Método para el diagnóstico precoz de la infertilidad equina.
Campo de la invención
La presente invención se encuadra en el campo general en el área de la medicina veterinaria equina y en particular, se refiere a un método para el diagnóstico precoz de la infertilidad equina.
Estado de la técnica
El impacto económico del Sector Ecuestre en España es muy importante, generando un volumen de 5.303, 6 millones de ? que representa el 0, 51% del PIB del país. Está representado por 723.496 animales que se distribuyen en 175.429 explotaciones, lo que generan más de 61.000 empleados. Más del 25% de estos caballos son de Pura Raza Española (PRE) , siendo esta raza la más importante de toda la Península Ibérica, e incluso una de las más importantes a nivel mundial. El censo actual de la raza incluye 182.509 animales (55.853 yeguas reproductoras y 33.391 sementales) distribuidos en 22.843 ganaderías en España a los que hay que sumar los 41.025 individuos (13.118 hembras y 8.917 machos reproductores) que se encuentran en las 8.054 explotaciones distribuidas a lo largo de 60 países (Gómez, Valera et al. 2009. "Assessment of inbreeding depression for body measurements in Spanish Purebred (Andalusian) horses." Livest Sci 122 (2-3) : 149155). Su relevancia supera ampliamente el interés productivo, ya que además estos animales son reconocidos en todo el mundo como un símbolo de la cultura y las tradiciones Españolas.
La gestión del libro genealógico y el plan de mejora de esta raza están a cargo de la Asociación Nacional de Criadores de Caballos de Pura Raza Española (ANCCE) , tanto en la Península Ibérica como en el resto del mundo.
Dentro del sector, la compra y venta de ejemplares así como de cubriciones para reproducción y cría generan un considerable volumen económico. De ahí la importancia de utilizar animales que no presenten ningún tipo de impedimento o tara reproductiva ya sea innata, de tipo genético, o adquirida, derivada de problemas médicos.
Las infertilidades de tipo congénito están provocadas por diversas causas. Este tipo de alteraciones suelen pasar desapercibidas en los animales debido a que la mayoría de los animales no desarrolla una sintomatología externa apreciable hasta que alcanzan la madurez sexual, momento en el que comienzan a manifestar problemas reproductivos. En
los machos se aprecian comportamientos anómalos y falta de libido mientras que en las hembras surgen dificultades a la hora de quedar gestantes llegando incluso a producirse la no presencia de ciclos sexuales regulares durante su temporada reproductiva.
Dentro de las enfermedades de origen genético son las alteraciones cromosómicas, caracterizadas por la variación en el número o en la estructura física en alguno de los 64 cromosomas presentes en la especie equina, las que representan el mayor porcentaje de la casuística. Este tipo de patologías están muy poco estudiadas en esta especie debido principalmente a la extrema dificultad que presenta su cariotipo como consecuencia de la similitud existente entre muchos de sus cromosomas (Bugno, Stota et al. 2009. "Identification of chromosome abnormalities in the horse using a panel of chromosome- specific painting probes generated by microdissection." Acta Vet Hung 57 (3) : 369-381). Se ha determinado que la mayoría de los casos de caballos que presentan alteraciones cromosómicas demuestran una infertilidad asociada, generalmente debido a desórdenes ligados al desarrollo sexual (DSD). Dentro las alteraciones cromosómicas en caballos, el síndrome de Turner y el síndrome de sexo reverso son las patologías más comunes con más del 70% de la casuística registrada hasta la fecha (Lear, T. L. and R. B. McGee (2012). "Disorders of sexual development in the domestic horse, Equus caballus." Sexual Development 6 (1-3) : 61-71).
En el síndrome de Turner, descrito por primera vez en los seres humanos en los años 50, se observa la ausencia de un cromosoma sexual, siendo normales los 62 cromosómas autosómicos, resultando en complemento cromosómico impar (monosomía en el par sexual; 2n=63, X0). Los animales portadores de esta patología presentan una apariencia externa normal, una leve disgenesia gonadal y por consiguiente, una esterilidad en la mayoría de los casos.
Por otro lado, existen animales que muestran un fenotipo y comportamiento sexual contrapuesto al que deberían tener de acuerdo a su dotación cromosómica, conocido como síndrome de sexo reverso. Inicialmente, esta patología se presentaba en sólo dos casuísticas bien diferenciadas: animales fenotípicamente machos con una dotación cromosómica de hembra (2n=64, XX) , o bien animales cuyo fenotipo coincidía con el de una hembra pero que contaban con una dotación cromosómica de macho (2n=64, XY). Sin embargo, existe una región dentro del genoma de los mamíferos superiores que codifica un gen relacionado con el inicio de la diferenciación sexual fetal (SRY, sex determining región) , altamente involucrada en los casos de sexo reverso (Sinclair, Berta et al. (1990). "A gene from the human sex-determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-binding motif." Nature 346 (6281) : 240-244). A partir de ello fue posible ampliar la
clasificación de este tipo de patologías detectándose cuatro posibles presentaciones: machos 64, XX, SRY positivo; machos 64, XX, SRY negativo y yeguas 64, XY SRY positivo o negativo. Las hembras 64, XY, SRY negativo es el caso más común entre los equinos (Lear, T. L. and R. B. McGee (2012). "Disorders of sexual development in the domestic horse, Equus caballus." Sexual Development 6 (1-3) : 61-71). Los animales que presentan sexo reverso suelen mostrar una apariencia externa normal y en ocasiones una leve disgenesia gonadal.
Otra de las patologías derivadas de las anomalías cromosómicas más comúnmente observadas en los animales de producción es el quimerismo celular. Esta patología se produce debido al intercambio de tejidos sanguíneos y de hormonas a través de la circulación placentaria entre hermanos mellizos dicigoticos durante las gestaciones gemelares (Mishra, Arora et al. 2009. "Studies on effect of Booroola (FecB) genotype on lifetime ewes productivity efficiency, litter size and number of weaned lambs in Garole x Malpura sheep." Anim Reprod Sci 113 (1-4) : 293-298). Se trata de una alteración muy extraña en los caballos debido a que la gestación gemelar en caballos termina en un altísimo porcentaje en abortos. Sin embargo, en el caso que suceda, su presentación en los caballos suele ser también asintomática hasta edades avanzadas (Padula, A. M. (2005). "The freemartin syndrome: An update." Animal Reproduction Science 87 (1-2) : 93-109.)
Este tipo de alteraciones, han sido diagnosticadas históricamente mediante técnicas citogenéticas de cariotipado. Las mismas requieren un cultivo de células sanguíneas, que se detienen en el estadio de metafase (fase de división celular en la que la célula ha organizado su ADN en cromosomas) y su posterior tratamiento con técnicas de bandeo para identificar de manera específica cada uno de los cromosomas presentes o ausentes (). Estas técnicas de cariotipado presentan en el caballo una elevada dificultad debido a la existencia de una gran cantidad de cromosomas de similar forma y tamaño pequeño que dificultan su correcta identificación y pueden ser fácilmente confundidos entre los que se encuentra el cromosoma Y (ECAY) (Bowling, Breen et al. 1997. "Report of the Third International Committee for the standardization of the domestic horse Kar y otype, Davis, CA, USA, 1996. International system for cytogenetic nomenclature of the domestic horse." Chromosome Research 5 (7) : 433-443).
Posteriormente se han desarrollado técnicas de citogenética molecular basadas en la hibridación fluorescente in situ (FISH). En ellas se utilizan sondas de ADN para determinar de manera específica la presencia o ausencia de un cromosoma, o inclusive una parte de los mismos. Sin embargo este tipo de técnicas no están desarrolladas de manera comercial en los equinos, y presentan una serie de desventajas como son la falta de sondas
específicas para cada uno de los 33 cromosomas de la especie, el elevado coste de cada determinación, la elevada inversión de tiempo necesario para analizar cada muestra, etc. Debido a todos estos factores, estas técnicas se desarrollan en muy pocos laboratorios a nivel mundial (Villagómez, Lear et al. 2011. "Equine disorders of sexual development in 17 mares including XX, SRY-negative, XY, SRY-negative and XY, SRY-positive genotypes." Sex Dev 5 (1) : 16-25).
Estos inconvenientes técnicos, unidos al hecho de que la mayoría de los caballos que presentan alteraciones cromosómicas no demuestran cambios fenotípicos o en su comportamiento hace que el número de individuos que permanecen sin diagnosticar es probablemente muy elevado y por lo tanto, la prevalencia real de animales portadores de aberraciones cromosómicas permanecen gran medida subestimada (Lear and Bailey 2008. Lear, T. L. and E. Bailey (2008). "Equine clinical cytogenetics: The past and future." Cytogenet Genome Res 120 (1-2) : 42-49).
Nuestro desarrollo se basa en la utilización de marcadores moleculares específicos de tipo Microsatélite o STR (del inglés, "Short Tandem Repeats") para la determinación de las anomalías antes descritas. Estos marcadores son ampliamente utilizados en diversas áreas científicas y han demostrado un alto porcentaje de fiabilidad en aplicaciones de tipo forense, legal y productivo, siendo los más utilizados en las investigaciones de caracterización genética y molecular.
En la actualidad, este tipo de marcadores son los de elección para la realización de test de paternidad o de identificación de muestras de ADN. Sin embargo, los marcadores utilizados rutinariamente (Dimsoski 2003. "Development of a 17-plex microsatellite polymerase chain reaction kit for genotyping horses." Croatian Medical Journal 44 (3) : 332-335) no cumplen con las condiciones necesarias para poder determinar anomalías cromosómicas debido a su falta de cobertura en los cromosomas ECAX (cromosoma X de caballo) e ECAY (cromosoma Y del caballo).
Existe pues la necesidad de proporcionar un procedimiento para la detección de problemas reproductivos en caballos, de manera precoz, rápida, fiable y con alta sensibilidad y especificidad.
Breve descripción de la invención
La presente invención soluciona los problemas anteriormente descritos ya que proporciona un sistema de diagnóstico molecular que permite la detección de alteraciones cromosómicas relacionadas con problemas reproductivos en equinos. El método de la presente invención
tiene la ventaja de ser un método rápido y fiable puesto que presenta un 100% de sensibilidad (probabilidad de dar como positivo a un individuo afectado) y un 99, 75% de especificidad (probabilidad de dar como negativo a un individuo no afectado) por lo que todo animal con alteración será dado como positivo y solo un 0, 25% de animales sanos pueden ser diagnosticados como falsos positivos.
Así pues, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de infertilidad equina de origen genético (de aquí en adelante, método de la presente invención) que comprende las siguientes etapas:
a) detectar, en una muestra obtenida de un animal, los marcadores ECAX: LEX026, TKY38, TKY270, LEX003, UCDEQ502, y los marcadores ECAY: Eca.YH12 y SRY, b) obtener el genotipo de dicha muestra aislada en base a la homozigosis, heterozigosis de los marcadores ECAX, y la presencia o ausencia de los marcadores ECAY detectados en la etapa a) , donde:
- la detección de amplificación de al menos un alelo en al menos un marcador ECAX es indicativo de la presencia de al menos un cromosoma X y la heterozigosis de al menos un marcador ECAX es indicativo de la presencia de al menos dos cromosomas X, y donde
- la presencia de amplificación en el marcador EcaYH12 es indicativo de la presencia de al menos un cromosoma Y, y donde la presencia de amplificación en el marcador SRY es indicativo de la presencia del gen responsable del inicio de la cadena de diferenciación sexual masculina.En una realización en particular, la muestra aislada del animal incluye cualquier tipo de muestra aislada del animal que contenga ADN, preferentemente la muestra aislada incluye pero no se limita a sangre, saliva, o un folículo piloso.
En una realización en particular de la presente invención, la detección de los marcadores de la etapa a) se realiza mediante amplificación. Más preferentemente la amplificación es una amplificación simultánea. Preferentemente la amplificación se realiza mediante PCR multiplex.
Infertilidad de origen genético incluye pero no se limita a infertilidad originada por el síndrome de Turner, quimerismo y síndrome del sexo reverso.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al uso de los marcadores LEX026, TKY38, TKY270, LEX003, UCDEQ502, Eca.YH12 y SRY (marcadores de la presente invención) para el diagnóstico de infertilidad equina de origen genético.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico de infertilidad equina de origen genético (de aquí en adelante kit de la presente invención) según el método de la presente invención que comprende las sondas y cebadores necesarios para detectar los marcadores LEX026, TKY38, TKY270, LEX003, UCDEQ502, Eca.YH12 y SRY. En una realización en particular, el kit comprende las sondas y cebadores identificados como SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 14.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del kit de la presente invención para el diagnóstico de la infertilidad equina de origen genético.
Descripción detallada de la invención
El método de la presente invención permite la detección de infertilidad equina de origen genético mediante el análisis probabilístico de los resultados obtenidos de un panel de microsatélites específicamente desarrollados, testeados y ajustados para su utilización en el caballo PRE. El mismo ofrece una serie de combinaciones basadas en la presencia o ausencia de amplificación en cada uno de los marcadores así como las distintas combinaciones alélicas posibles. Por un lado, la amplificación de microsatélites del cromosoma X indica la presencia de al menos un cromosoma X mientras que la amplificación de algún marcador del cromosoma Y indica la presencia de un cromosoma Y. Por otro lado, la presencia de al menos un marcador del cromosoma X en heterocigosis, nos indica que existen al menos dos cromosomas X diferentes. En primera instancia, mediante el uso de los marcadores microsatélites, este método permite identificar, en función de las combinaciones posibles y del fenotipo del animal entre machos normales (XY) , hembras normales (XX) , síndrome de Turner (X0) , síndrome de quimerísmo celular (XX/XY) y síndrome sexo reverso (Machos, XX y Hembras XY). A su vez, la presencia o ausencia del fragmento SRY permite la clasificación de los animales con síndrome de sexo reverso en: Machos XX, SRY positivo; Machos XX, SRY negativo; Hembras XY, SRY negativo; Hembras XY, SRY positivo.
En la tabla 1 se presentan los marcadores utilizados en la reacción, el tamaño de segmento genómico esperado, los cebadores utilizados, el tipo de marcaje fluorescente empleado en cada uno de ellos y su localización física en los distintos cromosomas sexuales del equino.
Marcador
Tamaño
Cebadores
Localización en el cromosoma
LEX026
300-314
SEQ ID NO: 1 (marcado con fluorocromo FAM) SEQ ID NO: 2
Xp
TKY38
105-131
SEQ ID NO: 3 (marcado con fluorocromo FAM) SEQ ID NO: 4
Xq23
TKY270
154-172
SEQ ID NO: 5 (marcado con fluorocromo HEX) SEQ ID NO: 6
X
LEX003
194-214
SEQ ID NO: 7 (marcado con fluorocromo FAM) SEQ ID NO: 8
Xq
UCDEQ502
164-176
SEQ ID NO: 9 (marcado con fluorocromo FAM) SEQ ID NO: 10
Xp
Eca.YH12
SEQ ID NO: 11 (marcado con fluorocromo FAM) SEQ ID NO: 12
Y
SRY
SEQ ID NO: 13 (marcado con fluorocromo HEX) SEQ ID NO: 14
Yq13
Tabla 1: marcadores utilizados en la presente invención
Todas las parejas de cebadores de los distintos marcadores se incluyeron en una sola 5 reacción de PCR multiplexada. La reacción se realizó en un volumen total de 25 pl de mezcla de reacción conteniendo de 20-60 ng de ADN genómico, 1.5-7.5 pmol de cada pareja de cebadores, 0.33 mmol/L de dNTPs, 2.5 mmol/L de MgCl2, tampón de reacción a una concentración de 1X, y 1.5 unidades de Taq Polimerasa. Al tubo de reacción se le aplicó un protocolo térmico que consistió en un paso de desnaturalización inicial de 95 °C durante 10 10 minutos, 33 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 57 °C durante 1 minuto, y 72 °C
durante 30 segundos. Finalmente se realizó una elongación de 72 °C durante 10 minutos. La resolución de los productos amplificados se realizó mediante la secuenciación mediante
electroforesis capilar. El análisis de los fragmentos resultantes para determinar el tamaño de los alelos se realizó mediante un software específico utilizando un estándar de tamaño LIZ 500 bp.
En base a la amplificación o no de los marcadores se determinó la presencia o ausencia del 5 ECAX y del ECAY. A su vez, la amplificación de marcadores del ECAX en heterocigosis u homocigosis determinó la presencia de uno o dos cromosomas X en un mismo individuo. También se puede conocer la presencia o no del gen SRY de diferenciación sexual masculina. En la tabla 2 se detallan todas las combinaciones posibles y el diagnóstico según nuestro test.
FENOTIPO
GENOTIPO
Microsatélites ECAX
Fragmentos ECAY
DIAGNOSTICO
YH12
SRY
Macho
Todos en homocigosis
+
+
Macho normal (XY)
Hembra
Al menos uno en heterocigosis
-
-
Hembra normal (XX) *
Hembra
Todos en homocigosis
-
-
Síndrome de Tumer (X0)
Macho
Al menos uno en heterocigosis
+
+
Quimerismo Macho**
Hembra
Al menos uno en heterocigosis
+
+
Quimerismo Hembra**
Macho
Al menos uno en heterocigosis
-
+
Macho SRY positivo DSD
Macho
Al menos uno en heterocigosis
-
-
Macho SRY negativo DSD
Hembra
Todos en homocigosis
+
+
Hembra SRY positivo DSD
Hembra
Todos en homocigosis
+
-
Hembra SRY negativo DSD
Tabla 2: resultados obtenidos en el test realizado * Este resultado tiene un 99, 75% de especificidad.
** En caso de haber diferencias entre los resultados obtenidos en muestras de sangre y de pelo el quimerismo será de tipo hematopoyético, es decir sanguíneo solamente.
Este sistema diagnóstico se validó sobre muestras de Caballo Pura Raza Español (PRE) 15 para determinar el nivel de Sensibilidad y Especificidad. Para ello se calcularon las frecuencias alélicas y el nivel de heterocigosidad de cada uno de los marcadores del ECAX. Esto permitió detectar la probabilidad de que en una hembra normal, los resultados demostraran la presencia de al menos un marcador del cromosoma X en heterocigosis indicándonos la presencia de dos cromosomas X. De esta manera, el nivel de Especificidad 20 de esta técnica se determinó en un 99, 75% por lo que solamente el 0, 25 de hembras sanas serían diagnosticadas como falsos positivos. Por otro lado, la técnica posee un 100% de
sensibilidad puesto que cualquier alteración relacionada con los marcadores sexuales será determinada en todos los individuos afectados.
Ejemplo 1: método de diagnóstico de infertilidad
Se recibieron muestras de dos yeguas PRE remitidas por el veterinario experto debido a la falta de suceso reproductivo en más de dos temporadas.
El primer caso se trataba de una yegua PRE de 4 años con sintomatología de infertilidad sin causa aparente. El segundo caso se trataba de un ejemplar de 3 años que no había mostrado celo en su primera campaña reproductiva.
En el día de la recepción se llevo a cabo la extracción de ADN de muestras de sangre de ambos animales y la reacción de PCR, enviándose una vez finalizada al servicio de secuenciación de la Universidad de Córdoba. El día siguiente se recibieron los resultados secuenciados y se procedió a su análisis.
Los resultados de los marcadores fueron los siguientes:
FENOTIPO
GENOTIPO
Microsatélites cromosoma X
Fragmentos
Cromosoma Y
DIAGNOSTI
LEX003
LEX026
TKY270
TKY38
UCDEQ502
YH12
SRY
Yegua
+
-
Hembra SRY
negativo
SDS
Yegua
+
-
Hembra SRY
negativo
SDS
De acuerdo al análisis de los datos y a la presencia de un cromosoma ECAX y un cromosoma ECAY y la ausencia del gen SRY en cada uno de los animales se determino que se trataba de casos 64, XY sexo reverso de tipo SRY negativo con un 100% de certeza. Es de hacer notar que el resultado se obtuvo en 24hs, lo cual es imposible mediante la utilización de otras metodologías diagnosticas.
