Extracto de maca y procedimiento de obtención de compuestos con actividad antiviral a partir de maca.
Sector de la Técnica La presente invención se refiere a extractos de Lepidium meyenii Walp y/o Lepidium peruvianum Chacón (comúnmente conocida como Maca) que comprenden compuestos ciclicos asimétricos con marcada actividad antiviral y su proceso de obtención. De forma más concreta, se refiere a derivados imidazo tiadiazólicos obtenidos por extracción y posterior aislamiento a partir de polvo de maca, así como a su actividad antiviral.
Estado de la técnica La especie botánica Lepidium meyeniiWalp y/o Lepidium peruvianum Chacón,
comúnmente conocida como maca, pertenece a la familia de las Brasiccaceae (Crucíferas) y es una de las plantas que los Incas domesticaron y cultivaron desde hace más de 2000 años, creciendo exclusivamente en zonas andinas entre 3700, 4000 Y 4500 metros de altitud; se distribuye en los Andes centrales de Perú, Bolivia y noroeste de Argentina. Las partes subterráneas (raíz y/o hipocótilo) de esta planta han sido usadas tradicionalmente en estos países como alimento, para aumentar la resistencia a las duras condiciones de trabajo y como estimulante de la fertilidad en humanos y animales. Los primeros testimonios escritos del uso de la maca se remontan al siglo XVI. La maca cultivada es usada en la actualidad a nivel mundial como suplemento alimentario y también por sus propiedades medicinales tradicionalmente descritas (Rea , J. et al. 1994, Neglected Crops: 1492 from a different perspective. Plant Production and Protection Series No.26. FAO, Rome, Italy 149-163; Hermann M. y Bernet, T. 2009. The transition of maca from neglect to market prominence: Lessons for improving use strategies and market chains of
minor crops. Agricultural Biodiversity and Livehoods. Discussion papers 1, Rome. Biodiversity International.; Dostert N. et al. 2013. Siete plantas vasculares de importancia económica en el Perú: Fichas botánicas. Arnaldoa 20 (2) : 359-432).
La maca se describe morfológicamente como una planta de porte arrosetado,
que presenta una corona de hojas basales que surgen por encima de un eje carnoso en el suelo. El cultivo es bianual y presenta una fase vegetativa en la que se produce el crecimiento y expansión del órgano de reserva y una fase reproductiva, caracterizada por la producción de flores y frutos. En condiciones climáticas favorables (ausencia de heladas y abundante humedad) las plantas pueden completar su ciclo reproductivo en unos seis meses (Brako L. , Zarucchi J.L, 1993. Catalogue of the flowering plants and giymnosperms of Peru. Monogra. Syst.Bot. Missouri Bot. Gar. 45: i-xl, 1-1286).
Actualmente, se proponen métodos de cultivo y de mejora de la especie vegetal 15 Lepidium meyen;; y sus variedades, como el descrito en la patente CN 1 03650886, con el fin de obtener un mayor rendimiento en el proceso.
Asimismo, se conocen métodos de secuenciación e identificación molecular de las distintos ecotipos de Lepidium meyenii (CN 102952878).
Desde los años 90 del siglo XX ha incrementado el interés por esta especie botánica por sus acciones energizantes y afrodisíacas, de modo que existen evidencias experimentales de su uso como suplemento alimenticio, energizante, adaptogénico, estimulante de la fertilidad (W02008012628) ,
acciones en disfunción eréctil (W02011 026500) , osteoporosis, tratamiento de la hiperlipidemia (JP2007314475) , hiperplasia de próstata y dermatológicas (FR2885052, JP2005306768, Gonzales, G.F., 2012, Ethnobiology and Ethnopharmacology of Lepidium meyen;; (Maca) , a plant from the Peruvian Highlands. Evidence-Based Complementar y and Alternative Medicine. eCAM.
2012; 2012:193496; Gonzales, G.F. et al., 2014, Maca (Lepidium meyenii Walp.) a review of its biological properties. Rev. Peru. Med. Exp. Salud Publica, 31 (1) :100-110; Del Valle J. et al., 2014, Antiviral activity of maca (Lepidium
meyenil) against human influenza virus. Asian Pacific Journal of Tropical
Medicine 7 (1) : S415-S420).
El proceso de preparación de la maca es importante para obtener adecuados efectos biológicos. Tradicionalmente la maca se hierve en agua o se extrae en alcohol antes de su uso. En los estudios experimentales, los extractos acuosos de maca solo son efectivos tras hervir en agua las raíces de maca.
Se han obtenido extractos hidroalcohólicos a partir de raíces de Lepidium meyenii (US6, 267, 995) donde se valoran diferentes componentes como isotiocianatos, esteroles, ácidos grasos y macamidas (US6, 428, 824) , procediéndose a la elucidación estructural de estos últimos componentes, los cuales presentan una estructura química de N-benzil-amidas, y reivindicando además su uso en la prevención del cáncer y disfunción sexual (US RE43, 005). Las macamidas pueden ser aisladas y estudiadas mediante cromatografía líquida (KR20090117284). Sin embargo, estas moléculas no han sido aisladas utilizando disolventes orgánicos fuertemente apolares. Otro método de extracción comprende la utilización de fluidos supercríticos (CN 103819570) como dióxido de carbono (CN104087489) , aunque no se obtienen moléculas individuales, sino extractos de Lepidium meyenii.
En el estado de la técnica se encuentra la patente número US7, 473, 434 donde el material vegetal es sometido a una digestión enzimática para obtener extractos peptídicos acuosos sometidos a ultrafiltración y/o purificación. Se reivindica fundamentalmente el extracto peptídico que comprende diferentes aminoácidos, y al que se le adjudica una actividad estimulante de los fibroblastos, por lo que se propone su uso como cosmético. Del mismo modo, como se indica en la patente CN1 03892265, la papaína puede utilizarse como método enzimático obteniendo extractos con vitaminas, aminoácidos, macamidas y similares. Sin embargo, en estos extractos no se identifican moléculas heterocíclicas asimétricas reclamadas en la presente invención.
Con respecto a la presencia de metabolitos secundarios de la especie Lepidium meyenii Wallp se han identificado hasta la fecha nueve tipos de glucosinolatos, la mayoría de tipo aromáticos, de los cuales el más abundante es la glucotropaeolina (Dini Migliuolo, G. et al., 1994. Chemical composition of 5 Lepidium meyenii. Food Chemistr y 49: 347-349; Dini, l., et al., 2002, Glucosinolates from maca (Lepidium meyenÍl). Biochemical Systematic and Ecology 30 : 1087-1090; Li, G., et al., 2001 , Glucosinolate contents in maca (Lepidium peruvianum Chacon) seeds, sprouts, mature plants and several derived commercial products. Economic Botany 55: 255-262; Flores, H.E., et 10 al., 2003, Andean root and tuber crops: Underground rainbows. Hortiscience 38: 161-167).
En la patente JP2008237117 A se describen los usos de los glucosinolatos obtenidos de la maca como aditivos en suplementos nutricionales anti-fatiga, 15 así como su posible uso en el tratamiento de la obesidad (JP2007230987).
La raíz de maca contiene entre un 60 a 75% de hidratos de carbono. Del extracto acuoso de maca se aíslan polisacáridos cuya estructura se elucida y se demuestra su actividad antioxidante (Zha S. et al, 2014, Extraction and
purification and antioxidant activity of the polisaccharides from maca (Lepidium meyenÍl). Carbohydrate Polymers 111 : 584-587).
La fracción esterólica es importante en las raíces de maca, se han aislado fitoesteroles en la maca, especialmente beta-sitosterol (Zheng, B.L. et al., 2000 , 25 Effect of a lipidic extract of Lepidium meyenii on sexual behaviour in mice and rats. Urology 55 (4) : 598-602) y Dini (1994) , atribuyendo a la fracción esterólica beneficio en la reducción del colesterol plasmático y en la prevención de los problemas menopaúsicos, incrementar la fertilidad , así como dotar a la maca de propiedades antiinflamatorias y antioxidantes (Lagarda, M.J. et al., 2006.
Analysis of phytoesterols in foods. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41 : 1486-1496).
Se han aislado macaenos y macamidas, que son ácidos grasos poliinsaturados novedosos (Muhammad, 1. et al., 2002 , Constituents of Lepidium meyenii "maca". Phytochemistr y 59: 105-110; Piacente, S. et al., 2002, Investigation of the tuber constituents of maca (Lepidium meyenii Walp) Journal of Agricultural 5 and Food Chemistr y 50: 5621-5625; Zhao, J. et al., 2005, New alkamides from maca (Lepidium meyenil) Journal of Agricultural and Food Chemistr y 5: 690693; Chain, F.E. et al., 2014, Macamides from wild "Maca", Lepidium meyenii Walpers (Brassicaceae). Phytochemistr y Letters 8: 145-148). Además, Muhammad encontró el derivado 1, 2-dihidro-N-hidroxipiridina llamado 10 macaridina junto con las alcamidas benciladas (macamidas). Hasta el momento se han descrito 19 macamidas responsabilizándose a alguna en concreto de un efecto neuroprotector por un mecanismo indirecto cannabimimético (Hajdu , Z. et al., 2014, Identification of endocannabinoid system-modulating N-Alkylamines from Heliopsis helianthoides var.scabra and 15 Lepidium meyenii. Journal of Natural Products 77: 1663-1669). Once de estas macamidas han sido sintetizadas con el fin de evaluar la inhibición enzimática in vitro de la hidrolasa amida acida (Wu , H. et al., 2013, Macamides and their synthetic analogs: Evaluation of in vitro FAAH inhibition. Bioorganic and Medicinal Chemistr y 21 : 5188-5197). Las alcamidas de la maca son el
resultado de los métodos de conservación realizados en el tratamiento postcosecha (Esparza, E. et al., 2015, Bioactive maca (Lepidium meyenii) alkamides are a result of traditional Andean postharvest dr y ing practices. Phytochemistr y 116: 138-148).
De la maca se aíslan además dos alcaloides imidazólicos (clorhidrato de 1, 3dibencil-4, 5-dimetil imidazol y el clorhidrato de 1, 3-dibencil-2, 4, 5-trimetil imidazol) , conocidos como lepidina A y lepidina B (Boaling, C. et al., 2003 , Imidazole alkaloids from Lepidium meyenii. Journal of Natural Products 66: 1101-1103). Un nuevo alcaloide imidazólico fue aislado e identificado como 2
bencil-3-tioxohexahidro-1 H pirrolo[1 , 2-c]imidazol-1-ona (Rocabado G. et al., 2011 , Aislamiento e identificación de un nuevo alcaloide en Lepidium meyenii Walpers. Biofarbo 19 (1) : 8-14). Se conocen alcaloides derivados del imidazol
obtenidos a partir de Lepidium meyenii, descritos en la patente US6, 878, 731 ,
cuya estructura es totalmente simétrica y con las que se han realizado estudios
con aplicación anticancerígena.
S En el estado de la técnica existen estudios en los que, compuestos de síntesis,
derivados 1, 3, 4 tiodiazólicos, similares o iguales a los obtenidos a partir de
Lepidium meyenii, presentan actividades antimicrobianas, tripanocidas,
antiinflamatorias y antiproliferativas (Matysiak, J. et al, 2006, Synthesis and
antiproliferative activity of N-substitued 2-amino-5- (2, 4-dihydroxyphenyl) -1 , 3, 4
10 thiadiazoles. Biorganic and Medicinal Chemistr y , 14 (13) :4483-4489;
Marganakop, S.B. et al., 2015, Electronic effect of substituents present on
carbonyl compounds: analysis of product formation in one-pot synthesis of 1, 3,
4-thiazole ringo American Chemical Science Journal 8 (1) :1-7; De Monte, C. et
al. , 2015, Synthesis and pharmacological screening of a large librar y of 1, 3, 4
1S thiadiazolines as innovative therapeutic tools for the treatment of prostate
cancer and melanoma. Eur J Med Chem.105:245-62) demostrando una
actividad inhibidora del enzima quinesin Eg5, enzima que juega un papel muy
importante en la división celular (Nakai, R. et al., 2009, K858, a novel inh ibitor
of mitotic kinesin Eg5 and antitumor agent, induces cell death in cancer cells.
20 Cancer Res. 69 (9) :3901 -9; De luliis, F. et al. , 2016, The kinesin Eg5 inhibitor
K858 induces apoptosis but also survivin-related chemoresisteance in breast
cancer cells. Investigational New Drugs 34 (4) :399-406). Los derivados 1, 3, 4
tiodiazólicos de síntesis se postulan como moléculas anticancerígenas en los
documentos W020 15153967 y W02005061707. Sin embargo, en el estado de
2S la técnica no se ha encontrado actividad antiviral en extractos vegetales que
puedan contener este tipo de moléculas.
Respecto a los derivados imidazo tiad iazólicos se han llevado a cabo estudios
con moléculas obtenidas por síntesis con compuestos similares o iguales al
30 compuesto obtenido de Lepidium meyenii presentando actividad antiapoptótica
y modulación de la muerte celular por inhibición de la actividad Jun quinasa a
través de la expresión de proteínas HSP70, y actividad antimicrobiana (Salehi,
A.H. et al., 2005, AEG3482 is an antiapoptotic compound that inhibits Jun kinase activity and cell death through induced expression of heat shock protein 70. Chemistr y and Biology. 13 (2) :213-23; Alagawadi, K.R. et al., 2011 , Synthesis, characterization and antimicrobial activity evaluación of new 2, 45 thiazolidines bearing imidazo[2, 1-b][1 , 3, 4]thiadiazole moiety. Arabian Journal of Chemistr y 4 (4) :465-472; Ebenezer, P.J. et al., 2010, Neuron specific toxicity of oligomeric amyloid-p: role for JUN-kinase and oxidative stress. Journal Alzheimers Disease 22 (3) :839-48; Gallo, KA, 2006, Targeting HSP90 to halt neurodegeneration. Chemistr y and Biology 13 (2) :115-6). Estos derivados imidazo-tiodiazólicos de síntesis se postulan como compuestos para tratar el dolor neuropático en las patentes CA 2584745 A1 , WO 2007087716 y para tratar alteraciones neuronales y enfermedades proliferativas (WO 2004111061) Y como compuestos neuroprotectores (WO 2003051890).
Descripción de la invención El objeto de la invención es un extracto de maca que comprende uno o varios compuestos derivados del 1 , 3, 4-tiadiazol de fórmula A.
(A)
También es objeto de la invención un procedimiento para la obtención del extracto alcohólico de Lepidium meyenii Walp y/o Lepidium peruvianum Chacón a partir del polvo de maca, así como la separación y aislamiento de las diferentes fracciones mediante métodos cromatográficos. Dicho proceso incluye novedosas fases en la extracción y aislamiento de compuestos procedentes de maca ya que habitualmente se utilizan extractos hidroalcohólicos o fluidos supercríticos para este objetivo. El método de extracción utilizado comprende:
a) Primera extracción utilizando de disolvente tipo alcano fuertemente
apolar como primer disolvente. b) Concentración del extracto apolar. c) Suspensión en alcohol primario no mayor de 6 carbonos y obtención del
extracto alcohólico.
Así mismo, la presente invención se refiere también a la obtención de los compuestos de estructura A mediante aislamiento en una etapa posterior a la obtención del extracto:
d) Separación y fraccionamiento por cromatografía de columna.
Los compuestos de estructura A no habían sido obtenidos hasta el momento a partir de especies vegetales. Estos compuestos contienen heterociclos aromáticos asimétricos donde se incluyen moléculas de nitrógeno y azufre,
cuya composición y estructura química ha sido determinada mediante métodos espectroscópicos. La estructura A se utiliza en la presente invención como molécula cabeza de serie o "core" de los compuestos reivindicados.
Se suponen diferentes compuestos a partir de la estructura A mencionada,
donde R1 comprende sustituyentes tales como acetamido, sulfonamido; donde R2 y R3 comprenden sustituyentes tales como protón, metil, etil, propil, isopropil, fenil, oxo; y donde R4 comprende sustituyentes tales como acetilo, 2-aminoetil, 2-aminopropil, 2-amino butil, 2-aminopentanil, 2-amino 3-metilbutil, 2aminofenetil, 2-aminoetenil, 2-amino 1-propenil, 2-amino 1-butenil, 2-amino 1-pentenil, 2-amino 3-metil 1-butenil, 2-amino 2-fenil 1-etenil. Los grupos R2. R3 Y R4 presentan capacidad de ciclación en las condiciones de obtención de los mismos.
Se han aislado y caracterizado compuestos heterocíclicos asimétricos a partir 30 de Lepidium meyenii como:
Compuesto 1: N- (4-acetil-4, 5-dihidro-5-metil-5-fenil-1 , 3, 4-tiadiazol-2-il)
acetamida.
(1)
Compuesto 11: 6-fenilimidazo[2, 1-b]-1 , 3, 4-tiadiazol-2-sulfonamida.
(11) La presente invención también tiene por objeto el uso del extracto y los compuestos aislados de estructura A (y/o combinaciones de ellos y/o sus sales
y/o sus derivados quirados levógiro, dextrógiro y la mezcla racémica) como agentes antivirales.
Finalmente, la invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende el extracto o los compuestos de estructura A aislados a partir 20 del extracto.
Descripción de las figuras Figura 1. Evaluación de la actividad anti-VIH y la citotoxicidad del compuesto I en la línea celular MT-2 infectada con el virus VIH recombinante NL4.3-REnilla.
Figura 2. Evaluación de la actividad anti-VIH y la citotoxicidad del compuesto II en la línea celular MT-2 infectada con el virus VIH recombinante NL4.3-Renilla.
Modo de realización de la invención La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos de su alcance.
Se utiliza como material vegetal, las raíces de Lepidium meyenii Walp y/o Lepidium peruvianum Chacón.
Ejemplo 1: Obtención del extracto de maca.
A partir de dicho material vegetal , se realiza la extracción hasta agotamiento y
el aislamiento de los compuestos del mismo. En el proceso concreto de extracción se utilizan de 10 g a 7000 g de polvo de maca, extraídos mediante soxhlet, utilizando como disolvente n-disolvente tipo alcano fuertemente apolar. Posteriormente el extracto apolar se concentra a presión y temperatura controlada desde 20 a 50°C y es suspendido en alcohol primario no mayor de 6 carbonos a baja temperatura (entre O y 10°C) durante un tiempo entre 12 a 24 horas.
Ejemplo 2: Separación del extracto obtenido en diferentes fracciones El extracto alcohólico se concentra hasta obtener el residuo seco y,
posteriormente, se somete a la separación de sus componentes mediante una cromatografía de columna (columna 1) , utilizando gel de sílice, como fase estacionaria y como fase móvil éter etílico, tolueno y mezclas de ambos en todas sus posibles proporciones, acidificando a saturación con diferentes ácidos como, por ejemplo, ácido acético glacial. Las fracciones obtenidas (1
12) de la columna 1 se reúnen de acuerdo a los resultados de los análisis de las cromatografías de capa fina.
Ejemplo 3: Aislamiento del compuesto 1.
Se procede a una segunda separación de las fracciones 6-9 por cromatografía en columna (columna 2) , utilizando Sephadex como fase estacionaria y como fase móvil un alcohol primario no mayor de 6 carbonos: diclorometano, en una relación hidrofílica. Las fracciones obtenidas (A-J) de la columna 2 se reúnen de acuerdo a los resultados de los análisis de las cromatografías de capa fina. Se procede a una tercera separación de las fracciones D-J por cromatografía de columna (columna 3) , utilizando silica gel como fase estacionaria y como fase móvil éter etílico, tolueno y mezclas de ambos en todas sus posibles proporciones, acidificando a saturación con diferentes ácidos como, por ejemplo, ácido acético glacial. Las fracciones obtenidas (a-h) de la columna 3 fueron reunidas de acuerdo a los resultados de los análisis de las cromatografías de capa fina.
A su vez, las fracciones a-b se reúnen de acuerdo a los resultados de los análisis de las cromatografías de capa fina y se procede a realizar una extracción de sus componentes nitrogenados.
La solución extraída es posteriormente concentrada a presión reducida. Finalmente se procede a realizar una separación del extracto orgánico de los componentes nitrogenados por cromatografía de columna (columna 4) , en fase reversa, utilizando como fase móvil una mezcla de alcohol primario no mayor de 6 carbonos, cloroformo e hidróxido amónico, en diferente gradiente de polaridad. Las fracciones obtenidas (a-v) de la columna 4 se reúnen de acuerdo a los resultados de los análisis de las cromatografías de capa fina. Se aísla de la fracción A un sólido de color blanco, re-cristalizado en alcohol primario no mayor de 6 carbonos, que corresponde al compuesto I
Ejemplo 4: Aislamiento del compuesto 11. Las fracciones 2-4 se reúnen de acuerdo a los resultados de los análisis de las cromatografías de capa fina y se procede a realizar una extracción de sus componentes nitrogenados.
La solución extraída posteriormente se concentra a presión reducida. Se procede a realizar una separación del extracto orgánico de los componentes nitrogenados por cromatografía de columna (columna 5) , utilizando sephadex
como fase estacionaria y como fase móvil un alcohol primario no mayor de 6 carbonos: diclorometano en relación hidrofílica. Las fracciones obtenidas (A'-D') se reúnen de acuerdo a los resultados de los análisis de las cromatografías de capa fina.
Finalmente se procede a realizar una separación de la fracción C' por cromatografía de columna (columna 6) , en fase reversa, utilizando como fase móvil una mezcla de alcohol primario no mayor de 6 carbonos, cloroformo e hidróxido amónico, en diferente gradiente de polaridad. Las fracciones obtenidas (a'-m') se reúnen de acuerdo a los resultados de los análisis de las cromatografías de capa fina. Se aísla de la fracción c' un sólido de color blanco re-cristalizado en alcohol primario no mayor de 6 carbonos, que corresponde al compuesto 11.
Ejemplo 5: Métodos espectroscópicos utilizados. Alcaloides tiopirazólicos se aíslan del extracto alcohólico de Lepidium meyenii Walp. y/o L. peruvianum Chacón, usando las técnicas cromatográficas descritas anteriormente. Estos compuestos son caracterizados por métodos espectroscópicos de IR, RMN-1H, RMN-13C, DEPT, HMBC, HMQC, COSY y EM.
Los espectros de IR se realizan en un espectrofotómetro Perkin-Elmer modelo FT -1725X. Para la obtención de los espectros de RMN-1H y RMN-13C se utiliza un espectrómetro Brucker Advance DRX-700 de 700 MHz, usando como disolvente alcohol primario no mayor de 6 carbonos. Para el análisis químico elemental se emplea un microanalizador de combustión CHNS, modelo Leca 932. Finalmente, para análisis de la Espectrometría de Masas (EM) , se emplea un espectrómetro Hewlett Packard modelo 5930.
Mediante estos métodos, se han aislado y caracterizado compuestos heterocíclicos asimétricos a partir de Lepidium meyenii como:
Compuesto 1: N- (4-acetil-4, 5-dihidro-5-metil-5-fenil-1 , 3, 4-tiadiazol-2
il) acetamida. Compuesto 11: 6-Fenilimidazo[2, 1-b]-1 , 3, 4-tiadiazol-2-sulfonamida.
Ejemplo 6: Elucidación estructural del Compuesto 1: N- (4-acetil-4, 5dihidro-5-metil-5-fenil-1 , 3, 4-tiadiazol-2-il) acetamida.
(1)
En el espectro IR se muestra una banda a 3302, 9 cm-1atribuida a la presencia de un protón asociado una amida secundaria, una banda a 1630, 8 cm-1debida a la existencia de una amida disustituida y otra banda a 1407, 2 cm-1que sugiere un metileno terminal de la molécula. En espectro RMN-1H se observa un singulete a 7, 93 que integra protón de un grupo amino secundario, un doblete a 7.44 dd J =8.4 Hz que corresponden a dos pares de protones aromáticos y un triplete a 7, 38 ttt J= 8, 4 Hz corresponden a dos pares de protones aromáticos. La señal de un triplete a 7, 28 J= 8, 4 Hz indica la presencia de un protón aromático. Se evidencian tres singuletes a 2, 360; 2, 270 Y 2, 100 que indican la presencia de tres grupos metilos. Su espectro DEPT 1350 muestra 3 señales a 128, 74; 129, 53 Y 125, 92 correspondientes a 5 carbonos terciarios aromáticos. El espectro de masa presenta un ion molecular [M+] a 278 mIz con fragmentos significativos debido a la presencia de dos picos a mIz 236, 08 y 229, 21 lo cual nos lleva a identificar el compuesto I como N- (4-acetil-4, 5
dih id ro-5-metil-5-fenil-1 , 3, 4-tiad iazol-2-il) acetamida.
(1) Tabla 1. Asignación de las señales de 13C, 1H del compuesto I
Atomo # 13C (ppm) 1H (ppm)
2 145, 10 -----
5 79, 49 _._---
1 ' 144, 70 -----
2 ' 129.53 7.44 d
6' 129.53 7.44 d 3' 128.75 7.38 d 5' 128.75 7.38 d 4' 125.93 7 , 28 t
CO 171.52 -----CO 171.16 ------CH3 49.12 2.36 s -CH3 49.00 2.27 s -CH3 48.88 2.10 s -NH-R ------7.93 s Ejemplo 7: Elucidación estructural del Compuesto 11: 6-Fenilimidazo[2, 1
b]-1 , 3, 4-tiadiazol-2-sulfonamida.
En el espectro IR se muestran dos bandas a 1375, 7 cm-1y 1291, 5 cm-1debido a la presencia del grupo sulfonamida. En espectro RMN-1H se observa un singulete a 8, 49 que integra para un protón de un carbono terciario cíclico, un doblete a 7.88 dd J = 8.4 Hz que corresponde a dos pares de protones aromáticos, un doblete a 7, 44 dd J= 8, 4 Hz correspondiente a dos pares de protones aromáticos y adicionalmente un triplete a 7, 35 J= 8, 4 Hz que indica la presencia de un protón aromático. Su espectro DEPT 1350 muestra 3 señales a 129, 76; 129, 14 Y 126, 33 correspondientes a 5 carbonos terciarios aromáticos. El espectro de masa presenta un ion molecular [M+] a 281 mIz lo que nos lleva a identificar el compuesto II como 6-Fenil imidazo[2, 1-b]-1 , 3, 4-tiadiazol-2sulfonamida.
(11)
Tabla 2. Asignación de las señales de 13C, 1H del compuesto 11
Atomo # 13C (ppm) 1H (ppm) 6 165.68 -----8 149.04 -----2 147.52 -----
111.55 8.49 s 1' 134, 45 -----3' 129.83 7.44 d 5' 129.83 7.44 d 4 ' 129.21 7, 35 t 2' 126.41 7.88 d 6' 126.41 7.88 d
Ejemplo 8: Derivados de la estructura A.
Así pues, la estructura principal reivindicada en la presente invención corresponde a la estructura A, un tiopirazol sustituido donde, en ciertos casos, los propios sustituyentes presentan capacidad de cielación. De este modo, se supone la obtención de los compuestos I y 11 a partir de extractos vegetales, así como de otros posibles derivados (tabla 3) que se reivindican a continuación. Algunos de estos compuestos han sido obtenidos mediante ha indicado en los antecedentes, pero nunca hasta (A)
La estructura A presenta 4 radicales o sustituyentes R, donde R1 comprende sustituyentes tales como acetamido, sulfonamido; R2 comprende sustituyentes tales como protón, metil , etil, propil, isopropil, fenil, oxo; R3 comprende sustituyentes tales como protón, metil , etil, propil, isopropil, fenil, oxo; y R4 comprende sustituyentes tales como acetilo, 2-amino etil, 2-amino propil, 2amino butil, 2-amino pentanil, 2-amino 3-metil butil, 2-amino fenetil, 2-amino etenil, 2-amino 1-propenil, 2-amino 1-butenil, 2-amino 1-pentenil, 2-amino 3-metil 1-butenil, 2-amino 2-fenil 1-etenil.
lO Para el compuesto 1, la estructura A presenta R1 acetamido, R2 fen ilo, R3 metilo y R4 acetilo (compuesto 15 de la tabla 3).
Tabla 3 Posibles sustituyentes de la estructura A.
R1:-NHCOCH3 R2:-H R3:-H R4:-COCH3 2 R1:-NHCOCH3 R2:-CH3 R3:-CH3 R4 :-COCH3 3 R1:-NHCOCH3 R2:-CH3 R3:-H R4 :-COCH3 4 R1:-NHCOCH3 R2:-C2Hs R3:-C2Hs R4 :-COCH3 5 R1:-NHCOCH3 R2:-C2Hs R3:-H R4 :-COCH3 6 R1:-NHCOCH3 R2:-C3H7 R3:-C3H7 R4 :-COCH3 7 R1:-NHCOCH3 R2:-C3H7 R3:-H R4 :-COCH3 8 R1:-NHCOCH3 R4 :-COCH3
R2: -\ R3: -\ 9 R1:-NHCOCH3 R3:-H R4 :-COCH3
R2: -\ R1:-NHCOCH3 R4 :-COCH3
- O-R3: -O
R2: 11 R1:-NHCOCH3 R3:-H R4 :-COCH3
-O
R2: 12 R1:-NHCOCH3 R2:-C2Hs R3:-CH3 R4:-COCH3 13 R1:-NHCOCH3 R2:-C3H7 R3:-CH3 R4:-COCH3 14 R1:-NHCOCH3 R3:-CH3 R4:-COCH3
R2: -\ 15 R1:-NHCOCH3 R3:-CH3 R4:-COCH3
R2: -O
-
16 R1:-NHCOCH3 R2:-C3H7 R3:-C2Hs R4:-COCH3
17 R1:-NHCOCH3 R2: --\ R3: -C2Hs R4:-COCH3
18 R1:-NHCOCH3 -OR2: - R3: -C2Hs R4:-COCH3
19 R1:-NHCOCH3 R2: --\ R3:-C3H7 R4:-COCH3
20 R1:-NHCOCH3 R2: -O- R3: -C3H7 R4:-COCH3
21 R1:-NHCOCH3 R2: --\ R3: -O- R4:-COCH3
22 R1:-S02NH2 R2Y R3: =0 ) R4: H2N
23 R1:-S02NH2 R2y R3: =0 >-R4: H2 N
24 R, :-S02NH2 R2Y R3: =0 }-I R4: H2N
25 R, :-S02NH2 R2yR3: =0 ~
R4: H2N
26 R1:-S02NH2 R2Y R3: =0 >-<R4: H2N
27 R1:-S02NH2 R2y R3: =0 ~
R4: H2N
28 R1:-S02NH2 R2y R3: =0 ~
R4: H2N
29 R1:-S02NH2 R2Y R3: =0 ~
R4: H2N
30 R1:-S02NH2 R2y R3: =0 -y R4: H2 N
31 R1:-S02NH2 R2Y R3: =0 ~
R4: H2N
32 R, :-S02NH2 R2Y R3: =0 ~
R4: H2N
33 R1:-S02NH2 R2Y R3: =0 ~
R4: H2N
En el caso del compuesto 11 los sustituyentes, el grupo R1 es sulfonamido R2,
R3 Y R4 se encuentran formando un ciclo.
Ejemplo 8: Actividad farmacológica.
Se ensaya la actividad anti-VIH-1 y la citotoxicidad de los extractos y compuestos aislados obtenidos. La evaluación de la actividad antiviral se realiza mediante la infección de células MT-2 con virus VIH recombinantes portadores de genes indicadores renilla-Iuciferasa NL4.3-Renilla EP1752541.
Tabla 4. Actividad anti-VIH y citotoxicidad del extracto apolar y compuestos aislados de L. meyen;; Concentración % IJg/ml infección % viabilidad Extracto apolar 50 ~g/ml 36% 94%
Extractos (LMO) 54% 95%
IJg/ml CI50 IJM CC50 IJM 15 Compuestos Compuesto I 1, 4 >100 >72, 0 aislados Compuesto" 55, 7 >100 >1 , 8 IS: Indice de especificidad. Clso y CCso: Concentración Inhibitoria 50%, Concentración citotóxica 50%
El extracto apolar inhibe en elevado porcentaje la replicación viral sin mostrar
toxicidad a las concentraciones ensayadas. Las fracciones obtenidas son todas activas. Los compuestos denominados compuesto I y compuesto 11 , son capaces de inhibir la replicación viral con concentraciones inhibitorias 50 (CI50)
de 1, 4 ~lM Y 55, 7 ) lM Y sin mostrar toxicidad (CC50 > 100 ) lM).
Se comprueba la evaluación de la actividad anti-VIH y la citotoxicidad del compuesto I en la línea celular MT-2 infectada con el virus VIH recombinante NL4.3-Renilla. (Figura 1). El compuesto denominado compuesto I presenta una capacidad de inhibición de la replicación viral a concentraciones inhibitorias 50
(CI50) igual a 1 , 4 ~lM Y no muestra toxicidad ya que su concentración citotóxica 50 es mayor a 100 (CC50 > 100 flM). Su índice de especificidad IS es mayor de 72. (Figura 1).
Se evalúa la actividad anti-VIH y la citotoxicidad del compuesto 11 en la línea celular MT-2 infectada con el virus VIH recombinante NL4.3-Renilla. [FIG.7].
El compuesto denominado compuesto 11 presenta una capacidad de inhibición de la replicación viral a concentraciones inhibitorias 50 (CI50) igual a 55, 7 J.!M Y no muestra toxicidad ya que su concentración citotóxica 50 es mayor a 100 (CC50 > 100 J.!M). Su índice de especificidad IS es mayor de 1, 8. (Figura 2).
Así pues, las ventajas y el valor innovador de esta invención radican en:
• La identificación de nuevas actividades farmacológicas antivirales con grandes posibilidades terapéuticas, muy alejadas de los usos medicinales tradicionales, a partir de Lepidium meyenii, planta cultivada y utilizada en alimentación por los pueblos andinos.
• La actividad radica en extractos altamente apolares, que no habían sido 15 obtenidos hasta el momento de la presente invención.
• Los compuestos químicos aislados, derivados de un núcleo tiopirazol Figura1 , contienen el átomo de azufre dentro del anillo y la disposición de los nitrógenos es totalmente novedosa respecto a otras moléculas previamente aisladas de L. meyenii.
• El método de extracción utilizado, se basa en solubilización de los principios activos en un disolvente altamente apolar.
La purificación del extracto apolar implica fases de concentración , suspensión y separaciones por cromatografía en columna.
