Andamio biodegradable que comprende ARN mensajero Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a un andamio biodegradable que comprende ARN mensajero. 5 Mas particularmente, se refiere al andamio, el metodo de preparation y uso de los mismos.
Antecedentes de la invencion
Los factores de transcription (TFs) son proteinas capaces de inducir grandes cambios en la expresion genica (Graf, 2009, Nature 462, 587-594). Dado que el transporte intracelular de 10 proteinas es un gran desafio, una de las principales preocupaciones es como ceder estos TFs a su lugar de action en el interior del nucleo y la forma de integrar estas tecnologias de cesion en sistemas de ingenieria de tejidos o dispositivos implantables. Para estas aplicaciones, por lo general la cesion se realiza a traves de la terapia genica, usando andamios activados con vectores virales. Sin embargo, usar un vector viral puede causar 15 problemas de seguridad, incluyendo reacciones inmunes peligrosas y la supresion inmune de los vectores virales. La activation de andamios con ADN plasmidico (pDNA) tambien es posible (Fang, 1996, PNAS 93, 5753-5758) , pero la eficacia de transfection es baja. Los andamios tambien han sido activados con otros oligonucleotidos tales como microRNA y siRNA, pero estas moleculas solo pueden producir la inhibition de la expresion genica, y 20 no la expresion forzada de la proteina (Andersen et al., 2010, Mol Ther 18, 2018-2027). Ademas, estas estrategias tienen todavia dificultades, especialmente en el caso de la transfeccion in vivo realizada en andamios de tejido.
Publicaciones recientes han demostrado que el ARN mensajero (mRNA) puede inducir la expresion forzada de la proteina, y se han aplicado para la codification de los factores de 25 crecimiento. Asi, Lui et al. usaron mRNA para la codificacion del factor de crecimiento VEGF para la vascularization de tejido, e implantaron esta terapia junto con las celulas en un andamio de proteina tumoral comercial (Matrigel®) (Lui, 2013, Cell Research 23, 11721186). Sin embargo, esta tecnologia no se puede aplicar en terapia ya que Matrigel se basa en las proteinas tumorales.
Por otro lado, Balmayor et al. han cedido un mRNA que codifica para factores de crecimiento a un defecto de femur en un modelo de rata con buenos resultados (Balmayor, 2016, Biomaterials 87, 131-146).
Sin embargo, todavia hay una necesidad de proporcionar tecnologias para la cesion de mRNAs, y mas especificamente mRNAs que codifican para factores de transcription que son proteinas intracelulares estrictamente reguladas, con una vida media muy corta. Los mRNAs deben de seguir siendo eficaces tras su cesion, y conseguir una transfection en el entorno tridimensional, que por lo general muestra una eficiencia mas baja que en 2D. Estos dispositivos deben ser capaces de producir un efecto biologico claro inducido por la sobreexpresion del factor de transcripcion. Este efecto podria ser medido por una sobreexpresion del propio factor de transcripcion, pero incluso mas importante, de otros genes objetivo regulados por dicho factor de crecimiento. Ademas, la estructura 3D del andamio debe ser capaz de albergar celulas adheridas y, si es necesario, permitir su proliferation.
Breve description de la invention
Los autores de la presente invencion han desarrollado un andamio biodegradable que esta activado con secuencias de mRNA que codifican para factores de transcripcion. Este andamio biodegradable puede conducir a la expresion forzada pronunciada del factor de transcripcion, mayor que la conseguida con ADN plasmidico. Tambien hemos confirmado que esta expresion forzada de un factor de transcripcion induce cambios en los niveles de expresion de otros genes, indicando un claro efecto biologico. Ademas, este andamio tiene la ventaja de evitar problemas de seguridad, en particular evita vectores virales.
Asi, un aspecto de la invencion se refiere a un andamio biodegradable que comprende un polimero biodegradable, un mRNA aislado que codifica para un factor de transcripcion y un agente de transfeccion.
Otro aspecto de la invencion se refiere a un andamio biodegradable de la invencion para uso como medicamento. En una realization particular, el andamio biodegradable de la invencion es para uso en tejidos u organos de terapia regenerativa, preferiblemente el tejido es cartilago, musculo o tejido nervioso. En otra realizacion particular, el andamio biodegradable de la invencion es para uso en el tratamiento de un defecto de cartilago, dano muscular o dano en el tejido nervioso.
En otra realization particular, la invention se refiere al uso del andamio biodegradable de la invention para preparar un medicamento. En otra realization particular, la invention se refiere al uso del andamio biodegradable de la invencion para preparar un medicamento para uso en tejidos u organos en terapia regenerativa, preferiblemente el tejido es cartilago, musculo o tejido nervioso. En otra realization particular, la invention se refiere al uso de del andamio biodegradable de la invencion para preparar un medicamento para el uso en el tratamiento de un defecto de cartilago, dano muscular o dano del tejido nervioso.
Otro aspecto de la invention se refiere a una composition farmaceutica que comprende el andamio biodegradable de la invention descrito previamente.
Un aspecto adicional de la invention se refiere a una composition cosmetica que comprende el andamio biodegradable de la invention descrito previamente.
Un aspecto mas de la invention se refiere a un metodo para preparar el andamio biodegradable descrito antes, que comprende
(i) mezclar un polimero biodegradable, un mRNA aislado que codifica un factor de transcription y un agente de transfection, opcionalmente adicionar celulas seleccionadas del grupo que consiste en celulas primarias y lineas de celulas inmortalizadas, (ii) incubar la mezcla preparada en (i) , (iii) inducir la coagulacion de la mezcla preparada en (ii).
Description detallada de las figuras
Figura 1: (A) Estructura del vector plasmidico usado para la transcription in vitro del mRNA que codifica para la proteina fluorescente YFP. (B) Imagen de fluorescencia de las celulas U87MG, 24 h despues de la transfection con mRNA codificante de YFP usando lipofectamina 2000 (imagen de la derecha). El experimento se realizo en una placa de 24 pocillos. Como referencia se muestra una imagen de luz transmitida de las mismas celulas (imagen izquierda).
Figura 2: (A) Un diagrama ilustrando los andamiajes, las celulas y el mRNA con un agente de transfection se muestra en la Figura 2A. (B) Las imagenes de microscopia optica de las celulas madre mesenquimales humanas cultivadas en andamiajes activados con complejos de 3DFectIN/mRNA. Los andamiajes se prepararon a dos concentraciones de fibrina (2 y 4
mg/mL). (C) Imagen de fluorescencia de andamiajes activados con plasmido, en complejos 3DFectIN/pDNA. Tres proporciones 3DFectIN/pDNA fueron probadas: 2: 1, 3: 1 y 4: 1. El pDNA se marco con SYBERGold para su observation por microscopia de fluorescencia.
Figura 3: Imagenes de microscopia electronica de barrido de andamiajes de fibrina (2 mg/mL) , tanto sin celulas (Control) o con celulas (Sembrado) y a diferentes aumentos. Las barras de escala se integran en cada imagen y se referencian en el lateral.
Figura 4: Imagenes de microscopia electronica de barrido de andamiajes de fibrina (4 mg/mL) , tanto sin celulas (Control) o con celulas (Sembrado) y a diferentes aumentos. Las barras de escala se integran en cada imagen y se referencian en el lateral.
Figura 5: Andamiajes biodegradables preparados a partir de alginato y poliarginina. A la izquierda, la imagen macroscopica de los geles formados en la parte inferior conica de tubos Eppendorf, manteniendose en su position tras la inversion del tubo. A la derecha, las imagenes de microscopia optica de dos ejemplo representativos de estos andamiajes sembrados con celulas U87MG.
Figura 6: Transfection de celulas U87MG en andamiajes de fibrina activados con mRNA (2 pg mRNA, relation 3DFectIN/mRNA 4:1). Se utilizo un mRNA codificante de YFP. La transfeccion de las celulas se evaluo a las 24 h, 48 h, 72 h y a los 5 dias. Cada panel muestra como referencia imagenes de luz transmitida (izquierda) y de fluorescencia (derecha) de la misma area.
Figura 7: Transfeccion de celulas U87MG en andamiajes de fibrina activados con mRNA (1 pg de mRNA, relacion 3DFectIN/mRNA 3:1). Se utilizo un mRNA codificante de YFP. La transfeccion de las celulas se evaluo a las 24 h, 48 h, 72 h y a los 5 dias. Cada panel muestra como referencia imagenes de luz transmitida (izquierda) y de fluorescencia (derecha) de la misma area.
Figura 8: Transfeccion de celulas U87MG en andamiajes de fibrina activados con mRNA (1 pg de ARNm, relacion 3DFectIN/mRNA 2:1). Se utilizo un mRNA codificante de YFP.
La transfeccion de las celulas se evaluo a las 24 h, 48 h y a los 5 dias. Cada panel muestra como referencia imagenes de luz transmitida (izquierda) y de fluorescencia (derecha) de la misma area.
Figura 9: Transfeccion de celulas U87MG en andamiajes de fibrina activados con pDNA (1 pg pDNA, relation 3DFectIN/pDNA 3:1). Se utilizo un pDNA codificante de YFP. La transfeccion de las celulas se evaluo a las 48 h y a los 5 dias. Cada panel muestra como referencia imagenes de luz transmitida (izquierda) y de fluorescencia (derecha) de la misma area.
Figura 10: Estudio de citotoxicidad con celulas U87MG cultivadas en andamiajes de fibrina (4 mg/mL de fibrina) activados con complejos 3DFectIN/mRNA en relaciones 2: 1 y 3: 1. Andamiajes no activados fueron utilizados como control (etiquetado "C" en la figura). La citotoxicidad de los andamiajes se midio mediante un ensayo de MTT a las 24 h (A) y 48 h (B). (C) La capacidad de los andamiajes de fibrina activados con 3DFectin/mRNA para soportar la proliferation celular se confirmo mediante la cuantificacion de la cantidad de DNA en el cultivo a las 0, 3 y 7, medido mediante un ensayo de PicoGreen.
Figura 11: (A) Transfeccion de celulas madre mesenquimales humanas (hMSCs) en los andamiajes de fibrina activados con complejos de mRNA a las 24 h (1 pg de mRNA, relacion de 3DFectIN/mRNA 3: 1). Se utilizo mRNA codificante de YFP. La transfeccion de las celulas se evaluo en andamiajes preparados a partir de soluciones de fibrina de 2 y 4 mg/mL. Cada panel muestra la imagen de fluorescencia a la izquierda, y como referencia, la imagen de luz trasmitida de la misma zona a la derecha. (B) Estudio de la citotoxicidad de hMSC cultivadas en andamiajes de fibrina (2 o 4 mg / ml de fibrina) activados con mRNA (relacion 3DFectIN/mRNA 3:1). Andamiajes no activados se utilizaron como control (etiquetado "C" en la figura). La citotoxicidad de los andamiajes se midio mediante un ensayo de MTT a las 24 h y 48 h. (C) La capacidad de los andamiajes activados con mRNA (2 y 4 mg / ml de fibrina) para soportar la proliferacion celular se confirmo mediante la cuantificacion de la masa de ADN en el cultivo a 0, 3, 7 y 10 semanas, medido mediante un ensayo PicoGreen. En cada grafico, la proliferacion en el andamiaje activado
con mRNA ("Tratamiento") se compara con los mismos andamiajes sin complejos 3DFectIN/mRNA ("Control").
Figura 12: (A) Estructura del vector plasmidico usado para la transcription in vitro de mRNA codificante del factor de transcripcion SOX9. (B) Despues de la transfection de celulas HEK293 con este mRNA y con lipofectamina, la expresion de SOX9 fue evaluada por mediante extraction de las proteinas a las 12 y 24 h y la realization de un western blot. Celulas no transfectadas se utilizaron como control negativo (C-). Las celulas transfectadas con pDNA codificante de SOX9 se utilizaron como control positivo (C+). La proteina a- tubulina se utilizo como referencia en el western blot.
Figura 13: (A) Expresion relativa de Sox9 24 h despues de la transfeccion de la linea celular U87MG en un andamiaje de fibrina (4 mg/mL) activado con mRNA o pDNA (1 pg, relation de 3DFectIN/mRNA y 3DFectIN/pDNA de 2:1 y 3:1). Se utilizo un mRNA codificante de Sox9. La expresion relativa de Sox9 se cuantifico por analisis de RT-PCR cuantitativo (qRT-PCR) de celulas transfectadas con respecto a los genes de referencia GAPDH yP-actina. (B) Una replica del experimento anterior de expresion de Sox9 a las 24 h post-transfeccion en U87MG, pero focalizado en los andamiajes de fibrina activados con mRNA o pDNA (1 pg) con proportion 3:1. (C) El mismo estudio comparativo del panel (B) , pero realizado en celulas madre mesenquimales humanas.
Figura 14: Cinetica de expresion de mRNA de Sox9 tras la transfeccion de hMSCs en andamiajes de fibrina de (A) 2 mg/mL y (B) 4 mg/mL. Los andamiajes fueron activados con 3DFectIN/mRNA o 3DFectIN/pDNA (1 pg, proporcion 3:1). Se utilizo un mRNA codificante de Sox9. La expresion genica se midio despues de 12, 24 y 48 h.
Figura 15: Expresion genica relativa de marcadores de diferenciacion condrogenica en hMSC transfectadas en andamiajes de fibirina (4 mg/mL) activados con mRNA o pDNA, o no activados ("C"). Los andamiajes se cultivaron durante 21 dias en medio condrogenico incompleto (ICM) o medio condrogenico completo (CCM). La expresion genica relativa de los marcadores (A) Sox9 (A) y (B) agrecano (ACAN) fue medida en estas condiciones tras los 21 dias de cultivo.
Figura 16: Expresion genica relativa de los marcadores de diferenciacion condrogenica en hMSC transfectadas en andamiajes de fibrina (2 mg/mL y 4 mg/ mL) activados con mRNA, pDNA o no activados ("C"). Los andamiajes fueron cultivados por 28 dias en medio condrogenico incompleto (ICM) o medio condrogenico completo (CCM). La expresion genica relativa de los marcadores (A) Sox9 (A) y (B) agrecano (ACAN) fue medida en estas condiciones tras los 28 dias de cultivo.
Descripcion detallada de la invencion
En un aspecto, la invencion se refiere a un andamio biodegradable que comprende un polimero biodegradable, un mRNA aislado que codifica un factor de transcription y un agente de transfeccion.
Los andamios de la invencion tienen la ventaja de que son biocompatibles y no ejercen importante toxicidad a celulas residentes (ejemplo 4 y figura 10). Ademas, los andamios de la invencion pueden soportar proliferation celular (ejemplo 4) y pueden conducir a elevados niveles de expresion forzada de los factores de transcripcion por las celulas (ejemplo 7, figura 13) ; incluso la transfection fue efectiva en celulas mesenquimales humanas (ejemplo 5 y figura 11).
Los andamios de la invencion activados con mRNA codificando SOX9 son capaces de conseguir la transfeccion en un entorno tridimensional, y lograr una expresion significativa de SOX9 en U87MG y tambien en celulas humanas mesenquimales (hMSCs). Esta expresion es mucho mas elevada que la obtenida cuando se empleo un ADN plasmidico (pDNA) (ejemplo 6, figuras 13A y 13C).
Ademas, hemos confirmado que los andamios de la invencion activados con mRNA pueden modificar el perfil de expresion genico de las celulas residentes, conduciendo per se a la diferenciacion de hMSCs hacia un linaje condrogenico (ejemplos 8 y 9).
"Andamio" significa una estructura temporal usada para sostener celulas en tres dimensiones, mientras reconstruyen un tejido u organo o realizan otras funciones biologicas. Andamios de tejidos estan ampliamente descritos en la bibliografia, y pueden tener dos posibles estructuras, o estructuras intermedias entre extremos: (i) una estructura solida en forma de matriz que tiene poros interconectados suficientemente grandes (>50 pm) para permitir penetration celular y hospedaje o (ii) una estructura de hidrogel donde las celulas pueden ser encapsuladas. Los andamios de la invencion son biodegradables y asi adecuados para ser reemplazados por tejido natural.
El termino "biocompatibilidad" se entiende que se refiere a la capacidad de un material para llevar a cabo con una apropiada respuesta en su hospedador en una situation especifica. Para que se considere biocompatible, un dispositivo deberia de cumplir con ISO 10993 o un standard similar, y ser testado en animales y en ensayos clinicos.
Los materiales que son susceptibles para la preparation de los andamios de la invention, que son biocompatibles y biodegradables y estan bien descritos en la bibliografia, se pueden clasificar en materiales inorganicos, polimeros degradables enzimaticamente y polimeros degradables hidroliticamente. Ejemplos de materiales inorganicos biodegradables son, pero no se limitan a, materiales ceramicos tales como apatitas, por ejemplo de hidroxiapatita, y el silicio poroso. Preferiblemente, el material utilizado debe estar libre de residuos de patogenos de origen animal o humano.
"Biodegradable" en relation a la presente invencion significa que el material es completamente reabsorbido cuando esta en el entorno de un organismo despues de 24 horas.
"Polimero biodegradable" significa un polimero que se reabsorbe completamente tras la implantacion despues de 24 horas, y que es adecuado para acomodar o para el crecimiento de celulas. Preferiblemente, el polimero biodegradable esta libre de materiales patogenicos y/o no deriva de muestras patogenicas. Los polimeros biodegradables en esta invencion pueden ser polimeros degradables enzimaticamente y polimeros degradables hidroliticamente. Polimeros degradables enzimaticamente como se entiende en la presente invencion son, por ejemplo, colageno, elastina, peptidos tipo-elastina, albumina, fibrina, fibroma de seda, quitosano, alginato, acido hialuronico y sulfato de condroitina. Polimeros degradables hidroliticamente como se entiende en la presente invencion son, por ejemplo poliesteres, poliuretanos, poli (ester amida) , poli (orto esteres) , polianhidridos, poli (anhidro- co-imida) , polianhidridos entrecruzados, poli (propilenfumarato) , poli (pseudoaminoacidos) , poli (alquil cianocrilatos) , polifosfacenos, polifosfoesteres. Ejemplos de poliesteres utiles comprenden, pero no estan limitados a, poliglicolico, polilactico, poli (lactico-co-glicolico) , polidioxanona, policaprolactona y poli (trimetilen carbonato).
En una realization preferida de la invencion el polimero biodegradable se selecciona de fibrina, alginato y mezclas de los mismos.
"mRNA aislado" se entiende como una molecula polimerica hecha de acidos nucleicos capaces de ser traducido en los ribosomas a una secuencia especifica de aminoacidos, y por lo tanto, para expresar una o mas proteinas, que ha sido aislado por procedimientos
tecnicos de un medio biologico o se ha sintetizado anteriormente para ser utilizado en el andamio de la presente invention. Este termino tambien incluye mRNA que puede estar modificado quimicamente. Algunos ejemplos de modificaciones quimicas de acidos nucleicos de ARNm, pero no limitado, son: 5-metil-citidina, 2-tio-uridina, 5- methoxyuridine, N-1-metilpseudo-uridina y pseudo-uridina.
El termino "ARN mensajero" ("mRNA) se entiende como una molecula polimerica hecha de acidos nucleicos capaces de ser traducido en los ribosomas a una secuencia especifica de aminoacidos, y por lo tanto, para expresar una o mas proteinas. En el contexto de esta invencion, el mRNA esta codificando al menos para un factor de transcription (TF). Preferiblemente, el mRNA empleado en esta invencion esta optimizado para la traduction en celulas eucariotas. Preferiblemente, el mRNA empleado en esta invencion se sintetiza para un proposito especifico y con secuencias especificas. Por lo tanto, conjuntos de mRNA extraidos de organismos vivos naturales, no manipulados o partes de ellos no son preferidos para la presente invencion.
Aunque no se limita a estos procedimientos, el mRNA de la invencion preferentemente se sintetiza mediante reacciones de transcripcion in vitro, a partir de un molde de plasmido, o alternativamente, mediante sintesis quimica en fase solida.
Aunque no se limita a las estructuras descritas a continuation, la eficacia de la invencion se beneficia de la utilization de mRNA con alta traducibilidad. Las caracteristicas estructurales del mRNA como un 5 Cap, una cola 3 poliadenina son algunas de las mas importantes para asegurar la elevada capacidad de traduccion. Ademas, un tramo corto 3' de oligouridina tambien es potencialmente util. Otras estructuras que podrian mejorar la traduccion del mRNA son regiones no traducidas, que podrian estar situadas en el 5' y / o en el extremo 3' en relation con la region de codification.
Por lo tanto, una realization particular de la invencion esta dirigida a un mRNA que tiene un 5'-Cap. Otra realizacion particular se refiere a un mRNA que tiene una cola poliadenina. Otra realizacion particular de la invencion esta dirigida a un mRNA que tiene una region no traducida 5'. Y otra realizacion particular se refiere a un mRNA que tiene una region no traducida 3'.
Las secuencias de mRNA pueden generar inmunidad celular, asi, para la presente invencion es preferido que algunos de los acidos nucleicos esten modificados quimicamente para reducir su reconocimiento inmune. Una realizacion particular de la invencion se dirige a un mRNA que tiene acidos nucleicos quimicamente modificados
seleccionados de la lista que consiste en 5-metil-citidina, 2-tio-uridina, 5-metoxiuridina, Nl-metilpseudo-uridina y pseudo-uridina.
El termino "factor de transcription" ("TF") significa una proteina que se une a secuencias especificas de DNA, controlando de este modo la tasa de transcripcion de la information genetica del DNA al mRNA. A veces los TFs tambien se llaman "trans-activadores" en bibliografia, siendo ambos terminos sinonimos. Los TFs para la presente invention preferiblemente tienen uno o mas dominios de union al DNA. Los TFs han sido clasificados por su superclase en: (1) dominios basicos, (2) dominios de union al DNA zinc-coordinados, (3) helice-giro-helice, (4) factores con estructura beta y contactos en la hendidura menor, (5) otros factores de transcripcion. Varias revisiones de la funcion y la estructura de TF estan disponibles en la literatura (Latchman, 1997, Int J Biochem Cell Biol 29, 1305-1312).
La base de datos de descriptores Medical Subject Headings (MeSH) identifica TFs mediante los tres numeros D12.776.930. Hay varias bases de datos de TF disponibles para buscar secuencias y funciones de TFs, por ejemplo, JASPAR
(http://jaspar.genereg.net)
.
En una realizacion preferida de la invencion, el mRNA codifica para un factor de transcripcion condrogenico.
En una realization preferida de la invention, los TFs codificados activan programas geneticos responsables de la diferenciacion celular o desdiferenciacion. En una realization preferida de la invencion, el mRNA codifica para un factor de transcripcion seleccionado del grupo que consiste en SOX9, MyoD, NeuroD1, c-Myc, Klf4, Nanog, Oct4, SOX2, C/EBP-P, PPAR-y, Brn2, Lmx1a, Nurr1, Mash1, Myt1l y NeuroG2. En una realization mas preferida de la invencion, el mRNA codifica para los factores de transcripcion seleccionado de SOX9, MyoD, NeuroD1, SOX2, Oct4, Klf4 y c-Myc. En una realization mas preferida de la invention, el TF es SOX9.
El termino "agente de transfection" se entiende como un compuesto capaz de mejorar la cesion de la secuencia de ARN mensajero (mRNA) al citoplasma. Asi, la presencia de un agente de transfeccion se evidencia por un incremento marcado de la expresion de proteina. El agente de transfection, tambien llamado sistema de cesion de genes, vehiculo de cesion de genes, o matrices activadas de genes, han sido descritos en muchas publicaciones (Borrajo, 2015, In: Polymers in Regenerative Medicine, 285-336).
Los agentes de transfection pueden estar hechos de materiales inorganicos, materiales lipidicos y materiales polimericos. Aunque no esta limitado a estos, una posible lista de
agentes de transfeccion inorganicos son sales de fosfato calcico y nanoparticulas de silicio cationicas.
Agentes de transfeccion lipidicos se pueden clasificar en lipidos condensantes y no condensantes, siendo los condensantes frecuentemente denominados lipoplejos. Los lipidos no condensantes son emulsiones, nanoemulsiones y liposomas que pueden encapsular el material genetico. Los lipoplejos se forman mediante lipidos con una cadena alifatica y uno o varios grupos cationicos. Aunque no esta necesariamente limitado a estos, a menudo estos grupos cationicos son aminas primarias, secundarias o terciarias, o estructuras con una mezcla de estas. La carga neta de los lipidos en los lipoplexos deberian de ser positivos a pH fisiologico, como medida de du potencial zeta, y deberian de ser capaces de unirse a material genetico mediante fuerzas electrostaticas.
Agentes de transfeccion polimericos tambien se pueden clasificar como condensantes y no condensantes. Los no condensantes generalmente se unen a material genetico mediante alguna tecnica de encapsulation o a traves de fuerzas debiles.
Los vehiculos polimericos condensantes estan formados por polimeros que muestran una carga neta positiva a pH fisiologico, como medida del potencial zeta, y que se pueden unir al material genetico, mediante fuerzas electrostaticas.
En una realization preferida de la invention, el agente de transfeccion se selecciona de entre lipidos cationicos, polimeros cationicos, y una sal de fosfato calcico.
En una realizacion preferida de la invencion, el agente de transfeccion. En una realizacion preferida de la invencion, el agente de transfeccion es un agente condensante lipidico. En una realizacion mas preferida de la invencion, el agente condensante lipidico es Lipofectamina o 3DFectin.
En una realizacion preferida de la invencion, el agente de transfeccion es un agente condensante polimerico. En una realizacion mas preferida de esta invencion, el agente polimerico condensante es poliarginina. En otra realizacion mas preferida de la invencion, el agente polimerico condenstante es poloxamina. En otra realizacion mas preferida de la invencion, agente polimerico condensante es un polifosfaceno cationico.
En una realizacion particular de la invencion, el anadamio biodegradable comprende ademas celulas. Aunque una variedad de celulas se podria beneficiar de la capacidad de esta invencion para ejercer control sobre sus funciones, las celulas primarias son de primer interes. Entre ellas, celulas progenitoras con alta plasticidad tales como celulas madre adultas y celulas madre pluripotentes inducidas podrian ser los mejores candidatos para ser
incluidos a esta invention. Estas celulas tienen la capacidad de proliferar y pueden recapitular diferentes vias de diferenciacion. Las celulas incorporadas al andamiaje de la invention, pueden proliferar y formar estructuras biologicas en forma 3D incluyendo tejidos en estos andamios.
En una realization particular, las celulas se seleccionan del grupo que consiste en celulas primarias y lmeas celulares inmortalizadas. En una realization particular, las celulas no son celulas madre embrionarias. En una realization preferida, el andamio de la invention es clmicamente util ya que es biodegradable y biocompatible.
En una realization mas preferida de la invention, las celulas primarias son celulas progenitoras. En una realization mas preferida de la invention, las celulas primarias son celulas madre adultas o celulas madre pluripotentes inducidas. En una realization preferida de la invention, las celulas madre adultas son celulas madre mesenquimales.
En otra realization preferida de la invention, las celulas primarias son fibroblastos o condrocitos.
En otra realization, la invention se dirige a una composition farmaceutica que comprende un andamio como se describe arriba.
En una realization particular, la composition farmaceutica comprende ademas veMculos farmaceuticamente aceptables.
En otra realization particular, la composition farmaceutica comprende ademas al menos un ingrediente farmaceutico activo adicional. Asi, otros farmacos o compuestos se pueden incorporar a las composiciones para mejorar su actuation o mejorar su presentation para el uso final. En una realization preferida, el ingrediente activo adicional se selecciona de farmacos, como por ejemplo antibioticos, inmunosupresores, anti-inflamatorios, de biologicos como por ejemplo factores de crecimiento, citoquinas, morfogenos, protemas, polisacaridos de la matriz extracelular; de compuestos para modificar las propiedades mecanicas y de gelificacion de los andamios como por ejemplo agentes de entrecruzamiento adicionales.
En otra realization particular, la composition farmaceutica es una solution inyectable, suspension, hidrogel o una matriz porosa solida.
En otra realization particular, la composition farmaceutica es para uso como vacuna.
En otra realization particular, la invention se refiere a un metodo para preparar el andamio de la invention como se describe arriba, que comprende:
(i) Mezclar un polimero biodegradable, un mRNA aislado que codifica para un factor de transcription y un agente de transfection, y opcionalmente celulas seleccionadas de entre el grupo que consiste en celulas primarias y lineas celulares inmortalizadas, (ii) Incubar la mezcla preparada en (i) , (iii) Inducir la coagulation de la mezcla preparada en (ii).
En otra realization particular, la invention se refiere a un metodo alternativo para preparar el andamio de la invencion como se describe arriba, que comprende:
(i) Preparar un andamio, (ii) Mezclar un mRNA aislado que codifica para un agente de transcripcion y un agente de transfeccion, (iii) Incubar la mezcla preparada en (ii) sobre el andamio preparado en (i) , y opcionalmente anadir celulas.
En una realizacion particular, el polimero biodegradable se selecciona de fibrina, alginato y mezclas de los mismos. En una realizacion preferida, la concentration de fibrina es de entre 1 mg/mL y 5 mg/mL. En una realizacion mas preferida, la concentracion de fibrina es de entre 2 mg/mL y 4 mg/mL.
En una realizacion particular, la coagulacion de la etapa (iii) , se lleva a cabo mediante la adicion de un agente de coagulacion. En una realizacion preferida, el agente de coagulacion se selecciona de trombina, sal calcica y sal de polifosfato.
En una realizacion particular de la invencion, cuando la trombina se usa como agente de coagulacion, el rango de trombina que se usa esta entre 0.2 U y 1.2 U por mg del fibrinogeno usado.
En el metodo alternativo, la interaccion del andamio y el mRNA/agente de transfeccion en la etapa (iii) puede ser reforzada mediante secado o liofilizacion del sistema.
En otra realizacion, la invencion se refiere a un andamio biodegradable obtenido por el metodo descrito arriba.
En otra realizacion, la invencion se refiere al uso de un andamio de la invencion, como un reactivo de diferenciacion in vitro o como implante cosmetico.
Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de un andamio biodegradable como se describe arriba como dispositivo para la regeneration de tejido y organos. En una realizacion preferida de la invencion, el andamio biodegradable se usa como dispositivo para regeneracion de cartilago.
Otro aspecto de la invention se refiere al uso de un andamio biodegradable definido arriba para propositos cosmeticos.
Un ultimo aspecto de la invention se refiere al uso de un andamio biodegradable como se define arriba como un farmaco para prevenir, paliar o curar enfermedades.
A continuation se describen algunos ejemplos ilustrativos de la invention; sin embargo, no deben de ser consideradas como limitaciones impuestas a la misma.
EJEMPLOS Ejemplo 1
Sintesis de mRNA codificante de la proteina fluorescente YFP: Un plasmido para la transcription in vitro de mRNA fue disenado basado en el plasmido pBluescript KS (pBSK KS, Stratagene, EE.UU.) , con un promotor de la transcription de T7. En este plasmido, la secuencia de YFP y una senal de poliadenilacion fue clonada a partir de un plasmido pIRES YFP (Clontech, Alemania) , utilizando los sitios de restriction Smal y Xhol. El diseno correcto se verifico a traves de su escision en sitios de restriction, y analisis por ensayos de migration en gel y secuenciacion. La estructura del plasmido utilizado se representa en la Figura 1A. El mRNA se sintetizo con un Cap analogo anti-reverso (ARCA) a traves del kit ultra mMACHINE T7 (Ambio) , siguiendo las instrucciones del fabricante. El mRNA se puede aislar por un metodo de extraction estandar de fenol- cloroformo. Sin embargo, se consigue una mejor reproducibilidad entre lotes de mRNA si la extraction se realiza con un tubo Pharme Lock Gel Light (5Prime, Alemania) , siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para verificar la actividad del mRNA, las celulas U87MG fueron transfectadas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) segun las recomendaciones del fabricante. las celulas U87MG se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 26300 celulas/cm el dia antes de la transfection. Los lipoplexos se prepararon a continuation en 100 pl de OptiMEM (Gibco) , con 0, 5 pg de mRNA y con una proportion de mRNA: lipido de 2:1; los complejos preparados se anadieron a las celulas. Despues de 6 h de incubation, el medio con lipoplexos se elimino y se reemplazo con medio de cultivo fresco. La presencia de celulas fluorescentes se verifico mediante un microscopio de fluorescencia (Olympus)
h despues de la transfeccion. Los resultados confirmaron que una alta fraction de las celulas que pueden ser observadas con luz trasmitida fueron transfectadas con exito (fig.
1B).
las celulas U87MG fueron cultivadas rutinariamente en medio completo, que consiste en Dulbeccos Modified Eagles Medium con alta glucosa (D5671 Sigma) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de glutamina y 100 mg/L de penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich). El cultivo se mantuvo a 37 ° C y bajo una atmosfera de 5% de CO2. Un esquema del andamiaje, las celulas, los mRNA y el agente de transfeccion se representa en la Figura 2A; la ilustracion representa un andamiaje biodegradable activado con mRNA que codifica para los factores de transfeccion y complejado este a un agente de transfeccion. La inclusion de las celulas en el andamiaje podria ser una option interesante para algunas aplicaciones, pero se considera como opcional en la presente invencion. Preparation de los andamiajes de fibrina activados con 1 o 2 pg de mRNA y 3DFectIN como agente de transfeccion: En primer lugar, 1 pg o 2 pg de mRNA fueron diluidos hasta
pl en OptiMEM (para andamiajes activados con 1 o 2 pg de mRNA, respectivamente). A continuation, esta disolucion de mRNA se mezclo con otra fase de 25 pl de 3DFectin (OZ Biosciences, Francia) en OptiMEM. Para andamiajes con 1 pg de mRNA, esta segunda fase tenia 2, 3 o 4 pl de 3DFectIN (correspondiente a las relaciones 2:1, 3:1 o 4:1, respectivamente) diluido hasta 25 pL en OptiMEM. Para los andamiajes con 2 pg de mRNA, esta segunda fase tenia 4, 6 o 8 pl de 3DFectIN (correspondiente a las relaciones 2:1, 3:1 o 4:1, respectivamente) y diluido hasta 25 pL en OptiMEM. El mRNA y las fases 3DFectIN se mezclaron y se dejaron interactuar durante 20 minutos. Esta reaction da lugar a 50 pL de fase 3DFectIN/mRNA.
Ademas de esta fase 3DFectIN/mRNA, se prepararon otras dos disoluciones. Una disolucion de fibrinogeno de 20 pL a 10 o 20 mg/mL se preparo para generar andamiajes de 2 o 4 mg/mL de concentration final. Una solution de trombina de 20 pL a 12, 5 U/mL fue preparada tambien como reticulante del fibrinogeno. La disolucion de fibrinogeno se pipetea despues en un pocillo de cultivo o en el lugar donde se pretende generan los andamiajes. Los complejos 3DFectIN/mRNA se mezclan despues con 10 pL de OptiMEM y la suspension resultante se mezcla con el fibrinogeno mediante pipeteo. A continuacion, esta fase se mezcla con una disolucion de trombina para la gelificacion. Despues de 1 h de incubation a 37 ° C con la trombina, todas estas posibles combinaciones de sistemas han formado un hidrogel.
Las celulas se pueden integrar en esta composition, cambiando los 10 pL de OptiMEM anadidos a los complejos de 3DFectIN/mRNA por el mismo volumen de suspension de celulas en OptiMEM. Un numero de 1, 5x105 celulas pueden ser facilmente incorporados en este volumen. Cuando las celulas van a ser cultivadas en los andamiajes, se puede anadir medio celular completo a los andamiajes despues de su formation, es decir, despues de 1 h de incubation del fibrinogeno y la trombina a 37°C.
las celulas madre mesenquimales humanas (hMSC) se incorporaron a los andamiajes de fibrina activados con mRNA codificante de YFP. La observation mediante microscopia optica muestra que hMSCs estan perfectamente integradas en estas matrices en 3D, y pueden ser cultivadas tanto en andamiajes de fibrina de 4 mg/mL como en andamiajes de 2 mg/mL (Figura 2B).
Andamiajes activados con ADN plasmidico (pDNA) : como referencia, se prepararon tambien andamiajes de fibrina activados con pDNA codificante de YFP. El plasmido usado para estos experimentos era el mismo que utilizamos para la transcription in vitro de mRNA (Figura 1) , ya que el plasmido pBSK KS tiene tambien un promotor de la transcription eucariotica. Estos andamiajes se pueden preparar exactamente de la misma manera que los activados con mRNA, pero cambiando mRNA por la misma cantidad de pDNA. Los andamiajes activados con pDNA mostraron exactamente las mismas propiedades morfologicas y mecanicas. Esperamos que los complejos de 3Dfectin/pADN tendran una distribution similar en los andamiajes a los complejos de 3Dfectin/mRNA. Debido a esto, marcamos los andamiajes activados con pDNA mediante SYBRGold (Thermo Fisher Scientific, Inc.) , y observamos la distribution de la fluorescencia en los andamiajes sin celulas (Figura 2C). La fluorescencia estuvo presente en todas las areas del andamiaje. Sin embargo, se observo que las relaciones 2:1 3DFectin/pDNA daban lugar a aglomeraciones de la fluorescencia. Esta aglomeracion era menos prominente en la proportion de 3:1 y no detectable en la relation 4: 1.
Se prepararon andamiajes de fibrina (2 mg/mL y 4 mg/mL) tal como se describio anteriormente, y se cargaron con 1, 5x105 celulas U87MG.
Los andamiajes de fibrina activados con mRNA se sembraron con celulas hMSC, y se cultivaron durante una semana a 37 ° C con medio completo (90% de humedad, 5% de CO2). Despues de una semana, los andamiajes se liofilizaron, se metalizaron con oro- paladio al vacio, y se estudiaron por microscopia electronica de barrido (SEM, LEO 435VP-SEM, Soluciones SEMTECH, Reino Unido). Las imagenes de SEM confirmaron
que los hidrogeles de fibrina forman una estructura altamente porosa (Figura 3 y 4). Contrariamente a nuestras expectativas, el tamano de poro fue mayor en los hidrogeles de fibrina de 4 mg/mL que en los de 2 mg/mL. Las micrografias sugieren una estructura diferente para los andamiajes sembrados con celulas en comparacion con andamiajes control. Esto podria estar relacionado con la contraction mecanica del andamiaje inducida por la adhesion celular y por la deposition de matriz extracelular por parte de dichas celulas.
Ejemplo 2
Este ejemplo describe la sintesis de andamiajes de alginato activados con mRNA y dos polimeros cationicos, poliarginina y protamina. Para los ejemplos actuales, se utilizo mRNA que codifica YFP, preparado tal como se describe en el ejemplo 1. En un primer paso, 1 o 2 pg de mRNA se mezclaron con una solution de 10 pl de poliarginina o protamina (1 o 2 mg). La solucion se dejo a interactuar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Despues, se anadieron 50 pl de alginato (8 o 16 mg) a esta suspension y se mezclo. Despues, se anadio a la disolucion una suspension de 10 pl con tiene 1.5x105 celulas U87MG. El sistema formo una estructura de tipo hidrogel despues de la adicion de 70 pl de la primera mezcla sobre 30 pl de una solucion de CaCl2 (243 o 486 mM). Los hidrogeles se estabilizan por incubation a 37 ° C, 5% de CO2 y con un 95% de humedad durante 5 minutos. Despues de este punto, se puede anadir medio completo de cultivo celular sobre los andamiajes.
Todos hidrogeles formaron estructuras estables y mecanicamente competentes, como se evidencia por pruebas de inversion de tubo (Figura 5, izquierda). Las celulas se integraron con exito en los andamiajes, y pudieron ser cultivadas durante al menos cuatro dias en estas estructuras (Figura 5, a la derecha).
Se comprobo que el prototipo con un 0, 2% de protamina y 1, 6% de alginato dio lugar a la expresion forzada de YFP.
Ejemplo 3
Se prepararon andamiajes de fibrina (4 mg /mL) activados con 3DFectIN/mRNA (1 o 2 pg de mRNA, proporciones 2:1, 3:1 y 4:1) , usando un mRNA codificante de YFP segun el metodo descrito en el ejemplo 1, pero antes de la adicion de la trombina, en lugar de 10 pl de OptiMEM, se anadio el mismo volumen de este medio conteniendo 1.5x105 celulas
U87MG. Como referenda, se preparo un andamiaje de fibrina (4 mg/ mL) activado con 3DFectin/pDNA (1 pg de pDNA, relacion 3:1) y con la misma concentration de celulas U87MG. Despues de la formation de hidrogel, se anadio medio de cultivo completo y las celulas se cultivaron durante 5 dias (37°C, 5% de CO2) , con cambios en el medio cada dos dias.
La transfection celular se evaluo a traves de un microscopio de fluorescencia a 24 h, 48 h, 72 h y 5 dias (5 d) despues de la preparation del andamiaje. Se tomaron imagenes opticas de la misma area como referencia. Los resultados mostraron una alta transfeccion celular en todos los andamiajes activados con mRNA independientemente de la relacion 3DFectin/mRNA y del la punto de tiempo de observation (Figuras 6-8). La transfeccion de los andamiajes activados con mRNA fue claramente mayor que la observada para los andamiajes activados con pDNA (Figura 9). Este resultado fue una primera indication de que los andamiajes activados con mRNA podian lograr niveles de expresion genica forzada superiores a los obtenidos con los andamiajes activados con pADN.
Ejemplo 4
Se prepararon andamiajes de fibrina (4 mg/mL) activados con 3DFectIN/mRNA (1 pg de mRNA, relaciones 2:1 y 3:1) codificando YFP tal como se describe en el ejemplo 1, pero antes de anadir la trombina, en lugar de 10 pl de OptiMEM, se anadio el mismo volumen de este medio conteniendo 1.5x105 celulas U87MG. Como control negativo (C) , se preparo un andamiaje no activado utilizando el mismo procedimiento, pero anadiendo solo OptiMEM en lugar de la suspension de 50 pl 3DFectIN/mRNA en OptiMEM. Despues de la formacion de hidrogel, se anadio medio de cultivo completo y las celulas fueron cultivadas durante 24, 48 h, 3 semanas y 7 semanas (37°C, 5% CO2).
La viabilidad celular a las 24 y 48 h se midio mediante un ensayo MTT siguiendo las instrucciones del fabricante. La capacidad de los andamiajes para sostener la proliferation celular se evaluo midiendo el contenido de DNA en los cultivos al inicio (semana 0) , tras 3 semanas y despues de 7 semanas. Los andamiajes con relacion 3:1 fueron los prototipos seleccionados para este ensayo de proliferacion. El contenido de DNA en los andamiajes se midio, despues de la extraction de ADN, mediante un ensayo PicoGreen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) , siguiendo las instrucciones del fabricante. La extraccion del DNA para su cuantificacion se realizo mediante la incubation de los andamiajes con una solution de 100 pL tripsina (5%) durante 30 minutos, y a continuation, mediante la
incubacion de la suspension resultante durante 20 minutos en SDS 0, 1% bajo intensa agitation.
Los resultados del ensayo MTT demostraron que los andamiajes activados con el complejo 2:1 no eran toxicos bajo cualquiera de las condiciones (Figura 10). Los andamiajes activados con la relation 3:1 no mostraron toxicidad a las 24 h y mostraron signos de toxicidad menores a las 48 h. El ensayo de contenido de DNA confirmo que el andamiaje 3:1 puede soportar la proliferation y el cultivo de celulas durante un periodo de 7 semanas, aunque no se observo proliferacion adicional pasada la semana 3.
Ejemplo 5
Se prepararon andamiajes de fibrina (2 y 4 mg/mL) activados con mRNA (1 pg de mRNA, relacion 3:1) codificante de YFP tal como se describe en el ejemplo 1, pero antes de anadir la trombina, en lugar de 10 pl de OptiMEM, se anadio el mismo volumen de este medio conteniendo 1.5x105 hMSCs. Como control negativo (C) , se preparo un andamiaje no activado po5 el mismo procedimiento, pero utilizando solo OptiMEM en lugar de los 50 pl de la suspension de 3DFectIN/mRNA. Despues de la formation de hidrogel, se anadio medio de cultivo completo y las celulas fueron cultivadas durante 24 y 48 h (37°C, 5% CO2). Se evaluo la transfection de hMSCs a las 24 h tal como se describe en el ejemplo 3. Se evaluo la toxicidad del andamiaje a las 24 y 48 h mediante un ensayo de MTT tal como se describe en el ejemplo 4. La capacidad del andamiaje para apoyar la proliferacion de celulas a los 0, 3, 7 y 10 dias fue evaluada mediante un ensayo de cuantificacion de DNA tal como se describe en el ejemplo 4.
El experimento mostro que los andamiajes activados con mRNA pueden generar una transfeccion eficaz en hMSCs, tanto para prototipos con 2 mg/mL de fibirina como los de 4 mg/mL de fibrina. Las pruebas de MTT indicaron que todos los andamiajes de fibrina mostraron una toxicidad menor a las 24 h, y ausencia de toxicidad a 48 h. La cuantificacion de DNA apoya la capacidad de estos andamiajes para soportar la proliferacion celular. Esto fue particularmente visible para los andamiajes de 2 mg/mL de fibrina (Figura 11).
Ejemplo 6
Sintesis de mRNA codificante de SOX9: se diseno un plasmido para la transcription in vitro de mRNA basado en un plasmido pCMVTnT®, en el cual se introdujo el gen SOX9
junto con una secuencia de consenso Kozak para iniciar la traduccion, una region UTR 5' de P-globina y una region UTR 3' de a-globina. Se agrego bien una cola de politimina o una senal de poliadenilacion tardia de SV40 en 3' para la sintesis de mRNA con una cola de poliadenina. El plasmido disenado tenia tambien un sitio de la transcription eucariotica, ya que se uso el mismo como control en los andamiajes activados pDNA codificante de SOX9. La estructura del plasmido utilizado se muestra en la Figura 12. La sintesis y aislamiento del mRNA a partir del plasmido se realizo mediante el metodo descrito en el ejemplo 1. Para validar la bioactividad de la secuencia de SOX9, se cultivaron celulas U87MG en una placa de cultivo de 24 pocillos y se transfectaron con 1 pg de este mRNA. La expresion de SOX9 en las celulas cultivadas 12 y 24 h despues de la transfection fue validada mediante western-blot tras la extraction de proteinas (anticuerpos anti-SOX9, Santa Cruz Biotech, USA). Las celulas no transfectadas se utilizaron como control negativo (C-) y las celulas transfectadas con el plasmido se utilizaron como control positivo (C+). Los resultados del western blot confirmaron la bioactividad del mRNA sintetizado.
Los andamiajes de fibrina (4 mg/mL) activados con 3DFectIN/mRNA o 3DFectIN/ pDNA (1 pg de mRNA/pDNA, relaciones 2:1 y 3:1) codificando SOX9 se prepararon como se describe en el ejemplo 1, pero antes de anadir la trombina, en lugar de 10 pl de OptiMEM, se anadio el mismo volumen de este medio conteniendo 1.5x105 celulas U87MG. Como control negativo (C-) , se preparo un andamiaje sin mRNA/pDNA ni 3DFectIN por el mismo procedimiento, pero utilizando solo OptiMEM en lugar de la 50 pl de suspension 3DFectIN/mRNA. Despues de la formation del hidrogel, se anadio medio de cultivo completo, y las celulas se cultivaron durante 24 h (37°C, 5% CO2).
La capacidad de los andamiajes activados con mRNA o pDNA para inducir expresion forzada de SOX9 se midio mediante una reaction en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR, C1000 termociclador, Bio-Rad Laboratories, Inc., EE.UU.) , utilizando sondas para los genes SOX9, GAPDH y P-actina (Taqman, Thermo Fisher Scientific, Inc.). La expresion relativa se evaluo utilizando el metodo 2AACt se utilizo para evaluar la expresion relativa, usando GAPDH y P-actina (ACTB) como los genes de referencia. La expresion relativa del control (C) es 1 en todos los graficos, pero no es visible en los graficos debido a la escala requerida para representar el resto de los datos.
El experimento demostro la capacidad de generar una regulation positiva extrema de la expresion de SOX9 con los andamiajes activados con mRNA. La expresion con el 5
andamiaje activado mRNA con una relation 2:1 fue de alrededor de 5000 veces la del control, mientras que la proportion de 3:1 llego a 20000 veces el control. La regulation positiva generada con andamiajes activados con pDNA fue ordenes de magnitud menor que la obtenida con mRNA, aunque significativamente superior al control negativo (Figura 13A).
El mismo experimento se repitio, con un mayor numero de replicados, pero solo para los andamiajes activados con mRNA o pDNA en la relacion 3:1 (Figura 13B). Finalmente, el mismo experimento se repitio para los andamiajes activados con mRNA y pDNA en la relacion 3:1, pero utilizando hMSCs en lugar de las celulas U87MG (misma densidad de sembrado). Los resultados mostraron una sobreexpresion de SOX9 en los andamiajes activados con mRNA 40000 veces superior al control, notablemente mejor que el conseguido con pDNA (Figura 13C).
Ejemplo 7
En este experimento se intento establecer la cinetica de expresion de SOX9 a tiempos cortos tras la transfection de hMSC en andamiajes activados con mRNA o pDNA. Para ello, andamiajes con 2 y 4 mg/mL de fibrina y activados con 1 pg de mRNA o pDNA (relacion 3:1 de 3DFectIN/mRNA o 3DFectIN/pDNA) se prepararon con hMSCs siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 1, pero utilizando mRNA codificante de Sox9 (ver sintesis en ejemplo 7). Los andamiajes se cultivaron durante 48 h en medio completo, a 37°C, con 90% de humedad relativa y 5% de CO2. La expresion genica de SOX9 en las celulas se valoro por qRT-PCR tal como se describe en el ejemplo 6. Los resultados mostraron un comportamiento diferente para andamiajes de 2 y 4 mg/mL de fibrina. La activation con pDNA fue tan eficiente o incluso mas eficiente en algun caso que la activacion con mRNA en los andamiajes con 2 mg/mL de fibrina. Por otra parte, la activacion con mRNA fue claramente mas eficiente en los andamiajes con 4 mg/mL de fibrina (Figura 15).
La cinetica de la expresion del gen parece estar afectada tanto por el polinucleotido utilizado para la activacion, mRNA o pDNA, como por la concentration de fibrina en los andamiajes. Para el mRNA, se alcanzaron valores maximos a las 12 y 24 h despues de la siembra de las celulas, independientemente de las condiciones. Para el pDNA, la expresion fue mas constante, pero se pudo observar un pico a las 24 h para los andamiajes de 2 mg/mL y a las 48 h para los de 4 mg/mL (Figura 14).
Ejemplo 8
En este experimento, se probo la capacidad de los andamiajes activados con mRNA de inducir la diferenciacion celular directa hacia un linaje condrogenico. Andamiajes de fibrina (4 mg/mL) se activaron con mRNA codificante para SOX9 (relacion 3:1) y se sembraron con hMSCs, siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 6. Como referencia, se utilizo un andamiaje sembrado con hMSCs y activado con pDNA (tambien relacion 3:1).
Despues de la formation del andamiaje por reticulation (1 h a 37°C despues de la adicion de la trombina) , se anadio medio de cultivo celular a las placas de cultivo donde fueron colocados los andamiajes. El experimento se realizo cultivando las celulas en los andamiajes en dos medios diferentes: (i) medio condrogenico incompleto (ICM) y (ii) medio condrogenico completo (CCM). El ICM contenia DMEM con alta glucosa (Sigma) , 100 nM de dexametasona, 50 pg/mL de acido ascorbico 2-fosfato, 40 pg /mL de L-prolina, 1% de suplemento Premix ITS (Becton Dickinson) , 1 mM piruvato sodico (Sigma) y 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma). El CCM contenia ICM y 10 ng/mL de TGF-P3 (Peprotech, UK). Los andamiajes se cultivaron durante 21 dias, con 3 cambios de medio a la semana, a 37°C, con un 90% de humedad y 5% de CO2. Despues de 21 dias, se evaluo la expresion de genes marcadores de diferenciacion condrogenica Sox9, agrecano (ACAN) y colageno de tipo II (Col2a1).
Los resultados mostraron que los andamiajes, tanto activados con mRNA como con pDNA, producen cantidades mucho mas grandes que los controles del regulador condrogenico maestro SOX9 despues de 21 dias, independientemente del medio de cultivo (ICM o CCM). Los andamiajes activados con mRNA fueron tambien capaces de inducir la expresion de ACAN en comparacion con los controles en ICM, aunque su efecto parecia ser negativo para este gen en los andamiajes cultivados en CCM (Figura 15).
Tambien se midio la expresion de Col2a1. Sin embargo, debido a que el gen no se detecto en los andamiajes control, no fuimos capaces de utilizar el procedimiento de calculo 2AACt. En su lugar, la Tabla 2 presenta el Ct de Col2a1 y los genes de referencia (GAPDH, ActB) para cada muestra. Es resenable que los andamiajes activados con mRNA fueron el unico tipo de muestra donde el Col2a1 se expreso consistentemente, y que este resultado fue independiente del medio de cultivo empleado (ICM o MCP).
En general, este dato confirma que los andamiajes activados con mRNA pueden inducir por si mismos la diferenciacion de hMSC hacia un linaje condrogenico.
Tabla 2: Valores de Ct de Col2a1 y de los genes de referencia (GAPDH, ActB) expresados por hMSCs cultivadas en ICM o MCP durante 21 dias en andamiajes de fibrina (4 mg/mL) no activados (C-) , activados con 3DFectIN/mRNA (relacion 3:1) o activados con 3DFectIN/pDNA (relacion 3:1). N/D = No detectado.
C-
mRNA 3:1
pDNA 3:1
ICM
Col2a1
ActB
GAPDH
Col2a1
ActB
GAPDH
Col2a1
ActB
GAPDH
N/D
15, 9893
17, 57854
37, 82298
16, 05839
17, 91439
N/D
16, 05839
17, 91439
N/D
15, 95448
17, 54497
39, 31226
16, 09343
17, 98782
N/D
16, 09343
17, 98782
N/D
16, 06559
17, 65261
32, 98505
16, 0598
17, 81497
35, 54242
16, 0598
17, 81497
CCM
N/D
15, 00767
17, 28146
31, 41614
15, 41693
17, 09681
N/D
14, 95397
16, 98424
N/D
14, 99462
17, 26188
29, 41751
15, 44408
17, 28308
N/D
15, 04821
17, 0261
N/D
15, 06974
17, 27417
30, 63256
15, 42
17, 09684
28, 43756
15, 07596
17, 07207
Ejemplo 9
En esta prueba, se repitio el mismo experimento que en el ejemplo 8, pero utilizando andamiajes con dos concentraciones de fibrina (2 mg/mL y 4 mg/mL) , preparadas como en el ejemplo 6. Ademas, en este experimento los marcadores de diferenciacion se analizaron despues de 28 dias de cultivo.
A los 28 dias, Sox9 estaba claramente sobreexpresado en los andamiajes activados con mRNA en comparacion con los controles, y este resultado fue independiente de la concentration de fibrina en el andamiaje (2 mg/mL o 4 mg/mL) y del medio de cultivo (ICM o CCM). A los 28 dias, ACAN tambien estaba sobreexperesado en comparacion con el control en los andamiajes activados con mRNA de 2 mg/mL, y este resultado tambien era independiente del medio de cultivo utilizado. Para los andamiajes de 4 mg/mL, los prototipos activados con mRNA mostraron niveles similares a los controles con ambos medios (Figura 16).
El analisis de la expresion genica Col2a1 solamente se realizo con andamiajes cultivados en CCM. Los resultados confirmaron que los andamiajes activados con mRNA fueron los
unicos capaces de producir la expresion consistente de este gen. En este experimento, todos los andamiajes con 4 mg/mL de fibrina fueron capaces de expresar Col2a1. Sin embargo, solo los andamiajes activados con mRNA mostraron expresion de mRNA en los prototipos con 2 mg/mL de fibrina (Tabla 3). Este dato confirma que los andamiajes 5 activados con mRNA pueden inducir la diferenciacion de hMSC hacia un linaje condrogenico, ya sea por si mismo, o en combination con medios clasicos de diferenciacion con factores de crecimiento.
Tabla 3: Los valores de Ct de Col2a1 y del gen de referencia (GAPDH) expresados por 10 hMSCs cultivadas en CCM durante 28 dias en andamiajes de 2 o 4 mg/mL de fibrina, no activados (C-) , activados con 3DFectIN/mRNA (relation 3:1) , o activados con 3DFectIN/pDNA (relacion 3:1). N/D = No detectado.
C-
RNA 3:1
DNA 3:1
mg/mL
Col2a1
GAPDH
Col2a1
GAPDH
Col2a1
GAPDH
N/D
19, 80034
N/D
19, 96768
N/D
20, 62754
N/D
19, 78157
38, 71413
20, 16157
N/D
20, 70585
N/D
19, 78686
38, 71413
19, 96851
N/D
20, 68075
mg/mL
26, 98096
18, 42884
38, 62078
17, 79144
39, 60755
17, 98131
26, 98096
18, 33812
35, 16769
17, 75767
39, 60755
18, 12178
38, 62078
18, 22016
35, 16769
17, 81862
N/D
18, 13876
