ocasionando importantes pérdidas económicas a los sectores agroalimentario, agropecuario y piscícola. La clase de biotoxinas más frecuentemente detectadas en alimentos son las producidas por hongos, o micotoxinas. Aunque se han identificado más de 400 diferentes micotoxinas con una gran diversidad estructural, es sobre las toxicológicamente más relevantes sobre las que existe una reglamentación más definida en cuanto a los límites máximos permitidos en alimentos.

La ocratoxina A es la micotoxina más importante de la familia de las ocratoxinas. Estructuralmente consiste en una molécula de L-fenilalanina unida, a través de un puente amida, a un grupo p-clorofenólico que contiene un grupo de dihidroisocumarina (Figura 1). Los principales efectos nocivos de esta micotoxina son nefrotóxicos, aunque también se ha observado actividad hepatotóxica, neurotóxica, teratogénica, inmunotóxica y carcinogénica en diferentes especies animales. La ocratoxina A es sospechosa de ser la causa de enfermedades crónicas de desenlace fatal, como la

nefropatía endémica de los Balcanes (BEN) y la nefropatía de Túnez (TCIN). Además, dado que el consumo de alimentos contaminados con OTA está asociado con una mayor incidencia de tumores en el tracto urinario superior en el hombre, esta micotoxina ha sido clasificada como posible carcinógeno por la Intemational Agency for Research on Cáncer (IARC). Dos especies del género Penicillium producen ocratoxina A: P. verrucosum, la principal fuente de contaminación en grano almacenado, y P. nordicum, el mayor productor encontrado en productos cárnicos. No obstante, la mayoría de los hongos ocratoxigénicos son del género Aspergillus, y particularmente uno de los principales productores es A. carbonarius, el cual se encuentra frecuentemente en viñedos. Por orden de aporte de ocratoxinas totales a la dieta encontramos los cereales (58%), el vino (21%), el zumo de uva (7%), el café (5%) y la carne de cerdo (3%).

Las técnicas analíticas para la determinación de ocratoxina A en alimentos son fundamentalmente de dos tipos: cromatográficas y de reconocimiento molecular. Entre las primeras, la que goza de más aceptación actualmente es HPLC-MS/MS, mientras que entre las segundas la mayoría emplea anticuerpos como elemento de detección. Las técnicas cromatográficas constituyen la metodología de referencia, debido a su elevada sensibilidad, reproducibilidad y fundamentalmente por su capacidad de determinar varias micotoxinas simultáneamente (K. F. Nielsen et al., J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 1029-1034). Por su parte, las técnicas basadas en la interacción anticuerpo-analito (inmunoensayos, cromatografía de afinidad, tiras inmunorreactivas) se consideran la mejor opción cuando es necesario realizar un elevado número de análisis en poco tiempo y/o en entornos poco dotados técnicamente. De hecho, las micotoxinas, y en particular la ocratoxina A, constituyen probablemente el grupo de contaminantes en donde estos métodos rápidos inmunoquímicos han alcanzado un mayor grado de aceptación e implantación, existiendo un gran número de empresas de inmunodiagnóstico que comercializan ensayos tipo kit para la detección de estos contaminantes (E. P. Meulenberg, Toxins 2012, 4, 244-266).

Los métodos inmunoanalíticos se basan en la unión selectiva, reversible y no covalente entre la sustancia a detectar (analito) y un anticuerpo que la reconoce específicamente. La ocratoxina A, debido a su bajo peso molecular, no es

inmunogénica, y por tanto es incapaz de generar una respuesta inmune por sí misma cuando se inyecta en un animal de experimentación. Para poder generar anticuerpos para ocratoxina A es necesario acoplarla covalentemente a una proteína, de forma que el conjugado obtenido sí resulte inmunogénico y permita la producción de anticuerpos frente a la micotoxina. Para conseguir obtener estos conjugados, a menudo es necesario recurrir al diseño y síntesis ex novo de un derivado, a través de estrategias que permitan la incorporación, en la posición deseada de la molécula, de una cadena hidrocarbonada con un grupo funcional terminal, respetando su estructura y grupos químicos característicos. Esta estrategia posibilita presentar la molécula al sistema inmune de la manera más adecuada para lograr anticuerpos de gran afinidad y especificidad. Sin embargo, la ocratoxina A posee en su estructura un grupo carboxilato que posibilita el anclaje directo a la proteína, por lo que, debido a las dificultades sintéticas que conlleva la síntesis total de derivados potencialmente más adecuados desde el punto de vista estructural, todos los anticuerpos obtenidos hasta la fecha capaces de reconocer a ocratoxina A se han obtenido empleando dicho grupo carboxilato para la obtención de los conjugados. La efectividad de esta estrategia ha sido muy variable (X. Li et al., Food Anal. Methods 2013, 6, 1433-1440). En todo caso, la generación de anticuerpos para ocratoxina A a partir de haptenos en los que el grupo carboxilato se encuentre libre y por tanto pueda interaccionar con el anticuerpo, constituye una vía no explorada que podría permitir la generación de anticuerpos con características diferentes a las de los actualmente disponibles, adecuados no sólo para el desarrollo de inmunoensayos más sensibles y específicos, sino también para su implementación en nuevas plataformas analíticas basadas en tecnologías avanzadas, tales como biosensores de diferente tipo, ensayos multiplex y métodos basados en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).

Existe por tanto la necesidad de obtener derivados funcionalizados de ocratoxina A no explorados anteriormente que permitan la generación de anticuerpos de mayor afinidad que los producidos hasta la fecha. Estos anticuerpos mejorados obtenidos a partir de haptenos innovadores constituirán la base para desarrollar nuevos métodos inmunoanalíticos para la determinación, detección, concentración o extracción de ocratoxina A, preferentemente mediante la utilización de un kit que pueda ser utilizado por la industria alimentaria, agrícola, clínica y/o medioambiental.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona bioconjugados y derivados marcados de ocratoxina A, y el uso de los bioconjugados para la obtención de anticuerpos para ocratoxina A.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un bioconjugado de fórmula general (I):

[T-L-Z]n-P

(I)

donde:

T se selecciona del grupo que consiste en R-I y R-II; HCX /.O

**(Ver fórmula)**

Preferiblemente T es R-I.

**(Ver fórmula)**

L es una cadena hidrocarbonada de 0 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende la sustitución de entre 0 y 10 átomos de carbono por heteroátomos, que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N; preferiblemente L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N, y más preferiblemente L es una cadena hidrocarbonada lineal saturada de 1 a 10 átomos de carbono y opcionalmente la cadena hidrocarbonada comprende entre 1 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; y

Z es un grupo funcional seleccionado entre:

-(C=O)NH-, -NH(C=O)-, -(C=O)S-, -S(C=O)-, -(C=O)O-, -O(C=O)-, -O(C=O)O-, -O(S=O)O- -O(SO2)O-, -NH(S=O)O-, -O(S=O)NH-, -NH(SO2)O-,-O(SO2)NH-,

-(SO2)NH-, -NH(SO2)-, -O(C=O)NH-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)NH-,

-NH(C=S)NH-, -NH-, -N(alquilo Ci-Ca)-, -S-, -S-S-, -NH-NH-, -N=C-, -C=N-,

-NH(C=NH)-, -N=N-, -O-, -CH=CH-,

**(Ver fórmula)**

N

y

**(Ver fórmula)**

En una realización preferida, Z se selecciona del grupo que consiste en -(C=O)NH-,

-NH(C=O)-, -O(C=O)NH-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)NH-, -NH-, -S-,

**(Ver fórmula)**

N

y

**(Ver fórmula)**

Más preferentemente, Z es -(C=0)NH-

P es un péptido o polipéptido, natural o sintético, de peso molecular mayor de 2000 daltons. El péptido o polipéptido P puede estar o no unido, mediante interacción covalente, electrostática o de otro tipo, a un soporte. Dicho soporte puede ser un polímero sintético o no, o estar compuesto por nanomateriales como nanotubos de carbono, zeolitas o sílice mesoporosa.

Según otra realización preferida de la presente invención, el bioconjugado de fórmula (I) descrito en esta solicitud de patente se caracteriza porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, beta-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. Más preferiblemente P es peroxidasa o albúmina, que puede ser albúmina de huevo o albúmina sérica; y

n es un número con un valor entre 1 y 500; preferiblemente n es un valor entre 1 y 100.

El valor de n indica el grado de conjugación, es decir, la relación molar entre la fracción derivada del fragmento T-L-Z y el péptido o polipéptido P, en el bioconjugado de fórmula (I) resultante.

Según otra realización preferida de la presente invención, el bioconjugado de fórmula (I) es un bioconjugado de fórmula (la)

a

**(Ver fórmula)**

(la)

donde:

P y n se han definido anteriormente. Preferiblemente P es albúmina o peroxidasa y n 5 es un valor seleccionado entre 1 y 50.

Según otra realización preferida, el bioconjugado de fórmula (I) es un bioconjugado de fórmula (Ib)

**(Ver fórmula)**

10 donde:

P y n se han definido anteriormente. Preferiblemente P es albúmina o peroxidasa y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

El bioconjugado de formula (I) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un derivado funcionalizado (hapteno) 15 de la ocratoxina A con P, un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor a 2000 daltons, por métodos ampliamente conocidos en la técnica.

En otra realización de la presente invención, cuando el material portador es un marcador no isotópico detectable, el derivado es un compuesto de formula (II):

[T-L-Z]m-Q

(II)

donde T, L y Z tienen el mismo significado definido anteriormente para el bioconjugado de formula (I);

Q es un marcador no isotópico detectable; y

m es un número con un valor entre 1 y 1000; preferiblemente m es un valor seleccionado entre 1 y 100.

En la presente invención se entiende por "marcador" cualquier molécula o fragmento que dé lugar a una señal medible por cualquier tipo de técnica analítica. En la presente invención, Q identifica un fragmento o una molécula química detectora, marcadora o trazadora no isotópica.

En una realización preferida, Q es una enzima, biotina, un compuesto luminiscente, un fluoróforo, un marcador acoplado a un sistema de detección indirecta, micro o nanopartículas u otros. Preferentemente, Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, fosfatasa alcalina, biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio, nanoparticulas cuánticas (en inglés quantum dots), y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.

en el compuesto de fórmula (II), Z se selecciona del grupo que O)NH-, -NH(C=O)-, -O(C=O)NH-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)NH-,

Preferiblemente L, en el compuesto de fórmula (II), es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0

**(Ver fórmula)**

Preferiblemente, consiste en -(C= -NH-, -S-,

**(Ver fórmula)**

y

y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N, y más preferiblemente L es una cadena hidrocarbonada lineal saturada de 1 a 10 átomos de carbono y opcionalmente la cadena hidrocarbonada comprende entre 1 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N;

Este compuesto de formula (II) puede utilizarse con un anticuerpo de ocratoxina A para determinar o detectar esta micotoxina en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo.

Según una realización preferida, el derivado de fórmula (II) es un derivado de fórmula (IIa)

**(Ver fórmula)**

donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluoresceína o nanopartículas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.

Según otra realización también más preferida, el derivado de fórmula (II) es un derivado de fórmula (IIb)

**(Ver fórmula)**

donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluoresceína o nanopartículas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.

El derivado marcado de formula (II) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un derivado funcionalizado (hapteno) de la ocratoxina A con Q, un marcador no isotópico, por métodos ampliamente conocidos en la técnica.

El bioconjugado de fórmula (I) de la presente invención puede utilizarse para la producción de anticuerpos, o junto con un anticuerpo de ocratoxina A para determinar o detectar esta micotoxina en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo. Además, los derivados marcados de formula (II) pueden utilizarse junto con un anticuerpo de ocratoxina A para determinar o detectar esta micotoxina en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo.

Para obtener anticuerpos frente a ocratoxina A se han preparado derivados funcionalizados de dicha micotoxina (haptenos), es decir, análogos estructurales de ocratoxina A que incorporan un grupo funcional susceptible de ser utilizado para la conjugación a un portador P o marcador Q. Este grupo funcional está separado del esqueleto de la molécula de ocratoxina A por un espaciador L. La posición de incorporación del grupo funcional a la estructura de ocratoxina A para la conjugación no es un aspecto obvio y puede ser determinante para la viabilidad de los bioconjugados de fórmula (I) como inductores de la producción de anticuerpos de afinidad y selectividad adecuadas frente a ocratoxina A, e incluso para la viabilidad de los bioconjugados de fórmula (I) o de derivados marcados de fórmula (II) para actuar como moléculas competidoras que permitan el desarrollo de un inmunoensayo sensible y específico para dicha micotoxina.

En el contexto de esta invención el término "anticuerpo" se refiere a la inmunoglobulina que un animal o una célula híbrida (como un hibridoma) sintetiza de forma específica contra el inmunógeno de la invención (bioconjugado de la invención).

Por tanto, un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un anticuerpo (a partir de ahora anticuerpo de la invención) generado en respuesta a un bioconjugado de la invención, en particular al bioconjugado de fórmula (I). Más preferiblemente los anticuerpos son generados en respuesta al bioconjugado de fórmula (Ia) o (Ib), más preferiblemente al bioconjugado de fórmula (Ia).

Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso del bioconjugado anteriormente descrito para la obtención de anticuerpos.

El procedimiento de obtención de los anticuerpos de la invención a partir de bioconjugados de la invención se puede llevar a cabo por métodos de inmunización ampliamente conocidos en la técnica, como por ejemplo a partir de la inmunización de un animal. Los anticuerpos generados a partir de un bioconjugado de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos de la invención tienen alta afinidad y especificidad hacia ocratoxina A.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un antisuero (a partir de ahora antisuero de la invención) que comprende los anticuerpos de la invención.

El término "antisuero" se refiere a un suero obtenido tras la inmunización de un animal con un inmunógeno. El antisuero comprende anticuerpos específicos de dicho inmunógeno generados tras la respuesta inmune producida en el animal. En el contexto de la presente invención, el inmunógeno es el bioconjugado de la invención y el antisuero comprende anticuerpos específicos generados frente al bioconjugado de la invención, los anticuerpos de la invención.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método de análisis in vitro de ocratoxina A en una muestra que comprende el uso del anticuerpo anteriormente descrito. Preferiblemente, este método comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo o el antisuero de la invención;

b) incubar la muestra y el anticuerpo (o el antisuero) de la etapa (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica; y

c) determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación de la etapa (b).

El método de la presente invención permite la determinación cuantitativa o análisis cualitativo del contenido de la micotoxina ocratoxina A en una muestra. Asimismo, el método de la presente invención permite analizar el contenido de ocratoxina A en diferentes tipos de muestras, por ejemplo, muestras de alimentos, como cereales, frutas y vinos, muestras medioambientales tales como agua, suelo o superficie, y

muestras biológicas aisladas tales como orina. Preferentemente, la presente invención proporciona un método de análisis in vitro de ocratoxina-A en vinos, cervezas y zumos.

Según una realización preferida, la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un bioconjugado de formula (I) o un derivado marcado de fórmula (II). Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de tipo ELISA.

El término inmunoensayo hace referencia a un ensayo analítico en el que ocurre una reacción inmunoquímica para la detección o cuantificación de un analito. Los inmunoensayos competitivos son aquéllos en los que el analito compite con otra molécula por la unión con el anticuerpo.

El término "antígeno" en esta solicitud de patente se refiere a una molécula capaz de interaccionar específicamente con un anticuerpo. La interacción o reacción inmunoquímica consiste en la unión específica y no covalente entre un anticuerpo y un antígeno, pudiendo ser éste el analito o un antígeno de ensayo.

En la presente memoria el término "antígeno de ensayo", "antígeno enzimático" o "trazador" se refiere a un bioconjugado de formula (I) o a un derivado marcado de formula (II) que se utiliza en el ensayo competitivo.

Un sexto aspecto de la presente invención también se refiere a un kit de detección de ocratoxina A que utiliza al menos un anticuerpo de la invención. Adicionalmente, el kit de detección de ocratoxina A puede comprender un bioconjugado de formula (I) o un derivado marcado de formula (II) tal como se describen en la presente solicitud de patente.

Un séptimo aspecto de la presente invención también se refiere a un método de purificación y/o concentración de ocratoxina A de una muestra que comprende el uso del anticuerpo anteriormente descrito. Particularmente, este método se basa en inmovilizar al menos un anticuerpo de la invención sobre un soporte cualquiera y hacer pasar una muestra a través de dicho soporte para que retenga la ocratoxina A presente en dicha muestra. La elución posterior de la ocratoxina A retenida en el

soporte por métodos ampliamente conocidos en la técnica (cambio de pH, modificación de la fuerza iónica, utilización de agentes caiotrópicos) permitirá su purificación y/o concentración, en un sistema conocido como cromatografía de inmunoafinidad. En una realización preferida, este método comprende las siguientes etapas:

a) inmovilizar al menos un anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 sobre un soporte;

b) hacer pasar la muestra a través de dicho soporte para que retenga la ocratoxina A presente en dicha muestra; y

c) eluir la ocratoxina A retenida en el soporte.

Los términos "inmunógeno" e "inmunogénico" tal como se utilizan en la presente invención se refieren a una sustancia que es reconocida como extraña al organismo vivo y por lo tanto es capaz de producir o de generar una respuesta inmune en un huésped. En la presente invención el inmunógeno es un bioconjugado de fórmula (I).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

A continuación se ilustra con algunos ejemplos y figuras la forma en que puede efectuarse la preparación de varios derivados funcionalizados de ocratoxina A (haptenos) y los correspondientes bioconjugados de fórmula (I), que no pretenden que sean limitativos de la presente invención, y que sirven para mostrar no sólo la forma en que puede efectuarse la preparación de los mismos sino también la importancia que puede tener la naturaleza estructural del bioconjugado de fórmula (I) para la producción de anticuerpos de afinidad adecuada hacia el analito, aptos para el desarrollo de un eficaz método inmunoanalítico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Estructura de la ocratoxina-A.

Fig. 2. Esquema de la síntesis del éster activo del hapteno OTA-1 (NHS-OTA-1).

Fig. 3. Esquema de la síntesis del éster activo del hapteno OTA-2 (NHS-OTA-2).

Fig. 4. Esquema de la síntesis del éster activo del hapteno OTA-3 (NHS-OTA-3).

Fig. 5. Esquema de la preparación de un bioconjugado de formula (I) a partir del correspondiente derivado funcionalizado (éster activo) de ocratoxina A.

Fig. 6. Curvas estándar para ocratoxina A en el formato de ELISA competitivo homólogo directo obtenidas con el mejor anticuerpo monoclonal producido a partir del bioconjugado BSA-OTA-1 (mAb Ia#310b; triángulos) y con el mejor anticuerpo monoclonal producido a partir del bioconjugado BSA-OTA-2 (mAb Ib#115; círculos).

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de los bioconjugados de fórmula (I) para la obtención de anticuerpos frente a ocratoxina A y el desarrollo de un inmunoensayo de elevada sensibilidad para la misma. Los números en negrita hacen referencia a la correspondiente estructura que se muestra en los esquemas. Estos ejemplos se presentan a modo de demostración, pero de ningún modo pueden suponer un límite a la invención.

1. Preparación de bioconjugados de fórmula (I)

Ejemplo 1: Preparación de bioconjugados de fórmula (I) para T = R-I, L = CH2CH2CH2CH2CH2, Z = -(C=O)NH- y P = BSA (seroalbúmina bovina), OVA (ovalbúmina) y HRP (peroxidasa de rábano picante).

1.1. Preparación del éster de N-hidroxisuccinimidilo del hapteno OTA-1 (NHS-OTA-1).

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Preparación de 4-cloro-2,6-diyodo-3-metilfenol (2). EtOH absoluto (31 mL) se añadió sobre una mezcla de 4-cloro-3-metilfenol (1) (1,78 g, 12,5 mmol), iodo (6,93 g, 27,3 mmol, 2,2 equiv) y AgSO4 (7,76 g 24,9 mmol, 2 equiv) y la mezcla se mantuvo bajo 5 agitación durante 3 horas a temperatura ambiente. Una vez finalizada la reacción, la mezcla se filtró para separar las sales, utilizando CHCl3 para lavar. El filtrado se lavó con una disolución acuosa al 10% de Na2S2O3 y salmuera. Tras secar sobre MgSO4 anhidro y evaporar el disolvente a vacío, el residuo obtenido se purificó a través de una columna de gel de sílice, utilizando hexano como eluyente, para obtener el 10 compuesto 2 como un sólido blanco (3,72 g, 75%). Pf. 91,0-92,0 °C (cristalizado de hexano en frío).

Datos espectroscópicos de 2 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 2.59 (s, 3H, Me-3), 5.83 (s, 1H, OH), 7.72 (s, 1H, H-5). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 26.8 (Me-3), 77.6 (C-6), 90.5 (C-2), 125.2 (C-4), 137.9 (C-5), 140.3 (C-3), 152.6 (C-1). EMAR (TOF 15 ESI-): calculado para C7H4ClI2O [M-H]" 392.8046, encontrado 392.8042.

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Preparación de 5-cloro-2-hidroxi-4-metilbenceno-1,3-dicarboxilato de dimetilo (3). Una mezcla del fenol 2 (300 mg, 0,76 mmol) y PdCl2(dppf)CH2Cl2 (64,0 mg, 0,08 mmol, 0,1 equiv) en MeOH anhidro (9 mL) en un reactor tiny Büchi se purgó exhaustivamente por 20 ciclos repetidos de vacío-purga con argón, enfriando a 0 °C. Tras esto, y bajo una corriente de argón, se añadió rápidamente Et3N (0,53 mL, 3,8 mmol, 5 equiv) y se volvió a someter el sistema a ciclos de purga a 0 °C, primero con argón y luego con CO. A continuación, se ajustó la presión de CO de 90 psi y la mezcla de reacción se agitó a 90 °C durante 2,5 horas. Transcurrido este tiempo se enfrió el reactor y se

venteó, la mezcla de reacción se transfierió a un matraz de fondo redondo con la ayuda de CH2Cl2 y se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se suspendió en Et2O y se filtró, el filtrado se lavó con una disolución acuosa 1M de HCl y salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro y se evaporó el disolvente a vacío. El residuo obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt (95:5 y 90:10), para obtener el compuesto 3 como un sólido de color blanco (158,4 mg, 82%). Pf. 66,1-67,1 °C (cristalizado de hexano en frío).

Datos espectroscópicos de 3: 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 2.35 (s, 3H, Me-4), 3.96 (s, 6H, 2xOMe), 7.87 (s, 1H, H-6), 10.96 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 18.0 (Me-4), 52.7 (2xOCH3), 111.5 (C-3), 124.9 (C-5), 125.1 (C-1), 130.6 (C- 6), 141.5 (C-4), 156.8 (C-2), 166.8 (CO2-3), 169.1 (CO2-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C11H12ClO5 [M+H]+ 259.0368, encontrado 259.0356.

H3CO

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Preparación de 5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxilato de metilo (4). Una disolución del dicarboxilato de dimetilo 3 (82,4 mg, 0,32 mmol) en THF anhidro (200 ^L) se adicionó gota a gota, a -78 °C bajo nitrógeno, sobre una disolución de diisopropilamiduro de litio (LDA) en THF, generada a partir de diisopropilamina (130 ^L, 0,88 mmol, 2,75 equiv), BuLi (500 ^L de una disolución 1,6 M en hexano, 0,8 mmol, 2,5 equiv) y THF anhidro (1,15 mL). La mezcla se mantuvo con agitación 30 minutos a -78 °C y a continuación se añadió acetaldehído (150 ^L, 2,55 mmol, 8 equiv). La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura durante 10 minutos y a 0 °C durante 1,5 horas. Una vez finalizado el tiempo de reacción se añadió 1 mL de una disolución 1:2 de AcOH en Et2O a 0 °C, se diluyó con AcOEt y se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro y se concentró a vacío para obtener un residuo que se purificó por cromatografía de columna, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0,3 y 95:5:0,3) para obtener el compuesto 4 como un semisólido de color blanco (51,7 mg, 82%).

Datos espectroscópicos de 4 (una mezcla racémica): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.58 (d, J = 6.4 Hz, 3H, Me-3), 2.84 (dd, J = 17.4, 11.6 Hz, 1H, H-4), 3.27 (dd, J = 17.3, 3.2 Hz, 1H, H-4), 3.95 (s, 3H, CO2CH3), 4.42-4.92 (m, 1H, H-3), 8.11 (s, 1H, H- 6), 12.19 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): 5 (ppm) 20.6 (Me-3), 32.6 (C-4), 52.6 5 (OCH3), 75.1 (C-3), 111.2 (C-7), 118.4 (C-8a), 121.7 (C-5), 138.0 (C-6), 142.2 (C-4a),

161.1 (C-8), 165.0 (C-1), 167.9 (CO2-7). EMAR (TOF ESI+): calculado para C12H12CIO5 [M+H]+ 271.0368, encontrado 271.0371.

H3CO

i. LiOH, THF-H20, 3.5h, reflujo

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Preparación del ácido 5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxílico (5). Una 10 disolución de LiOH H2O (115,0 mg, 2,73 mmol, 10 equiv) en agua (1,20 mL) se adicionó sobre una suspensión de la dihidroisocumarina 4 (74,0 mg, 0,27 mmol) en THF anhidro (910 pL). La mezcla se calentó a reflujo durante 3,5 horas y a continuación se enfrió a 0 °C y se acidificó con una disolución acuosa 1M de HCl (4,91 mL, 4,91 mmol, 18 equiv). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente 15 durante 2 horas, se diluyó con agua y se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 anhidro y se concentraron a presión reducida para obtener el ácido 5 (69,9 mg, 100%) como un sólido amorfo de color pardo claro.

Datos espectroscópicos de 5: 1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz): 5 (ppm) 1.44 (d, J = 6.2 20 Hz, 3H, Me-3), 2.88 (dd, J = 17.3, 11.6 Hz, 1H, H-4), 3.20 (dd, J = 17.3, 3.2 Hz, 1H, H-4), 4.75 (ddd, J = 11.7, 6.2, 3.2 Hz, 1H, H-3), 7.99 (s, 1H, H-6). 13C-RMN (DMSO-da, 75 MHz): 5 (ppm) 20.1 (Me-3), 32.2 (C-4), 74.4 (C-3), 112.5 (C-7), 117.8 (C-8a), 120.6 (C-5), 136.0 (C-6), 143.4 (C-4a), 160.5 (C-8), 165.4 (C-1), 167.3 (CO2H). EMAR (TOF ESI+): calculado para C11H10ClO5 [M+H]+ 257.0211, encontrado 257.0212.

**(Ver fórmula)**

Preparación de 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3-(4- yodofenil)propanoato de terc-butilo (7). A una disolución del ácido 5 (56,3 mg, 0,22 mmol) en DMF anhidra (1,5 mL) se añadieron sucesivamente una disolución de HATU 5 (125,5 mg, 0,33 mmol, 1,5 equiv) en DMF anhidra (1,5 mL) y DIEA (80 ^L, 0,44 mmol,

2 equiv). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y seguidamente se añadió una disolución de la amina 6 (153 mg, 0,44 mmol, 2 equiv) y DIEA (80 ^L, 0,44 mmol, 2 equiv) en DMF anhidra y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, tras lo cual la reacción se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente 10 con disoluciones acuosas de HCl (1M), LiCl (1,5%), NaHCO3 (5%) y salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro y se evaporó el disolvente en el rotavapor. El residuo obtenido se purificó por cromatografía de columna, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0,3, 90:10:0,3 y 80:20:0,3) para obtener el compuesto 7 (107 mg, 83%) como un aceite amarillento.

15 Datos espectroscópicos de 7 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.43 (dos s, 4.5H cada uno, CMe3 de cada diastereoisómero), 1.61 (dos d, J = 6.4, 1.5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisómero), 2.84 y 2.89 (cada uno dd, J = 17.4, 11.6 Hz, 0.5H cada uno, H-4 de cada diastereoisómero), 3.07-3.24 (m, 2H, H2-3), 3.30 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H-4), 4.77 (m, 1H, H-3), 4.94 (dt, J = 20 7.3, 6.0 Hz, 1H, H-2), 6.96 (br d, J = 7.9 Hz, 2H, H-2 y H-6), 7.56-7.62 (m, 2H, H-3 y

H-5), 8.44 (s, 1H, H-6), 8.57 (m, 1H, NH), 12.78 (s ancho, 1H, OH). 13C-RMN (CDCh, 75 MHz): 5 (ppm) 20.7 (Me-3), 28.0 (CMe3), 32.3 (C-4), 37.6 (C-3), 54.3 (C-2), 75.9

(C-3), 82.6 (CMea), 92.4 (C-4), 110.0 (C-8a), 120.7 (C-7), 123.1 (C-5), 131.5 (C-2 y C-6), 136.1 (C-1), 137.4 (C-3 y C-5), 138.9 (C-6), 140.7 (C-4a), 159.0 (C-8), 162.1 (CONH), 169.7 (C-1), 170.1 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C24H26NClIO6 [M+H]+ 586.0488, encontrado 586.0459.

**(Ver fórmula)**

OCH,

Preparación de 6-(4-(3-(terc-butoxi)-2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano- 7-carboxamido)-3-oxopropil)fenil)hex-5-inoato de metilo (9). Una mezcla del derivado yodado 7 (36,5 mg, 0,062 mmol), hex-5-ionato de metilo (8) (27,4 mg, 0,217 mmol, 3,5 equiv), PdCl2(Ph3P)2 (5,1 mg, 7,310-3 mmol, 0,12 equiv) y CuI (2,2 mg, 11,510-3 mmol, 10 0,18 equiv) se purgó con ciclos repetidos de vacío-nitrógeno mientras se enfriaba a 0

°C. A continuación, se añadió DMF anhidra (730 pL) y se volvió a purgar el sistema, se añadió Et3N (540 pL, 3,87 mmol, 62 equiv) y se volvió a purgar el sistema a baja temperatura. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 21 horas, tras lo cual se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente con disoluciones 15 acuosas de HCl (1M), LiCl (1,5%), NaHCO3 (5%) y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4 anhidro y se concentró a presión reducida para obtener un residuo que se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt (80:20, 70:30 y 50:50), para obtener el alquino 9 (22,5 mg, 62%) como un aceite de color amarillento.

Datos espectroscópicos de 9 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.43 (s ancho, 9H, CMe3 de los dos diastereoisómero), 1.60 (dos d, J = 6.3 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisómero), 1.87-1.98 (m, 2H, H2-3), 2.50 (m, 4H, H2-2 y H2-4), 2.84 y 2.89 (dos dd, J = 17.5, 11.5 Hz, 0.5H cada uno, H-4 5 de cada diastereoisómero), 3.19 (m, 2H, H2-1), 3.30 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H-4), 3.68 (s, 3H, CH3O), 4.71-4.82 (m, 1H, H-3), 4.96 (dt, J = 7.3, 6.0 Hz, 1H, H-2), 7.14 (d, J = 7.9 Hz, 2H, H-3 y H-5), 7.30 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 2H, H-2 y H-6), 8.45 (s, 1H, H-6), 8.56 (m, 1H, NH), 12.76 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): 5 (ppm) 18.9 (C-4), 20.7 (Me-3), 23.9 (C-3), 28.0 (CMe3), 32.3 (C-4), 32.9 (C-2), 38.0 (C-1), 51.6 10 (CH3O), 54.5 (C-2), 75.8 (C-3), 81.3 (C-6), 82.5 (CMe3), 88.8 (C-5), 110.1 (C-8a), 120.8 (C-7), 122.3 (C-4), 123.1 (C-5), 129.4 (C2 y C-6), 131.5 (C-3 y C-5), 136.0 (C-1), 139.0 (C-6), 140.6 (C-4a), 159.1 (C-8), 162.1 (CONH), 169.7 (C-1), 170.2 (C-3), 173.6 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C31H35CINO8 [M+H]+ 584.2046, encontrado 584.2029.

**(Ver fórmula)**

OH O

**(Ver fórmula)**

76%

RhCI(PPh3)3 H2 (4 atm) THF, 28h, ta

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Preparación de 6-(4-(3-(terc-butoxi)-2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1 -oxoisocromano-7- carboxamido)-3-oxopropil)fenil)hexanoato de metilo (10). Una disolución del alquino 9 (17,6 mg, 0,03 mmol) y RhCl(PPh3)3 (4,2 mg, 4,510-3 mmol, 0,15 equiv) en THF anhidro (1,3 mL) contenida en un reactor tiny Büchi se purgó con hidrógeno. La 20 presión de hidrógeno se ajustó a 4 atm y se mantuvo con agitación a temperatura durante 28 horas. A continuación, se venteó el reactor y la mezcla de reacción se

concentró a sequedad a vacío para obtener un residuo que se purificó por cromatografía de columna, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt (90:10, 80:20 y 60:40) para obtener el compuesto 10 (13,4 mg, 76%) como un aceite amarillento.

5 Datos espectroscópicos de 10 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN

(CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.31-1.38 (m, 2H, H2-4), 1.42 (s ancho, 9H, CMe3 de

ambos diastereoisómeros), 1.54-1.71 (m, 4H, H2-3, H2-5), 1.60 (dos d, J = 6.2 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisómero), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H, H2-2), 2.57 (t, J = 7.6 Hz, 2H, H2-6), 2.83 y 2.88 (dos dd, J = 17.4, 11.6, 0.5H cada uno, H-4' de cada

10 diastereoisómero), 3.17 (d, J = 6.0 Hz, 2H, H2-1), 3.29 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H-

4), 3.66 (s, 3H, OMe), 4.69-4.82 (m, 1H, H-3), 4.94 (dt, J = 7.3, 6.0 Hz, 1H, H-2), 7.03-7.16 (m, 4H, H-2, H-3, H-5 y H-6), 8.46 (s, 1H, H-6), 8.54 (m, 1H, NH), 12.73 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 20.7 (Me-3), 24.8 (C-5), 28.0 (CMe3), 28.7 (C-4), 31.0 (C-3), 32.3 (C-4), 34.0 (C-2), 35.3 (C-6), 37.8 (C-1), 51.4 15 (OMe), 54.7 (C-2), 75.8 (C-3), 82.2 (CMe3), 110.0 (C-8a), 121.0 (C-7), 123.0 (C- 5), 128.4 (C-2 y C-6), 129.4 (C-3 y C-5), 133.5 (C-1), 139.0 (C-6), 140.5 (C-4a), 141.1 (C-4), 159.1 (C-8), 162.1 (CONH), 169.8 (C-1), 170.5 (C-3), 174.2 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C31H39ClNO8 [M+H]+ 588.2359, encontrado 588.2358.

**(Ver fórmula)**

Preparación del ácido 6-(4-(3-(terc-butoxi)-2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1- oxoisocromano-7-carboxamido)-3-oxopropil)fenil)hexanoico (11). Una suspensión del éster metílico 10 (13,4 mg, 0,023 mmol) y lipasa de Candida antarctica inmovilizada en resina acrílica macroporosa (Novozyme 435, 26,4 mg) en THF (160 pL) en una disolución tampón fosfato con pH=7,4 (630 pL) se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 7 horas, tras lo cual se filtró y la resina y el reactor se lavaron con agua y AcOEt. La fase acuosa se acidificó con una disolución acuosa 1M de HCl hasta pH=2 y se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 anhidro y se concentraron a sequedad a presión reducida para obtener un residuo aceitoso que se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de CHCl3-MeOH (100:0, 95:5 y 90:10), para obtener el ácido 11 (9,9 mg, 75%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscópicos de 11 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.31-1.37 (m, 2H, H2-4), 1.43 (s, 9H, CMe3), 1.54-1.70 (m, 4H, H2-3, H2-5), 1.60 (dos d, J = 6.2 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisómero), 2.32 (t, J = 7.3 Hz, 2H, H2-2), 2.57 (t, J = 7.5 Hz, 2H, H2-6), 2.782.92 (m, 1H, H-4), 3.17 (m, 2H, H2-1), 3.29 (dd, J = 17.4, 3.3 Hz, 1H, H-4), 4.684.82 (m, 1H, H-3), 4.88-5.00 (m, 1H, H-2), 7.02-7.16 (m, 4H, H-2, H-3, H-5 y H-6), 8.45 (s, 1H, H-6), 8.56 (m, 1H, NH), 12.73 (s ancho, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 125 MHz): 5 (ppm) 20.7 (Me-3), 24.5 (C-3), 28.0 (CMe3), 28.4 (C-4), 30.9 (C-5), 32.3 (C- 4), 33.8 (C-2), 35.2 (C-6), 37.8 (C-1), 54.7 (C-2), 75.9 (C-3), 82.3 (CMe3), 110.0 (C-8a), 121.0 (C-7), 123.0 (C-5), 128.4 (C-2 y C-6), 129.4 (C-3 y C-5), 133.5 (C- 1), 139.0 (C-6), 140.6 (C-4a), 141.1 (C-4), 159.1 (C-8), 162.2 (CONH), 169.8 (C- 1), 170.5 (C-3), 179.3 (CO2H). EMAR (TOF ESI+): calculado para C30H37NCO [M+H]+ 574.2202, encontrado 574.2220.

**(Ver fórmula)**

Preparación de 6-(4-(3-(terc-butoxi)-2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano-7- carboxamido)-3-oxopropil)fenil)hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (12). Una

disolución del ácido 11 (10,2 mg, 0,018 mmol), NHS (2,2 mg, 0,019 mmol, 1,1 equiv) y EDCHCl (3,7 mg, 0,019 mmol, 1,1 equiv) en CH3CN anhidro (1,0 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas bajo atmósfera de nitrógeno. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente con agua, una disolución acuosa al 5% de NaHCO3 y salmuera. Tras evaporar a sequedad, el residuo obtenido se pasó a través de una pequeña columna de gel de sílice, empleando CH2Cl2 como eluyente, para obtener en éster de N- hidroxisuccinimidilo 12 (9,6 mg, 79%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscópicos de 12 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz): 5 (ppm) 1.42 (s ancho, 9H, CMe3 de ambos diastereoisómeros), 1.43-1.49 (m, 2H, H2-5), 1.58-1.67 (m, 2H, H2-4), 1.60 (dos d, 1.5H cada uno, J = 6.4, 15 Me-3 de cada diastereoisómero), 1.77 (quint, J = 7.6 Hz, 2H, H2-3), 2.59 (m, 4H, H2-2

y H2-6), 2.79-2.90 (m, 5H, H-4, COCH2CH2CO), 3.11-3.22 (m, 2H, H2-1), 3.29 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H-4), 4.69-4.81 (m, 1H, H-3), 4.89-4.97 (m, 1H, H-2), 7.06-7.16 (m, 4H, H-2, H-3, H-5 y H-6), 8.45 (s, 1H, H-6), 8.54 (m, 1H, NH), 12.73 (s ancho, 1H, OH). 13C-RMN (CDCl3, 125 MHz): 5 (ppm) 20.7 (Me-3), 24.4 (C-3), 25.6 20 (COCH2CH2CO), 28.0 (CMe3), 28.4 (C-4), 30.8 (C-5), 30.9 (C-2), 32.3 (C-4), 35.2 (C-

6), 37.8 (C-1), 54.7 (C-2), 75.9 (C-3), 82.2 (CMe3), 110.0 (C-8a), 121.0 (C-7), 123.0 (C-5), 128.4 (C-2 y C-6), 129.5 (C-3 y C-5), 133.6 (C-1), 139.0 (C-6), 140.5

(C-4a), 140.9 (C-4), 159.1 (C-8), 162.1 (CONH), 168.6 (C-1), 169.1 (COCH2CH2CO), 169.8 (C-1), 170.5 (C-3).

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

1:1 CF3Ca2H-CH2Cl2 ta, 2h

**(Ver fórmula)**

NHS-OTA-1

Preparación del ácido 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3- 5 (4-(6-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-6-oxohexil)fenil)propanoico (Éster de N-

hidroxisuccimidilo del hapteno OTA-1, NHS-OTA-1). Ácido trifluoroacético (370 pL, 4,8 mmol, 370 equiv) se añadió gota a gota sobre una disolución del éster terc-butílico 12 (9,0 mg, 0,013 mmol) en CH2Cl2 anhidro (760 pL) y la mezcla resultante se mantuvo con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras esto, la mezcla de 10 reacción se concentró a sequedad a presión reducida para proporcionar el éster NHS- OTA-1 (7,9 mg, 99%) como un aceite de aspecto resinoso y color parduzco.

Datos espectroscópicos de NHS-OTA-1 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H- RMN (CDCl3, 500 MHz): 5 (ppm) 1.42 (m, 2H, H2-2), 1.57-1.68 (m, 2H, H2-3), 1.75 (m, 2H, H2-4), 1.60 (dos d, 1.5H cada uno, J = 6.4, Me-3 de cada diastereoisómero), 15 2.59 (m, 4H, H2-1 y H2-5), 2.78-2.91 (m, 5H, H-4, COCH2CH2CO), 3.16-3.34 (m,

3H, H2-3 y H-4), 4.77 (m, 1H, H-3), 5.00-5.04 (m, 1H, H-2), 7.06-7.18 (m, 4H, H-2, H-3, H-5 y H-6), 8.42 (m, 1H, H-6), 8.51 y 8.58 (dos m, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisómero). EMAR (TOF ESI+): calculado para C30H32ClN2O10 [M+H]+ 615.1740, encontrado 615.1732.

**(Ver fórmula)**

1.2. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-1 con BSA (BSA-OTA-1). 100 |jL de la disolución del éster activo NHS-OTA-1 (50 mM en DMF) obtenida en la reacción anterior se añadieron lentamente y con agitación constante sobre 0,9 mL de una disolución de BSA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. La reacción de conjugación se incubó durante 2 horas con agitación suave a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, los conjugados se purificaron por exclusión molecular en 3 columnas cromatográficas HiTrap Desalting Columns de 5 mL cada una, acopladas en serie, utilizando como tampón de elución fosfato sódico 100 mM, pH 7,4. Finalmente, tras el proceso de purificación, las fracciones recogidas que contenían el bioconjugado de BSA se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL con tampón de elución y se almacenaron a -20 °C.

Para determinar la carga hapténica (n) obtenida en el conjugado, una alícuota de 100 jL del bioconjugado BSA-OTA-1 purificado se dializó (diálisis contra 5 L de agua 15 desionizada con al menos 2 a 3 cambios de agua cada 24 h a 4 °C); finalmente, el producto dializado se liofilizó y el número de moléculas de hapteno (OTA-1) conjugadas por molécula de BSA se determinó mediante MALDI-TOF-MS (n = 15,2, ver Tabla 1, entrada 1).

**(Ver fórmula)**

1.3. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-1 con OVA (OVA-OTA-1). A partir de una disolución 50 mM del hapteno activado NHS-OTA-1 en DMF, se tomaron 90 pL y se añadieron lentamente y con agitación constante a un volumen de 1,7 mL de una disolución de OVA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Después de 2 h de reacción en agitación suave y a temperatura ambiente, se procedió a la purificación del bioconjugado como se ha descrito anteriormente para el conjugado de BSA. Las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución con timerosal al 0,01% (v/v) y, se almacenaron a -20 °C. Una alícuota del conjugado OVA-OTA-1 recién obtenido se dializó y liofilizó para calcular la eficiencia de la conjugación en términos del número de moléculas de hapteno (OTA-1) acoplados a la proteína mediante MALDI-TOF-MS (n = 9,6, ver Tabla 1, entrada 2).

**(Ver fórmula)**

1.4. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-1 con HRP (HRP-OTA-1). A partir de una disolución 5 mM del hapteno activado NHS-OTA-1 en DMF, se tomaron 80 pL y se añadieron lentamente y con agitación constante y suave sobre 0,9 mL de una disolución de HRP a una concentración de 2,5 mg/mL en tampón carbonato 50 mM, pH 7,4. La reacción de conjugación se incubó durante 2ha temperatura ambiente. Posteriormente, el bioconjugado se purificó siguiendo el procedimiento descrito previamente para los bioconjugados de BSA y OVA, y se llevó a una concentración de 400 pg/mL en tampón PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0,02% (p/v) y se almacenaron a 4 °C. Una alícuota del conjugado HRP-OTA-1 recién obtenido se dializó y liofilizó para calcular la eficiencia de la conjugación en términos del número de moléculas de hapteno (OTA-1) acoplados a la proteína mediante MALDI-TOF-MS (n = 1,1, ver Tabla 1, entrada 3).

TABLA 1. Valores de la carga hapténica de los conjugados proteicos del hapteno OTA-1 determinados por MALDI-TOF-MS

		RMo	m/z proteína referencia	m/z	A(m/z)	Am/hapteno	n
	BSA-OTA-1		6.380	73.988	7.608		15,2
	OVA-OTA-1		2.397#	28.235#	4.838		9,6
	HRP-OTA-1		43.884	44.437	553		1,1

RM0: relación molar inicial hapteno/proteína utilizada para la conjugación n: relación molar hapteno/proteína obtenida para cada conjugado A(m/z): (m/z conjugado) (m/z proteína de referencia)

Am/hapteno: incremento de masa por cada molécula de hapteno conjugada # correspondiente al ión doblemente cargado ([M+2H]2+)

Ejemplo 2: Preparación de bioconjugados de fórmula (I) para T = R-II, L = -CH2CH2CH2CH2-, Z = -(C=O)NH- y P = BSA, OVA y HRP.

2.1. Preparación del éster de N-hidroxisuccinimidilo del hapteno OTA-2 (NHS-OTA-2).

**(Ver fórmula)**

OCH-, i- LDA, THF

**(Ver fórmula)**

Preparación de 3-(5-(benziloxi)pentil)-5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisocromano-7-carboxilato de metilo (14). Una disolución del diéster 3 (117,0 mg, 0,45 mmol) en THF anhidro (280 pL) se añadió gota a gota sobre una disolución de LDA en THF, generada a partir de diisopropilamina (185 pL, 1,25 mmol, 2,75 equiv) y 1,6 M BuLi en hexano (710 pL, 10 0,14 mmol, 2,5 equiv) en THF (1,4 mL), a -78°C bajo nitrógeno. La mezcla se mantuvo

a la misma temperatura durante 30 minutos y a continuación se añadió una disolución

del aldehido 13 (150 mg, 0,73 mmol, 1,6 equiv) en THF anhidro (150 pL). La mezcla de reacción se agitó a -78 °C durante 15 minutos y luego se dejó que se calentara lentamente hasta -5°C (aproximadamente 3 horas). Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se trató con una mezcla 1:2 de AcOH-Et2O y se agitó durante 10 5 minutos a 0°C, se diluyó con AcOEt y se lavó con agua, salmuera y se secó sobre

MgSO4 anhidro para obtener, tras evaporar el disolvente a vacio, un residuo que se purificó por cromatografía, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt- AcOH (100:0:0,3, 95:5:0,3 y 85:15:0,3) para obtener el compuesto 14 (109,0 mg, 67%) como aceite amarillento.

10 Datos espectroscópicos de 14 (una mezcla racémica): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.30-1.93 (m, 8H, H2-1, H2-2, H2-3 y H2-4), 2.77 (dd, J = 17.3, 11.7 Hz, 1H, H- 4), 3.16 (dd, J = 17.3, 3.4 Hz, 1H, H-4), 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 3H, H2-5), 3.89 (s, 3H, OMe), 4.44 (s, 2H, OCH2), 4.45-4.58 (m, 1H, H-3), 6.98-7.46 (m, 5H, Ph), 8.05 (s, 1H, H-6), 12.14 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCh, 75 MHz): 5 (ppm) 24.5 (C-2), 25.9 (C-3),

15 29.5 (C-4), 30.9 (C-4), 34.6 (C-1), 52.5 (OMe), 70.0 (C-5), 72.8 (OCH2), 78.5 (C-3),

111.4 (C-7), 118.2 (C-8a), 121.7 (C-5), 127.5 (C-4), 127.6 (C-2 y C-6), 128.3 (C-3 y C-5), 137.9 (C-1), 138.5 (C-6), 142.3 (C-4a), 161.0 (C-8), 165.0 (C-1), 167.9 (CO2). EMAR (TOF ESI+): calculado para C23H2aCl Oa [M+H]+ 433.1412, encontrado 433.1415.

**(Ver fórmula)**

97%

i. LiOH, THF-H20, 3.5h, refl.

ii. 1M HCI-H20, 2h, 0°C

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Preparación del ácido 3-(5-(benziloxi)pentil)-5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisocromano-7- carboxílico (15). Una disolución de LiOH H2O (135,0 mg, 3,21 mmol, 10 equiv) en agua (1,40 mL) se añadió sobre una disolución de la dihidroisocumarina 14 (139,0 mg,

0,32 mmol) en THF anhidro (1,30 mL) y la mezcla se calentó a reflujo durante 3,5 horas. A continuación la mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo y se trató con una disolución acuosa 1M de HCl (5,80 mL, 5,80 mmol, 18 equiv), se agitó a 0 °C durante 2 horas, se diluyó con agua y se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas 5 reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 anhidro y se concentraron a sequedad a presión reducida para obtener el ácido 15 (130,5 mg, 97%) como un semisólido amarillento, cuyo RMN de 1H muestra que tiene una pureza suficientemente elevada para ser utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional.

10 Datos espectroscópicos de 15 (una mezcla racémica): 1H-RMN (MeOD, 300 MHz): 5 (ppm) 1.42-1.91 (m, 8H, H2-1, H2-2, H2-3 y H2-4), 2.87 (dd, J = 17.3, 11.7 Hz, 1H, H-4), 3.21-3.29 (m, 1H, H-4), 3.52 (t, J = 6.4 Hz, 2H, H2-5), 4.50 (s, 2H, OCH2), 4.56 (m, 1H, H-3), 7.21-7.37 (m, 5H, Ph), 8.12 (s, 1H, H-6). 13C-RMN (MeOD, 75 MHz): 5 (ppm) 25.8 (C-2), 27.2 (C-3), 30.7 (C-4), 32.5 (C-4), 35.7 (C-1), 71.4 (C-5), 74.0

15 (OCH2), 79.7 (C-3), 114.0 (C-7), 118.6 (C-8a), 122.8 (C-5), 128.8 (C-4), 129.0 (C-2 y

C-6), 129.5 (C-3 y C-5), 138.2 (C-1), 140.0 (C-6), 145.4 (C-4a), 163.0 (C-8), 167.5 C-1), 169.8 (CO2H). EMAR (TOF ESI+): calculado para C22H24 CO [M+H]+ 419.1256, encontrado 419.1251.

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Cl

20 Preparación de 2-(3-(5-(benziloxi)pentil)-5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisocromano-7-carboxa mido-3-fenilpropanoato de terc-butilo (17). Una disolución de HATU (123,5 mg, 0,33 mmol, 1,5 equiv) en DMF anhidra (1,5 mL) y DIEA (80 pL, 0,44 mmol, 2 equiv) se

añadieron sobre una disolución del ácido 15 (91,0 mg, 0,22 mmol) en DMF anhidra (1,5 mL) bajo nitrógeno y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, se añadió una disolución del clorhidrato 16 (108 mg, 0,44 mmol, 2 equiv) y DIEA (80 ^L, 0,44 mmol, 2 equiv) en DMF anhidra (1,1 mL) y se agitó 5 a la misma temperatura durante 4 horas, se diluyó la mezcla de reacción con AcOEt y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de HCl (1M), LiCl (1,5%), NaHCO3 (5%) y salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro y se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0,3, 90:10:0,3, y 10 80:20:0,3) para obtener la amida 17 como un aceite amarillento (87 mg, 65%).

Datos espectroscópicos de 17 (una mezcla 1:1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.28-1.91 (m, 8H, H2-1, H2-2, H2-3, H2-4), 1.36 (s, 9H, CMe3), 2.69-2.86 (m, 1H, H-4), 3.08-3.23 (m, 3H, H-4 y H2-3), 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 2H, H2-5), 4.44 (s, 2H, OCH2), 4.47-4.59 (m, 1H, H-3), 4.86-4.96 (m, 1H, H-2), 7.04-7.32 (m, 10H, 15 Ph y PhBn), 8.39 (s, 1H, H-6), 8.50 (d, J = 5.3 Hz, 1H, NH), 12.66 (s, 1H, OH). 13C- RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 24.5 (C-2), 25.9 (C-3), 27.9 (CMe3), 29.5 (C-4), 30.6 (C-4), 34.6 (C-1), 38.1 (C-3), 54.6 (C-2), 70.0 (C-5), 72.9 (OCH2), 79.2 (C-3), 82.2 (CMe3), 110.2 (C-8a), 120.8 (C-7), 123.0 (C-5), 126.9 (C-4), 127.5 (C-4 PhBn), 127.6 (C-2 y C-6 PhBn), 128.3 (C-3 y C-5), 129.0 (C-3 y C-5 PhBn), 129.5 (C-2 y C-6), 20 136.3 (C-1), 138.5 (C-1 PhBn), 138.9 (C-6), 140.6 (C-4a), 159.0 (C-8), 162.1

(CONH), 169.7 (C-1), 170.3 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C35H41CINO7 [M+H]+ 622.2566, encontrado 622.2570.

**(Ver fórmula)**

Preparación de 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-(5-hidroxipentil)-1-oxoisocromano-7-carbox amido)-3-fenilpropanoato de terc-butilo (18). Una suspensión de Pd(OH)2 (44 mg, 0,04 mmol, 0,3 equiv) y del éter bencílico 17 (85 mg, 0,14 mmol) en AcOEt (4,8 mL) se purgó con repetidos ciclos de vacío-hidrógeno y posteriormente se agitó 5 vigorosamente bajo una presión de H2 de 1 atm (globo) a temperatura ambiente durante 6 horas. La mezcla de reacción se filtró sobre una pequeña columna de gel de sílice, utilizando AcOEt para lavar, y el filtrado y las aguas de lavado se concentraron a sequedad para proporcionar el alcohol 18 (65 mg, 90%) como un aceite, cuyo RMN de 1H muestra la presencia de un pequeño porcentaje (5-6%) del producto de 10 hidrogenolisis del enlace C-Cl.

Datos espectroscópicos de 18 (una mezcla 1:1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.40-1.98 (m, 8H, H2-1, H2-2, H2-3, H2-4), 1.42 (s, 9H, CMe3), 2.78-2.94 (dos dd, J = 17.4, 11.8 Hz, 1H, H-4 de cada diastereoisómero), 3.14-3.33 (m, 3H, H-4 y H2-3), 3.67 (t, J = 6.4 Hz, 2H, H2-5), 4.51-4.69 (m, 1H, H-3), 4.96 (m, 15 1H, H-2), 7.10-7.35 (m, 5H, Ph), 8.44 (s, 1H, H-6), 8.50-8.63 (dos d, J = 7.4 Hz, 0.5H

cada uno, NH de cada diasteroisómero), 12.72 (dos s, 0.5H cada uno, OH de cada diasteroisómero). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): 5 (ppm) 24.5 (C-2), 25.5 (C-3), 27.9 (CMe3), 30.6 (C-4), 32.4 (C-4), 34.6 (C-1), 38.1 (C-3), 54.6 (C-2), 62.6 (C-5), 79.3 (C-3), 82.3 (CMe3), 110.1 (C-8a), 120.8 (C-7), 123.1 (C-5), 126.9 (C-4), 128.3 (C-2 20 y C-6), 129.5 (C-3 y C-5), 136.2 (C-1), 138.9 (C-6), 140.6 (C-4a), 159.0 (C-8), 162.1 (CONH), 169.7 (C-1), 170.4 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C28H35CINOt [M+H]+ 532.2097, encontrado 532.2060.

**(Ver fórmula)**

Preparación de 2-(5-cloro-8-hidroxi- 1-oxo-3-(5-oxopentil)isocromano-7-carboxamido)- 3-fenilpropanoato de terc-butilo (19). Una suspensión de Dess-Martin periodinano (DMP) (78,0 mg, 0,18 mmol, 1,5 equiv) y NaHCO3 (82 mg, 0,98 mmol, 8,0 equiv) en CH2CI2 (1,0 mL) se añadió sobre una mezcla del alcohol 18 (65,0 mg, 0,12 mmol) y 5 NaHCO3 (82 mg, 0,98 mmol, 8,0 equiv) en CH2Cl2 (4 mL) enfriada a 0 °C. La mezcla resultante se agitó 10 minutos a 0 °C y 1 hora a temperatura ambiente, se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de Na2S2O3 (10%), NaHCO3 saturado y salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro y se concentró a sequedad a presión reducida para obtener el aldehido 19 (59,6 mg, 92%) como un aceite 10 amarillento.

Datos espectroscópicos de 19 (una mezcla 1:1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.42 (s, 9H, CMe3), 1.48-1.99 (m, 6H, H2-1, H2-2 y H2-3), 2.52 (dt, J = 7.0, 1.1 Hz, 2H, H2-4), 2.87 (dos dd, J = 17.3, 11.7, 0.5H cada uno, H-4 de cada diasteroisómero), 3.14-3.31 (m, 3H, H-4 y H2-3), 4.60 (ddt, J = 11.7, 7.7, 4.0 Hz, 15 1H, H-3), 4.92-5.01 (dt, J = 7.3, 6.1 Hz, 1H, H-2), 7.16-7.32 (m, 5H, Ph), 8.45 (s, 1H,

H-6), 8.56 (dos d, J = 7.3 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisómero), 9.80 (t, J = 1.4 Hz, 1H, CHO), 12.69 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCh, 75 MHz): 5 (ppm) 21.6 (C- 3), 24.3 (C-2), 27.9 (CMe3), 30.6 (C-4), 34.5 (C-1), 38.1 (C-3), 43.6 (C-4), 54.6 (C- 2), 79.0 (C-3), 82.3 (CMe3), 110.1 (C-8a), 120.9 (C-7), 123.1 (C-5), 126.9 (C-4), 20 128.3 (C-2 y C-6), 129.5 (C-3 y C-5), 136.3 (C-1), 139.0 (C-6), 140.5 (C-4a),

159.0 (C-8), 162.3 (CONH), 169.6 (C-1), 170.4 (C-1), 201.9 (C-5). EMAR (TOF ESI+): calculado para C28H33ClNO7 [M+H]+ 530.1940, encontrado 530.1920.

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Preparación del ácido 5-(7-((1-(terc-butoxi)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)carbamoil)-5-cloro- 8-hidroxi-1-oxoisocromano-3-il)pentanóico (20). Una disolución de NaH2PO4 (92,7 mg, 0,67 mmol, 6,0 equiv) y NaClO2 (40,5 mg, 0,45 mmol, 4 equiv) en agua (620 ^L) se adicionó sobre una disolución del aldehído 19 (59,6 mg, 0,11 mmol) y 2-metilbut-2-eno 5 (175 ^L, 1,57 mmol, 14 equiv) en `BuOH (1,5 mL) y la mezcla se agitó a temperatura

ambiente durante 1 hora. A continuación, se añadió una disolución acuosa 1M de HCl (1,5 mL) y se agitó durante 3 minutos a temperatura ambiente, se diluyó con AcOEt, se lavó con salmuera y se concentró a sequedad a vacío para obtener el ácido 20 (62,6 mg, 94%) como un aceite amarillento.

10 Datos espectroscópicos de 20 (una mezcla 1:1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.41 (dos s, 4.5H cada uno, CMe3 de cada diastereoisómero), 1.53

2.00 (m, 6H, H2-3, H2-4 y H2-5), 2.42 (t, J = 7.10 Hz, 2H, H2-2), 2.80-2.92 (m, 1H, H-4), 3.13-3.31 (m, 3H, H-4 y H2-3), 4.55-4.65 (m, 1H, H-3), 4.97 (dt, J = 7.3, 6.1 Hz, 1H, H-2), 7.11-7.31 (m, 5H, Ph), 8.44 (s, 1H, H-6), 8.57-8.62 (m, 1H, NH), 12.71 (s, 1H, 15 OH). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 24.2 (C-4), 27.9 (CMe3), 29.6 (C-3), 30.6 (C- 4), 33.6 (C-2), 34.3 (C-5), 38.1 (C-3), 54.6 (C-2), 79.0 (C-3), 82.4 (CMe3), 110.1 (C- 8a), 120.7 (C-7), 123.1 (C-5), 126.9 (C-4), 128.3 (C-2 y C-6), 129.5 (C-3 y C- 5), 136.2 (C-1), 139.0 (C-6), 140.6 (C-4a), 159.0 (C-8), 162.2 (CONH), 169.6 (C- 1), 170.3 (C-1), 178.6 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C28H33ClNO8 [M+H]+ 20 546.1889, encontrado 546.1867.

**(Ver fórmula)**

Preparación de 5-(7-( (1-(terc-butoxi)- 1-oxo-3-fenilpropan-2-il)carbamoil)-5-cloro-

8-hidroxi-1-oxoisocromano-3-il)pentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (21). Una

disolución del ácido 20 (31,8 mg, 0,058 mmol), NHS (7,3 mg, 0,064 mmol, 1,1 equiv) y EDC HCl (13,4 mg, 0,07 mmol, 1,2 equiv) en CH3CN seco (1,6 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas bajo nitrógeno, tras lo cual se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente con agua, disolución acuosa del 5% de NaHCO3 y 5 salmuera. Tras secar sobre MgSO4 anhidro y eliminar el disolvente a presión reducida se obtuvo el éster de N-hidroxisuccinimidilo 21 (33,0 mg, 90%) como un aceite.

Datos espectroscópicos de 21 (una mezcla 1:1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.41 (s, 9H, CMe3), 1.50-1.91 (m, 6H, H2-3, H2-4 y H2-5), 2.67 (t, J =

7.0 Hz, 2H, H2-2), 2.83 (s, 4H, COCH2CH2CO), 2.88-2.94 (m, 1H, H-4), 3.14-3.24 (m, 10 2H, H2-3), 3.27 (dd, J = 17.2, 3.3 Hz, H-4), 4.54-4.68 (m, 1H, H-3), 4.90-5.01 (m, 1H,

H-2), 7.12-7.34 (m, 5H, Ph), 8.44 (s, 1H, H-6), 8.55 (dos dd, J = 7.4 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diasteroisómero), 12.69 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 24.2 (C-4), 25.6 (COCH2CH2CO), 27.9 (CMe3), 29.6 (C-3), 30.6 (C-2), 30.7 (C- 4), 34.1 (C-5), 38.1 (C-3), 54.6 (C-2), 78.9 (C-3), 82.3 (CMe3), 110.1 (C-8a), 120.8 15 (C-7), 123.1 (C-5), 126.9 (C-4), 128.3 (C-2 y C-6), 129.5 (C-3 y C-5), 136.2 (C-

1), 138.9 (C-6), 140.5 (C-4a), 159.0 (C-8), 162.1 (CONH), 168.3 (C-1), 169.1 (COCH2CH2CO), 169.6 (C-1), 170.3 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C32H3aClN2O10 [M+H]+ 643.2053, encontrado 643.2050.

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

O

**(Ver fórmula)**

1:1 CF3CO2H-CH2CI2 2h, ta

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Preparación del ácido 2-(5-cloro-3-(5-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-5-oxopentil)-8- hidroxi-1-oxoisocroman-7-carboxamido)-3-fenilpropanoico (Éster de N-

hidroxisuccimidilo del hapteno OTA-2, NHS-OTA-2). Una disolución del éster terc- butílico 21 (33,0 mg, 0,051 mmol) y CF3CO2H (1,5 mL, 19,0 mmol, 370 equiv) en CH2Cl2 anhidro (2,3 mL) se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente bajo nitrógeno. A continuación, los disolventes se eliminaron a sequedad a presión reducida 5 para obtener NHS-OTA-2 (29,8 mg, 99%) como un residuo de aspecto resinoso y color parduzco.

Datos espectroscópicos de NHS-OTA-2 (una mezcla 1:1 de diasteroisómeros): 1H- RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.54-1.93 (m, 6H, H2-1, H2-2 y H2-3), 2.68 (t, J = 6.69 Hz, 2H, H2-4), 2.85 (s ancho, 4H, COCH2CH2CO), 2.92 (m, 1H, H-4), 3.17-3.43 10 (m, 3H, H2-3 y H-4), 4.61 (m, 1H, H-3), 5.03 (m, 1H, H-2), 7.18-7.33 (m, 5H, Ph), 8.39

(s, 1H, H-6), 8.56 (s ancho, 1H, NH), 12.73 (s ancho, 1H, OH). EMAR (TOF ESI+): calculado para C28H28ClN2O10 [M+H]+ 587.1427, encontrado 587.1425.

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

DMF

Tampón carbonato 50 mM pH 9,6, 2h, t.a

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

BSA

2.2. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-2 con BSA (BSA-OTA-2) 15 Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado BSA-OTA-1 a partir de 200 pL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-2 y 1,8 mL de una disolución de BSA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Tras la correspondiente purificación cromatográfica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución y se almacenaron 20 a -20 °C. El número de moléculas de OTA-2 conjugadas por cada molécula de BSA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 11,8 (ver Tabla 2, entrada 1).

DMF

Tampón carbonato 50 mM pH 9,6, 2h, t.a

**(Ver fórmula)**

OVA

2.3. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-2 con OVA (OVA-OTA-2). Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado OVA-OTA-1 a partir 100 pL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-2 y 5 1,9 mL de una disolución de OVA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6.

Tras la correspondiente purificación cromatográfica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución con timerosal al 0,01% (v/v) y se almacenaron a -20 °C. El número de moléculas de OTA-2 conjugadas por cada molécula de OVA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 10 3,1 (ver Tabla 2, entrada 2).

**(Ver fórmula)**

DMF

Tampón carbonato 50 mM pH 9,6, 2h, t.a

**(Ver fórmula)**

2.4. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-2 con HRP (HRP-OTA-2). Preparado a partir de 80 pL de una disolución 5 mM del hapteno activado NHS-OTA- 2 en DMF y 0,9 mL de una disolución de HRP (2,5 mg/mL) en tampón carbonato 50 5 mM, pH 7,4. Tras la purificación cromatográfica, las fracciones obtenidas conteniendo el bioconjugado se llevaron a una concentración de 460 pg/mL en tampón PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0,02% (p/v) y se almacenaron a 4 °C. El número de moléculas de OTA-2 conjugadas por cada molécula de HRP, determinado por MALDI- TOF-MS, fue de n = 0,6 (ver Tabla 2, entrada 3).

TABLA 2. Valores de la carga hapténica de los conjugados proteicos del hapteno OTA-2 determinados por MALDI-TOF-MS

		RMo	m/z proteína referencia	m/z	A(m/z)	Am/hapteno	n
	BSA-OTA-2		66.428	71.982	5.554		11,8
	OVA-OTA-2		21.340	22.071	731		3,1
	HRP-OTA-2		43.928	44.200			0,6

RM0, n, A(m/z) y Am/hapteno tienen el mismo significado que en pie de Tabla 1.

Ejemplo 3: Preparación de bioconjugados comparativos basados en el anclaje de la proteína a través del grupo carboxilato de OTA donde L = CH2CH2CH2CH2CH2, Z = - (C=O)NH- y P = BSA, OVA y HRP.

3.1. Preparación del éster de N-hidroxisuccinimidilo del hapteno OTA-3 (NHS-OTA- 5 3).

**(Ver fórmula)**

HATU, DIEA

O

**(Ver fórmula)**

Cl

**(Ver fórmula)**

Preparación de 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3- fenilpropanoato de terc-butilo (22). A una disolución del ácido 5 (40 mg, 0,16 mmol) en DMF anhidra (1,1 mL) se añadieron una disolución de HATU (91,3 mg, 0,24 mmol, 1,5 10 equiv) en DMF anhidra (1,1 mL) y DIEA (60 pL, 0,32 mmol, 2 equiv). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y a continuación se añadió una disolución del clorhidrato 16 (82,5 mg, 0,32 mmol, 2 equiv) y DIEA (60 pL, 0,324 mmol, 2 equiv) en DMF anhidra (1,1 mL). Se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, tras lo cual se diluyó la mezcla de reacción con AcOEt y se lavó sucesivamente 15 con disoluciones acuosas de HCl (1M), LiCl (1,5%), NaHCO3 (5%) y salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro y se concentró a sequedad en el rotavapor. El residuo obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0,3, 90:10:0,3 y 80:20:0,3) para obtener el compuesto 22 (67 mg, 65%) como un aceite amarillento.

20 Datos espectroscópicos de 22 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.46 (s, 9H, CMe3), 1.62-1.64 y 1.63-1.65 (dos d, J = 6.3,

I. 5H cada uno, Me-3 de cada diastereoisómero), 2.84-2.89 y 2.90-2.95 (dos dd, J =

II. 7, 3.4 Hz, 0.5H cada uno, H-4 de cada diastereoisómero), 3.25 (m, 2H, H2-3), 3.33 (dd, J = 17.3, 3.4 Hz, 1H, H-4), 4.80 (m, 1H, H-3), 5.01 (dt, J = 7.4, 6.0 Hz, 1H, H-2), 7.20-7.38 (m, 5H, Ph), 8.49 (s, 1H, H-6), 8.58-8.62 (dos d, J = 6.9 Hz, 0.5H cada uno,

5 NH de cada diastereoisómero), 12.77 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 20.6 (Me-3), 27.9 (CMe3), 32.2 (C-4), 38.1 (C-3), 54.5 (C-2), 75.8 (C-3), 82.3 (CMe3), 110.0 (C-8a), 120.8 (C-7), 123.0 (C-5), 126.9 (C-4), 128.3 (C-2 y C-6), 129.5 (C-3 y C-5), 136.2 (C-1), 138.9 (C-6), 140.5 (C-4a), 159.0 (C-8), 162.1 (CONH), 169.7 (C-1), 170.3 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C24H27CINO6 [M+H]+ 460.1521, 10 encontrado 460.1522.

**(Ver fórmula)**

Preparación del ácido 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3- fenilpropanóico (23, OTA). Ácido trifluoroacético (1,27 mL, 16,28 mmol, 370 equiv) se añadió sobre una disolución del éster 22 (20,5 mg, 0,045 mmol) en CH2Cl2 anhidro (2 15 mL) y la mezcla se mantuvo bajo agitación durante 2h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a sequedad a presión reducida para obtener 23 (17.6 mg, 99%) como un sólido de color crema.

Datos espectroscópicos de 23 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.60 (d, J = 6.2 Hz, 3H, Me-3), 2.82 y 2.88 (dos dd, J = 20 11.5, 3.2 Hz, 0.5H cada uno, H-4 de cada diastereoisómero), 3.16-3.40 (m, 3H, H2-3 y

H-4), 4.75 (m, 1H, H-3) 4.99-5.08 (m, 1 H, H-2) 7.10-7.37 (m, 5H, Ph) 8.42 (s, 1H, H- 6), 8.50 (dos d, J = 6.8 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisómero), 12.74 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 20.6 (Me-3), 32.2 (C-4), 37.3 (C-3), 54.3

(C-2), 75.9 (C-3), 110.0 (C-8a), 120.2 (C-7), 123.2 (C-5), 127.3 (C-4), 128.3 (C-2 y C-6), 129.3 (C-3 y C-5), 135.7 (C-1), 138.9 (C-6), 141.0 (C-4a), 159.0 (C-8), 163.1 (CONH), 169.7 (C-1), 175.1 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C20H19ClNO6 [M+H]+ 404.0895, encontrado 404.0901.

**(Ver fórmula)**

Preparación de 6-(2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3- fenilpropanamido)hexanoato de metilo (25). Sobre una disolución del ácido 23 (18 mg, 0,044 mmol) y cloruro de 6-metoxi-6-oxohexan-1-amonio (24, 9,4 mg, 0,052 mmol, 1,1 equiv) en DMF anhidra (600 pL) bajo nitrógeno se añadió DIEA (25 pL, 0,143 mmol, 10 3,25 equiv), la mezcla resultante se agitó durante 10 minutos y seguidamente se

añadió una disolución de PyAOP (34 mg, 0,065 mmol, 1,5 equiv) en DMF anhidra (600 pL). Tras 4 horas de agitación a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con AcOEt y se lavó con disoluciones acuosas de LiCl (1,5%) y NaHCO3 (5%) y salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro. El residuo obtenido tras la evaporación del disolvente a 15 presión reducida se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de CHCl3-MeOH (100:0 y 99:1) para obtener la amida 25 (16,8 mg, 72%) como un aceite amarillento.

Datos espectroscópicos de 25 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 (ppm) 1.11-1.28 (m, 2H, H2-4), 1.31-1.44 (m, 2H, H2-5), 1.49-1.63 20 (m, 2H, H2-3), 1.61 (dos d, J = 6.4 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada uno de los

diastereoisómeros), 2.17-2.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H, H2-2), 2.86 (dos dd, J = 11.6, 1.6 Hz, 0.5H cada uno, H-4 de cada diastereoisómero), 3.04-3.37 (m, 5H, H2-6, H2-3 y H-

4), 3.66 (s, 3H, OMe), 4.62-4.89 (m, 2H, H-3 y NH), 5.83 (m, 1H, H-2), 7.12-7.40 (m, 5H, Ph), 8.41 (s, 1H, H-6), 8.59 (d, J = 7.4 Hz, 1H, NH), 12.81 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): 5 (ppm) 20.7 (Me-3), 24.4 (C-3), 26.2 (C-4), 28.9 (C-5), 32.2 (C-4), 33.8 (C-2), 38.4 (C-3), 39.2 (C-6), 51.5 (OMe), 55.7 (C-2), 75.9 (C-3), 5 110.1 (C-8a), 120.6 (C-7), 123.1 (C-5),127.0 (C-4), 128.6 (C-2 y C-6), 129.3

(C-3 y C-5), 136.8 (C-1), 138.8 (C-6), 140.8 (C-4a), 159.0 (C-8), 162.7 (CONH), 169.7 (C-1), 170.4 (C-1), 173.9 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C27H32CIN2O7 [M+H]+ 531.1893, encontrado 531.1878.

H3CO

**(Ver fórmula)**

10 Preparación del ácido 6-(2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido) 3-fenilpropanamido) hexanóico (26). Una disolución de LiOH H2O (13 mg, 0,31 mmol, 10 equiv) en agua (700 qL) se añadió sobre una disolución del éster metílico 25 (16,6 mg, 0,031 mmol) en THF (700 qL) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se enfrió en un baño de 15 hielo y se acidificó con una disolución acuosa 1M de KHSO4 hasta pH=2, se diluyó con AcOEt, se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4 anhidro para obtener, tras evaporar el disolvente a presión reducida, un residuo que se disolvió en THF anhidro (1,2 mL) sobre el que se añadió una gota de HCl 4M en dioxano. Tras 30 min de agitación a temperatura ambiente, el disolvente se eliminó a vacío hasta sequedad 20 para obtener el ácido 26 (15,7 mg, 98%) como un semisólido amarillento.

Datos espectroscópicos de 26 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (DMSO-da, 500 MHz): 5 (ppm) 1.18-1.28 (m, 2H, H2-4), 1.30-1.40 (m, 2H, H2-5), 1.421.52 (m, 2H, H2-3), 1.46-1.47 (dos d, J = 6.4 Hz, 1.5H cada uno, Me-3 de cada uno de los diastereoisómeros), 2.14-2.20 (t, J = 7.4 Hz, 2H, H2-2), 2.88-3.08 (m, 6H, H-4, 5 H2-3, H2-6 y NH), 3.22 (dd, J = 17.2, 3.1 Hz, 1H, H-4), 4.69-4.76 (m, 1H, H-3), 4.84

(m, 1H, H-2), 7.15-7.28 (m, 5H, Ph), 8.08 y 8.09 (dos s, 0.5H cada uno, H-6 de cada diastereoisómero), 8.14 y 8.60 (dos m, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisómero). 13C-RMN (DMSO-da, 125 MHz): 5 (ppm) 20.0 (Me-3), 24.2 (C-3), 25.9 (C-4), 28.6 (C-5), 31.6 (C-4), 33.56 (C-2), 38.1 (C-3), 38.4 (C-6), 54.5 (C-2), 75.4 (C-3), 111.3 10 (C-8a), 120.2 (C-7), 121.4 (C-5), 126.4 (C-4), 128.1 (C-2 y C-6), 129.2 (C-3 y C-

5), 136.0 (C-1), 139.2 (C-6), 141.6 (C-4a), 158.4 (C-8), 162.54 (CONH), 169.9 (C- 1), 169.9 (C-1), 174.3 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C26H30CIN2O7 [M+H]+ 517.1736, encontrado 517.1731.

HO

**(Ver fórmula)**

O

H

**(Ver fórmula)**

15 Preparación de 6-(2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3-fenil propanamido)hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (Éster de W-hidroxisuccimidilo del hapteno OTA-3, NHS-OTA-3). Una disolución de EDCHCl (7,0 mg, 0,037 mmol, 1,2 equiv) en DMF anhidra (0,5 mL) se adicionó sobre una disolución del ácido 26 (16 mg, 0,031 mmol) y NHS (3,9 mg, 0,034 mmol, 1,1 equiv) en DMF anhidra (0,5 mL) bajo 20 nitrógeno. La mezcla se mantuvo bajo agitación a temperatura ambiente durante 24 horas y a continuación se trató con una disolución saturada de NH4Cl, se diluyó con AcOEt y se lavó con disoluciones acuosas de LiCl (1,5%), NaHCO3 (5%) y salmuera.

Tras secar sobre MgSO4 anhidro y evaporar el disolvente a presión reducida se obtuvo un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de CH2Cl2-acetona (90:10, 85:15 y 80:20), para obtener el éster NHS-OTA-3 (8,5 mg, 45%) como aceite amarillento.

5 Datos espectroscópicos de NHS-OTA-3 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H- RMN (DMSO-da, 500 MHz): 5 (ppm) 1.29-1.37 (m, 2H, H2-4), 1.39-1.47 (m, 2H, H2-5), 1.60 (d, J = 6.4 Hz, 3H, Me-3), 1.64-1.78 (m, 2H, H2-3), 2.56 (t, J = 6.8 Hz, 2H, H2-2), 2.76-2.93 (m, 5H, H-4, COCH2CH2CO), 3.06-3.37 (m, 5H, H-4, H2-3 y H2-6), 4.684.91 (m, 2H, H-3 y NH), 6.04 (m, 1H, H-2), 7.16-7.35 (m, 5H, Ph), 8.38 (s, 1H, H-6), 10 8.60 (d, J = 7.0 Hz, 1H, NH), 12.79 (s, 1H, OH). EMAR (TOF ESI+): calculado para

C30H33N3ClO9 [M+H]+ 614.1900, encontrado 614.1892.

DMF

Tampón carbonato 50 mM pH 9,6, 2h, t.a

**(Ver fórmula)**

Cl - n

bioconjugado BSA-OTA-3

3.2. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-3 con BSA (BSA-OTA-3,). Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado BSA-OTA-1 a 15 partir de 178 pL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-3 y 1,6 mL de una disolución de BSA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Tras la correspondiente purificación cromatográfica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución y se almacenaron a -20 °C. El número de moléculas de OTA-3 conjugadas por cada molécula de BSA, 20 determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 14,4 (ver Tabla 3, entrada 1).

DMF

Tampón carbonato 50 mM pH 9,6, 2h, t.a

**(Ver fórmula)**

Ci - n

bioconjugado OVA-OTA-3

3.3. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-3 con OVA (OVA-OTA-3). Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado OVA-OTA-1 a partir de 100 pL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-3 5 y 1,9 mL de una disolución de OVA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Tras la correspondiente purificación cromatográfica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución con timerosal al 0,01% (v/v) y se almacenaron a -20 °C. El número de moléculas de OTA-3 conjugadas por cada molécula de OVA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 10 3,0 (ver Tabla 3, entrada 2).

DMF

Tampón carbonato 50 mM pH 9,6, 2h, t.a

**(Ver fórmula)**

d - n

bioconjugado HRP-OTA-3

3.4. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-3 con HRP (HRP-OTA-3,). Preparado a partir de 80 pL de una disolución 5 mM del hapteno activado NHS-OTA- 5 3 en DMF y 0,9 mL de una disolución de HRP (2,5 mg/mL) en tampón carbonato 50

mM, pH 7,4. Tras la purificación cromatográfica, las fracciones obtenidas conteniendo el bioconjugado se llevaron a una concentración de 470 pg/mL en tampón PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0,02% (p/v) y se almacenaron a 4 °C. El número de moléculas de OTA-3 conjugadas por cada molécula de HRP, determinado por MALDI- 10 TOF-MS, fue de n = 0,9 (ver Tabla 3, entrada 3).

TABLA 3. Valores de la carga hapténica de los conjugados proteicos del hapteno OTA-3 determinados por MALDI-TOF-MS

		RMo	m/z proteína referencia	m/z	A(m/z)	Am/hapteno	n
	BSA-OTA-3		66.428	73.642	7.214		14,4
	OVA-OTA-3		21.340#	22.079#	739		3,0
	HRP-OTA-3		43.928	44.382			0,9

RM0, n, A(m/z), Am/hapteno y # tienen el mismo significado que en pie de Tabla 1.

2. Procedimiento ELISA

Se emplearon placas de poliestireno de 96 pocilios. Cada anticuerpo se evaluó en los dos formatos clásicos de ELISA competitivo (el de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta y el de anticuerpo inmovilizado con detección directa y pretapizado) usando antígenos de ensayo homólogos, es decir, un antígeno de ensayo a partir del mismo bioconjugado de fórmula (I) o bioconjugado comparativo que el utilizado para obtener el inmunógeno pero en el que P = OVA o HRP. Después de cada etapa de incubación, las placas se lavaron cuatro veces con una disolución de lavado, usando un lavador de 96 canales ELx405 (Biotek Instruments, Winooski, EE.UU.). La señal producida por la peroxidasa utilizada como marcador se reveló con 100 pL por pocillo de una disolución 2 mg/mL de o-fenilendiamina en tampón citrato 25 mM, fosfato 62 mM, pH 5,4, conteniendo 0,012% (v/v) de H2O2. Este revelado se desarrolló durante 10 min a temperatura ambiente y se paró usando 100 pL por pocillo de ácido sulfúrico 2,5 M. Al finalizar los ensayos, la absorbancia de cada pocillo se leyó a 492 nm usando una longitud de onda de referencia de 650 nm en un lector de microplacas PowerWave HT (Biotek Instruments, Winooski, EE.UU.). Las curvas patrón sigmoideas obtenidas al representar la absorbancia frente a la concentración de analito se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros usando el paquete informático SigmaPlot de SPSS (Chicago, EE.UU.).

La afinidad del anticuerpo (IC50) se estimó como la concentración de analito libre capaz de reducir a la mitad la señal máxima (Amax).

2.1. Ensayos ELISA competitivos en formato de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta (ensayo indirecto)

Las placas se tapizaron con 100 pL por pocillo de una disolución de antígeno de ensayo que es un bioconjugado de formula (I) o bioconjugado comparativo donde P es OVA, a diversas concentraciones en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, mediante incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, en cada columna se dispensó 50 pL por pocillo de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 pL por pocillo de un determinado anticuerpo diluido en PBST (0,05% Tween 20). La reacción inmunoquímica se llevó a

cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. A continuación, cada pocillo recibió 100 pL de una dilución 1/2000 de RAM-HRP (inmunoglobulinas de conejo anti-ratón marcadas con peroxidasa) en PBST. Esta reacción se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar las placas, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito anteriormente.

2.2. Ensayos ELISA competitivos en formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa (ensayo directo)

Las placas se tapizaron con 100 pL por pocillo de una dilución de anticuerpo de captura en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, se añadió 100 pL por pocillo de anticuerpo o antisuero en PBST a la concentración o dilución considerada como óptima, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar de nuevo las placas, en cada columna se dispensó 50 pL por pocillo de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 pL por pocillo de una dilución concreta en PBST de bioconjugado enzimático que es un bioconjugado de formula (I) o bioconjugado comparativo donde P es HRP. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. Finalmente, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito.

3. Inmunización de conejos

Se inmunizaron, siguiendo protocolos estandarizados, 2 hembras de conejo de la raza New Zealand con cada bioconjugado de fórmula (I) o bioconjugado comparativo donde P es BSA. Cada animal recibió 0,3 mg de uno de los bioconjugados de fórmula (I) o el bioconjugado comparativo disuelto en 1 mL de una mezcla 1:1 de tampón PB y adyuvante de Freund completo. La inmunización prosiguió con la inoculación de una dosis de recuerdo cada 21 días con la misma cantidad de conjugado pero empleando adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la cuarta inyección, los animales fueron desangrados y la sangre obtenida se dejó coagular a 4 °C durante toda la noche. Al día siguiente, se recuperaron los sueros por centrifugación, se diluyeron a % con PBS frío y se les añadió un volumen de una disolución saturada de

sulfato amónico. El precipitado proteico resultante de cada suero se recogió por centrifugación y se redisolvió en tampón PBS frío. Finalmente, las proteínas se reprecipitaron como anteriormente y se almacenaron en este estado a 4 °C. Este precipitado contiene una mezcla indeterminada de proteínas que denominamos antisuero, anticuerpo policlonal o simplemente anticuerpo. Se obtuvieron dos anticuerpos de cada bioconjugado de fórmula (I) y del bioconjugado comparativo donde P es BSA, identificados como #1 y #2.

4. Producción de anticuerpos monoclonales de ratón

4.1. Inmunización de ratones

Para la inmunización se emplearon los bioconjugados de fórmula (Ia) y (Ib) en los que P es BSA (conjugados inmunizantes) obtenidos en los ejemplos anteriores. Se utilizaron hembras de ratón BALB/c, con una edad al inicio del proceso comprendida entre 6 y 8 semanas.

En cada dosis se administraron por vía intraperitoneal 100 pg de bioconjugado por ratón, siendo el volumen total administrado 200 pL. En la primera inmunización se suministró el bioconjugado en una emulsión preparada con adyuvante de Freund completo (1:1, v/v). A intervalos de 3 semanas, los ratones recibieron dos inmunizaciones adicionales, en estos casos emulsionando los bioconjugados con adyuvante de Freund incompleto. Cuatro días antes de cada fusión celular, los ratones seleccionados recibieron una última dosis de 100 pg del correspondiente bioconjugado diluido en PBS.

4.2. Fusiones celulares para la obtención de hibridomas

Las fusiones con los ratones inmunizados se llevaron a cabo básicamente siguiendo metodologías previamente descritas y bien establecidas en el estado de la técnica. Inmediatamente después del sacrificio de los ratones se extrajo el bazo, que se homogeneizó con el émbolo de una jeringa estéril. Tras lisar los glóbulos rojos por choque osmótico con 1 mL de tampón de lisis durante un minuto en frío, los linfocitos

se lavaron 2 veces con medio completo (con suero) frío y se filtraron para eliminar los coágulos formados.

La línea de mieloma P3-X63-Ag8.653 fue cultivada los días previos a la fusión en medio DMEM suplementado [2 mM L-alanina-L-glutamina, 1 mM aminoácidos no esenciales, 25 pg/mL gentamicina, suero bovino fetal (SBF) 10% (v/v)], manteniendo las células en fase de crecimiento exponencial, de manera que el día de la fusión se dispuso de un número suficiente de las mismas.

Tras dos lavados con medio sin suero, ambas poblaciones celulares se juntaron a una relación linfocito:mieloma 4:1. A continuación, las células se centrifugaron, para inmediatamente después llevar a cabo la fusión celular. Para ello, se empleó el agente fusionante químico PEG1500 (1 mL por bazo, 1 min), que al disolver parcialmente las membranas permite la fusión de las células. Una vez fusionadas ambas poblaciones, las células se resuspendieron en medio DMEM suplementado [SBF 15% (v/v)] y se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (100 pL por pocillo) a una densidad celular de 150*103 linfocitos por pocillo, y se incubaron a 37 °C en una atmósfera con 5% de CO2 y un 95% de humedad. 24 h después de la fusión, se añadió 100 pL por pocillo de medio HAT para selección de hibridomas [DMEM suplementado con 100 pM hipoxantina, 0,4 pM aminopterina, 16 pM timidina, y SBF 20% (v/v)] que contenía HFCS (High Fusión and Cloning Supplement) al 1% (v/v).

4.3. Selección, clonaje y conservación de hibridomas

Aproximadamente 10-12 días después de la fusión celular se llevó a cabo la evaluación de los sobrenadantes de los pocillos sembrados, con objeto de identificar cuáles contenían hibridomas secretores de anticuerpos capaces de reconocer ocratoxina A tanto en su forma conjugada como libre (clones competidores). Previamente, se determinó por inspección visual la eficiencia de la fusión, definida como el porcentaje de pocillos que presentaban al menos un clon claramente visible al microscopio.

Para llevar a cabo la identificación de clones competidores, los sobrenadantes de cultivo se analizaron mediante la técnica ELISA diferencial, que consiste en analizar

paralelamente en pocilios adyacentes cada sobrenadante en ausencia de analito y en presencia de una concentración prefijada de analito, habitualmente 100 nM. Para ello, las placas se tapizaron con el conjugado homólogo, que es un bioconjugado de fórmula (I) en el que P es OVA, a una concentración de 0,1 pg/mL, y el ensayo se llevó a cabo añadiendo 50 pL del sobrenadante de cultivo. Las condiciones para el formato de ELISA indirecto se detallan en el apartado 2.1.

A continuación, se seleccionaron aquellos pocillos que contenían hibridomas productores de anticuerpos capaces de proporcionar una señal de absorbancia igual o superior a 0,5 en el ensayo en ausencia de ocratoxina A e inhibición de la señal igual o superior al 80% en el ensayo en presencia de ocratoxina A. Adicionalmente, para todos los pocillos positivos se llevó a cabo un segundo cribado más exhaustivo en modo bidimensional competitivo con el fin de seleccionar con mayor seguridad los mejores hibridomas. Para ello, el sobrenadante de cada hibridoma se ensayó a 4 diluciones (1/8, 1/32, 1/128 y 1/512) en placas tapizadas con el bioconjugado homólogo a 0,01 y 0,1 pg/mL, y utilizando como competidor ocratoxina A a 10 y 100 nM (en ensayo). Así, 200 pL del sobrenadante de cultivo se diluyeron en 600 pL de PBST y las siguientes diluciones se hicieron de forma seriada a partir de esta primera. El ensayo se realizó añadiendo 50 pL por pocillo de la correspondiente dilución de sobrenadante y 50 pL de la disolución de ocratoxina A en PBS a la concentración de 100, 10 y 0 nM.

Las células de los pocillos finalmente seleccionados se clonaron por el método de dilución límite, sembrando a partir de cada pocillo una nueva placa de 96 pocillos a 2 células por pocillo en medio HT, de igual composición que el HAT pero sin aminopterina, y conteniendo HFCS al 1% (v/v).

Generalmente, 7-10 días después del primer clonaje, se identificaron por inspección visual los pocillos que contenían un único clon, evaluándose de nuevo el sobrenadante de cultivo de la misma forma que se ha descrito previamente para los sobrenadantes de fusión. Este proceso se realizó tantas veces como fue necesario (al menos dos) para asegurar la monoclonalidad de los hibridomas seleccionados, así como su estabilidad. Finalmente, se procedió a la expansión de las líneas celulares seleccionadas, cultivando progresivamente el hibridoma en recipientes de mayor

volumen. Una vez crecido el clon, las células se congelaron en nitrógeno líquido a una concentración de 107 células por vial (2-4 viales para cada hibridoma) en una disolución de SBF con DMSO 10% (v/v) como agente crioprotector. Los viales se mantuvieron a -80 °C en el interior de una caja de poliestireno durante 24 h antes de pasarlos al contenedor de nitrógeno líquido.

4.4. Producción y purificación de anticuerpos monoclonales

En la última fase de la expansión celular de los hibridomas, éstos se dividieron progresivamente en placas de cultivo hasta alcanzarse un volumen final comprendido entre 100 y 200 mL de sobrenadante. Se dejaron crecer las células hasta alcanzar la confluencia, y una vez agotados los nutrientes del medio de cultivo se procedió a recoger el contenido de las placas. El volumen recogido se centrifugó para eliminar los restos celulares y el sobrenadante se precipitó mediante la adición de un volumen de una disolución saturada de sulfato amónico, manteniéndose a 4 °C hasta su purificación.

La purificación de los anticuerpos se realizó por cromatografía de afinidad con columnas de proteína G siguiendo las instrucciones del fabricante. Con este propósito, el anticuerpo precipitado se centrifugó durante 20 min a 5000 rpm (4000*g) y se descartó el sobrenadante. El precipitado que contenía los anticuerpos se redisolvió con tampón fosfato sódico 20 mM, pH 7,4 y se filtró con membranas de nitrocelulosa (diámetro de poro 0,45 pm) para eliminar partículas en suspensión. La elución del anticuerpo de la columna se realizó con tampón citrato sódico 100 mM, pH 2,5. Las fracciones que contenían el anticuerpo se identificaron mediante espectrofotometría UV y se recogieron. La disolución se neutralizó adicionando Tris-HCl 1 M, pH 9,5. Finalmente, se determinó por espectrofotometría UV la concentración del anticuerpo purificado [A280 (1 mg/mL IgG) = 1,4] y se preparó una disolución de trabajo a una concentración de 500 pg/mL en PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0,01% (p/v), que se almacenó a 4 °C. La disolución restante se precipitó con sulfato amónico saturado [1:1, (v/v)], lo cual garantiza su estabilidad a 4 °C durante años.

5. Resultados

5.1. Respuesta inmune y determinación de la afinidad de los antisueros

Cada uno de los antisueros obtenidos se ensayó frente a su antígeno de ensayo 5 homólogo usando el ensayo de tipo ELISA competitivo en el formato de anticuerpo

inmovilizado. Se ensayaron diferentes concentraciones de antígeno de ensayo frente a diferentes concentraciones de anticuerpo utilizando como competidor varias concentraciones de ocratoxina A preparadas por dilución seriada. Los tres inmunógenos produjeron respuestas inmunes adecuadas, con títulos elevados y 10 habituales para este tipo de analitos. Sin embargo, mientras los antisueros

procedentes de animales inmunizados con los inmunógenos de fórmula Ia y Ib presentaron una elevada afinidad hacia ocratoxina A, con valores de IC50 cercanos o inferiores a 1 nM, los antisueros obtenidos a partir del inmunógeno comparativo mostraron afinidades hacia ocratoxina A claramente inferiores (mayor IC50). Este 15 resultado confirma que unas estructuras son más idóneas que otras para el objetivo

que se persigue, y que los haptenos funcionalizados a través de posiciones alternativas al grupo carboxilato de la ocratoxina A, y que por tanto dejan dicho grupo libre, dan lugar a anticuerpos de mayor afinidad hacia la micotoxina diana. Los valores de la señal máxima, de la IC50 y de la pendiente de la curva de inhibición resultante 20 para cada antisuero con antígeno de ensayo homólogo se han incluido en la Tabla 4.

TABLA 4 Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo de antisuero

inmovilizado con detección directa

Antisuero &	Trazador (ng/mL)	Dilución As. (x103)	A ^max	Pendiente	IC50 (nM)
Ia#1			1,632	0,541	0,735
Ia#2			1,472	0,442	1,889
Ib#1			1,523	0,408	0,445
Ib#2			1,050	0,709	0,361
Comp.#1			1,574	0,394	9,842
Comp.#2			1,225	0,359	>100

& Antisueros de conejo; inmunización con los conjugados BSA-OTA-1 (la), BSA-OTA- 2 (Ib) y BSA-OTA-3 (Comp.),

5.2. Generación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente a ocratoxina-A

5 Para demostrar de manera más concluyente la idoneidad de los bioconjugados de fórmula (Ia) y (Ib) para la obtención de anticuerpos anti-ocratoxina A, se inmunizaron ratones con ambos conjugados de fórmula (Ia) y (Ib) en los que P es BSA y se llevaron a cabo fusiones celulares encaminadas a la generación de hibridomas. Se consiguió obtener 4 líneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales con elevada 10 afinidad hacia ocratoxina A a partir del bioconjugado de fórmula (Ia), y 7 líneas celulares a partir del bioconjugado de fórmula (Ib). Los anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de dichos hibridomas se han denominado a efectos de la presente invención y de los ejemplos aquí incluidos: mAb Ia#39, mAb Ia#41, mAb Ia#310a y mAb Ia#310b (anticuerpos monoclonales a partir del bioconjugado de fórmula Ia); y 15 mAb Ib#16, mAb Ib#21, mAb Ib#27, mAb Ib#111, mAb Ib#114, mAb Ib#115 y mAb Ib#118 (anticuerpos monoclonales a partir del bioconjugado de fórmula Ib). Estos resultados ponen de manifiesto que los bioconjugados de fórmula (Ia) y (Ib) son adecuados para obtener anticuerpos monoclonales de muy elevada afinidad frente a ocratoxina A.

5.3. Determinación de la afinidad de los anticuerpos

Una vez purificados por cromatografía de inmunoafinidad los 11 anticuerpos monoclonales obtenidos, se determinó su afinidad hacia ocratoxina A mediante ELISA 5 competitivo directo homólogo. Cada anticuerpo monoclonal se ensayó a varias concentraciones (100, 300 y 1000 ng/mL) frente a diferentes concentraciones de trazador enzimático (300, 100, 30 y 10 ng/mL), que es un derivado marcado de fórmula II donde Q es peroxidasa. Los valores de Amax, pendiente e IC50 para cada anticuerpo monoclonal que se muestran en la Tabla 5 corresponden a la combinación 10 óptima, es decir, a la concentración de inmunorreactivos que generó la curva de calibración con un menor valor de IC50, y por tanto una afinidad mayor para ocratoxina A. En dicho formato de ensayo los anticuerpos mostraron valores de IC50 para ocratoxina A comprendidos entre 0,071 y 1,457 nM, siendo el anticuerpo con mayor afinidad de entre los producidos a partir del bioconjugado de fórmula Ia el mAb 15 Ia#310b (IC50=0,071 nM), y el anticuerpo con mayor afinidad de entre los producidos a

partir del bioconjugado de fórmula Ib el mAb Ib#115 (IC50=0,169 nM).

TABLA 5 Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo

homólogo de anticuerpo inmovilizado con detección directa

Anticuerpo monoclonal	Trazador (ng/mL)	mAb (ng/mL)	A ^max	Pendiente	IC50 (nM)
Ia#38			1,880	1,309	0,504
Ia#39			1,907	0,891	1,457
Ia#310a			1,013	1,116	0,088
Ia#310b			1,054	1,324	0,071
Ib#16			1,739	2,003	0,397
Ib#25			1,639	1,468	0,394
Ib#27			1,830	1,128	1,114
Ib#111			1,679	2,219	0,321
Ib#114			1,958	1,442	0,623
Ib#115			1,245	1,277	0,169
Ib#118			2,499	1,646	0,357

Claims

ES-2672945_B1

1. Un bioconjugado de formula (I) :

[T-L-Z]n-P

(I)

donde

T se selecciona del grupo que consiste en R-I y R-II;

L es una cadena hidrocarbonada de 0 a 40 atomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroatomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N;

Z es un grupo funcional seleccionado entre - (C=O) NH-, -NH (C=O) -, - (C=O) S-, -

S (C=O) -, - (C=O) O-, -O (C=O) -, -O (C=O) O-, -O (S=O) O-, -O (SO2) O-

-NH (S=O) O-, -O (S=O) NH-, -NH (SO2) O-, -O (SO2) NH-, - (SO2) NH-, -NH (SO2) -,

-O (C=O) NH-, -NH (C=O) O-, -NH (C=O) NH-, -NH (C=S) NH-, -NH-, -N (alquilo Cr Ca) -, -S -, -S -S -, -NH-NH-, -N=C-, -C=N-, -NH (C=NH) -, -N=N-, -O -,

P es un peptido o polipeptido, natural o sintetico, de peso molecular mayor de 2000 daltons donde el peptido o polipeptido P puede estar o no unido, mediante interaction covalente, electrostatica o de otro tipo, a un soporte y donde dicho soporte puede ser un pollmero sintetico o no, o estar compuesto por nanomateriales como nanotubos de carbono, zeolitas o sllice mesoporosa;

n es un numero con un valor entre 1 y 500.

2. El bioconjugado de formula (I) según la reivindicación 1 caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 atomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.

3. El bioconjugado de formula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en - (C=O) NH-, -NH (C=O) -, -O (C=O) NH-, -NH (C=O) O-, -NH (C=O) NH-, -NH-, -S -,

4. El bioconjugado de formula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque P se selecciona del grupo que consiste en albumina, tiroglobulina, hemocianina, beta-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.

5. El bioconjugado de formula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, con la formula (la)

donde P se selecciona del grupo que consiste en albumina o peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

6. El bioconjugado de formula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, con la formula (lb)

donde P se selecciona del grupo que consiste en albumina o peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

7. Un derivado marcado de formula (II) :

[T -L-Z ]m-Q

(II)

donde

T, L y Z son según se han definido en la reivindicación 1; Q es un marcador no isotopico detectable y m es un numero con un valor entre 1 y 1000.

8. El derivado marcado de formula (II) según la reivindicación 7, donde Q se selecciona del grupo que consiste en enzimas, biotina, fluorescelna o uno cualquiera de sus derivados, un fluoroforo de cianina, un fluoroforo de rodamina, un fluoroforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un ester de acridinio, nanoparticulas cuanticas (en ingles quantum dots) , y micro- o nanoparticulas de oro coloidal, de carbon o de latex.

9. El derivado marcado de formula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en - (C=O) NH-, -NH (C=O) -, -O (C=O) NH-, -NH (C=O) O-, -NH (C=O) NH-, -NH-, -S -,

10. El derivado marcado de formula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 atomos e carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.

11. El derivado marcado de formula (II) según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, con la formula (Ila)

donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluorescelna o nanopartlculas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.

12. El derivado marcado de formula (II) según cualquiera de las reivindicaciones 7 a

10, con la formula (IIb)

donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluorescelna o nanopartlculas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.

13. Un anticuerpo que reconoce especlficamente un bioconjugado según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

14. El anticuerpo según la reivindicación 13, donde el anticuerpo se selecciona entre monoclonal, policlonal y recombinante.

15. Uso de un bioconjugado según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la obtención de un anticuerpo.

16. Método de analisis in vitro de ocratoxina A en una muestra que comprende el uso de un anticuerpo según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

17. Método según la reivindicación 16 que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14;

b) incubar la muestra y el anticuerpo de la etapa (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoqulmica; y

c) determinar la existencia de reacción inmunoqulmica tras la incubación de la etapa (b) .

18. Método según la reivindicación 17, donde la determination de la reacción inmunoqulmica en el paso (c) se realiza mediante un ensayo competitivo, usando como competidor un bioconjugado según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

19. Método según la reivindicación 17, donde la determinación de la reacción inmunoqulmica en el paso (c) se realiza mediante un ensayo competitivo, usando como competidor un derivado marcado según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

20. Kit de detection y/o determinación de ocratoxina A, que comprende al menos un anticuerpo según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 junto con un bioconjugado descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o junto con un derivado marcado descrito en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

21. Método de purification y/o concentration de ocratoxina A de una muestra que comprende el uso de un anticuerpo según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

22. Método según la reivindicación 21 realizado mediante cromatografla de afinidad que comprende las siguientes etapas:

a) inmovilizar al menos un anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 sobre un soporte;

b) hacer pasar la muestra a traves de dicho soporte para que retenga la ocratoxina A presente en dicha muestra; y

c) eluir la ocratoxina A retenida en el soporte.

ES-2672945_A1

1. Un bioconjugado de fórmula (I):

[T-L-Z]n-P

(I)

donde

T se selecciona del grupo que consiste en R-I y R-II;

**(Ver fórmula)**

L es una cadena hidrocarbonada de 0 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N;

Z es un grupo funcional seleccionado entre -(C=O)NH-, -NH(C=O)-, -(C=O)S-, - S(C=O)-, -(C=O)O-, -O(C=O)-, -O(C=O)O-, -O(S=O)O-, -O(SO2)O- -NH(S=O)O-, -O(S=O)NH-, -NH(SO2)O-,-O(SO2)NH-, -(SO2)NH-, -NH(SO2)-, -O(C=O)NH-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)NH-, -NH(C=S)NH-, -NH-, -N(alquilo Cr

Ca)-, -S- -S-S-, -NH-NH-, -N=C-, -C=N-, -NH(C=NH)- -N=N-, -O-,

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

y

N=N

**(Ver fórmula)**

P es un péptido o polipéptido, natural o sintético, de peso molecular mayor de 2000 daltons donde el péptido o polipéptido P puede estar o no unido, mediante interacción covalente, electrostática o de otro tipo, a un soporte y donde dicho soporte puede ser un polímero sintético o no, o estar compuesto por nanomateriales como nanotubos de carbono, zeolitas o sílice mesoporosa;

n es un número con un valor entre 1 y 500.

2. El bioconjugado de fórmula (I) según la reivindicación 1 caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.

3. El bioconjugado de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -(C=O)NH-, - NH(C=O)-, -O(C=O)NH-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)NH-, -NH-, -S-,

**(Ver fórmula)**

P

N y

O

**(Ver fórmula)**

4. El bioconjugado de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, beta-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.

5. El bioconjugado de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, con la fórmula (la)

**(Ver fórmula)**

20 donde P se selecciona del grupo que consiste en albúmina o peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

6. El bioconjugado de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, con la fórmula (Ib)

**(Ver fórmula)**

donde P se selecciona del grupo que consiste en albúmina o peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

7. Un derivado marcado de formula (II):

[T-L-Z]m-Q

(II)

donde

T, L y Z son según se han definido en la reivindicación 1; Q es un marcador no isotópico detectable y m es un número con un valor entre 1 y 1000.

8. El derivado marcado de fórmula (II) según la reivindicación 7, donde Q se selecciona del grupo que consiste en enzimas, biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio, nanoparticulas cuánticas (en inglés quantum dots), y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.

9. El derivado marcado de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -(C=O)NH-, - NH(C=O)-, -O(C=O)NH-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)NH-, -NH-, -S-

**(Ver fórmula)**

_ y

**(Ver fórmula)**

10. El derivado marcado de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos

de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.

11. El derivado marcado de formula (II) según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, con la fórmula (Ila)

**(Ver fórmula)**

donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluoresceína o nanopartículas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.

12. El derivado marcado de formula (II) según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, con la fórmula (IIb)

**(Ver fórmula)**

(IIb)

donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluoresceína o nanopartículas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.

13. Un anticuerpo que reconoce específicamente un bioconjugado según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

14. El anticuerpo según la reivindicación 13, donde el anticuerpo se selecciona entre monoclonal, policlonal y recombinante.

15. Uso de un bioconjugado según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la obtención de un anticuerpo.

16. Método de análisis in vitro de ocratoxina A en una muestra que comprende el uso de un anticuerpo según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

17. Método según la reivindicación 16 que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14;

b) incubar la muestra y el anticuerpo de la etapa (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica; y

c) determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación de la etapa (b).

18. Método según la reivindicación 17, donde la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un ensayo competitivo, usando como competidor un bioconjugado según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

19. Método según la reivindicación 17, donde la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un ensayo competitivo, usando como competidor un derivado marcado según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

20. Kit de detección y/o determinación de ocratoxina A, que comprende al menos un anticuerpo según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 junto con un bioconjugado descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o junto con un derivado marcado descrito en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

21. Método de purificación y/o concentración de ocratoxina A de una muestra que comprende el uso de un anticuerpo según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

22. Método según la reivindicación 21 realizado mediante cromatografía de afinidad que comprende las siguientes etapas:

a) inmovilizar al menos un anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 sobre un soporte;

b) hacer pasar la muestra a través de dicho soporte para que retenga la ocratoxina A presente en dicha muestra; y

c) eluir la ocratoxina A retenida en el soporte.