Bacterial strain of pseudonocardia carboxydivorans producer of branimycins and branimycins produced by the same (Machine-translation by Google Translate, not legally binding*)

Abstract

Bacterial strain of pseudonocardia carboxydivorans producer of branimycins and branimycins produced by it.

The invention provides a new bacterial strain of pseudonocardia carboxydivorans that has been isolated from its natural environment and deposited in the spanish collection of type cultures under the accession number 9108, which is able to efficiently produce by fermentation antibiotic compounds of the family of the branimicines. Specifically, this strain is the producer of two new branimicines, designated in the present invention as branimicins b and c, which present antibiotic or antibacterial activity in vitro and in vivo against pathogenic bacteria, preferably human, both gram positive and gram negative, preferably resistant. To the antibiotics of habitual use.

Description

ES-2585929_B1

Cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans productora de branimicinas y branimicinas producidas por la misma.

5

La presente invención se encuadra dentro del campo de la microbiología clínica, específicamente dentro de las cepas bacterianas productoras de antibióticos macrólidos de la familia de las branimicinas. La invención también se refiere a las branimicinas producidas y a composiciones farmacéuticas que las comprenden, las cuales son útiles para el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas provocadas por bacterias 10 patógenas, preferiblemente por bacterias patógenas humanas, más preferiblemente resistentes a antibióticos.

Estado de la técnica

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Las branimicinas son nuevos antibióticos que estructuralmente pertenecen a la familia de antibióticos macrólidos conocidos como nargenicinas, con actividad antimicrobiana principalmente contra Staphylococcus aureus. Las nargenicinas, y branimicinas, tienen una estructura tricíclica con un anillo lactona de 9 o 10 miembros y contienen un único puente éter. En 1977, la familia de antibióticos nargenicina fue aislada por Pfizer y Upjohn 20 tras la fermentación aeróbica de Nocardia argentinensis ATCC 31306. Uno de estos compuestos, nargenicina A1, fue posteriormente patentado y su estructura fue elucidada (W. D. Celmer, et al., 1980, J. Am. Chem. Soc. 102: 4203-4209). Aunque se demostró su actividad antibacteriana in vitro, esta se restringía a bacterias Gram-positivas de la especie Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) También se demostró 25 que la nargenicina A1 induce diferenciación celular y puede ser usada, por tanto, como posible tratamiento en enfermedades neoplásicas.

La primera branimicina fue aislada del Actinomycete GW 60/1571, según ha sido descrito en Org Lett. 2016 Feb 19; 18 (4) :780-3. doi: 10.1021/acs.orglett.6b00044.. Desde 30 entonces, ha habido un gran interés en esta nueva molécula y han sido desarrolladas varias síntesis orgánicas de la misma (Marchat et al., 2010, Angew Chemie lnt Ed Engl. 49: 2050-2053; Enev et al., 2012, Che m Eur J 18: 9651-9668). Recientemente, ha sido descrita la síntesis química de miembros adicionales de la familia (WO2015028095A1) , demostrando distintas actividades antibióticas contra Bacillus subtilis, Staphylococcus 35 aureus, Escherichia coli y Streptomyces viridochromogenes. Dicho trabajo también describe la actividad antibiótica que presentan las branimicinas in vivo en modelos de infección animal, lo que demuestra su eficacia en el tratamiento de infecciones in vivo particularmente por vía oral.

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Los ambientes marinos están emergiendo como una fuente de nuevos productos naturales de importancia farmacológica. Los océanos constituyen más del 70% de la superficie de nuestro planeta, de los cuales el 92-93% son profundidades marinas, mientras que la región costera representa solamente un 7-8%. En las profundidades marinas, se estima que el 60% es agua de más de 2000 m de profundidad. Se trata de un 45 ambiente extremo con alta presión, baja temperatura, oscuridad, alta salinidad y baja concentración de oxígeno. A pesar de ello, las profundidades marinas se han revelado como una fuente que merece ser investigada para el descubrimiento de nuevos antibióticos (Bull et al., 2000, Microbiology and Molecular Biology Reviews 64: 573-606). Los hábitats de aguas profundas son, por tanto, fuentes de descubrimiento de productos 50 naturales esencialmente inexploradas.

Trabajos anteriores en el mar Cantábrico (Bahía de Vizcaya) , Atlántico Noreste, han revelado que actinobacterias bioactivas, principalmente especies de Streptomyces, están asociadas a corales y otros invertebrados que viven hasta a 4700 m de profundidad en el cañón submarino de Avilés (Braña et al., 2015, Microb Ecol 69: 512-524; Sarmiento-Vizcaíno et al., 2015, lnt J Syst Evol Microbiol 65: 1328-1334). Una nueva actinobacteria, 5 Myceligenerans cantabricum, se ha aislado de un coral solitario (escleractinia) en aguas de 1500 m de profundidad (Sarmiento-Vizcaíno et al., 2015, lnt J Syst Evol Microbiol 65: 1328-1334).

En resumen, debido a la creciente aparición en el ámbito clínico de bacterias patógenas 10 resistentes a los antibióticos de uso actual, se hace necesaria la obtención de nuevos antibióticos con potencial biomédico en el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas provocadas por bacterias patógenas tanto Gram positivas como Gram negativas. Asimismo, es necesario disponer de procedimientos simples, cortos y económicos para la obtención de dichos compuestos con actividad antibacteriana. 15

Descripción de la invención

La presente invención proporciona una nueva cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans que ha sido aislada de su medio natural y depositada en la Colección 20 Española de Cultivos Tipo bajo el número de acceso 9108, la cual es capaz de producir eficientemente por fermentación compuestos antibióticos de la familia de las branimicinas. Concretamente, esta cepa es productora de dos nuevas branimicinas, designadas en la presente invención como branimicinas B y C, que presentan actividad antibiótica o antibacteriana in vitro e in vivo frente a bacterias patógenas, preferiblemente 25 humanas, tanto Gram positivas como Gram negativas.

Los inventores de la presente invención han aislado dicha cepa de actinobacterias, Pseudonocardia carboxydivorans M-227, de los ecosistemas de arrecifes de coral desde el cañón submarino de Avilés. Dicha cepa fue aislada a 3.000 m de profundidad en la 30 columna de agua y fue estudiada e identificada posteriormente. Se describe por tanto en la presente invención dicha cepa, un procedimiento para obtener branimicinas por fermentación a partir de la misma y dos nuevos antibióticos de la familia de las branimicinas con actividad antibacteriana contra bacterias patógenas clínicas, tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Estos nuevos compuestos presentan actividad 35 antibiótica in vivo frente a bacterias Gram-negativas, como por ejemplo aunque sin limitarnos, los patógenos Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Bacteroides fragilis y Escherichia coli; y bacterias Gram-positivas, por ejemplo pero sin limitarnos, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Cor y nebacterium urealyticum, Clostridium perfringens y Enterococcus faecalis. 40

Los inventores determinaron las condiciones de cultivo de la cepa para la producción de dichas nuevas branimicinas, posteriormente purificaron las mismas, procedieron a su elucidación estructural y testaron su actividad antibiótica frente a una variedad de patógenos clínicos tanto Gram-negativos como Gram-positivos, algunos de tos cuales 45 presentaban multiresistencias frente a antibióticos de uso habitual.

La presente invención representa así una solución a la necesidad de disponer de nuevos compuestos antibióticos con potencial biomédico en el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas provocadas por bacterias patógenas tanto Gram positivas 50 como Gram negativas resistentes a los antibióticos de uso actual. Asimismo, representa una solución a la necesidad de disponer de procedimientos simples, cortos y económicos para la obtención de dichos compuestos con actividad antibacteriana, ya que el procedimiento descrito en la presente invención permite producir los citados antibióticos por fermentación con una actinobacteria en lugar de por síntesis química, proceso más complejo, largo y costoso. En este sentido, en procesos biotecnológicos que implican la 5 obtención de productos naturales estructuralmente complejos, como es el caso de las branimicinas, la producción por fermentación mediante el microorganismo productor es el procedimiento preferido, ya que es mas sencillo, más corto y más económico que el procedimiento de síntesis orgánica.

10

Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans M-227 depositada el 8 de marzo de 2016 en la Colección Española de Cultivo Tipo bajo el número de acceso 9108. De ahora en adelante se hará referencia a esta cepa bacteriana como "cepa de la invención" o "cepa bacteriana de la invención". 15

Otro aspecto de la invención se refiere a un sobrenadante o extracto de un cultivo de la cepa bacteriana de la invención. A este sobrenadante se hará referencia como "sobrenadante de la invención", y comprende al menos un compuesto de fórmula general (I) : 20

25

o cualquiera de sus sales,

donde: R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

El sobrenadante de la invención que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) 30 puede obtenerse mediante el cultivo de la cepa de la invención en presencia de un medio de cultivo adecuado y en condiciones de fermentación. Dichas condiciones de fermentación y dicho medio de cultivo son, preferiblemente, los que se describen más adelante en el procedimiento de la invención. Posteriormente, se puede proceder a la centrifugación de dicho cultivo bacteriano, mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia para tal fin, y a la eliminación de los sedimentos depositados como consecuencia de este paso de centrifugación, obteniéndose así el sobrenadante de la invención que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) y otros metabolitos producidos y secretados por la cepa de la invención en cultivo. 5

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa bacteriana de la invención para la producción de compuestos de fórmula general (I) :

10

o cualquiera de sus sales,

15

donde R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un compuesto de fórmula general (I) descrito anteriormente, de ahora en adelante "procedimiento de la invención", que comprende: 20

a. Cultivar la cepa bacteriana de la invención en un medio de cultivo en condiciones de fermentación, y

b. Purificar el compuesto de fórmula general (I) producido por la cepa en cultivo de la 25 etapa (a).

El cultivo de la etapa (a) del procedimiento de la invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, aunque sin limitarnos, inoculando la cepa o esporas de la cepa en un medio de cultivo apropiado. Los expertos en la materia reconocerán los medios de cultivo 30 bacterianos que pueden ser empleados en esta etapa del procedimiento de la invención. El "medio de cultivo" es un medio nutritivo adecuado, es decir, que comprende los nutrientes necesarios para el mantenimiento y crecimiento in vitro de la cepa de la invención, para el desarrollo de su actividad fermentadora y, por tanto, para la producción de los compuestos de fórmula (I) descritos anteriormente. Dicho medio de cultivo puede 35 ser líquido, sólido o semisólido. Para que la cepa de la invención crezca adecuadamente en el medio de cultivo, éste debe reunir una serie de condiciones como son temperatura, agitación, grado de humedad, luz/oscuridad y presión de oxigeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad (pH). Asimismo, el medio de cultivo debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

5

Así, el cultivo de la etapa (a) tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende, por ejemplo aunque sin limitarnos, agar o gelatina o albúmina, fuentes de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa o manitol) , fuentes de nitrógeno (por ejemplo, peptonas) , azufre, fósforo, fuentes de vitaminas, aminoácidos y hormonas y/o factores de crecimiento (por ejemplo, extracto de carne o extracto de levadura) , MOPS, sales 10 inorgánicas (por ejemplo, calcio en forma de CaCI2, magnesio, manganeso, sodio o potasio) , iones de hidrógeno, etc. En una realización preferida, el medio de cultivo empleado en el procedimiento de la invención es un medio de cultivo que comprende nutrientes y propiedades físico-químicas similares a las del medio marino, más preferiblemente el medio es RSA marino. 15

La cepa de la invención se puede cultivar, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante cultivo en matraz con agitación, y fermentación a pequeña o a gran escala (que incluye las fermentaciones continua, discontinua o batch, de alimentación discontinua o feed-batch, o en estado sólido) llevada a cabo en un biorreactor de laboratorio o industrial en 20 un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar los compuestos de fórmula (I) descritos anteriormente. Los compuestos de la invención se secretan, junto con otros metabolitos o compuestos, en el medio nutritivo, y éstos se pueden recuperar directamente del medio.

25

El experto en la materia reconocerá las condiciones de fermentación adecuadas para ser aplicadas en el paso (a) del procedimiento de la invención Preferiblemente, dichas condiciones comprenden la incubación en agitación, mas preferiblemente en agitador orbital, del cultivo de la invención durante entre 2 y 10 días, preferiblemente entre 3 y 7 días, más preferiblemente durante 4 días: a una temperatura esencialmente constante de 30 entre 25 y 30ºC, preferiblemente entre 27 y 29ºC, más preferiblemente a 28ºC; a entre 200 y 300 rpm, preferiblemente entre 250 y 270 rpm, más preferiblemente a 250 rpm y a un pH constante de entre 6 y 7.5, preferiblemente de entre 6 y 7, más preferiblemente a 6.7.

35

Tras el cultivo de la etapa (a) del procedimiento de la invención, puede tener lugar un paso adicional de centrifugación tras el cual se descartan los sedimentos y se seleccionan los sobrenadantes, obteniendo así el sobrenadante de la invención. Dichos sobrenadantes pueden ser posteriormente filtrados en el paso (b) del procedimiento de la invención y se pueden someter a continuación a un procedimiento de extracción, como 40 por ejemplo aunque sin limitarnos, a extracción en fase sólida, con el fin de eluir los compuestos de la invención presentes en los mismos.

Los compuestos de la invención secretados al medio de cultivo por la cepa de la invención pueden recuperarse del medio empleando procedimientos conocidos en la 45 técnica. Por ejemplo, mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitación, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación y/o precipitación.

Los compuestos de la invención producidos por la cepa en cultivo pueden purificarse 50 mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, cromatografía (por ejemplo, HPLC, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica cromatoenfoque, y exclusión molecular) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato amónico). SDS-PAGE, precipitación o extracción, con el fin de obtener uno o varios compuestos de la invención sustancialmente puros. 5

Los compuestos de la invención producidos por la cepa en cultivo pueden detectarse usando procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos de detección pueden incluir, por ejemplo aunque sin limitarnos, UPLC, UV, RMN, espectrometría de masas, o similares. 10

Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) o a cualquiera de sus sales (a partir de ahora "compuesto de fórmula (I) de la invención") :

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donde R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

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Cuando R1 es -CH3 el compuesto es la branimicina B y cuando R1 es -CH2OCH3 el compuesto es la branimicina C.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante "composición de la invención", que comprende la cepa de la invención, el sobrenadante 25 de la invención o el compuesto de fórmula (I) de la invención. Dicha composición puede ser una composición farmacéutica o cosmética, que comprende la cepa de la invención, el sobrenadante de la invención o el compuesto de fórmula (I) de la invención, y un excipiente o vehículo farmacéutica o cosméticamente aceptable. Preferiblemente, la composición de la invención comprende la cepa de la invención, el sobrenadante de la 30

invención o el compuesto de fórmula (I) de la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva.

Se entiende por "cantidad terapéuticamente efectiva" la cantidad de cepa de la invención, sobrenadante de la invención o compuesto de la invención, que cuando se administra al 5 sujeto para tratar y/o prevenir una infección bacteriana produce el efecto deseado. Dicho efecto deseado puede ser, por ejemplo aunque sin limitarnos, eliminar o reducir el número de bacterias causantes de la infección La cantidad terapéuticamente efectiva puede variar dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo pero sin limitarnos, del tipo de infección y su severidad, así como de la edad, peso, sexo, condición física, 10 capacidad de respuesta o tolerancia, etc., del individuo al que le va a ser administrada la composición de la invención.

Los excipientes y vehículos farmacéutica o cosméticamente aceptables que pueden ser utilizados en la composición de la invención son los conocidos por los expertos en la 15 materia.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia. Así pues, los 20 excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio bibásico, la 25 función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El "vehículo farmacéuticamente aceptable", al igual que el excipiente, es una sustancia o combinación de sustancias que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los 30 componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se debe administrar la composición de la invención; obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con dicha composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser, aunque sin limitarnos, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. Ejemplos de 35 vehículos son, aunque sin limitarnos, agua, aceites o surfactantes, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como por ejemplo, y sin sentido limitativo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, aceites de ricino, polisorbatos, ésteres de sorbitano, éter sulfatos, sulfatos, betaínas, glucósidos, maltósidos, alcoholes grasos, nonoxinoles, poloxámeros, polioxietilenos, 40 polietilenglicoles, dextrosa, glicerol, digitonina y similares. El vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos comprendidos en la composición de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición Cuando la 45 forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente.

La composición de la presente invención puede formularse para su administración a un animal, preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas 50 conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, barras, lápices, vaporizadores, aerosoles, etc.) , semisólida (ungüento, crema, pomada, gel, hidrogel, espuma, loción, jabón, jalea, gelatina, etc.) o líquida (soluciones acuosas o no acuosas, soluciones hidroalcohólicas o hidroglicólicas, suspensiones, emulsiones, jarabes, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, 5 linimentos, sueros, etc.) para administración oral, tópica o parenteral. La composición de la presente invención también puede estar en forma de formulaciones de liberación sostenida o de cualquier otro sistema convencional de liberación. El término "liberación sostenida" se utiliza en sentido convencional refiriéndose a un sistema de vehiculización de un compuesto que proporciona la liberación gradual de dicho compuesto durante un 10 periodo de tiempo y preferiblemente, aunque no necesariamente, con niveles de liberación del compuesto relativamente constantes a lo largo de un periodo de tiempo. Ejemplos ilustrativos de vehículos o sistemas de liberación sostenida incluyen, aunque no se limitan a, liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas 15 mixtas de tensioactivos, micelas mixtas fosfolípidotensioactivo, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartículas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas, nanopartículas sólidas lipídicas, soportes lipídicos nanoestructurados, materiales poliméricos, parches o implantes biodegradables o no biodegradables, o micropartículas biodegradables, como por ejemplo, microesferas 20 biodegradables.

Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, 25 intralesional, intraarterial, intracardíaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, cutánea o subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, oftalmológica u ocular, mediante parches transdérmicos o vía rectal o vaginal, mediante la administración de un supositorio o encapsulado, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter. 30

Las composiciones de la presente invención son aptas para su aplicación mediante dispositivos médicos que permitan la liberación del principio activo en concentraciones adecuadas para el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas. Estos dispositivos deben ser, preferiblemente, adecuados para la administración del principio 35 activo de forma local, permitiendo que el tratamiento actúe en la zona afectada y no se disperse. Los dispositivos pueden, por ejemplo, pero sin limitarse, llevar el principio activo en su interior o ir recubiertos con el mismo.

En una realización preferida, la composición de la invención, preferiblemente 40 farmacéutica o cosmética, además comprende otro agente antibacteriano y/o antifúngico, más preferiblemente dicho agente antibacteriano es otro antibiótico.

Se entiende por "agente antibacteriano" una sustancia química, producida de forma sintética o natural (sintetizada por ejemplo por hongos o bacterias) , que inhibe el 45 crecimiento (bacteriostático) o mata (bactericida) a las bacterias. El agente antibacteriano puede ser, por ejemplo aunque sin limitarnos, un antibiótico, un inhibidor de la bomba de eflujo o un agente permeabilizante de la membrana bacteriana.

Los antibióticos a los que se refiere la presente invención son compuestos que, 50 preferiblemente, no comprometen la viabilidad y supervivencia de la cepa de la invención.

Ejemplos de antibióticos que pueden incluirse en la composición de la invención son, aunque sin limitarnos, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, paromomicina, geldanamicina, herbimicina, loracarbef, ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatin, meropenem, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefalexina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima, cefixima, 5 cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepime, ceftobiprole, teicoplanin, vancomicina, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espectinomicina, aztreonam, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina, 10 piperacilina, ticarcilina, bacitracina, colistina, ciprofloxacino, enoxacino, gatifloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, norfloxacino, ofloxacin, trovafloxacino, grepafloxacino, sparfloxacino, temafloxacino, mafenide, sulfonamidocrisoidina, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfametizol, sulfanilimidae, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol (co-trimoxazol) , demeclociclina, doxiciclina, 15 minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, arsfenamina, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, etambutol, fosfomicina, ácidofusídico, furazolidona, isoniacida, linezolida, metronidazol, mupirocina, nitrofurantoina, platensimicina, pirazinamida, quinupristin/ dalfopristin, rifampicina, tiamfenicol, tinidazol, dapsona y clofazimina, así como otras nargenicinas, incluyendo branimicinas distintas a las descritas en la presente invención. 20

La composición de la presente invención puede incluir alternativa o adicionalmente un agente antifúngico o antimicótico, dicho agente antifúngico puede ser un fungicida o un fungistático.

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El uso de la cepa de la invención, del sobrenadante de la invención, del compuesto de fórmula (I) de la invención o de la composición de la invención en combinación con otros agentes antibacterianos es una estrategia interesante en la prevención y/o tratamiento de infecciones bacterianas, preferiblemente de enfermedades de origen infeccioso provocadas por bacterias patógenas resistentes o multi-resistentes, y en la inhibición de 30 la formación de biopelículas bacterianas sobre cualquier superficie.

Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso del sobrenadante de la invención, del compuesto de fórmula (I) de la invención o de la composición, preferiblemente farmacéutica, de la invención para la elaboración de un medicamento. Alternativamente, 35 este aspecto de la invención se refiere al sobrenadante de la invención, el compuesto de fórmula (I) de la invención o la composición de la invención para su uso como medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del sobrenadante de la invención, del 40 compuesto de fórmula (I) de la invención o de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas Alternativamente, este aspecto de la invención se refiere al sobrenadante de la invención, el compuesto de fórmula (I) de la invención o la composición de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas. 45

Las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invención son provocadas por una o más bacterias Gram negativas o Gram positivas, o por ambas conjuntamente. En una realización más preferida, las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invención son provocadas por una o más bacterias de los géneros seleccionados de 50 Clostridium, Cor y nebacterium, Enterococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Bacteroides, Escherichia, Haemophilus o Neisseria. En una realización aún más preferida, las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invención son provocadas por una o más bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Cor y nebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria 5 meningitidis. En una realización aún más preferida, la bacteria es Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, las bacterias a las que se refiere la presente invención son bacterias resistentes, más preferiblemente multiresistentes, a uno o más antibióticos.

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Como ejemplos de bacterias resistentes a antibióticos, se encuentran aquellas cepas resistentes a aminoglicósidos, carbapenemas, cefalosporinas, glicopéptidos, lincosamidas, lipopéptido, macrólidos, monobactámico, nitrofuranos, oxazolidononas, penicilinas, quinolonas, sulfonamidas, ácido fusídico, ácido pseudomónico, rifamicinas, lipoglicopéptidos, novobiocina y/o tetraciclinas, entre otros. Más preferiblemente, las 15 bacterias a las que se refiere la presente invención son bacterias resistentes a al menos un antibiótico seleccionado de la lista que consiste en: amikacina, amoxicilina, ampicilina, capreomicina, ciprofloxacina, ácido clavulánico, clindamicina, cotrimoxazol, etambutol, eritromicina, fosfomicina, isoniazida, kanamicina, nitrofurantoina, quinolonas, rifampicina, estreptomicina y/o tetraciclina. 20

En una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B y la bacteria es Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B o C y la 25 bacteria es Cor y nebacterium urealyticum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis y/o Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina 8 y la bacteria es Haemophilus influenzae, Escherichia coli y/o Bacteroides fragilis. 30

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina e y la bacteria es Enterococcus faecalis y/o Staphylococcus aureus.

En otra realización preferida, el medicamento al que se refiere la presente invención es 35 para el tratamiento y/o prevención de enfermedades infecciosas bacterianas o enfermedades provocadas por infecciones bacterianas. Más preferiblemente, dichas enfermedades se seleccionan de la lista que consiste en: enteritis necrótica, gangrena gaseosa, infecciones del tracto genitourinario (tales como cistitis, uretritis, prostatitis, pielonefritis, epididimitis) , infecciones cutáneas (tales como impétigo, foliculitis, celulitis, 40 abscesos, infección de heridas) , osteomielitis, mastitis, faringoamigdalitis, conjuntivitis, epiglotitis, otitis, meningitis, meningococemia, bacteriemia, sepsis, endocarditis, infecciones del tracto respiratorio (tales como neumonía o sinusitis) , infecciones intraabdominales (colecistitis, peritonitis, abscesos viscerales) , así como infecciones nosocomiales. 45

El termino "medicamento", tal y como se usa en esta invención, hace referencia a cualquier sustancia usada para la prevención, alivio, tratamiento o curación de infecciones en el hombre, o cualquier otro animal, y plantas. En el contexto de la presente invención, este término se refiere a una preparación que comprenda el sobrenadante de 50 la invención, el compuesto de fórmula (I) de la invención o la composición de la invención.

El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones 5 fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo 10 una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario, incluyendo, pero sin limitarse, a las premezclas medicamentosas. Se entiende por "premezcla medicamentosa" o "premezcla para alimentos medicamentosos", todo medicamento veterinario preparado de antemano con vistas a la fabricación ulterior de alimentos medicamentosos. Se entiende por "alimento medicamentoso" toda mezcla de 15 medicamento (s) veterinario (s) y de alimento (s) preparada previamente a su comercialización y destinada a ser administrada a los animales sin transformación, en razón de las propiedades curativas o preventivas o de otras propiedades del medicamento.

20

Los medicamentos de la invención pueden utilizarse tanto solos como en combinación con otros medicamentos o composiciones para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas. Así, los medicamentos de la presente invención pueden ser empleados junto a otros principios activos o terapias a modo de terapia combinada. Los otros principios activos pueden formar parte de la misma composición o bien pueden ser proporcionados 25 mediante una composición distinta, siendo administrados al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la infección, enfermedad o 30 condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la infección, enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;

35

(ii) aliviar la infección, enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la infección, enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la infección, enfermedad o la condición patológica.

40

El término "prevención", tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de la infección o enfermedad infecciosa o biopelícula bacteriana, es decir, evitar la aparición de una biopelícula en una superficie o evitar que se produzca la infección o la enfermedad infecciosa en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) , en particular cuando dicho sujeto tiene predisposición para 45 sufrir una infección pero aún no se ha diagnosticado que la tenga, como es el caso, por ejemplo, de neonatos, ancianos o pacientes inmunodeprimidos o sometidos recientemente a intervención quirúrgica.

El término "infección" es el término clínico empleado para describir la colonización de un 50 organismo huésped por microorganismos de otras especies. En clínica, el organismo colonizador es perjudicial para el funcionamiento normal y supervivencia del huésped. Como se usa aquí, el término "enfermedades infecciosas bacterianas" o "enfermedades de origen infeccioso provocadas por bacterias" se refiere a enfermedades precedidas por una infección bacteriana, incluyendo infecciones sistémicas (bacteriemia y sepsis) e infecciones en cualquier órgano o tejido del organismo huésped. Los órganos o tejidos 5 incluyen, pero sin limitación, músculo esquelético, piel, tejidos blandos o mucosas, torrente sanguíneo, riñones o cualquier otro tejido del tracto urinario, tracto respiratorio, tracto gastrointestinal, órganos sexuales, oído, ojo, corazón, pulmones o hueso. Estas infecciones pueden estar causadas por bacterias Gram positivas y/o Gram negativas.

10

En la presente invención, dichas infecciones ocurren en un sujeto que puede ser, pero sin limitarnos, un animal, en particular un mamífero y más particularmente un humano, o un animal doméstico, por ejemplo cerdo, ratón, rata, gato, jerbo conejo, perro, mono, chimpancé, etc., o un ave.

15

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa de la invención, del sobrenadante de la invención, del compuesto de fórmula (I) de la invención o de la composición de la invención para la eliminación y/o prevención y/o inhibición de la formación de biopelículas bacterianas, preferiblemente sobre superficies inertes, es decir ex vivo. 20

En una realización preferida de este aspecto de la invención, las biopelículas bacterianas son provocadas por una o más bacterias de los géneros seleccionados de Clostridium, Cor y nebacterium, Enterococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Bacteroides, Escherichia, Haemophilus o Neisseria. En una realización más preferida, las biopelículas bacterianas 25 son provocadas por bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Cor y nebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria meningitidis. En una realización aún más preferida, la bacteria es Micrococcus luteus. 30

En una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B y la bacteria es Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B o C y la 35 bacteria es Cor y nebacterium urealyticum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis y/o Micrococcus luteus.

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina B y la bacteria es Haemophilus influenzae, Escherichia coli y/o Bacteroides fragilis. 40

En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es la branimicina e y la bacteria es Enterococcus faecalis y/o Staphylococcus aureus.

Se entiende por "biopelículas" o "biofilms" las comunidades de microorganismos que 45 crecen embebidos en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o a un tejido in vivo o ex vivo (en cultivo). Es una comunidad de bacterias (de una única especie o varias) que se adhiere a una superficie sólida. Las biopelículas son una causa común de infecciones bacterianas, tanto en humanos como en otros animales y plantas. Ejemplos de biopelículas son aquellas que se forman en la cavidad oral, tales como las 50 caries (placa dental) o enfermedad periodontal.

Los mecanismos por los que el biofilm produce los síntomas de la enfermedad todavía no están completamente establecidos, pero se ha sugerido que las bacterias del biofilm pueden producir exotoxinas, se pueden liberar grupos de bacterias al torrente sanguíneo, se vuelven resistentes a la acción fagocitaría de las células del sistema inmune y, por otro lado, constituyen un nicho para la aparición de bacterias resistentes a los tratamientos 5 antibióticos. Este último aspecto puede ser especialmente relevante dado que las bacterias resistentes originadas en un biofilm podrían extenderse de paciente a paciente a través de las manos del personal sanitario.

Por otro lado, la contaminación biológica de superficies por formación de biofilms es 10 común, pudiendo desarrollarse el biofilm sobre superficies hidratabas, hidrófilas, bióticas o abióticas, y conduce a la degradación del material, productos de contaminación, bloqueo mecánico e impedancia de la transferencia de calor en procesos acuáticos. Los biofilms son también la primera causa de contaminación biológica en alimentos, catéteres, drenajes o implantes, así como en los sistemas de distribución de agua 15 potable, y otras conducciones, siendo especialmente importante el control de biofilms en los sistemas antiincendios.

El término "Gram negativa" se refiere a las bacterias que no retienen la coloración violeta en el protocolo de tinción Gram e incluyen, pero sin limitarse, Enterobacteriaceae, 20 incluyendo E. coli, Klebsiella spp., Haemophilus, Bacteroides, Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp., Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas (incluyendo P. aeruginosa) y especies tales como Moraxella spp. (incluyendo, M catarrhalis) y Neisseria spp.

25

El término "Gram positiva" se refiere a las bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta en el protocolo de tinción Gram e incluyen, pero sin limitarse, Staphylococcus (incluyendo Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophytics) , Streptococcus (incluyendo Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. avium, S. bovis, S. lactis, S. sanguis y Streptococcus del grupo C, Streptococcus del 30 grupo G y Streptococcus viridans) , Enterococcus (incluyendo Enterococcus faecalis y E. faecium) , Clostridium, Cor y nebacterium, Listeria monocytogenes, Cor y nebacterium jeikeium, Chlamydia spp. (incluyendo C. pneumoniae) , Micrococcus y Mycobacterium tuberculosis. Las cepas habituales de S. aureus son resistentes a la penicilina. La aparición de cepas de esta especie resistentes a la meticilina y vancomicina representa 35 un serio problema sanitario.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se 40 desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de las figuras 45

FIG. 1. Árbol filogenético obtenido por el método " neighbour-joining" obtenido por análisis matriciales de distancias de las secuencias del gen 16S rRNA, mostrando la posición de Pseudonocardia carboxydivorans M-227 y sus parientes filogenéticos más próximos. Los números de los nodos son valores bootstrap (1000 50 muestreos; solo se presentan valores >70%). Los asteriscos indican que los correspondientes nodos también se obtuvieron en el árbol obtenido por el método de la máxima verosimilitud (maximum-likelihood). La barra indica un 1% de divergencia de secuencias.

Ejemplos 5

A continuación se ilustrara la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la cepa de la invención en la producción de dos nuevos antibióticos macrólidos de la familia de las branimicinas (designados en la presente invención como branimicinas B y C) , así como la actividad 10 antimicrobiana de estos nuevos antibióticos frente a bacterias patógenas tanto Gram negativas como Gram positivas.

Ejemplo 1. Sección experimental

15

Procedimientos experimentales generales

Los análisis y separaciones mediante HPLC semipreparativo se llevaron a cabo utilizando un sistema cromatográfico de Alliance con una columna SunFire C18 (10 m, 10 x 250 mm, Waters). Para los análisis de UPLC se usó un UPLC Acquity equipado con una 20 columna BEH C18 (1, 7 m, 2.1 x 100 mm, Waters) , la rotación óptica fue determinada con un polarímetro JASCO P-2000. Los espectros de IR fueron medidos con un espectrómetro JASCO FT/IR-4100 equipado con un accesorio ATR de PIKE MIRacle (reflexión simple). Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III (500 y 125 MHz para 1H y 13C RMN, respectivamente) equipado con una sonda 25 TCI MicroCr y oProbe de 1, 7 mm, usando la señal del solvente residual como referencia interna (H 7, 27 y C 77, 0 ppm para CDCI3). Los espectros de HRESIMS fueron adquiridos usando un espectrómetro de masas Bruker maXis QTOF.

Microorganismos y condiciones de fermentación 30

La cepa M-227 (CECT 91 08) fue aislada de una muestra de aguas profundas recogida en el mar Cantábrico a 3000 m de profundidad. Un cultivo de siembra fue preparado inoculando esporas de esta cepa en 50 ml de medio GCM (1, 5% glucosa, 2% peptona de soja, 0, 15% extracto de levadura, 1% MOPS, 0, 01% CaCI2, pH 6.7) en un matraz 35 Erlenmeyer de 250 ml. Este cultivo fue incubado en un agitador orbital durante 4 días a 28ºC y 250 rpm y usado para inocular (al 2%, v/v) veinte matraces Erlenmeyer de 250 ml, conteniendo cada uno 50 ml de medio R5A, que fueron incubados durante 10 días en las condiciones arriba descritas.

40

Análisis filogenético (taxonomía) del microorganismo productor

La cepa M-227 fue sometida a análisis filogenético en base al análisis de la secuencia del 16S rRNA. El análisis filogenético fue realizado usando MEGA versión 6.0 después de un alineamiento múltiple de los datos mediante CLUSTALO. Las distancias (opciones de 45 distancia según el modelo de dos parámetros de Kimura) y alineamiento con el método neighbor-joining fueron determinadas usando valores bootstrap basadas en 1000 replicaciones.

50

Actividad antimicrobiana de las branimicinas B y C contra patógenos clínicos

Se determinó la actividad antimicrobiana de las branimicinas B y C y la concentración inhibitoria mínima (ClM) contra un grupo de patógenos humanos (Tabla 1).

5

Tabla 1. Descripción de los patógenos clínicos. a lnh, rif, emb. b lnh, rif, emb, str, amk, kan, cap c Amp, amo/clav, er y , cot, cip, fos, nitro. Amk amikacina; amo: amoxicilina; amp: ampicilina; cap: capreomicina; cip: ciprofloxacina; clav: ácido clavulánico; clin: 10 clindamicina; cot: cotrimoxazol; emb: etambutol; er y : eritromicina; fos: fosfomicina; inh: isoniazida; kan: kanamicina; nitro: nitrofurantoina; quin: quinolonas; rif: rifampicina; str: estreptomicina; tet: tetraciclina.

Algunos de ellos han sido aislados e identificados en los laboratorios de microbiología 15 clínica a partir de muestras obtenidas de pacientes con infecciones clínicas. El medio Mueller-Hinton (Biomedics) fue utilizado en los bioensayos frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Micrococcus luteus, Haemophilus influenzae, siendo suplementado de acuerdo a las condiciones CLSI (CLSI, Clinical and Laborator y Standards lnstitute, documento M100-S24 2014) para 20

Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Neisseria meningitidis, Tripticaseina de soja con sangre de carnero al w/5% (DIFCO) fue usada para Cor y nebacterium urealyticum. Brucella Broth (SIGMA) suplementado con hemina (5 g/ml) , vitamina K1 (1 g/ml) y sangre de caballo sometida a lisis (5% v/v) fue usada para Bacteroides fragilis y Clostridium perfringens. 5

Para la mayoría de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, se realizaron los ensayos antimicrobianos según normas del protocolo CLSI. Las pruebas de sensibilidad de Mycobacterium tuberculosis se realizaron en medio agarificado Middlebrook 7H10 suplementado con OADC al 10% y glicerol al 0, 5% de acuerdo al método de proporción 10 en agar para micobacterias de lento crecimiento (CLSI documento M24-A2, 2011).

Ejemplo 2. Resultados

Taxonomía de la cepa M-227 15

El 16S rDNA de la cepa productora M-227 fue amplificado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciado. El análisis de la secuencia demostró una identidad del 99, 9% con Pseudonocardia carboxydivorans Y8. El árbol filogenético generado por el método "neighbor-joining", basado en la secuencia del gen 16S rRNA, 20 reveló claramente la relación evolutiva de la cepa M-227 con un grupo de especies conocidas del género Pseudonocardia (Figura 1). Por lo tanto, esta cepa fue señalada como Pseudonocardia carboxydivorans M-227.

Aislamiento y purificación de branimicinas B y C guiados por bioactividad 25

Los cultivos se centrifugaron, se descartaron los sedimentos y los sobrenadantes fueron filtrados y aplicados a un cartucho de extracción en fase sólida (Sep-Pak Vac C18, 10 g, Waters). El material retenido se eluyó con una mezcla de metanol y 0, 05% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua. Un gradiente lineal de 0 a 100% metanol en 60 min, a 10 30 ml/min, fue utilizado. Las fracciones fueron recogidas cada 5 minutos y su actividad antibiótica fue detectada por la prueba de difusión en disco, utilizando Micrococcus luteus como microorganismo indicador. La mayor parte de la actividad fue localizada en las dos fracciones recogidas entre 15 y 25 minutos, que se evaporaron en vacío y el material seco fue posteriormente redisuelto en 3 ml de DMSO y m etanol (1:1). Muestras (100 I) 35 de las fracciones activas fueron cromatografiadas en una columna SunFire C18 (10 m, 10 x 250 mm, Waters) con acetonitrilo y 0, 05% TFA en agua como solventes. La elución se realizó con un gradiente lineal de 20 a 100% de acetonitrilo en 10 min, a 5 ml/min, y el eluyente se recogió en fracciones recolectadas cada 10 segundos. Una vez más, la actividad antibiótica de estas fracciones fue localizada por bioensayo y posteriormente 40 todo el material activo fue cromatografiado en inyecciones múltiples en las mismas condiciones. Se agruparon las fracciones activas recogidas, correspondientes a los mismos tiempos de retención, se diluyeron cuatro veces con agua y se desalaron y concentraron por extracción en fase sólida (Sep-Pak C18, Waters). El análisis por UPLC de estas fracciones indicó que la actividad antibiótica pareció correlacionarse con la 45 presencia de dos picos principales. Estos picos se purificaron aún más usando la misma columna y solventes, pero esta vez fue empleada una elución isocrática con acetonitrilo al 20%. Los compuestos purificados se diluyeron con agua y se extrajeron en fase sólida como se indica arriba. Finalmente, fueron disueltos en una mezcla de agua y tert-butanol (1:1) y liofilizados. Los rendimientos resultantes fueron de 58, 6 mg de branimicina By 61, 7 50 mg de branimicina C.

Branimicina B: sólido blanco; []20D +106.6º (c 0.1, CHCI3) ; IR (ATR) vmax 3419, 3038, 2961, 2929, 2878, 2832, 1719, 1457, 1378, 1248, 1147, 1117, 1082, 1030, 984, 944, 890 cm-1; para los datos de 1H y 13C RMN ver Tabla 2; HRESIMS m/z 456.2596 (M+NH4]+ (calcd. para C23H38NO8+, 456.2592) , 439.2326 [M+H]+ (calcd. para C23H35O8+, 439.2326) , 421.2222 [M-H2O+H]+ (calcd para C23H33O7+, 421.2221). 5

Branimicina C: sólido blanco; []20D +101.2º (c 0.1, CHCI3) ; IR (ATR) vmax 3422, 3038, 2961, 2931, 2879, 2833, 1722, 1457, 1386, 1248, 1140. 1118, 1083, 1030, 979, 945, 889 cm-1; para los datos de 1H y 13C RMN ver Tabla 2; HRESIMS m/z 486.2709 [M+NH4]+ (calcd. para C24H40NO9+, 486.2698) , 469.2432 [M+H]+ (calcd. para C24H37O9+, 469.2432) , 10 451.2333 (M-H2O+H]+ (calcd. para C24H35O8+, 451.2326).

15

Tabla 2. Espectros 1H y 13C de RMN para las branimicinas B y C (500 MHz, CDCl3).

5

Actividad antimicrobiana de las branimicinas B y C

La actividad antimicrobiana de las branimicinas By e fue probada contra un grupo de patógenos humanos (Tabla 1). Algunos de ellos fueron aislados e identificados en laboratorios de microbiología clínica a partir de muestras obtenidas de pacientes con 10 infecciones clínicas.

La Tabla 3 muestra las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM). Ambos compuestos exhiben actividades moderadas contra las bacterias Gram-positivas Cor y nebacterium urealyticum y Clostridium perfringens. La branimicina B mostró actividades moderadas 15 contra las Gram-negativas Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Escherichia coli ESS y Bacteroides fragilis ATCC 25285 y fuerte actividad contra la Gram-positiva Micrococcus luteus, con un valor de CIM de 1 g ml-1. La branimicina C mostró actividades moderadas contra las Gram-positivas Enterococcus faecalis 10544, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 6538P y 20 Micrococcus luteus, y la Gram-negativa Neisseria meningitidis.

Tabla 3. Concentración inhibitoria mínima (CIM) frente a un panel de patógenos clínicos.

En conclusión, dos nuevos antibióticos, las branimicinas B y C, fueron aislados y 5 caracterizados a partir de una actinobacteria abisal, Pseudonocardia carboxydivorans M-227, aislada de la columna de agua a 3.000 m de profundidad en el mar Cantábrico. Estos compuestos exhiben importantes actividades inhibitorias contra diversas bacterias patógenas, tanto Gram-positivas como Gram-negativas, aisladas de los principales Hospitales (HUCA y Cabueñes) de la misma región geográfica. Estos resultados son un 10 ejemplo de la relevancia de los productos naturales marinos como candidatos para el tratamiento de bacterias patógenas resistentes a los antibióticos.

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Trabajos anteriores en el mar Cantabrico (Bahia de Vizcaya) , Atlantico Noreste, han revelado que actinobacterias bioactivas, principalmente especies de Streptomyces, estan asociadas a corales y otros invertebrados que viven hasta a 4700 m de profundidad en el canon submarino de Aviles (Brana et al., 2015, Microb Ecol 69: 512-524; Sarmiento- Vizcalno et al., 2015, lnt J Syst Evol Microbiol 65: 1328-1334). Una nueva actinobacteria, Myceligenerans cantabricum, se ha aislado de un coral solitario (escleractinia) en aguas de 1500 m de profundidad (Sarmiento-Vizcalno et al., 2015, lnt J Syst Evol Microbiol 65: 1328-1334).

En resumen, debido a la creciente aparicion en el ambito cllnico de bacterias patogenas resistentes a los antibioticos de uso actual, se hace necesaria la obtencion de nuevos antibioticos con potencial biomedico en el tratamiento o prevention de enfermedades infecciosas provocadas por bacterias patogenas tanto Gram positivas como Gram negativas. Asimismo, es necesario disponer de procedimientos simples, cortos y economicos para la obtencion de dichos compuestos con actividad antibacteriana.

Description de la invention

La presente invencion proporciona una nueva cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans que ha sido aislada de su medio natural y depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo bajo el numero de acceso 9108, la cual es capaz de producir eficientemente por fermentation compuestos antibioticos de la familia de las branimicinas. Concretamente, esta cepa es productora de dos nuevas branimicinas, designadas en la presente invencion como branimicinas B y C, que presentan actividad antibiotica o antibacteriana in vitro e in vivo frente a bacterias patogenas, preferiblemente humanas, tanto Gram positivas como Gram negativas.

Los inventores de la presente invencion han aislado dicha cepa de actinobacterias, Pseudonocardia carboxydivorans M-227, de los ecosistemas de arrecifes de coral desde el canon submarino de Aviles. Dicha cepa fue aislada a 3.000 m de profundidad en la columna de agua y fue estudiada e identificada posteriormente. Se describe por tanto en la presente invencion dicha cepa, un procedimiento para obtener branimicinas por fermentacion a partir de la misma y dos nuevos antibioticos de la familia de las branimicinas con actividad antibacteriana contra bacterias patogenas cllnicas, tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Estos nuevos compuestos presentan actividad antibiotica in vivo frente a bacterias Gram-negativas, como por ejemplo aunque sin limitarnos, los patogenos Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Bacteroides fragilis y Escherichia coli; y bacterias Gram-positivas, por ejemplo pero sin limitarnos, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Cor y nebacterium urealyticum, Clostridium perfringens y Enterococcus faecalis.

Los inventores determinaron las condiciones de cultivo de la cepa para la production de dichas nuevas branimicinas, posteriormente purificaron las mismas, procedieron a su elucidation estructural y testaron su actividad antibiotica frente a una variedad de patogenos cllnicos tanto Gram-negativos como Gram-positivos, algunos de tos cuales presentaban multiresistencias frente a antibioticos de uso habitual.

La presente invencion representa asl una solution a la necesidad de disponer de nuevos compuestos antibioticos con potencial biomedico en el tratamiento o prevencion de enfermedades infecciosas provocadas por bacterias patogenas tanto Gram positivas como Gram negativas resistentes a los antibioticos de uso actual. Asimismo, representa

una solucion a la necesidad de disponer de procedimientos simples, cortos y economicos para la obtencion de dichos compuestos con actividad antibacteriana, ya que el procedimiento descrito en la presente invention permite producir los citados antibioticos por fermentation con una actinobacteria en lugar de por slntesis qulmica, proceso mas complejo, largo y costoso. En este sentido, en procesos biotecnologicos que implican la obtencion de productos naturales estructuralmente complejos, como es el caso de las branimicinas, la production por fermentacion mediante el microorganismo productor es el procedimiento preferido, ya que es mas sencillo, mas corto y mas economico que el procedimiento de slntesis organica.

Asl, en un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans M-227 depositada el 8 de marzo de 2016 en la Coleccion Espanola de Cultivo Tipo bajo el numero de acceso 9108. De ahora en adelante se hara referencia a esta cepa bacteriana como "cepa de la invencion" o "cepa bacteriana de la invencion".

Otro aspecto de la invencion se refiere a un sobrenadante o extracto de un cultivo de la cepa bacteriana de la invencion. A este sobrenadante se hara referencia como "sobrenadante de la invencion", y comprende al menos un compuesto de formula general (I) :

** (Ver fórmula) **

o cualquiera de sus sales, donde: R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

El sobrenadante de la invencion que comprende al menos un compuesto de formula (I) puede obtenerse mediante el cultivo de la cepa de la invencion en presencia de un medio de cultivo adecuado y en condiciones de fermentacion. Dichas condiciones de fermentacion y dicho medio de cultivo son, preferiblemente, los que se describen mas adelante en el procedimiento de la invencion. Posteriormente, se puede proceder a la

centrifugacion de dicho cultivo bacteriano, mediante cualquier metodo conocido por los expertos en la materia para tal fin, y a la eliminacion de los sedimentos depositados como consecuencia de este paso de centrifugacion, obteniendose asl el sobrenadante de la invention que comprende al menos un compuesto de formula (I) y otros metabolitos producidos y secretados por la cepa de la invencion en cultivo.

Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de la cepa bacteriana de la invencion para la production de compuestos de formula general (I) :

** (Ver fórmula) **

o cualquiera de sus sales, donde ^ es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento para la obtencion de un compuesto de formula general (I) descrito anteriormente, de ahora en adelante "procedimiento de la invencion", que comprende:

a. Cultivar la cepa bacteriana de la invencion en un medio de cultivo en condiciones de fermentacion, y

b. Purificar el compuesto de formula general (I) producido por la cepa en cultivo de la etapa (a).

El cultivo de la etapa (a) del procedimiento de la invencion se puede llevar a cabo, por ejemplo, aunque sin limitarnos, inoculando la cepa o esporas de la cepa en un medio de cultivo apropiado. Los expertos en la materia reconoceran los medios de cultivo bacterianos que pueden ser empleados en esta etapa del procedimiento de la invencion. El "medio de cultivo" es un medio nutritivo adecuado, es decir, que comprende los nutrientes necesarios para el mantenimiento y crecimiento in vitro de la cepa de la invencion, para el desarrollo de su actividad fermentadora y, por tanto, para la produccion de los compuestos de formula (I) descritos anteriormente. Dicho medio de cultivo puede ser llquido, solido o semisolido. Para que la cepa de la invencion crezca adecuadamente

en el medio de cultivo, este debe reunir una serie de condiciones como son temperatura, agitacion, grado de humedad, luz/oscuridad y presion de oxigeno adecuadas, asl como un grado correcto de acidez o alcalinidad (pH). Asimismo, el medio de cultivo debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

Asl, el cultivo de la etapa (a) tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende, por ejemplo aunque sin limitarnos, agar o gelatina o albumina, fuentes de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa o manitol) , fuentes de nitrogeno (por ejemplo, peptonas) , azufre, fosforo, fuentes de vitaminas, aminoacidos y hormonas y/o factores de crecimiento (por ejemplo, extracto de carne o extracto de levadura) , MOPS, sales inorganicas (por ejemplo, calcio en forma de CaCI2, magnesio, manganeso, sodio o potasio) , iones de hidrogeno, etc. En una realization preferida, el medio de cultivo empleado en el procedimiento de la invencion es un medio de cultivo que comprende nutrientes y propiedades flsico-qulmicas similares a las del medio marino, mas preferiblemente el medio es RSA marino.

La cepa de la invention se puede cultivar, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante cultivo en matraz con agitacion, y fermentation a pequena o a gran escala (que incluye las fermentaciones continua, discontinua o batch, de alimentation discontinua o feed- batch, o en estado solido) llevada a cabo en un biorreactor de laboratorio o industrial en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar los compuestos de formula (I) descritos anteriormente. Los compuestos de la invencion se secretan, junto con otros metabolitos o compuestos, en el medio nutritivo, y estos se pueden recuperar directamente del medio.

El experto en la materia reconocera las condiciones de fermentacion adecuadas para ser aplicadas en el paso (a) del procedimiento de la invencion Preferiblemente, dichas condiciones comprenden la incubation en agitacion, mas preferiblemente en agitador orbital, del cultivo de la invencion durante entre 2 y 10 dlas, preferiblemente entre 3 y 7 dlas, mas preferiblemente durante 4 dlas: a una temperatura esencialmente constante de entre 25 y 30°C, preferiblemente entre 27 y 29°C, mas preferiblemente a 28°C; a entre 200 y 300 rpm, preferiblemente entre 250 y 270 rpm, mas preferiblemente a 250 rpm y a un pH constante de entre 6 y 7.5, preferiblemente de entre 6 y 7, mas preferiblemente a 6.7.

Tras el cultivo de la etapa (a) del procedimiento de la invencion, puede tener lugar un paso adicional de centrifugation tras el cual se descartan los sedimentos y se seleccionan los sobrenadantes, obteniendo asl el sobrenadante de la invencion. Dichos sobrenadantes pueden ser posteriormente filtrados en el paso (b) del procedimiento de la invencion y se pueden someter a continuation a un procedimiento de extraction, como por ejemplo aunque sin limitarnos, a extraccion en fase solida, con el fin de eluir los compuestos de la invencion presentes en los mismos.

Los compuestos de la invencion secretados al medio de cultivo por la cepa de la invencion pueden recuperarse del medio empleando procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitacion, centrifugacion, filtracion, extraccion, secado por pulverizacion, evaporacion y/o precipitacion.

Los compuestos de la invencion producidos por la cepa en cultivo pueden purificarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la tecnica incluyendo, pero sin

limitation, cromatografla (por ejemplo, HPLC, intercambio ionico, afinidad, hidrofobica cromatoenfoque, y exclusion molecular) , procedimientos electroforeticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitation con sulfato amonico). SDS-PAGE, precipitation o extraction, con el fin de obtener uno o varios compuestos de la invention sustancialmente puros.

Los compuestos de la invencion producidos por la cepa en cultivo pueden detectarse usando procedimientos conocidos en la tecnica. Estos procedimientos de detection pueden incluir, por ejemplo aunque sin limitarnos, UPLC, UV, RMN, espectrometrla de masas, o similares.

Otro aspecto de la invention se refiere a un compuesto de formula general (I) o a cualquiera de sus sales (a partir de ahora "compuesto de formula (I) de la invention") :

** (Ver fórmula) **

donde Ri es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

Cuando Ri es -CH3 el compuesto es la branimicina B y cuando Ri es -CH2OCH3 el compuesto es la branimicina C.

Otro aspecto de la invention se refiere a una composition, de ahora en adelante "composicion de la invencion", que comprende la cepa de la invencion, el sobrenadante de la invention o el compuesto de formula (I) de la invention. Dicha composition puede ser una composition farmaceutica o cosmetica, que comprende la cepa de la invention, el sobrenadante de la invention o el compuesto de formula (I) de la invention, y un excipiente o vehlculo farmaceutica o cosmeticamente aceptable. Preferiblemente, la composition de la invention comprende la cepa de la invention, el sobrenadante de la

invention o el compuesto de formula (I) de la invention en una cantidad terapeuticamente efectiva.

Se entiende por "cantidad terapeuticamente efectiva" la cantidad de cepa de la invencion, sobrenadante de la invencion o compuesto de la invencion, que cuando se administra al sujeto para tratar y/o prevenir una infection bacteriana produce el efecto deseado. Dicho efecto deseado puede ser, por ejemplo aunque sin limitarnos, eliminar o reducir el numero de bacterias causantes de la infeccion La cantidad terapeuticamente efectiva puede variar dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo pero sin limitarnos, del tipo de infeccion y su severidad, asl como de la edad, peso, sexo, condition flsica, capacidad de respuesta o tolerancia, etc., del individuo al que le va a ser administrada la composicion de la invencion.

Los excipientes y vehlculos farmaceutica o cosmeticamente aceptables que pueden ser utilizados en la composition de la invencion son los conocidos por los expertos en la materia.

El termino "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorcion de los elementos de la composicion de la invencion, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparation de la composicion en el sentido de darle consistencia. Asl pues, los excipientes podrlan tener la funcion de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azucares o celulosas, la funcion de endulzar, la funcion de colorante, la funcion de protection de la composicion, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la funcion de relleno de una pastilla, capsula o cualquier otra forma de presentation, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio bibasico, la funcion desintegradora para facilitar la disolucion de los componentes y su absorcion, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este parrafo.

El "vehlculo farmaceuticamente aceptable", al igual que el excipiente, es una sustancia o combinacion de sustancias que se emplea en la composicion para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El termino "vehlculo" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se debe administrar la composicion de la invencion; obviamente, dicho vehlculo debe ser compatible con dicha composicion. Los vehlculos farmaceuticamente aceptables pueden ser, aunque sin limitarnos, solidos, llquidos, disolventes o tensioactivos. Ejemplos de vehlculos son, aunque sin limitarnos, agua, aceites o surfactantes, incluyendo los de origen petrollfero, animal, vegetal o sintetico, como por ejemplo, y sin sentido limitativo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo, aceites de ricino, polisorbatos, esteres de sorbitano, eter sulfatos, sulfatos, betalnas, glucosidos, maltosidos, alcoholes grasos, nonoxinoles, poloxameros, polioxietilenos, polietilenglicoles, dextrosa, glicerol, digitonina y similares. El vehlculo farmacologicamente aceptable es una sustancia inerte o de action analoga a cualquiera de los elementos comprendidos en la composicion de la presente invencion. La funcion del vehlculo es facilitar la incorporation de otros elementos, permitir una mejor dosificacion y administration o dar consistencia y forma a la composicion Cuando la forma de presentacion es llquida, el vehlculo farmacologicamente aceptable es el diluyente.

La composicion de la presente invencion puede formularse para su administracion a un animal, preferiblemente a un mamlfero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la tecnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye

cualquier composition solida (comprimidos, plldoras, capsulas, polvos, granulos, barras, lapices, vaporizadores, aerosoles, etc.) , semisolida (unguento, crema, pomada, gel, hidrogel, espuma, locion, jabon, jalea, gelatina, etc.) o llquida (soluciones acuosas o no acuosas, soluciones hidroalcoholicas o hidroglicolicas, suspensiones, emulsiones, jarabes, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, balsamos, linimentos, sueros, etc.) para administration oral, topica o parenteral. La composition de la presente invention tambien puede estar en forma de formulaciones de liberation sostenida o de cualquier otro sistema convencional de liberation. El termino "liberation sostenida" se utiliza en sentido convencional refiriendose a un sistema de vehiculizacion de un compuesto que proporciona la liberation gradual de dicho compuesto durante un periodo de tiempo y preferiblemente, aunque no necesariamente, con niveles de liberation del compuesto relativamente constantes a lo largo de un periodo de tiempo. Ejemplos ilustrativos de vehlculos o sistemas de liberation sostenida incluyen, aunque no se limitan a, liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicapsulas, microcapsulas, nanocapsulas, esponjas, ciclodextrinas, veslculas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas fosfollpidotensioactivo, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartlculas, milipartlculas, micropartlculas, nanopartlculas, nanopartlculas solidas lipldicas, soportes lipldicos nanoestructurados, materiales polimericos, parches o implantes biodegradables o no biodegradables, o micropartlculas biodegradables, como por ejemplo, microesferas biodegradables.

Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradermica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracardlaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, cutanea o subcutanea, intraorbital, intracapsular, topica, oftalmologica u ocular, mediante parches transdermicos o via rectal o vaginal, mediante la administration de un supositorio o encapsulado, percutanea, espray nasal, implante quirurgico, pintura quirurgica interna, bomba de infusion o via cateter.

Las composiciones de la presente invention son aptas para su aplicacion mediante dispositivos medicos que permitan la liberacion del principio activo en concentraciones adecuadas para el tratamiento y/o prevention de infecciones bacterianas. Estos dispositivos deben ser, preferiblemente, adecuados para la administracion del principio activo de forma local, permitiendo que el tratamiento actue en la zona afectada y no se disperse. Los dispositivos pueden, por ejemplo, pero sin limitarse, llevar el principio activo en su interior o ir recubiertos con el mismo.

En una realization preferida, la composition de la invention, preferiblemente farmaceutica o cosmetica, ademas comprende otro agente antibacteriano y/o antifungico, mas preferiblemente dicho agente antibacteriano es otro antibiotico.

Se entiende por "agente antibacteriano" una sustancia qulmica, producida de forma sintetica o natural (sintetizada por ejemplo por hongos o bacterias) , que inhibe el crecimiento (bacteriostatico) o mata (bactericida) a las bacterias. El agente antibacteriano puede ser, por ejemplo aunque sin limitarnos, un antibiotico, un inhibidor de la bomba de eflujo o un agente permeabilizante de la membrana bacteriana.

Los antibioticos a los que se refiere la presente invention son compuestos que, preferiblemente, no comprometen la viabilidad y supervivencia de la cepa de la invention.

Ejemplos de antibioticos que pueden incluirse en la composition de la invention son, aunque sin limitarnos, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, paromomicina, geldanamicina, herbimicina, loracarbef, ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatin, meropenem, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefalexina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepime, ceftobiprole, teicoplanin, vancomicina, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espectinomicina, aztreonam, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina, piperacilina, ticarcilina, bacitracina, colistina, ciprofloxacino, enoxacino, gatifloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, norfloxacino, ofloxacin, trovafloxacino, grepafloxacino, sparfloxacino, temafloxacino, mafenide, sulfonamidocrisoidina, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfametizol, sulfanilimidae, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol (co-trimoxazol) , demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, arsfenamina, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, etambutol, fosfomicina, acidofusldico, furazolidona, isoniacida, linezolida, metronidazol, mupirocina, nitrofurantoina, platensimicina, pirazinamida, quinupristin/ dalfopristin, rifampicina, tiamfenicol, tinidazol, dapsona y clofazimina, asl como otras nargenicinas, incluyendo branimicinas distintas a las descritas en la presente invention.

La composition de la presente invention puede incluir alternativa o adicionalmente un agente antifungico o antimicotico, dicho agente antifungico puede ser un fungicida o un fungistatico.

El uso de la cepa de la invencion, del sobrenadante de la invencion, del compuesto de formula (I) de la invention o de la composition de la invention en combination con otros agentes antibacterianos es una estrategia interesante en la prevention y/o tratamiento de infecciones bacterianas, preferiblemente de enfermedades de origen infeccioso provocadas por bacterias patogenas resistentes o multi-resistentes, y en la inhibicion de la formation de biopellculas bacterianas sobre cualquier superficie.

Por ello, otro aspecto de la invention se refiere al uso del sobrenadante de la invention, del compuesto de formula (I) de la invention o de la composition, preferiblemente farmaceutica, de la invention para la elaboration de un medicamento. Alternativamente, este aspecto de la invention se refiere al sobrenadante de la invention, el compuesto de formula (I) de la invention o la composition de la invention para su uso como medicamento.

Otro aspecto de la invention se refiere al uso del sobrenadante de la invention, del compuesto de formula (I) de la invention o de la composition de la invention para la elaboration de un medicamento para el tratamiento y/o prevention de infecciones bacterianas Alternativamente, este aspecto de la invencion se refiere al sobrenadante de la invencion, el compuesto de formula (I) de la invencion o la composicion de la invencion para su uso en el tratamiento y/o prevention de infecciones bacterianas.

Las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invention son provocadas por una o mas bacterias Gram negativas o Gram positivas, o por ambas conjuntamente. En una realization mas preferida, las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invencion son provocadas por una o mas bacterias de los generos seleccionados de Clostridium, Cor y nebacterium, Enterococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Bacteroides, 5

Escherichia, Haemophilus o Neisseria. En una realization aun mas preferida, las infecciones bacterianas a las que se refiere la presente invention son provocadas por una o mas bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Cor y nebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria meningitidis. En una realization aun mas preferida, la bacteria es Micrococcus luteus.

En otra realization preferida, las bacterias a las que se refiere la presente invention son bacterias resistentes, mas preferiblemente multiresistentes, a uno o mas antibioticos.

Como ejemplos de bacterias resistentes a antibioticos, se encuentran aquellas cepas resistentes a aminoglicosidos, carbapenemas, cefalosporinas, glicopeptidos, lincosamidas, lipopeptido, macrolidos, monobactamico, nitrofuranos, oxazolidononas, penicilinas, quinolonas, sulfonamidas, acido fusldico, acido pseudomonico, rifamicinas, lipoglicopeptidos, novobiocina y/o tetraciclinas, entre otros. Mas preferiblemente, las bacterias a las que se refiere la presente invencion son bacterias resistentes a al menos un antibiotico seleccionado de la lista que consiste en: amikacina, amoxicilina, ampicilina, capreomicina, ciprofloxacina, acido clavulanico, clindamicina, cotrimoxazol, etambutol, eritromicina, fosfomicina, isoniazida, kanamicina, nitrofurantoina, quinolonas, rifampicina, estreptomicina y/o tetraciclina.

En una realization aun mas preferida, el compuesto de formula (I) es la branimicina B y la bacteria es Micrococcus luteus.

En otra realization preferida, el compuesto de formula (I) es la branimicina B o C y la bacteria es Cor y nebacterium urealyticum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis y/o Micrococcus luteus.

En otra realization preferida, el compuesto de formula (I) es la branimicina 8 y la bacteria es Haemophilus influenzae, Escherichia coli y/o Bacteroides fragilis.

En otra realization preferida, el compuesto de formula (I) es la branimicina e y la bacteria es Enterococcus faecalis y/o Staphylococcus aureus.

En otra realization preferida, el medicamento al que se refiere la presente invention es para el tratamiento y/o prevention de enfermedades infecciosas bacterianas o enfermedades provocadas por infecciones bacterianas. Mas preferiblemente, dichas enfermedades se seleccionan de la lista que consiste en: enteritis necrotica, gangrena gaseosa, infecciones del tracto genitourinario (tales como cistitis, uretritis, prostatitis, pielonefritis, epididimitis) , infecciones cutaneas (tales como impetigo, foliculitis, celulitis, abscesos, infection de heridas) , osteomielitis, mastitis, faringoamigdalitis, conjuntivitis, epiglotitis, otitis, meningitis, meningococemia, bacteriemia, sepsis, endocarditis, infecciones del tracto respiratorio (tales como neumonla o sinusitis) , infecciones intraabdominales (colecistitis, peritonitis, abscesos viscerales) , asl como infecciones nosocomiales.

El termino "medicamento", tal y como se usa en esta invention, hace referencia a cualquier sustancia usada para la prevention, alivio, tratamiento o curacion de infecciones en el hombre, o cualquier otro animal, y plantas. En el contexto de la presente invention, este termino se refiere a una preparation que comprenda el sobrenadante de la invention, el compuesto de formula (I) de la invention o la composition de la invention.

El medicamento al que se refiere la presente invention puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combination de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevencion de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiologicas ejerciendo una action farmacologica, inmunologica o metabolica, o de establecer un diagnostico medico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinacion de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiologicas ejerciendo una accion farmacologica, inmunologica o metabolica, o de establecer un diagnostico veterinario, incluyendo, pero sin limitarse, a las premezclas medicamentosas. Se entiende por "premezcla medicamentosa" o "premezcla para alimentos medicamentosos", todo medicamento veterinario preparado de antemano con vistas a la fabrication ulterior de alimentos medicamentosos. Se entiende por "alimento medicamentoso" toda mezcla de medicamento (s) veterinario (s) y de alimento (s) preparada previamente a su comercializacion y destinada a ser administrada a los animales sin transformation, en razon de las propiedades curativas o preventivas o de otras propiedades del medicamento.

Los medicamentos de la invencion pueden utilizarse tanto solos como en combinacion con otros medicamentos o composiciones para el tratamiento o prevencion de infecciones bacterianas. Asl, los medicamentos de la presente invencion pueden ser empleados junto a otros principios activos o terapias a modo de terapia combinada. Los otros principios activos pueden formar parte de la misma composition o bien pueden ser proporcionados mediante una composicion distinta, siendo administrados al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

El termino "tratamiento", tal como se entiende en la presente invencion, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la infection, enfermedad o condition patologica de interes en un sujeto (preferiblemente mamlfero, y mas preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la infeccion, enfermedad o condicion patologica, es decir, detener su desarrollo;

(ii) aliviar la infeccion, enfermedad o la condicion patologica, es decir, causar la regresion de la infeccion, enfermedad o la condicion patologica o su sintomatologla;

(iii) estabilizar la infeccion, enfermedad o la condicion patologica.

El termino "prevention", tal como se entiende en la presente invencion, consiste en evitar la aparicion de la infeccion o enfermedad infecciosa o biopellcula bacteriana, es decir, evitar la aparicion de una biopellcula en una superficie o evitar que se produzca la infeccion o la enfermedad infecciosa en un sujeto (preferiblemente mamlfero, y mas preferiblemente un humano) , en particular cuando dicho sujeto tiene predisposition para sufrir una infeccion pero aun no se ha diagnosticado que la tenga, como es el caso, por ejemplo, de neonatos, ancianos o pacientes inmunodeprimidos o sometidos recientemente a intervention quirurgica.

El termino "infeccion" es el termino cllnico empleado para describir la colonization de un organismo huesped por microorganismos de otras especies. En cllnica, el organismo

colonizador es perjudicial para el funcionamiento normal y supervivencia del huesped. Como se usa aqui, el termino "enfermedades infecciosas bacterianas" o "enfermedades de origen infeccioso provocadas por bacterias" se refiere a enfermedades precedidas por una infeccion bacteriana, incluyendo infecciones sistemicas (bacteriemia y sepsis) e infecciones en cualquier organo o tejido del organismo huesped. Los organos o tejidos incluyen, pero sin limitation, musculo esqueletico, piel, tejidos blandos o mucosas, torrente sangumeo, rinones o cualquier otro tejido del tracto urinario, tracto respiratorio, tracto gastrointestinal, organos sexuales, oido, ojo, corazon, pulmones o hueso. Estas infecciones pueden estar causadas por bacterias Gram positivas y/o Gram negativas.

En la presente invention, dichas infecciones ocurren en un sujeto que puede ser, pero sin limitarnos, un animal, en particular un mamifero y mas particularmente un humano, o un animal domestico, por ejemplo cerdo, raton, rata, gato, jerbo conejo, perro, mono, chimpance, etc., o un ave.

Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de la cepa de la invencion, del sobrenadante de la invencion, del compuesto de formula (I) de la invencion o de la composicion de la invencion para la eliminacion y/o prevencion y/o inhibicion de la formation de biopeliculas bacterianas, preferiblemente sobre superficies inertes, es decir ex vivo.

En una realization preferida de este aspecto de la invencion, las biopeliculas bacterianas son provocadas por una o mas bacterias de los generos seleccionados de Clostridium, Cor y nebacterium, Enterococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Bacteroides, Escherichia, Haemophilus o Neisseria. En una realizacion mas preferida, las biopeliculas bacterianas son provocadas por bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Cor y nebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria meningitidis. En una realizacion aun mas preferida, la bacteria es Micrococcus luteus.

En una realizacion aun mas preferida, el compuesto de formula (I) es la branimicina B y la bacteria es Micrococcus luteus.

En otra realizacion preferida, el compuesto de formula (I) es la branimicina B o C y la bacteria es Cor y nebacterium urealyticum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis y/o Micrococcus luteus.

En otra realizacion preferida, el compuesto de formula (I) es la branimicina B y la bacteria es Haemophilus influenzae, Escherichia coli y/o Bacteroides fragilis.

En otra realizacion preferida, el compuesto de formula (I) es la branimicina e y la bacteria es Enterococcus faecalis y/o Staphylococcus aureus.

Se entiende por "biopeliculas" o "biofilms" las comunidades de microorganismos que crecen embebidos en una matriz de exopolisacaridos y adheridos a una superficie inerte o a un tejido in vivo o ex vivo (en cultivo). Es una comunidad de bacterias (de una unica especie o varias) que se adhiere a una superficie solida. Las biopeliculas son una causa comun de infecciones bacterianas, tanto en humanos como en otros animales y plantas. Ejemplos de biopeliculas son aquellas que se forman en la cavidad oral, tales como las caries (placa dental) o enfermedad periodontal.

Los mecanismos por los que el biofilm produce los slntomas de la enfermedad todavla no estan completamente establecidos, pero se ha sugerido que las bacterias del biofilm pueden producir exotoxinas, se pueden liberar grupos de bacterias al torrente sangulneo, se vuelven resistentes a la accion fagocitarla de las celulas del sistema inmune y, por otro lado, constituyen un nicho para la aparicion de bacterias resistentes a los tratamientos antibioticos. Este ultimo aspecto puede ser especialmente relevante dado que las bacterias resistentes originadas en un biofilm podrlan extenderse de paciente a paciente a traves de las manos del personal sanitario.

Por otro lado, la contamination biologica de superficies por formation de biofilms es comun, pudiendo desarrollarse el biofilm sobre superficies hidratabas, hidrofilas, bioticas o abioticas, y conduce a la degradation del material, productos de contaminacion, bloqueo mecanico e impedancia de la transferencia de calor en procesos acuaticos. Los biofilms son tambien la primera causa de contaminacion biologica en alimentos, cateteres, drenajes o implantes, asl como en los sistemas de distribution de agua potable, y otras conducciones, siendo especialmente importante el control de biofilms en los sistemas antiincendios.

El termino "Gram negativa" se refiere a las bacterias que no retienen la coloration violeta en el protocolo de tincion Gram e incluyen, pero sin limitarse, Enterobacteriaceae, incluyendo E. coli, Klebsiella spp., Haemophilus, Bacteroides, Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp., Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas (incluyendo P. aeruginosa) y especies tales como Moraxella spp. (incluyendo, M catarrhalis) y Neisseria spp.

El termino "Gram positiva" se refiere a las bacterias que se tinen de azul oscuro o violeta en el protocolo de tincion Gram e incluyen, pero sin limitarse, Staphylococcus (incluyendo Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophytics) , Streptococcus (incluyendo Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. avium, S. bovis, S. lactis, S. sanguis y Streptococcus del grupo C, Streptococcus del grupo G y Streptococcus viridans) , Enterococcus (incluyendo Enterococcus faecalis y E. faecium) , Clostridium, Cor y nebacterium, Listeria monocytogenes, Cor y nebacterium jeikeium, Chlamydia spp. (incluyendo C. pneumoniae) , Micrococcus y Mycobacterium tuberculosis. Las cepas habituales de S. aureus son resistentes a la penicilina. La aparicion de cepas de esta especie resistentes a la meticilina y vancomicina representa un serio problema sanitario.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invention se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

Descripcion de las figuras

FIG. 1. Arbol filogenetico obtenido por el metodo " neighbour-joining" obtenido por analisis matriciales de distancias de las secuencias del gen 16S rRNA, mostrando la position de Pseudonocardia carboxydivorans M-227 y sus parientes filogeneticos mas proximos. Los numeros de los nodos son valores bootstrap (1000 muestreos; solo se presentan valores >70%). Los asteriscos indican que los

correspondientes nodos tambien se obtuvieron en el arbol obtenido por el metodo de la maxima verosimilitud (maximum-likelihood). La barra indica un 1% de divergencia de secuencias.

Ejemplos

A continuation se ilustrara la invention mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la cepa de la invencion en la production de dos nuevos antibioticos macrolidos de la familia de las branimicinas (designados en la presente invencion como branimicinas B y C) , asl como la actividad antimicrobiana de estos nuevos antibioticos frente a bacterias patogenas tanto Gram negativas como Gram positivas.

Ejemplo 1. Seccion experimental Procedimientos experimentales generales

Los analisis y separaciones mediante HPLC semipreparativo se llevaron a cabo utilizando un sistema cromatografico de Alliance con una columna SunFire C18 (10 pm, 10 x 250 mm, Waters). Para los analisis de UPLC se uso un UPLC Acquity equipado con una columna BEH C18 (1, 7 pm, 2.1 x 100 mm, Waters) , la rotation optica fue determinada con un polarlmetro JASCO P-2000. Los espectros de IR fueron medidos con un espectrometro JASCO FT/IR-4100 equipado con un accesorio ATR de PIKE MIRacle (reflexion simple). Los espectros de RMN se registraron en un espectrometro Bruker Avance III (500 y 125 MHz para 1H y 13C RMN, respectivamente) equipado con una sonda TCI MicroCr y oProbe de 1, 7 mm, usando la senal del solvente residual como referencia interna (5H 7, 27 y 5C 77, 0 ppm para CDCI3). Los espectros de HRESIMS fueron adquiridos usando un espectrometro de masas Bruker maXis QTOF.

Microorganismos y condiciones de fermentation

La cepa M-227 (CECT 91 08) fue aislada de una muestra de aguas profundas recogida en el mar Cantabrico a 3000 m de profundidad. Un cultivo de siembra fue preparado inoculando esporas de esta cepa en 50 ml de medio GCM (1, 5% glucosa, 2% peptona de soja, 0, 15% extracto de levadura, 1% MOPS, 0, 01% CaCI2, pH 6.7) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Este cultivo fue incubado en un agitador orbital durante 4 dlas a 28°C y 250 rpm y usado para inocular (al 2%, v/v) veinte matraces Erlenmeyer de 250 ml, conteniendo cada uno 50 ml de medio R5A, que fueron incubados durante 10 dlas en las condiciones arriba descritas.

Analisis filogenetico (taxonomla) del microorganismo productor

La cepa M-227 fue sometida a analisis filogenetico en base al analisis de la secuencia del 16S rRNA. El analisis filogenetico fue realizado usando MEGA version 6.0 despues de un alineamiento multiple de los datos mediante CLUSTALO. Las distancias (opciones de distancia segun el modelo de dos parametros de Kimura) y alineamiento con el metodo neighbor-joining fueron determinadas usando valores bootstrap basadas en 1000 replicaciones.

Actividad antimicrobiana de las branimicinas B y C contra patogenos clinicos

Se determino la actividad antimicrobiana de las branimicinas B y C y la concentration inhibitoria minima (ClM) contra un grupo de patogenos humanos (Tabla 1).

Patogenos clinkos

Aislado

Hospital

Afto

Resistencias a antibiotiros

Gram posltivas

Mycobacterium tuberculosis H37Rv

ATCC 27294

-

Mycoboctenum tuberculosis MDR-1

14595

SNRL Spain

2013

Multirreslstente*

Mycobacterium tuberculosis MDR-2

14615

SNRL Spain

2013

Multlrresistente

Clostridium perfringens

103281

HUCA

2013

-

Cor y nebaderium urealyticum

1492

CabueAes

2014

Multlrresistente*

Enterococcus faecalis

10544

Cabuenes

2015

Er y , din, tet

Enterococcus faecalis

ATCC 51299

-

Enterococcus faecalis

ATCC 29212

Enterococcus faecium

10701

CabueAes

2015

Amp, quin, er y

Micrococcus luteus

ATCC 14452

-

Streptococcus pneumoniae

64412

HUCA

2013

Er y

Streptococcus pyogenes

81293

HUCA

2013

-

Staphylococcus aureus

11497

CabueAes

2015

Susceptible a meticilina

Staphylococcus aureus

ATCC 43300

-

Staphylococcus aureus

ATCC 6538P

-

Staphylococcus aureus

ATCC 25923

Gram negatlvas

Bacterotdes fraqihs

61592

HUCA

2013

Amo, tet

Bacteroides fragilis

ATCC 25285

-

Escherichia coli

ESS

-

Haemophilus influenzae

10996

CabueAes

2015

Amp, cot, quin

Haemophilus influenzae

ATCC 49247

Neisseria meningitidis

71327

HUCA

2013

Clin

Tabla 1. Description de los patogenos clinicos. a lnh, rif, emb. b lnh, rif, emb, str, amk, kan, cap c Amp, amo/clav, er y , cot, cip, fos, nitro. Amk amikacina; amo: amoxicilina; amp: ampicilina; cap: capreomicina; cip: ciprofloxacina; clav: acido clavulanico; clin: clindamicina; cot: cotrimoxazol; emb: etambutol; er y : eritromicina; fos: fosfomicina; inh: isoniazida; kan: kanamicina; nitro: nitrofurantoina; quin: quinolonas; rif: rifampicina; str: estreptomicina; tet: tetraciclina.

Algunos de ellos han sido aislados e identificados en los laboratorios de microbiologla cllnica a partir de muestras obtenidas de pacientes con infecciones cllnicas. El medio Mueller-Hinton (Biomedics) fue utilizado en los bioensayos frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Micrococcus luteus, Haemophilus influenzae, siendo suplementado de acuerdo a las condiciones CLSI (CLSI, Clinical and Laborator y Standards lnstitute, documento M100-S24 2014) para

Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Neisseria meningitidis, Tripticaseina de soja con sangre de carnero al w/5% (DIFCO) fue usada para Cor y nebacterium urealyticum. Brucella Broth (SIGMA) suplementado con hemina (5 pg/ml) , vitamina K1 (1 pg/ml) y sangre de caballo sometida a lisis (5% v/v) fue usada para Bacteroides fragilis y Clostridium perfringens.

Para la mayorla de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, se realizaron los ensayos antimicrobianos segun normas del protocolo CLSI. Las pruebas de sensibilidad de Mycobacterium tuberculosis se realizaron en medio agarificado Middlebrook 7H10 suplementado con OADC al 10% y glicerol al 0, 5% de acuerdo al metodo de proportion en agar para micobacterias de lento crecimiento (CLSI documento M24-A2, 2011).

Ejemplo 2. Resultados

Taxonomia de la cepa M-227

El 16S rDNA de la cepa productora M-227 fue amplificado mediante reaction en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciado. El analisis de la secuencia demostro una identidad del 99, 9% con Pseudonocardia carboxydivorans Y8. El arbol filogenetico generado por el metodo "neighbor-joining", basado en la secuencia del gen 16S rRNA, revelo claramente la relation evolutiva de la cepa M-227 con un grupo de especies conocidas del genero Pseudonocardia (Figura 1). Por lo tanto, esta cepa fue senalada como Pseudonocardia carboxydivorans M-227.

Aislamiento y purification de branimicinas B y C guiados por bioactividad

Los cultivos se centrifugaron, se descartaron los sedimentos y los sobrenadantes fueron filtrados y aplicados a un cartucho de extraction en fase solida (Sep-Pak Vac C18, 10 g, Waters). El material retenido se eluyo con una mezcla de metanol y 0, 05% de acido trifluoroacetico (TFA) en agua. Un gradiente lineal de 0 a 100% metanol en 60 min, a 10 ml/min, fue utilizado. Las fracciones fueron recogidas cada 5 minutos y su actividad antibiotica fue detectada por la prueba de difusion en disco, utilizando Micrococcus luteus como microorganismo indicador. La mayor parte de la actividad fue localizada en las dos fracciones recogidas entre 15 y 25 minutos, que se evaporaron en vaclo y el material seco fue posteriormente redisuelto en 3 ml de DMSO y m etanol (1:1). Muestras (100 pI) de las fracciones activas fueron cromatografiadas en una columna SunFire C18 (10 pm, 10 x 250 mm, Waters) con acetonitrilo y 0, 05% TFA en agua como solventes. La elucion se realizo con un gradiente lineal de 20 a 100% de acetonitrilo en 10 min, a 5 ml/min, y el eluyente se recogio en fracciones recolectadas cada 10 segundos. Una vez mas, la actividad antibiotica de estas fracciones fue localizada por bioensayo y posteriormente todo el material activo fue cromatografiado en inyecciones multiples en las mismas condiciones. Se agruparon las fracciones activas recogidas, correspondientes a los mismos tiempos de retention, se diluyeron cuatro veces con agua y se desalaron y concentraron por extraccion en fase solida (Sep-Pak C18, Waters). El analisis por UPLC de estas fracciones indico que la actividad antibiotica parecio correlacionarse con la presencia de dos picos principales. Estos picos se purificaron aun mas usando la misma columna y solventes, pero esta vez fue empleada una elucion isocratica con acetonitrilo al 20%. Los compuestos purificados se diluyeron con agua y se extrajeron en fase solida como se indica arriba. Finalmente, fueron disueltos en una mezcla de agua y tert-butanol (1:1) y liofilizados. Los rendimientos resultantes fueron de 58, 6 mg de branimicina By 61, 7 mg de branimicina C.

Branimicina B: solido blanco; [a]20D +106.6° (c 0.1, CHCI3) ; IR (ATR) umax 3419, 3038, 2961, 2929, 2878, 2832, 1719, 1457, 1378, 1248, 1147, 1117, 1082, 1030, 984, 944, 890 cm-1; para los datos de 1H y 13C RMN ver Tabla 2; HRESIMS m/z 456.2596 (M+NHJ+ (calcd. para C23H38NO8+, 456.2592) , 439.2326 [M+H]+ (calcd. para C23H35O8+, 439.2326) , 5 421.2222 [M-H2O+H]+ (calcd para C23H33O7+, 421.2221).

Branimicina C: solido blanco; [a]20D +101.2° (c 0.1, CHCI3) ; IR (ATR) Umax 3422, 3038, 2961, 2931, 2879, 2833, 1722, 1457, 1386, 1248, 1140. 1118, 1083, 1030, 979, 945, 889 cm-1; para los datos de 1H y 13C RMN ver Tabla 2; HRESIMS m/z 486.2709 [M+NHJ+ 10 (calcd. para C24H^NO9+, 486.2698) , 469.2432 [M+H]+ (calcd. para C24H3t09+, 469.2432) , 451.2333 (M-H2O+H]+ (calcd. para C24H35O8+, 451.2326).

** (Ver fórmula) **

Branimicina B

Branimicina C

Posicidn

8C, tipo

6h (Jen Hz|

8c, tipo

8h (J en Hz)

179 6 C

179.5. C

1. CH

10 ddd (10 9 9 6 5 0)

1. CH

08. ddd (10 6 9 6 5 1)

5. CH

03 br d (9 6)

5 CH

02, br d (9 6)

126 4 CH

5.37. dd (9 8, 15)

126 4. CH

36. dd (9 7, 2 0)

131 5. CH

06 dd (9 8. 6 9. 1 3)

131 5. CH

05. dd (9 7, 6 9 1 0)

6. CH

67. br a (6 9)

4 CH

71. brd (6 9)

0 CH

14 d (4 8)

8. CH

09. d (4 8)

4, CH

85, dd (4 8. 4 0)

5, CH

06. dd (4 8, 4 2)

7. CH

2.15. ddq ( 10 8, 4 0, 6 8)

CH

31, m

5. CH

56, m

9, CH

00, d (10 9)

6. CH

47, br s

1. CH

46, d (1 9)

4 C

5. C

133 4. C

133 8 C

138 9. CH

br d (7 6)

138 4 CH

brd (7 6)

2. CH

91, m

1. CH

90, m

8, CH

03. dd (9 9. 6.6)

8, CH

02, dd (10 0, 6, 5)

3, CH

91 br d (9.8)

3. CH

90. br d (9 7)

2, CH2

381, dd, (12 1, 2 5) 3 71. br d (12 1)

2, CH2

79. dd, (12 2, 2 9) 3 70. brd (11 5)

73.5. CH2

3.55. m

48. dd (11.2, 5.0)

5, CH2

55, dd ( 10 6, 8 6) 3 47, dd (8 2, 4 8)

12.9, CH3

1.03, d (6 8)

3, CH2

76, dd ( 9 5, 4 6) 3 63, dd (9 5, 5 6)

8, CH3

1.68. S

8, CH3

1.70, s

15.1, CH3

26 d (6 9)

1, CH3

25, d (6 8)

2, CH3

3.31, s

1, CH3

3.30, s

-

-

1. CH3

35. s

Tabla 2. Espectros 1H y 13C de RMN para las branimicinas B y C (500 MHz, CDCl3).

Actividad antimicrobiana de las branimicinas B y C

La actividad antimicrobiana de las branimicinas By e fue probada contra un grupo de patogenos humanos (Tabla 1). Algunos de ellos fueron aislados e identificados en 10 laboratorios de microbiologla cllnica a partir de muestras obtenidas de pacientes con infecciones cllnicas.

La Tabla 3 muestra las concentraciones inhibitorias mlnimas (CIM). Ambos compuestos exhiben actividades moderadas contra las bacterias Gram-positivas Cor y nebacterium 15 urealyticum y Clostridium perfringens. La branimicina B mostro actividades moderadas contra las Gram-negativas Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Escherichia coli ESS y Bacteroides fragilis ATCC 25285 y fuerte actividad contra la Gram- positiva Micrococcus luteus, con un valor de CIM de 1 pg ml-1. La branimicina C mostro actividades moderadas contra las Gram-positivas Enterococcus faecalis 10544, 20 Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 6538P y Micrococcus luteus, y la Gram-negativa Neisseria meningitidis.

Branimicina B

Branimicina C

Gram-positivas

Clostridium perfnngens 103281

Cor y nebactenum urealyticum 1492

Enterococcus faecahs 10544

>64

Micrococcus luleus ATCC 14452

Staphykxxccus aureus ATCC 6538P

>128

Staphylococcus aureus ATCC 25923

>64

Gram-nagativas

Bacteroides fragilis ATCC 25285

Eschenchla coh ESS

Haemophilus influenzae ATCC 49247

>64

Neissena meningitidis

Tabla 3. Concentration inhibitoria minima (CIM) frente a un panel de patogenos cilnicos.

En conclusion, dos nuevos antibioticos, las branimicinas B y C, fueron aislados y caracterizados a partir de una actinobacteria abisal, Pseudonocardia carboxydivorans M- 227, aislada de la columna de agua a 3.000 m de profundidad en el mar Cantabrico. Estos compuestos exhiben importantes actividades inhibitorias contra diversas bacterias patogenas, tanto Gram-positivas como Gram-negativas, aisladas de los principales 10 Hospitales (HUCA y Cabuenes) de la misma region geografica. Estos resultados son un ejemplo de la relevancia de los productos naturales marinos como candidatos para el tratamiento de bacterias patogenas resistentes a los antibioticos.

1. Cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans M-227 depositada en la Coleccion Espanola de Cultivo Tipo bajo el numero de acceso 9108.

2. Sobrenadante de un cultivo de la cepa segun la reivindicacion 1.

3. Uso de la cepa segun la reivindicacion 1 para la produccion de compuestos de formula general (I) o cualquiera de sus sales: OH

** (Ver fórmula) **

donde: R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

4. Procedimiento para la obtencion de un compuesto de formula general (I) , o cualquiera de sus sales, descrito en la reivindicacion 3, que comprende:

a. Cultivar la cepa segun la reivindicacion 1 en un medio de cultivo en condiciones de fermentacion, y

b. Purificar el compuesto de formula (I) producido por la cepa en cultivo de la etapa (a).

5. Compuesto de formula general (I) :

Claims

ES-2585929_B1

1. Cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans M-227 depositada en la Colección Española de Cultivo Tipo bajo el número de acceso 9108.

5

2. Sobrenadante de un cultivo de la cepa según la reivindicación 1.

3. Uso de la cepa según la reivindicación 1 para la producción de compuestos de

fórmula general (I) o cualquiera de sus sales: OH

10

donde: R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3. 15

4. Procedimiento para la obtención de un compuesto de fórmula general (I) , o cualquiera de sus sales, descrito en la reivindicación 3, que comprende:

a. Cultivar la cepa según la reivindicación 1 en un medio de cultivo en condiciones de 20 fermentación, y

b. Purificar el compuesto de fórmula (I) producido por la cepa en cultivo de la etapa (a).

25

5. Compuesto de fórmula general (I) :

o cualquiera de sus sales,

5

donde: R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

6. Composición que comprende el sobrenadante según la reivindicación 2 o el compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 5.

10

7. Composición según la reivindicación 6, que además comprende otro agente antibacteriano y/o antifúngico.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, donde la composición es una composición farmacéutica o cosmética y además comprende un excipiente o 15 vehículo farmacéutica o cosméticamente aceptable.

9. Uso del sobrenadante según la reivindicación 2, del compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 5 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la elaboración de un medicamento. 20

10. Uso del sobrenadante según la reivindicación 2, del compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 5 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas. 25

11. Uso según la reivindicación 10, donde las infecciones bacterianas son provocadas por bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Cor y nebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria 30 meningitidis.

12. Uso según la reivindicación 11, donde la bacteria es Micrococcus luteus.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde las bacterias son bacterias resistentes a antibióticos.

5

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde el compuesto de fórmula (I) es un compuesto donde R1 es -CH3 y la bacteria es Micrococcus luteus.

15. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del sobrenadante según la reivindicación 2, del compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 5 o de la composición según 10 cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la eliminación y/o prevención de la formación de biopelículas bacterianas sobre superficies inertes.

16. Uso según la reivindicación 15, donde las biopelículas bacterianas son provocadas por bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, 15 Cor y nebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria meningitidis.

17. Uso según la reivindicación 16, donde la bacteria es Micrococcus luteus. 20

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde el compuesto de fórmula (I) es un compuesto donde R1 es -CH3 y la bacteria es Micrococcus luteus.

ES-2585929_A1

** (Ver fórmula) **

o cualquiera de sus sales, donde: R1 es un grupo -CH2Ra y Ra se puede seleccionar entre H o el grupo -OCH3.

6. Composition que comprende el sobrenadante segun la reivindicacion 2 o el compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 5.

7. Composicion segun la reivindicacion 6, que ademas comprende otro agente antibacteriano y/o antifungico.

8. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, donde la composicion es una composicion farmaceutica o cosmetica y ademas comprende un excipiente o vehlculo farmaceutica o cosmeticamente aceptable.

9. Uso del sobrenadante segun la reivindicacion 2, del compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 5 o de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la elaboracion de un medicamento.

10. Uso del sobrenadante segun la reivindicacion 2, del compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 5 o de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la elaboration de un medicamento para el tratamiento y/o prevention de infecciones bacterianas.

11. Uso segun la reivindicacion 10, donde las infecciones bacterianas son provocadas por bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Cor y nebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria meningitidis.

12. Uso segun la reivindicacion 11, donde la bacteria es Micrococcus luteus.

13. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde las bacterias son bacterias resistentes a antibioticos.

14. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde el compuesto de formula (I) es un compuesto donde R1 es -CH3 y la bacteria es Micrococcus luteus.

15. Uso de la cepa segun la reivindicacion 1, del sobrenadante segun la reivindicacion 2, del compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 5 o de la composition segun

cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, para la elimination y/o prevention de la

formation de biopellculas bacterianas sobre superficies inertes.

16. Uso segun la reivindicacion 15, donde las biopellculas bacterianas son provocadas

por bacterias seleccionadas de la lista que consiste en: Clostridium perfringens, Cor y nebacterium urealyticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae o Neisseria

meningitidis.

17. Uso segun la reivindicacion 16, donde la bacteria es Micrococcus luteus.

18. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde el compuesto de formula (I) es un compuesto donde R1 es -CH3 y la bacteria es Micrococcus luteus.

I

Pseudonocordia nitrificons PI 33 {KP338818) Pseudonocardia antitumoralis SCSIO 01299 (JN204514)

eel Pseudonocardia compacta IMSNU 20111T (AJ252825) Pseudonocardia antarctico 13675 (JN180177)

Pseudonocardia carboxydivorans M-227 (LN824219)

Pseudonocardia alni DSM 44104 (NR_117429)

Pseudonocordia konqjuensis OAct415 (KC514123)

I Pseudonocardia ammonioxydans H9 (AY500143)

Pseudonocardia tropica Yl M 61452 (N R_ 104541) Pseudonocardia autotrophica (AJ 252824)

| Ps<

n_

<4-

rsi

h

H

Search Report

ES-2585929_B1

Clasificación:
C12N1/20 (2006.01)
C07D493/10 (2006.01)
C12P17/18 (2006.01)
A61K31/365 (2006.01)
A61K35/74 (2015.01)
A61P31/04 (2006.01)
A61P31/10 (2006.01)
C12R1/01 (2006.01)

El presente informe ha sido realizado para las siguientes reivindicaciones: TODAS
Fecha de realización del informe: 26.09.2016
Examinador: G. Esteban García

Categoría	Documentos citados	Reivindicaciones afectadas
A	WO 2015/028095 A1 (GALAPAGOS NV) 05.03.2015, Párrafos [0001], [0010], [0091], [0282]-[0283]; página 75, tabla 1A; tabla 1B.	1-18
A	IKO?, A. et al. "Reinvestigation of the Branimycin Stereochemistry at Position 17-C". Organic Letters 2016, Volumen 18, páginas 780-783. [Publicado el 05.02.2016]. Ver página 780.	1-18
A	MULZER, J. et al. "Toward the Synthesis of the Antibiotic Branimycin: Novel Approaches to Highly Substituted cis-Decalin Systems". Chemistry: A European Journal 2006, Volumen 12, páginas 5992-6001. [Disponible en línea el 19.05.2016]. Ver página 5992, resumen e introducción.	1-18
A	TANVIR, R. et al. "Rare actinomycetes Nocardia caishijiensis and Pseudonocardia carboxydivorans as endophytes, their bioactivity and metabolites". Microbiological Research 2016, Volumen 185, páginas 22-35. [Disponible en línea el 23.01.2016]. Ver página 22, resumen; página 27, tabla 4; página 33, conclusiones.	1-18

Categoría de los documentos citados
X: de particular relevancia		O: referido a divulgación no escrita
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría		P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud
A: refleja el estado de la técnica		E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

C12N, C07D, C12P, A61K, A61P, C12R

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, TXTE, REGISTRY, HCAPLUS, NPL, XPESP, EMBASE, MEDLINE, BIOSIS, GOOGLE PATENTS, GOOGLE SCHOLAR

Written Opinion

ES-2585929_B1

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 26.09.2016

Declaración
Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)	Reivindicaciones	1-18	SÍ
	Reivindicaciones		NO
Actividad inventiva (Art. 8.1 LP 11/1986)	Reivindicaciones	1-18	SÍ
	Reivindicaciones		NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento	Número Publicación o Identificación	Fecha Publicación
D01	WO 2015/028095 A1 (GALAPAGOS NV)	05.03.2015
D02	IKO?, A. et al. Organic Letters 2016, Vol. 18, pp. 780-783	05.02.2016
D03	MULLZER, J. et al. Chemistry: A European Journal 2006, Vol. 12, pp. 5992-6001	19.05.2016
D04	TANVIR, R. et al. Microbiological Research 2016, Vol. 185, pp. 22-35	23.01.2016

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

El objeto de la invención es una cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans, el sobrenadante de un cultivo de esta cepa; el uso de la cepa para la producción de compuestos de fórmula general (I) ; un procedimiento para la obtención del compuesto (I) mediante la cepa bacteriana; el compuesto de fórmula general (I) ; una composición que comprende el sobrenadante; el uso del sobrenadante o de la composición que lo comprende para la elaboración de un medicamento; y el uso de la cepa, del sobrenadante, del compuesto de fórmula (I) o de la composición que comprende el sobrenadante para la eliminación y/o prevención de la formación de biopelículas bacterianas sobre superficies inertes.

El documento D01 divulga un compuesto de fórmula general (I) con esqueleto tetracíclico, que cuando A-B es CH=CH-, es similar al esqueleto de branimicina y, por tanto, al del compuesto de la invención, pero que se diferencia de éste en la configuración estereoquímica del carbono en posición 2 y en que el grupo hidroxilo terminal del sustituyente en posición C16 se encuentra en forma de éter metílico (ver párrafo [0010]) . En concreto, se recogen la branimicina (ver página 75, tabla 1A) y derivados de ésta (ver párrafo [0091]; tabla 1B) , la mayoría de los cuales, a diferencia del compuesto de la invención, presentan el grupo hidroxilo en posición 8 protegido en forma de éster.

Estos compuestos, que tienen aplicación para el tratamiento de enfermedades infecciosas (ver párrafo [0001]) , se preparan a partir de la branimicina, producto natural obtenido por fermentación a partir de un cultivo de Saccharothrix xinjiangensis (ver párrafos [0282]-[0283]) .

La diferencia entre la branimicina divulgada en el documento D01 y los compuestos de la invención es que estos últimos tienen configuración estereoquímica opuesta en C-2, además de que el grupo hidroxilo terminal del sustituyente en posición C-16 se encuentra libre y no en forma de éter metílico. Por otro lado, los derivados recogidos en este documento presentan el grupo hidroxilo en posición 8 protegido en forma de éster y no libre, como ocurre en los compuestos de la invención.

El documento D02 divulga un estudio conformacional sobre branimicina que dio lugar a la revisión de la configuración esteroquímica del carbono en posición 17.

Del mismo modo, el documento D03 divulga la branimicina, su origen natural, actividad biológica y un procedimiento para su síntesis.

El documento D04 divulga una cepa identificada como Pseudonocardia carboxydivorans (AGLS 2) asilada como endófito a partir de Ageratum conyzoides, cuyos extractos resultaron tener actividad antribicrobiana frente a Bacillus subtilis DSM, Candida tropicalis, Staphylococcus aureus ATCC, Staphylococcus aureus resistente a Meticilina (MRSA) , Escherichia coli K12 y Chlorella vulgaris. Se realizó también un análisis de los metabolitos presentes, encontrándose borrelidina y 2piranona, tanto en el extracto de micelio como en el cultivo de la cepa (ver página 22, resumen; página 27, tabla 4; página 33, conclusiones) .

Aunque la cepa divulgada en el documento D04 pertenece a la misma especie que la cepa de la invención, la primera es de origen vegetal, mientras que la de la invención se aisló de actinobacterias. Así mismo, los metabolitos producidos por ambas cepas son diferentes, aunque ambos posean actividad antibiótica o antibacteriana.

Los documentos citados muestran sólo el estado de la técnica del campo al que pertenece la invención. Ninguno de ellos, tomado solo o en combinación con los otros, divulga ni contiene sugerencia alguna que pudiera dirigir al experto en la materia hacia el compuesto de fórmula general (I) ( reivindicación independiente 5) ni hacia una cepa bacteriana de Pseudonocardia carboxydivorans ( reivindicación independiente 1) ; y, por tanto, tampoco hacia el sobrenadante de un cultivo de esta cepa ( reivindicación independiente 2) ; el uso de la cepa para la producción del compuesto (I) ( reivindicación independiente 3) ; un procedimiento para la obtención del compuesto (I) mediante la cepa bacteriana ( reivindicación independiente 4) ; una composición que comprende el sobrenadante ( reivindicación independiente 6) ; el uso del sobrenadante o de la composición que lo comprende para la elaboración de un medicamento ( reivindicación independiente 9) ; y el uso de la cepa, del sobrenadante, del compuesto de fórmula (I) o de la composición que comprende el sobrenadante para la eliminación y/o prevención de la formación de biopelículas bacterianas sobre superficies inertes ( reivindicación independiente 16) .

En consecuencia, se considera que el objeto de las reivindicaciones 1-18 reúne los requisitos de patentabilidad (novedad, actividad inventiva y aplicación industrial) establecidos en el Artículo 4.1 de la Ley de Patentes 11/1986.