Procedimiento para la detección, cuantificación y/o identificación de Aeromonas salmonicida spp. Salmonicida SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a procedimiento y kit para su utilización en la detección específica de Aeromonas 5 salmonicida spp. salmonicida en cultivos bacterianos, puros y mixtos, y en muestras de tejidos de peces, mediante un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real con un fluorocromo. El procedimiento es de aplicación en el sector de la acuicultura para el control de infecciones en peces salmónidos y no salmónidos, así como para la detección del patógeno en poblaciones naturales.
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ESTADO DE LA TÉCNICA
La furunculosis clásica es una enfermedad bacteriana causada por una bacteria Gram-negativa denominada Aeromonas salmonicida spp. salmonicida o también conocida como A. salmonicida típica. La enfermedad presenta una amplia distribución geográfica y afecta a peces salmónidos y no salmónidos de agua dulce y marina, tanto en poblaciones 15 naturales como en granjas de producción (Austin y Austin, 2007). La furunculosis es una enfermedad sistémica con manifestaciones aguda, crónica y subclínica, que causa grandes pérdidas económicas en el sector de la acuicultura a nivel mundial (Austin y Austin, 2007). Sin embargo, se han descrito otras subespecies de A. salmonicida, como Aeromonas salmonicida spp. achromogenes, Aeromonas salmonicida spp. masoucida y Aeromonas salmonicida spp. smithia que también son capaces de afectar a una gran variedad de especies de peces, produciendo furunculosis 20 atípica. Los signos clínicos de las furunculosis causadas por las subespecies típicas y atípicas de A. salmonicida en los peces afectados son muy similares, dificultando el diagnóstico presuntivo basado en la clínica.
Debido a esto, el diagnóstico de la enfermedad se basa habitualmente en el aislamiento del agente patógeno, a partir de tejidos de los peces enfermos, y su identificación mediante métodos microbiológicos convencionales que implican el 25 aislamiento del agente patógeno y su identificación mediante pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas, empleando métodos clásicos o sistemas multiprueba de caracterización (Santos et al., 1993. Aquaculture. 116: 111-120). Los estudios fenotípicos, serológicos y moleculares han demostrado que Aeromonas salmonicida spp. salmonicida constituye un grupo homogéneo, a diferencia de las restantes subespecies conocidas como Aeromonas salmonicida atípicas (A. salmonicida spp. achromogenes, A. salmonicida spp. masoucida). Sin embargo, estos métodos presentan 30 limitaciones importantes como son: i) lento crecimiento de la bacteria y ii) dificultad para distinguir entre las subespecies de Aeromonas salmonicida en base a caracteres fenotípicos.
La identificación de A. salmonicida y su detección en tejidos de peces enfermos también puede realizarse utilizando métodos que no requieran el aislamiento del microorganismo en cultivo puro como son la técnica de ELISA (Hiney et al., 35 1994. Dis. Aquat. Organ. 19: 161-167) , PCR convencional (Hiney et al., 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58: 1039-1042; Gustafson et al., 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58: 3816-3825; Miyata et al., 1996. Aquaculture, 141: 13-24) , amplificación isotérmica de ácidos nucleicos (LAMP) (Kulkarni et al., 2009. J Rapid Methods Autom Microbiol. 17: 476-489) , PCR múltiple (mPCR) (Altinok et al., 2008. Vet. Microbiol. 131:332-338; Onuk et al., 2010. J Vet Sci. 11 (3) : 235-241; Kulkarni et al., 2010. Aquac. Res. 41, 1533-1538) , mPCR combinada con microarrays (González et al., 2004. J Clin 40 Microbiol., 42:1414-1419). Sin embargo, ninguno de los métodos descritos hasta el momento permiten la diferenciación de Aeromonas salmonicida a nivel de subespecies.
La PCR en tiempo real es una técnica sensible que permite la cuantificación de los productos generados en la reacción de PCR, mediante la detección por fluorescencia del producto generado (Higuchi et al., 1993. Biotechnology 11, 1026-45 1030). Esta técnica ha sido ampliamente utilizada para la detección, cuantificación e identificación de bacterias patógenas Gram-negativas que infectan a peces incluyendo A. salmonicida (Balcázar et al., 2007. J. Med. Microbiol., 56: 323-328; Keeling, 2013. J. Fish Dis. 36: 495-503). Pero ninguno de estos procedimientos permite diferenciar entre las subespecies de A. salmonicida.
En 1996, Miyata et al. describieron una pareja de cebadores utilizando como diana un fragmento de 512 pares de bases 50 (pb) , obtenido tras la amplificación aleatoria del genoma (RAPD) de la cepa de referencia ATCC14174 de A. salmonicida spp. salmonicida, utilizando como cebadores de la reacción secuencias arbitrarias de ADN sintético. El método de PCR convencional descrito por estos investigadores permite la diferenciación de A. salmonicida ssp. salmonicida de las subespecies atípicas masoucida y achromogenes. Sin embargo, este método es lento, tedioso y costoso al requerir la extracción del ADN a partir de los cultivos bacterianos y el análisis de los productos de amplificación mediante 55 electroforesis. Además, la secuencia diana descrita por Miyata et al. (1996) no tiene una función conocida, no está depositada en GenBank y se desconoce si se trata de una secuencia de copia única o múltiple, lo cual dificulta el diseño de otros procedimientos de diagnóstico basados en PCR no convencional.
En 2014, otros autores proponen un método de diagnóstico para A. salmonicida spp. salmonicida basado en la detección de producto final (CN104357570) , mediante amplificación isotérmica de ácidos nucleicos (LAMP) , utilizando 60 tres parejas de cebadores. Sin embargo, este método cuenta con una especificidad baja ya que, no es capaz de detectar niveles bajos de ADN o ADN de baja calidad (Fukuta et al., 2003. Arch. Virol. 148:1713-1720; Kubota et al., 2008. Phytopathology 98:1045-1051). Sumado a esto, la técnica LAMP precisa la confirmación de los resultados mediante métodos espectrofotométricos o de electroforesis, lo que incrementa el coste y tiempo necesario para el diagnóstico.
Todo lo expuesto pone de manifiesto la necesidad de desarrollar un procedimiento específico, sensible, rápido y barato para la identificación de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en muestras de peces así como, para su 5 diferenciación de las especies que producen la furunculosis atípica. Un procedimiento que comprende la realización de una PCR en tiempo real con un fluorocromo junto a la curva de fusión para la identificación del patógeno de peces A. salmonicida spp. salmonicida, sería un procedimiento adecuado para alcanzar este fin.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN 10
La presente invención se refiere a un procedimiento y kit para la detección, cuantificación y/o identificación de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida y, más concretamente, para la detección, cuantificación y/o identificación de ADN específico de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida o bien, a partir de cultivos bacterianos, puros o mixtos, o bien a partir de muestras de tejidos de peces. La invención se basa en la amplificación y cuantificación de ADN 15 mediante PCR en tiempo real. El procedimiento propuesto comprende la amplificación de un fragmento de 119 pb perteneciente a un gen que codifica una proteína efectora con actividad serina/treonina quinasa del sistema de secreción Tipo III específica de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida. En dicha amplificación se incluye el fluorocromo SYBR Green que permite la detección de los productos de la amplificación. La lectura continua de la fluorescencia durante el proceso permite identificar al patógeno en base al pico de fluorescencia específico. Este 20 procedimiento no amplifica el ADN de otras subespecies de Aeromonas salmonicida, ni el ADN de peces hospedadores, siendo los cebadores diseñados altamente específicos e informativos.
La técnica propuesta es más sensible y específica que los métodos moleculares descritos hasta la fecha y presenta las siguientes ventajas: 25
- La identificación de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida a partir de cultivos bacterianos, puros o mixtos, y de tejidos así como, su diferenciación de las subespecies Aeromonas salmonicida spp. achromogenes y Aeromonas salmonicida spp. masoucida, principales agentes causales de furunculosis atípica.
- Se reduce el coste y tiempo necesario para el diagnóstico de la furunculosis.
- La detección de los productos de PCR es rápida, fácil y objetiva, permitiendo un fácil y rápido diagnóstico de la 30 infección.
- No requiere utilizar electroforesis en geles de agarosa, luz ultravioleta, ni el uso de agentes tóxicos para la detección de los productos obtenidos.
- Gracias al uso de la PCR en tiempo real, donde no se requiere la manipulación de los productos de PCR al final de la amplificación, se disminuye el riesgo de contaminación. 35
- Permite la monitorización de la respuesta a los diversos tratamientos así como, la detección temprana de recidivas
- Es susceptible de ser automatizado.
Constituye un primer objeto de la presente invención un procedimiento para la detección, cuantificación y/o identificación 40 de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en muestras de cultivos bacterianos, puros y mixtos, y en tejidos de peces que comprende las siguientes etapas:
a) Aislar muestras de:
i. Cultivo bacteriano, puro o mixto o, 45
ii. ADN de un cultivo bacteriano, puro o mixto, o de tejidos de peces
b) Realizar un ensayo de PCR en tiempo real sobre las muestras de la etapa a) utilizando una pareja de cebadores específicos para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 y un fluorocromo.
c) Detectar, cuantificar y/o identificar las secuencias nucleotídicas amplificadas como resultado de la PCR en 50 tiempo real.
Una realización de esta invención es el procedimiento de la invención, donde se utilizan cebadores que tienen una identidad del 75% respecto a los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. Una realización preferente es un procedimiento de la invención donde dicha identidad es del 85%. Una realización más 55
preferente es un procedimiento de la invención donde dicha identidad es del 95% y una realización aún más preferente es un procedimiento de la invención donde dicha identidad es del 99%.
En la presente solicitud, el porcentaje de identidad en una secuencia determinada se calcula teniendo en cuenta que un 99% de identidad significa que un 99% de residuos de la secuencia completa de los cebadores identificados por las 5 secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 son idénticos a los residuos de la secuencia determinada.
Otra realización de la invención es un kit para detectar, cuantificar y/o identificar Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en un ensayo de PCR en tiempo real, que comprende:
a) La pareja de cebadores específicos para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida identificados por las 10 secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2,
b) Un fluorocromo,
c) Desoxinucleótidos trifosfato,
d) Tampón de reacción,
e) Un control positivo, 15
f) Manual de instrucciones que detalla el procedimiento a seguir.
El control positivo está presente en el kit para permitir determinar el correcto funcionamiento de los componentes del kit.
Una realización preferente es el kit de la invención donde el fluorocromo es SYBR Green.
Una realización preferente es el kit de la invención donde el control positivo es ADN de A. salmonicida spp. salmonicida 20 de la cepa de referencia ATCC33658.
Otra realización preferente es un kit de la invención donde dichos desoxinucleótidos trifosfato son dATP, dCTP, dGTP y dTTP a una concentración final 200 µM.
Otra realización preferente es un kit de la invención donde dicho tampón de reacción es 50 mM de cloruro de potasio, 10 25 mM TrisHCl pH 9, 0 a temperatura ambiente, 2, 5 mM de MgCl2, 20mM (NH4) 2SO4, 2, 5 unidades de polimerasa por 25 L de reacción.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Curva de disociación de los productos de amplificación obtenidos utilizando suspensiones bacterianas de A. salmonicida spp. salmonicida que muestra un valor de temperatura de fusión de 80, 5-81, 0ºC, específica para el 30 fragmento de 119 pb amplificado.
Figura 2. Curvas de disociación obtenidas utilizando ADN extraído a partir de tejidos infectados con suspensiones de A. salmonicida spp. salmonicida de diferentes concentraciones (2 x 109 hasta 2 x 102 células/mL) que muestra el producto de amplificación característico de la subespecie salmonicida (Tm=80, 5-81, 0ºC). En el eje de abscisas se indica la 35 temperatura de fusión y en el eje de ordenadas la derivada de las unidades de fluorescencia relativa.
Figura 3. Curvas de disociación obtenidas utilizando suspensiones bacterianas de A. salmonicida típica y atípicas que muestra la ausencia del producto de amplificación característico de la subespecie salmonicida (Tm=80, 5-81, 0ºC) en las subespecies atípicas (A. salmonicida spp. achromogenes, y A. salmonicida spp. masoucida). En el eje de abscisas se 40 indica la temperatura de fusión y en el eje de ordenadas la derivada de las unidades de fluorescencia relativa.
Figura 4. Recta de calibrado obtenida con el protocolo de PCR cuantitativa descrito utilizando como fuente de ADN suspensiones de A. salmonicida spp. salmonicida con diferentes concentraciones (2 x 109 hasta 2 x 102 células/mL). Coeficiente de correlación (R2) =0, 992. 45
Figura 5. Recta de calibrado obtenida con el protocolo de PCR cuantitativa descrito utilizando ADN obtenido a partir de tejidos infectados con diferentes concentraciones de A. salmonicida spp. salmonicida. Coeficiente de correlación (R2) =0, 981
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MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra adecuadamente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
Ejemplo 1. Diseño de cebadores específicos
Los cebadores específicos se diseñaron en base a la secuencia de 3735 pb del gen aopO de A. salmonicida spp. salmonicida A449, localizado en el plásmido pAsa5 (GenBank Accession no.DQ386862.1) el cual codifica para una proteína serina/treonina kinasa de tipo III del sistema de secreción ligada a la virulencia (Dacanay et al., 2006). Para el 5 diseño de los cebadores y para testar su especificidad, se utilizaron las herramientas Pick Primer y Primer-BLAST, del Servicio de Información del Centro Nacional de Biotecnología. Para la evaluación de las propiedades de los cebadores y para optimizar las condiciones de la PCR en tiempo real se utilizó IDT SciTools Web Tools (Integrated DNA Technologies, Inc.). Se desarrollaron el cebador directo, Asal-aopO-FW y el cebador inverso Asal-aopO-RV (Tabla 1).
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La especificidad de los cebadores se evaluó usando la herramienta BLAST para alineamiento frente a otras secuencias recogidas en la base de datos GenBank. Estos cebadores franquean un fragmento interno de 119 pb del gen aopO.
Tabla 1. Secuencias de los cebadores específicos diseñados para A. salmonicida spp. salmonicida.
Cebador (oligonucleótido)
Secuencia 53
Asal-aopO-FW
Caracterizado por SEQ ID NO:1
AGCTCATCCAATGTTCGGTATT
Asal-aopO-RV
Caracterizado por SEQ ID NO:2
AAGTTCATCGTGCTGTTCCA
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Ejemplo 2. Ensayos de patogenicidad La infección bacteriana se realizó a través de una inyección intraperitoneal a juveniles de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) (10, 0 ±0, 1 gramos) con una suspensión bacteriana de A salmonicida SK181/12, SK164/12, MT416 y TO96 7.1, siguiendo la metodología previamente descrita (Santos et al., 1991.J Appl Ichthyol 7, 160-167). En resumen, los peces fueron anestesiados por inmersión en tricaina metano sulfonato (MS-222, Sigma) (60mgL-1, Neiffer & Stamper, 2009) y 20 se les inyectó intraperitonealmente 0, 1 mL de suspensión bacteriana que contenía entre 106 y 109 células/mL (10 peces por dosis). Durante el experimento, los peces fueron mantenidos en un tanque de 100 litros con agua dulce aireada. Los peces moribundos fueron sacrificados mediante una sobredosis de anestésicos y se extrajeron en condiciones asépticas muestras de sangre, bazo y riñón para su análisis mediante métodos basados en cultivo y caracterización bacteriana y análisis de PCR en tiempo real con SYBR Green. 25
Ejemplo 3. Aislamiento de ADN a partir de cultivos bacterianos y/o tejidos de peces A partir de cultivos puros y mixtos de los microorganismos problema, se prepararon suspensiones bacterianas en agua estéril libre de nucleasas ajustadas a una concentración final aproximada de entre 3 x 109 y 3 x 1012 células/mL (tubo 7 de la escala MacFarland). El número de unidades formadoras de colonias (UFC) se determinó mediante el método de 30 recuento en placa, usando medio agar Soja Tríptica suplementado con 1% de NaCl (TSA-1) y se contaron las colonias de bacterias producidas.
El ADN de cultivos bacterianos, puros y mixtos, se obtuvo usando InstaGene Matrix (BioRad).
A partir de peces sanos (sacrificados por sobredosis de anestésico) , se obtuvieron tejidos (riñón, bazo y sangre) , se 35 homogenizaron con solución salina a una concentración final del 25% peso/volumen, se inocularon con un volumen igual de suspensiones bacterianas de la cepa de referencia de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida ATCC33658 conteniendo entre 1, 5 x 109 y 1, 5x 102 células/mL y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. El número de unidades formadoras de colonias (UFC) se determinó mediante el método de recuento en placa. Se prepararon también homogenizados de tejidos no inoculados para utilizarlos como control negativo. Los homogenizados se 40 utilizaron en la reacción de PCR con o sin extracción previa de ADN.
A partir de tejidos obtenidos a partir de peces infectados experimentalmente con A. salmonicida spp salmonicida (cepas SK181/12, SK164/12, MT416 y TO96 7.1) , se prepararon homogenizados en solución salina como se describió en el párrafo anterior. Los homogenizados obtenidos se utilizaron en la reacción de amplificación directamente o previa extracción del ADN. 45
Además, para la validación y comparación del procedimiento, tejidos de 40 truchas arcoíris cultivadas (10g ±1g) y 40 rodaballos (45g ± 5g) con y sin síntomas clínicos de furunculosis y 20 rodaballos con síntomas de tenacibaculosis fueron procesados como se describió anteriormente antes de ser utilizados en los ensayos de PCR en tiempo real y métodos microbiológicos. 50
El ADN se obtuvo a partir de los homogenizados de tejidos utilizando Dynabeads® DNA Direct Universal (Dynal).
El ADN obtenido a partir de cultivos bacterianos y de homogenizados de tejidos se almacenaron a -20ºC hasta su uso.
Ejemplo 4. Amplificación de fragmentos de ADN a partir de cultivos puros y mixtos. 5
En la amplificación se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 12, 5 µL de Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x) , no ROX, (Thermo Scientifics) , 1 µL de cada cebador (SEC ID NO 1 y SEC ID NO 2) (400 nmoles) , 5 µL de la suspensión bacteriana problema o 2 µL de ADN bacteriano purificado. Se completó el volumen de la reacción con agua destilada estéril hasta los 25µL.
La mezcla de reacción se sometió a amplificación en un termociclador MiniOpticon para PCR en tiempo real, con el 10 software de detección CFX ManagerTM (BioRad) , en las siguientes condiciones: un paso inicial de incubación a 95ºC durante 15 min, seguido de 35 ciclos consistentes en una desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, y una hibridación a 62ºC durante 30 segundos. El análisis de las curvas de fusión de los productos amplificados se llevó a cabo mediante el aumento gradual de la temperatura desde 60ºC a 100ºC en intervalos de 0, 5ºC durante 10 segundos y lectura continua de la fluorescencia para determinar la Tm del producto de amplificación específico para A. salmonicida 15 spp. salmonicida. En todas las muestras positivas para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida se detectó un pico de amplificación con una temperatura de fusión de 80, 5-81, 0ºC (Figura 1). Estos resultados indican que la técnica de PCR y los cebadores descritos en la presente invención, permiten un diagnóstico sensible, rápido y económico de la furunculosis típica.
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Ejemplo 5. Amplificación de fragmentos de ADN a partir de tejidos de peces.
En la amplificación se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 12, 5 µL de Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x) (Thermo Scientifics) , 1 µL de cada cebador (SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2) (concentración final de 400 nm) y 2-5 µL de ADN extraído. Se completó el volumen de la reacción con agua destilada estéril hasta los 25µL.
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La mezcla de reacción se sometió a amplificación en un termociclador MiniOpticon para PCR en tiempo real, con el software de detección CFX ManagerTM (BioRad) , en las siguientes condiciones: un primer paso de incubación a 95ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos consistentes en una desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto, hibridación a 62ºC durante 30 segundos. El análisis de las curvas de fusión de los productos amplificados se llevó a cabo mediante el aumento gradual de la temperatura desde 65ºC a 95ºC en intervalos de 0, 5ºC durante 10 segundos y lectura continua 30 de la fluorescencia para determinar la Tm del producto de amplificación específico para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida. En todas las muestras de tejido analizadas, la presencia de un pico de amplificación con una Tm de 80, 5-81, 0ºC (Figura 2) , indicó la presencia de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en el tejido del pez infectado. La bacteria se detectó en todas las muestras de peces que mostraron síntomas clínicos de furunculosis. No se obtuvo amplificación con muestras de ADN de tejidos de peces sanos o infectados con otras especies bacterianas. Estos 35 resultados indican que la técnica de PCR cuantitativa y los cebadores descritos en la presente invención pueden ser empleados como un método de diagnóstico utilizando los tejidos de peces enfermos como fuente de ADN.
Ejemplo 6. Especificidad y sensibilidad de la PCR en tiempo real con SYBR Green.
La especificidad del ensayo de la PCR en tiempo real y la existencia de amplificaciones cruzadas fueron evaluadas 40 utilizando una muestra de ADN de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida (40 cepas) y varias bacterias no diana incluyendo subespecies atípicas de Aeromonas salmonicida (Aeromonas salmonicida spp. achromogenes (n=1) , Aeromonas salmonicida spp. masoucida (n=1) , Aeromonas sobria (n=1) , A, caviae (n=1) , A. bestiarum (n=1) y A. hydrophila (n=1) , así como, otras bacterias representativas de especies patógenas de peces no relacionadas pertenecientes a los géneros, Tenacibaculum (n=4) , Flavobacterium (n=2) , Yersinia (n=1) , Vibrio (n=5) , Listonella (n=2) , 45 Edwarsiella (n=2) , Streptococcus (n=2) , Vagococcus (n=1) , Lactococcus (n=2) y Renibacterium (n=1) que afectan a peces de agua dulce y salada.
En las PCR en tiempo real realizadas se detectó el gen aopO en todas las cepas de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida, cuando se utilizaron las suspensiones bacterianas directamente o el ADN extraído a partir de ellas. La 50 curva de fusión mostró un único pico con un valor Tm medio de entre 80, 5 y 81, 0ºC. No se obtuvo amplificación cuando se utilizaron las suspensiones bacterianas o el ADN extraído de subespecies atípicas (Aeromonas salmonicida spp. achromogenes, Aeromonas salmonicida spp. masoucida) (Figura 3) o de otras especies bacterianas no relacionadas taxonómicamente.
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Para el ensayo de sensibilidad, tanto las suspensiones bacterianas (con y sin previa extracción de ADN) como el ADN de tejidos de peces infectados, fueron utilizados para generar una curva estándar usada para la cuantificación de las muestras desconocidas. Se preparó un gráfico representando los valores Ct frente al log10 de ADN o concentración bacteriana. La eficiencia de los ensayos de la PCR en tiempo real se calculó con la pendiente de la recta de acuerdo con la ecuación E=10 (-1/m) -1. La linealidad de la curva de calibración se expresó como coeficiente de correlación (R2). 60 Las Figura 4 y 5 muestran las rectas de calibrado obtenidas utilizando ADN bacteriano o ADN obtenido a partir de tejidos, respectivamente.
