USO DE EXTRACTO DE HOJA DE MANGO MANGUIFERA INDICA, PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS.
SECTOR DE LA TÉCNICA
Esta invención está relacionada con el empleo del extracto fenólico bioactivo procedente de la hoja de mango (Mangifera indica Linn, MGF a partir de aquí) como tratamiento y/o prevención de, complicaciones del sistema nervioso central (SNC) , relacionadas con proceso neurodegenerativo propio de patologías centrales asociadas al envejecimiento como son los procesos de demencia Adicionalmente, también se relaciona con el empleo del mismo extracto para la elaboración de una composición farmacéutica o nutracéutica útil en el tratamiento de enfermedades del SNC que cursen con inflamación, daño vascular y/o neurodegeneración, como ocurre en la enfermedad de Alzheimer (EA) y en la demencia vascular (DVa). Éstas son las formas más comunes de demencia y suponen aproximadamente el 80% de los casos Es más, la frontera entre ambas es borrosa y en muchos pacientes los marcadores de daño tipo EA coexisten con alteraciones vasculares propias de la DVa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El aumento progresivo de la esperanza de vida está contribuyendo secundariamente al aumento de patologías asociadas a la edad, entre las que la EA y la DVa juegan un papel relevante, debido a su prevalencia y a los costes económicos, sociales y humanos asociados Las características neuropatológicas de la EA incluyen: ovillos neurofibrilares formados por protema tau anormalmente fosforilada, acumulo de p-amiloide (PA) formando placas seniles (PS) y angiopatía amiloide (CAA) alrededor de los vasos, y pérdida neuronal y sinóptica (Serrano-Pozo, A., et al Neuropathological alterations in Alzheimer disease Journal/Cold Sphng Harb Perspect Med 1 a006189. 2011) A esto se añade un proceso inflamatorio, relacionado con la presencia de PS y ovillos La demencia de tipo vascular es la segunda causa más común de demencia Se trata de una patología heterogénea que engloba microinfartos múltiples, enfermedad isquémica de pequeños vasos, daño microvascular (Craft. S The role of metabolic disorders in Alzheimer disease and vascular dementia two roads converged Joumal/Arch Neurol 66 300-305, 2009) o depósito de PA en forma de angiopatía amiloide en torno a los vasos cerebrales (Greenberg, S. M.. et al. Detection of isolated cerebrovascular beta-amyloid with Pittsburgh compound B Journaí/Ann Neurol 64:587-591. 2008) La línea entre EA y DVa es difusa borrosa y en muchos
pacientes los marcadores de daño vascular coexisten con las características marcas histopatológicas de la EA
En la actualidad las demencias, de diferente etiología, y concretamente la EA, no tienen tratamiento exitoso: se recurre al uso de fármacos anticolinesterásicos y antagonistas glutamatérgicos que son tratamientos sintomáticos y que aunque retrasan el deterioro cognitivo no impiden la progresión de la patología en el SNC, ni la neurodegeneración asociada Los tratamientos basados en la hipótesis amíloide, como inhibidores de la p y y secretasas, o las vacunas anti-pA, se han estudiado ampliamente, sin embargo a día de hoy todavía tienen serios problemas de aplicación clínica. De ahí que se requieran urgentemente nuevas alternativas terapéuticas para la población que sufre los procesos de demencia (para revisión ver (Sabbagh, M. and Cummings, J. Progressive cholinergic decline in Alzheimeds Disease consideration for treatment with donepezil 23 mg in patients with modérate to severe symptomatology Joumal/BMC Neurol. 11:21, 2011) ).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención se han enfrentado al problema de proporcionar una terapia exitosa frente a demencias como la EA o la DVa Para ello y a la vista de estudios previos, más que usar una "bala mágica" que revierta completamente su causa, los autores consideran más útil para el tratamiento de este tipo de enfermedades el uso de agentes que controlen varios aspectos relacionados con los procesos inflamatorios o el daño vascular Así, trabajos previos se han centrado en el estudio de compuestos fenólicos naturales Se trata de los grupos de metabolitos secundarios más numerosos en las plantas, con más de 8000 estructuras conocidas (Soobrattee. M. A., et al. Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions Journal/Mutat Res 579 200-213, 2005) que presentan gran actividad antioxidante y antiinflamatoria, entre otras (Nijveldt. R J.. et al Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications. Journal/Am J Clin Nutr 74 418-425. 2001). Debido a estas propiedades, actualmente se considera que los compuestos fenólicos pueden actuar como agentes terapéuticos en un amplio número de patologías relacionadas con el daño de radicales libres y el proceso inflamatorio, que suele ir asociado y que incluye, entre otros, activación microglial, aumento de la producción de citoquinas o daño endotelial. Los compuestos fenólicos pueden encontrarse en casi cualquier parte de las plantas, por tanto los subproductos agroindustnales, como hojas o corteza, son una fuente rica en este tipo de compuestos
En el caso concreto de los subproductos agrícolas de la planta de Mangifera indica Linn, su interés se atribuye a su alta concentración en compuestos fenólicos de alto poder antioxidante (Lmg, L. T, et al Standardised Mangifera indica extract is an ideal antioxidant. Joumal/Food Chemistr y 113 1154-1159, 2008) , considerados como los compuestos responsables de las múltiples propiedades farmacológicas de esta planta. Entre los polifenoles más importantes de la planta de mango, en términos de capacidad antioxidante y cantidad, se encuentran la mangiferina y quercetina, aunque esta planta contiene otros polifenoles en menor proporción como catequmas, kaempferol, antocianinas, ácido gálico y ácido benzoico La mangiferina, de la familia de las xantonas, presenta interesantes propiedades nutraceúticas y farmacológicas, como capacidad antiinflamatoria, antioxidante, antibacteriana o con actividad prometedora en el tratamiento de enfermedades como la diabetes (Benard, O and Chi. Y Medicinal properties of mangiferin, structural features. denvative synthesis, pharmacokinetics and biological activities. Journal/Mini Rev Med Chem. 15:582-594. 2015;Pal, P B. et al Mangiferin attenuates diabetic nephropathy by inhibiting oxidative stress mediated signaling Cascade. TNFalpha related and mitochondnal dependent apoptotic pathways in streptozotocin-induced diabetic rats. Journal/PLoS One 9:e107220, 2014 Wang. H L. et al Mangiferin facilitates islet regeneration and beta-cell proliferation through upregulation ofcell cycle and beta-cell regeneration regulators. Journal/lnt J Mol Sci 15:9016-9035. 2014). La quercetina es un flavonoide que posee propiedades antioxidantes y anticancerígenas asi como efectos en la regulación de la expresión génica (Masibo. M. and He, Q Major Mango Polyphenols and Their Potential Significance to Human Health Journal/Comprenhensive Reviews in Food Science and Food Safety 7:309-319, 2008) En la bibliografía se describen propiedades antiespasmódicas, antipiréticas, antiinflamatorias, antimicrobianas, antifúngicas. antidiabéticas, inmunomoduladoras, analgésicas, antioxidantes y antidiarreicas (Aderibigbe, A O., et al Evaluation ofthe antidiabetic action of Mangifera indica in mice Joumal/Phytother Res. 15:456-458, 2001 Amazzal, L, et al. Mangiferin protects against 1 -methyl-4-phenylpyridinium toxicity mediated by oxidative stress in N2A cells. Joumal/Neurosci Lett. 418:159-164. 2007;Garrido, G.. et al. In vivo and in vitro anti-inflammator y activity of Mangifera indica L extract (VIMANG) Journal/Pharmacol Res 50:143-149, 2004).
El proceso de extracción a alta presión de los polifenoles presentes en la hoja de Mangifera indica Linn y su composición exacta se ha descrito previamente en la patente ES 2464192 A1 Extractos fenólicos de Mangifera indica Linn, procedimiento de obtención y usos, Mantell Serrano, C., Fernandez-Ponce, T, Casas Cardoso, L., Martínez de la Ossa, E describe un procedimiento que permite obtener extractos de Mangifera indica Linn enriquecidos en compuestos fenólicos. como mangiferina y quercetina mediante el empleo de disolventes verdes, como son dióxido de carbono, agua, y etanol, bajo condiciones sub-
o supercriticas a elevada presión y temperatura, evitando el uso de cantidades de disolventes orgánicos considerados como perjudiciales para la salud y el ambiente El extracto se caracteriza por presentar un contenido fenólico mínimo de mangiferina y quercetina de 1, 93 y 0, 88% respectivamente, asi como la presencia de compuestos 5 minoritarios.
Los autores de la presente invención se han dado cuenta que los polifenoles presentes en la hoja de Mangifera indica Linn son extraordinariamente útiles en el tratamiento y profilaxis de enfermedades neurodegenerativas asociadas a patología vascular del sistema nervioso central como la enfermedad de alzheimer o que cursan con demencia vascular cerebral 10
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Análisis HPLC. Análisis HPLC por columna de fase reversa Sinergy Hidro RP para el extracto fenólico obtenido en el ejemplo 1, con identificación de los picos cromatográficos correspondientes a los compuestos fenólicos mangiferina y 3- (3-D-glucosil- 15 quercetina de acuerdo a su tiempo de retención (tr=20min para mangiferina y tr=34, 4 min para 3-P-D-glucosil-quercetina).
Figura 2: Espectros de masas. Espectros de masas de compuestos fenólicos presentes en extractos de Mangifera indica Linn realizados en equipo LC-ES-MS cuadrupolo-ES negativo modo SIM
Figura 3: Análisis LC-ES-MS y LC-UV Análisis LC-ES-MS y LC-UV para los patrones de posibles compuestos fenólicos presentes en los extractos sub- o supercriticos de hojas de Mangifera indica Linn
Figura 4. El tratamiento crónico con MGF durante 20 semanas mejora las alteraciones cognitivas en ratones db/db y APP/PS1. A) La memoria episódica, valorada mediante el 25 test NOD, mostró una mejoría de los ratones db/db tratados con MFG para todos los parámetros en estudio mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b o Tamhane, según se requería: "qué" [F (3104) =41 043, **p<0.01 vs. resto de grupos, ttp<0 01 vs Control-Sham y Control-MFG], "dónde" [F (3107) =20.752, ttpO.01 vs. Control-Sham y Control-MGF] y "cuándo" [F (310º) =17 451, **p<0 01 vs resto de grupos, ttP<0.01 vs 30 Control-Sham y Control-MGF). B) Un efecto similar observamos en ratones APP/PS1, modelo de EA, tratados con MGF, que mostraron una mejoría significativa en la memoria episódica, valorada mediante NOD Diferencias detectadas mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b o Tamhane, según se requería: "qué" [F (3135) =18.62, **p<0.01 vs. resto de grupos, ttp<0 01 vs. Control-Sham y Control-MGF]., "dónde" [F (3, 28) =22.87, 5
**p<0.01 vs. resto de grupos, ttP<0.01 vs. Control-Sham y Control-MGF] y "cuándo" [Fp.i23r2.61, p=0.054] C) El aprendizaje espacial, valorado en la fase de adquisición del laberinto acuático de Morris, también reveló una mejoría en los animales db/db tratados con MGF. El análisis diario mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b o Tamhane, según se requería, reveló una mejora significativa en el tiempo que requerían los animales db/db tratados con MGF para encontrar la plataforma oculta (dial: [F (7156) =2.319, p=0 078], día 2 [F (3153) =13 155, ttp<0 01 vs Control-Sham y Control-MGF, $tp<0 01 vs. Control-Sham], día 3 [F (3145) =20 5262, **p<0 01 vs resto de grupos, ttp<0.01 vs. Control- Sham y Control-MGF], día 4 [F (37153) =24.062, **p<0.01 vs. reto de grupos, ffp<0 01 vs Control-Sham y Control-MGF]. D) Un perfil de mejoría similar observamos en ratones APP/PS1 tratados con MGF de modo crónico El análisis diario mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b o Tamhane, según se requería, reveló una mejora significativa en el tiempo que empleaban los animales APP/PS1 tratados con MGF para encontrar la plataforma oculta (día 1 [F (3184) =2 007, p=0 115], día 2: [F (3, 182) =8.16, ttP<0 01 vs Control y Control-MGF], día 3: [F (3159) =3.13, tp<0.05 vs. Control y Control-MGF], día 4 [Fp.ie4r9.88, **p<0.05 vs resto de grupos, típ<0 01 vs. Control]. E) Al valorar la memoria espacial en la fase de retención del laberinto acuático de Morris, tanto 24 h como 72 h tras concluir la adquisición, observamos una recuperación en el tiempo que los animales pasaban en el cuadrante en el que originariamente se encontraba la plataforma (cuadrante 2) : análisis mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b o Tamhane, según se requería (retención 24h. [F (737) =3 1 3, p=0.037, fp<0 05 vs. Contro-sham y Control-MGF], retención 72 horas: [F (7156) =2.319, p=0 078], day 2 [F (334) =3.29, *p=0 032]). F) En la fase de retención para los ratones APP/PS1 también observamos una mejora significativa tras el tratamiento crónico con MGF, mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b o Tamhane, según se requería (retención 24h [F (737) =3.13, p=0 037, fpcO.05 vs Control- Sham y Control-MGF, 72 h: [F (3«0) =4 40, **p=0.009 vs. resto de grupos].
Figura 5. El tratamiento crónico con MGF mejora la atrofia cerebral propia de ratones db/db. A) Observamos una leve mejoría en el peso cerebral de los animales db/db tratados con MGF. aunque las diferencias no resultaron significativas mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b [F (333) =161 65, ttp<0 01 vs. Control-Sham Control-MGF]. B) Imagen representativa de tinción cresil violeta en los diferentes grupos en estudio, en los que se puede ver la reducción del grosor cortical en un ratón db/db, y la mejoría tras el tratamiento con MGF Escala= 250 pm C) El análisis de la corteza mediante tinción cresil violeta reveló que el tratamiento con MGF es capaz de revertir la atrofia cortical observada en ratones db/db y también observamos mejora en los ratones db/db-MGF cuando comparamos el grosor hipocámpico Diferencias detectadas mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b Corteza [F (3612) =9 63, **p<0 01 vs resto de grupos], hipocampo
[F, 3, 3, 7, =4.29. $tp=0 06 vs Control-Sham] D) El aumento de la actividad caspasa 3/7 en la corteza en ratones db/db se reduce significativamente tras el tratamiento con MGF [F<3.22) =4.24, *p=0.016 vs resto de los grupos]. De forma similar en el hipocampo, la actividad caspasa3/7 está reducida, aunque las diferencias no resultan estadísticamente significativas [F (322) =1 52, p=0 23], Los datos son la media de 6-8 ratones y las diferencias estadísticas se han detectado mediante ANOVA de una vía seguida de un test b de Tuckey
Figura 6. El tratamiento crónico con MGF disminuye la hiperfosforilación cortical de tau en ratones modelo de DM2 (db/db). A) El aumento de la fosforilación de tau cortical observada en ratones db/db se ve parcialmente disminuida tras el tratamiento crónico con MGF [F (320) =4 37, ffpOO 016 vs Control-Sham y Control-MGF] B) Imagen representativa de los niveles de fosfo-tau, tau total y actina en corteza procedente de los 4 grupos de animales en estudio: Control-Sham, Control-MGF, db/db-Sham y db/db-MGF C) El aumento de la fosforilación de tau cortical observada en ratones APP/PS1 se ve parcialmente disminuida tras el tratamiento crónico con MGF, aunque las diferencias no resultaron estadísticamente significativas] [F (317) =1.33, p=0.295]
Figura 7. El tratamiento crónico con MGF disminuye la presencia de hemorragias espontáneas en ratones modelo de DM2 (db/db). A) El aumento de la carga hemorrágica cortical (% área afectada) , propio de ratones db/db, disminuye significativamente tras el tratamiento crónico con MGF [F (3 m) =12.70, **p<0.01 vs. resto de grupos] Este hecho es debido a un aumento de hemorragias [F (3112) =12.48, **p<0 01 vs resto de grupos], ya que el tamaño no se ve afectado [F, 3 3147) =0 541, p=0.654] Diferencias detectadas mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b B) Imagen representativa de la corteza de un ratón control, un ratón control tratado con MGF, un ratón db/db y un ratón db/db MGF, donde se aprecia una disminución de las hemorragias espontáneas (señaladas con flechas verdes) en los ratones db/db-MGF Escala= 50 pm C) Un perfil similar observamos en el hipocampo, y aunque la disminución de la carga hemorrágica no alcanzó diferencias significativas [F<3 52) =12.70, p=0.087], la densidad de hemorragias fue significativamente menor tras el tratamiento con MGF de los ratones db/db [F (355) =4 23. **p=0.009 vs. resto de grupos], Al igual que en la corteza el tratamiento no MGF no influyó en el tamaño de las hemorragias [F (3 4a9) =0 541, p=0262]. Diferencias detectadas mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b
Figura 8. El tratamiento crónico con MGF disminuye el proceso inflamatorio en el SNC en ratones db/db y APP-PS1. A) El aumento de carga microglial cortical en ratones db/db es controlado por el tratamiento con MGF [F (31585) =12 06, **p<0 01 vs resto de grupos, ttP<0 01 vs. Control-Sham y Control-MFG] y este efecto es debido a una reducción del 5
tamaño de las células microgliales [F (38i23»=12 06, **p<0 01 vs. resto de grupos, ttP^.OI vs. Control-Sham y Control-MFG], mientras que el número de células microgliales /mm2 no se vio alterado [F<31561|=43.03, ttP<0 01 vs. Control-Sham ay Control-MFG]. Diferencias detectadas mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b o Tamhane según se requería B) Un perfil similar se observó en el hipocampo, donde el tratamiento con MGF redujo la carga microglial [F (3312) =7.19, **p<0.01 vs. resto de grupos] y el tamaño de las células microgliales [F (3-1767) =5.87, **p<0 01 vs resto de grupos] mientras que la densidad de las mismas no se vio alterada [F (31313) =14 60, **p<0 01 vs resto de grupos, tTp<0.01 vs. Control-Sham] Diferencias detectadas mediante ANOVA de un criterio seguida de test Tuckey b o Tamhane según se requería. C) Imágenes representativas de la inmunotinción de microglía cortical (verde) con anticuerpo anti-IBA1 en la que se aprecia una disminución de la carga microglial y del tamaño de las células microgliales tras el tratamiento con MGF. D) La carga microglial aumentaba en la corteza de los animales APP-PS1. El tratamiento con manguiferina reducía significativamente la carga microglial en la corteza Este efecto se detectaba en áreas libres de placas seniles [F (3, 1693) =157 30, **p<0.01 vs. resto de grupos of the groups, ttP<0.01 vs control-sham y control-MGF, fctp<0 01 vs control-sham] y a pesar de que cerca de las placas podía observarse una reduciión similar, no resultaba estadísticamente significativa (p=0 367). La reducción de la carga microglial se debía a una reducción en el número de las células microgliales lejos de las placas seniles [F (3, 1748) =912.83, **p<0 01 vs. resto de grupos, ttp<0.01 vs control-sham y control-MGF], (p=0 480 cerca de placas) mientras que el tamaño de las células se mantenía entre los diferentes grupos (cerca de placas seniles p=0 06, lejos de placas seniles [F (83.10954) =2.46, p=0.06]. Los da tos representan la media de 5-6 ratones y las diferencias se detectaron mediante un test T-student paa muestras independientes o ANOVA de una vía seguida de test b de Tuckey. E) Un perfil similar se observaba en el hipocampo donde la carga microglial estaba reducida en los ratones tratados con MGF Estas diferencias eran estadísticamente significativas lejos de las placas seniles [F (3, 333) =44 03, **p<0 01 vs. resto de grupos, ftp<0.01 vs control-sham y control-MGF, ] y a pesar de que un perfil similar se podía observar en las proximidades de las placas, las diferencias no llegaban a ser estadísticamente significativas (p=0 085). La reducción de la carga microglial se debía al reducido número de células microgliales (lejos de placas seniles [F (3, 332) =145.13, **p<0.01 vs. resto de grupos, tíP<0.01 vs. control-sham y control-MGF], (p=0 441 cerca de placas seniles). EL tamaño cellular individual se mantenía entre los diferentes grupos (cerca de placas seniles p=0 073, lejos de placas seniles [F (3, 2166) =2 25, p=0.081], los datos representan una media de 5-6 ratones y las diferencias se detectaron mediante un test T-de Student para muestras independientes or o mediante ANOVA de una vía seguida de un test b de Tuckey
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención supone una alternativa para el tratamiento de las complicaciones en el SNC asociadas a daño vascular y/o a procesos neurodegenerativos, mediante tratamiento con un extracto fenólico obtenido a partir de hojas y/o ramas de Mangifera indica Linn mediante técnicas de alta presión (caracterizado en la patente ES 2464192 A1).
Este extracto en el SNC reduce el proceso inflamatorio, limita la atrofia cortical e hipocámpica, disminuye la hiperfosforilación de tau y controla la presencia de hemorragias espontáneas Todo ello se traduce en una mejoría de las alteraciones cognitivas propias de los procesos de demencia, tales como EA o DVa
A continuación detallamos de forma exhaustiva la forma de obtención del extracto de la invención (obtenido a partir de hojas y/o ramas de Mangifera indica Linn mediante técnicas de alta presión) , los ejemplos incorporan información adicional con respecto a este extracto
Procedimiento de obtención
i) Preparación de las hojas y ramas de Mangifera indica Linn:
Se parte de hojas y/o ramas de Mangifera indica Linn húmeda o seca. El secado se puede realizar al ambiente o en horno. La materia prima se almacena en condiciones de refrigeración o congelación y posteriormente es molida para reducir su tamaño
ii) Extracción de hojas y/o ramas de Manqifera indica Linn con disolventes sub- o supercrlticos:
Las ramas y hojas secas y molidas se someten a un proceso de extracción en continuo con disolventes verdes a alta presión
Como sistema disolvente se emplean mezclas de dióxido de carbono supercrítico (C02-SC) con agua y/o disolventes hidro-alcohólicos y/o alcohólicos Como alcoholes se utilizan metanol o etanol, utilizando preferentemente el etanol por ser un disolvente GRAS (Generally Recognized as Safe). El porcentaje de C02 se fija entre 0-100% p/p, el de agua entre 0-100% p/p y de igual forma el de etanol, dando lugar a diferentes mezclas de disolventes El sistema disolvente se somete a un flujo entre 5-40 g/min dependiendo del tamaño de la planta de extracción.
El uso de C02 en el proceso de extracción aumenta la eficiencia del proceso, reduce los tiempos de extracción, minimiza el uso de disolventes líquidos, reduce las etapas de concentración, y permite conservar las propiedades de los compuestos bioactivos.
La temperatura de extracción se fija entre un rango de 35-140 °C, considerando una temperatura superior al punto critico del C02 y no muy elevada para evitar degradación de compuestos termolábiles Se utiliza preferiblemente un rango entre 80-100 °C
La presión se fija entre 10-40 MPa, considerando una presión superior al punto crítico del C02, preferentemente en un rango entre 10-20 MPa.
El tiempo de extracción está en el intervalo de 1 a 3 horas, preferentemente entre 1, 5-2 horas, para un flujo de disolvente en un rango de 5-40 g/min dependiendo del tamaño de la planta de extracción
El proceso extractivo con C02-SC se realiza protegido de la luz y en ausencia de oxigeno, esto previene el inicio de reacciones de oxidación y evita posibles degradaciones de los compuestos fenólicos. Ventaja adicional que ofrece el uso de C02 en el sistema disolvente
El rendimiento de extracción global obtenido con el proceso extractivo oscila entre el 1-50 g/100g de materia seco El uso de C02-SC como disolvente único permite muy bajos rendimientos de extracción La adición de modificadores polares como agua y/o etanol permite obtener mayores rendimientos de extracción, llegando a rendimientos del 42% cuando se utiliza como sistema disolvente una mezcla de C021 0, 5:0, 5
Los extractos obtenidos en esta etapa ya pueden ser utilizados en aplicaciones cosméticas y alimentarias por que presentan contenido fenólico mínimo entre 1, 93% y 0, 88% de mangiferina y quercetina respectivamente, así como potentes propiedades antioxidantes con un IAA mínimo de 4, 0, superior al IAA del tocoferol iii) Obtención de los extractos secos de hojas y/o ramas de Mangifera indica Linn
Los extractos sub- o supercríticos de Mangifera indica Linn obtenidos se pueden secar de diversas formas, teniendo en cuenta que siempre se realice preferentemente a temperaturas inferiores a 40 °C Se contemplan como formas de secado la evaporación a vació, secado con nitrógeno, la liofilización o el secado por precipitación empleando fluidos supercríticos Se utiliza preferentemente el secado con nitrógeno a temperatura ambiente que evita la oxidación de los compuestos antioxidantes
Los extractos se almacenan refrigerados o congelados, preferentemente a -4 °C, y protegidos de la luz para evitar posibles alteraciones en el contenido fenólico, así como en las propiedades antioxidantes/antirradicalarias de los extractos
La tabla 1 muestra que los compuestos fenólicos predominantes presentes en el extracto de Mangifera indica Linn obtenido por técnicas a alta presión fueron en primer lugar la 3-C- (3-D- glucosil iriflofenona, seguida del ácido gálico y en tercer lugar la mangiferina. Este extracto favorece el control metabólico, limitando el peso corporal y manteniendo la actividad p-
pancreática, caracterizada por niveles de péptido C Esto se traduce en niveles mantenidos de insulina Además, en el SNC reduce el proceso inflamatorio, limita la atrofia cortical e hipocámpica. disminuye la hiperfosforilación de tau y controla la presencia de hemorragias espontáneas Todo ello se traduce en una mejoria de las alteraciones cognitivas propias de 5 los procesos de demencia, tales como los asociados a alteraciones metabólicas, EA o DVa
Tablal. Composición fenólica característica del extracto de Mangifera indica Linn obtenido por técnicas a alta presión
Compuesto
Contenido fenólico (g/100 g extracto)
ácido gálico
6, 29 ±0, 13
3. C-P-D-glucosil iriflofenona
14, 28 ±0, 10
3. C- (2-0-p-hidroxibenzoil) -p-D-glucosil iriflofenona
1, 88 ±0, 07
mangiferina
5, 52 ±0, 16
3. C- (2-6-di-0-galoil) -P-D-glucosil iriflofenona
2, 06 ±0, 12
tetra-O-galoil-glucosa
0, 10 ±0, 02
3. D-galactosil-quercetina
0, 61 ± 0, 08
3. p-D-glucosil-quercetina
0, 97 ± 0, 10
3. O-xilosil quercetina
0, 32 ± 0, 02
3. O-L-arabopiranosil-quercetina
0, 23 ± 0, 01
1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galoil-p-D-glucosa
0, 08 ±0, 01
En este punto es importante entender que los procesos de demencia son la consecuencia 10 más grave de la pérdida neuronal y sináptica del cerebro de edad avanzada. La heterogeneidad clínica y la complejidad neuropatológica hacen que la clasificación de los procesos de demencia sea controvertida, aunque los estudios más recientes hacen referencia a 5 grandes grupos: AD, a-sinucleopatias (demencia con cuerpos de Lewy y demencia parkinsoniana) , demencia frontotemporal, demencia vascular y demencias mixtas 15 (Raz, L, et ai. The neuropathology and cerebrovascular mechanisms of dementia Journal/J Cereb Blood Flow Metab. 2015). Aunque cada una de estas condiciones tiene unas características neuropatológicas especificas, la pérdida neuronal y sináptica, y las alteraciones cerebrovasculares son una característica común a todas ellas en algún momento de la enfermedad (Raz, L, et al. The neuropathology and cerebrovascular 20 mechanisms of dementia. Journal/J Cereb Blood Flow Metab. 2015). Es más, estudios previos han mostrado que la enfermedad cerebrovascular es común en pacientes de edad que padecen demencia (Gorelick. P. B., et al. Vascular contributions to cognitive impairment and dementia a statement for healthcare professionals from the american heart
association/american stroke association Journal/Stroke 42:2672-2713, 2011.ladecola. C. The pathobiology of vascular dementia. Joumal/Neuron. 80:844-866. 2013;Toledo, J. B., et al. Conthbution of cerebrovascular disease in autopsy confírmed neurodegenerativo disease cases in the National Alzheimer's Coordinating Centre Joumal/Brain. 136:2697-2706. 2013) y que existe una sinergia entre neurona, glía y células vasculares (ladecola. C. The overlap between neurodegenerativo and vascular factors in the pathogenesis of dementia. Journal/Acta Neuropathol. 120:287-296. 2010:Zlokovic. B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders Joumal/Nat Rev Neurosci 12:723-738. 2011) subrayando el papel de la patología vascular en el daño neuronal y el deterioro cognitivo derivado. Teniendo en cuenta que las demencias en general no cuentan con tratamiento exitoso, el control de las alteraciones cerebrovasculares puede suponer un beneficio para los pacientes que padecen EA u otras demencias, como se ha sugerido previamente (Toledo. J. B., et al Conthbution of cerebrovascular disease in autopsy confírmed neurodegenerativo disease cases in the National Alzheimer's Coordinating Centre. Joumal/Brain. 136:2697-2706. 2013). En este sentido y tal y como se ilustra en los ejemplos de la invención, el extracto de la invención ha sido probado con éxito en el control de dichas alteraciones cerebrovasculares que denominaremos en términos generales como enfermedades neurodegenerativas asociadas a patología vascular del sistema nervioso central o que cursan con demencia vascular cerebral.
En el contexto de la presente invención, por alteraciones vasculares o patología vascular se entiende patología cerebrovascular de pequeño vaso, como consecuencia del proceso inflamatorio, presencia de radicales libres, ruptura del endotefio y/o musculatura vascular que conllevan sangrado espontáneo
En el contexto de la presente invención, por procesos de demencia se entiende el deterioro de los procesos de aprendizaje y memoria que presentan los pacientes demenciados y que reproducen los modelos experimentales presentados, incluyendo alteraciones cognitivas a nivel de memoria episódica y espacial.
En el contexto de la presente invención, por procesos neuroinflamatorios se entiende la alteración de la activación microglial, como marcador de inflamación central, observada en pacientes con EA y DVa, y que también observamos en nuestros modelos experimentales (APP/PS1 y db/db).
Por tanto, en base a todas estas consideraciones, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende un extracto seco de Mangitera indica Linn, donde dicho extracto se caracteriza porque comprende los componentes fenólicos que se detallan en la tabla 1, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades neurodegenerativas asociadas a patología
vascular del sistema nervioso central o que cursan con DVa Preferiblemente, la presente invención se centra en la profilaxis de este tipo de enfermedades. Preferiblemente, dicho extracto se caracteriza adicionalmente porque mediante el ensayo de DPPH (2, 2-Difenil-1- picrilhidrazil) presenta una actividad antioxidante IC50 (cantidad de antioxidante necesaria para reducir hasta el 50 % la concentración inicial de DPPH) mínima de 5, 3 ug/mL. Más preferiblemente, dicho extracto se caracteriza adicionalmente por ser obtenido u obtenible por cualquiera de los procedimientos de obtención detallados en la presente invención, más preferiblemente un procedimiento caracterizado porque comprende los siguientes pasos
a Se obtienen hojas y/o corteza de Mangifera indica linn de la variedad Kent y se procede al secado, congelado y molienda de las mismas;
b El producto del paso a) se somete a un proceso de extracción en continuo en un equipo de alta presión utilizando como sistema disolvente una mezcla de C02 y disolventes acuosos, alcohólicos o hidroalcohólicos a un flujo de C02 en el rango entre 5-40 glmin g/min, donde las condiciones de extracción se fijan a una temperatura entre 35-140 °C y una presión de entre 10-40 MPa y donde la extracción se realiza por un tiempo de 1-3 horas, preferentemente entre 1, 5-2 horas, en una atmósfera inerte y protegido de la luz, y
c. Se evapora el extracto obtenido en la etapa b) a temperatura ambiente hasta sequedad para obtener el extracto seco de Mangifera indica Linn
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, las enfermedades
neurodegenerativas asociadas a patología vascular del SNC o que cursan con DVa se
seleccionan de la lista que consiste en a-sinucleopatias, demencia frontotemporal o enfermedad de Pick, DVa y demencias mixtas. Preferiblemente las a-sinucleopatias se seleccionan de la lista que consiste en demencia con cuerpos de Lewy y demencia parkinsomana
En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, por enfermedades
neurodegenerativas asociadas a patología vascular del SNC o que cursan con DVa se
refieren a enfermedades que cursan con la sobreproducción de proteína tau anormalmente fosforilada. Preferiblemente, la EA.
Un segundo aspecto de la presente invención especifica que la composición referida en el primer aspecto de la invención es una composición farmacéutica que además comprende excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros principios activos
Un tercer aspecto de la presente invención especifica que la composición referida en el primer aspecto de la invención es una composición alimentaria, nutracéutica o un
composición alimentaria medicamentosa Preferiblemente dicha composición se utiliza como suplemento alimenticio.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención pero en ningún caso limitan la misma
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Obtención del extracto
Preparación del extracto de hojas de Manaifera indica Linn obtenido con una mezcla CO^agua/etanol en una relación de 1, 0:0, 5:0, 5 como sistema disolvente.
Las hojas secas, congeladas y molidas de Mangifera indica Linn de la variedad Kent se someten a un proceso de extracción en continuo en un equipo de alta presión Thar Tehcnologies Modelo SF100 de 100 mL de capacidad. Se utiliza como sistema disolvente una mezcla de C02/agua/etanol en una relación 1, 0:0, 5:0, 5 a un flujo de C02 de 5 g/min Las condiciones de extracción se fijan a una temperatura de 80 °C y una presión de 12 MPa. La extracción se realiza por un tiempo de 3 horas, en una atmósfera inerte y protegido de la luz
Posterior a la etapa de extracción, el extracto obtenido se evapora con nitrógeno a temperatura ambiente hasta sequedad Se almacena en congelación a -4 °C protegido de la luz para evitar su degradación
El rendimiento de la extracción para este ejemplo 1 es de 38, 8 g de extracto/100g hojas secas
El contenido de mangiferina y 3-p-D-glucosil-quercetina en el extracto de este ejemplo 1 se determinó inyectando 50 pL de extracto a 1000 ppm en un equipo Agilent HPLC series 1100, con una columna C18 de fase reversa Thermo Electron. Se utilizó como método de separación una fase móvil Solvente A: ácido acético en agua al 2% y Solvente B metanol a una tasa de flujo de 0, 9 mL/min, y con un gradiente de 0-2 min, 5% B; 2-7 min, 5-25% B, 711 min, 25% B. 11-19 min, 25-32% B; 19-27 min, 32% B: 27-28 min, 32-40% B; 28-38 min, 40% B; 38-50 min, 40-100% B, 50-60 min, 100% B; 60-70 min, 100-5% B; 5 min, 5% B isocrático, a una longitud de onda de 340nm
Cada compuesto fue identificado de acuerdo a su tiempo de retención (tr=20min para mangiferina y tf=34.4 min para 3-P-D-glucosil-quercetina) , y cuantificado de acuerdo a la curva de calibración respectiva, Abs = 54.252 C 100.12 para mangiferina, y
A = 54.252 C - 100.12 A = 87.077 C - 130.11 bs = 87.077 C- I30.il para quercetina
El extracto obtenido de este ejemplo 1 tuvo un contenido de 3, 78 ± 0, 01 g de Mangiferina/100g de extracto y 1, 23 ± 0, 02 g de 3- (3-D-glucosil-quercetina/100g de extracto (Figura 1: Análisis HPLC por columna de fase reversa Sinergy Hidro RP para el extracto obtenido en el ejemplo 1, con identificación de los picos de mangiferina y 3-P-D-glucosil- quercetina).
Se identificaron también de manera cualitativa otros compuestos fenólicos presentes en el extracto mediante el método LC-MS. Se inyectaron 100 pL de una dilución del extracto a una concentración de 300 ppm en un equipo cuadrupolo-ES negativo, utilizando una columna Phenomenex C18 de fase reversa Synergi 4 pm Hydro -RP 150x3mm con precolumna C18, una fase móvil de A: Agua al 0, 1% de ácido fórmico y B Acetonitrilo al 0, 1% de ácido fórmico, a 0, 8 mL/min, utilizando un gradiente de elución de: 0-0, 2 min, 0% B; 0, 2-0, 3 min, 0-7% B, 0, 3-14, 7 min, 7-8, 5% B; 14, 7-40 min. 8, 5-19% B; 40-45 min. 19-33% B; 45-48 min, 33-50% B; 48-50 min, 50-95% B; 50-57 min, 95-0% B; 57-63 min, 0% B; a una longitud de onda de 278 nm 0-18 min, 340 nm 18-43 min, 278 nm 43-45 min, 340 nm hasta 50 min. La ionización se realizó en modo SCAN ES negativo, fragmentar 100V y rango m/z de 50-2000 urna La identificación de los compuestos fenólicos se realizó teniendo en cuenta el tiempo de retención y los iones de cada compuesto determinados por su respectivo espectro de masas
En el extracto obtenido en este ejemplo 1 se identificó la presencia además de mangiferina, 3-P-D-glucosil-quercetina, ácido gálico, metil galato, 3-D-galactosil-quercetina, 3-O-a-L- arabinopiranosil-quercetina y 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galoil-p-D-glucosa, más no de quercetina (Figura 2: Análisis LC-ES-MS en un cuadrupolo-ES negativo Modo SCAN, fragmentar 100V y rango m/z- 50 - 2000 urna para el extracto de hoja de mango obtenido en el ejemplo 1)
También se determinó la capacidad antioxidante del extracto de Mangifera indica Linn con el ensayo de DPPH*, expresada en términos de índice de Actividad Antioxidante IAA Este extracto del ejemplo 1 presentó una potente actividad antioxidante con un valor IAA=4, 84, superior al del tocoferol IAA=3, 65.
Ejemplo 2. Definición del extracto.
Caracterización de los extractos sub- o supercriticos de Mangifera indica Linn
Los extractos de Mangifera indica Linn se caracterizan teniendo en cuenta su contenido fenólico y su capacidad antioxidante, para determinar su posible uso en la industria cosmética y alimentaria
i) Determinación del contenido fenólico de los extractos sub- o supercrlticos de Mangifera indica Linn:
La determinación del contenido fenólico del extracto se realiza por medio de cromatografía líquida de alta resolución HPLC (High Performance Liquid Chromatography) , en un equipo Agilent HPLC series 1100 (Agilent Technologies, Estados Unidos) , con una columna C18 de fase reversa (Thermo Electron Corporation) y un detector UV/vis.
El método de separación utiliza como fase móvil una disolución de ácido acético en agua al 2% (solvente A) y metanol (solvente B) , a una tasa de flujo de 0, 9 mL/min, un volumen de inyección de 50 pmL, y utilizando las siguientes condiciones de elución: 0-2 min, 5% B ¡socrático; 2-7 min, gradiente lineal 5-25% B; 7-11 min, 25% B (socrático; 11-19 min, gradiente lineal 25-32% B, 19-27 min, 32% B ¡socrático; 27-28 min, gradiente lineal 32-40% B; 28-38 min, 40% B ¡socrático y finalmente se incluye una etapa de lavado y reacondicionamiento de la columna (38-50 min, gradiente lineal 40-100% B, 50-60 min, 100% B ¡socrático; 60-70 min, gradiente lineal 100-5% B, y 5 min, 5% B isocrático)
Los compuestos fenólicos se detectan a una longitud de onda de 340 nm de acuerdo a su tiempo de retención, y se cuantifican utilizando curvas de calibración para los patrones correspondientes Un cromatograma tipo de los compuestos fenólicos mayoritarios presentes en los extractos de mango, mangiferina y 3-P-D-glucosil-quercetina se muestra en la Figura 1 Análisis HPLC por columna de fase reversa Sinergy Hidra RP para el extracto fenólico obtenido en el ejemplo 1, con identificación de los picos cromatográficos correspondientes a los compuestos fenólicos mangiferina y 3-P-D-glucosil-quercetina de acuerdo a su tiempo de retención (tf=20min para mangiferina y tr=34, 4 min para 3-p-D- glucosil-quercetina).
Las curvas de calibración de los compuestos mayoritarios presentes en los extractos, mangiferina y 3-p-D-glucosil-quercetina, se expresan como Abs = 54.252 C - 100.12, y
A = 54.252 C - 100.12 A = 87.077 * C - 130.11 Abs = 87.077 C- 130, 11, respectivamente Donde C es la concentración expresada en pg/ml Para cada muestra se realizan mediciones por triplicado
Finalmente el rendimiento de extracción de los compuestos fenólicos se expresa en términos de g/100g extracto seco Los extractos de Mangifera indica Linn obtenidos según el procedimiento de extracción, presentan un contenido mínimo en mangiferina y quercetina de 1, 93 % y 0, 88% respectivamente
Sin embargo la actividad antioxidante de los extractos no depende únicamente del alto contenido de estos dos compuestos, sino de la sinergia entre los diferentes compuestos fenólicos extraídos durante el proceso
¡i) Determinación cualitativa de los compuestos fenólicos presentes en los extractos sub- o supercrlticos de Mangifera indica Linn:
Para confirmar que los extractos contienen mangiferina y 3-P-D-glucosil-quercetina, asi como la presencia de otros compuestos fenólicos se realiza un análisis cualitativo por cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas LC-MS utilizando un detector de masas Cuadrupolo-ES (Quadrupolar-ionization time-of-flight mass spectrometr y ).
Para este análisis se contó con patrones comerciales de ácido gálico, metil galato, mangiferina, 3-D-galactosil-quercetina, 3-P-D-glucosil-quercetina, 3-O-a-L-arabinopiranosil- quercetina, 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galoil-P-D-glucosa, y quercetina Con objeto de optimizar las condiciones de ionización, se inyectaron los patrones de manera individual, uno por uno, directamente en el espectrómetro de masas en modo de ionización ES (Electro Spray) Negativo con un rango m/z de 50-2000 u.m.a. Se utilizó una fase móvil compuesta por una disolución A de agua al 0, 1% de ácido fórmico y una disolución B de acetonitrilo al 0, 1% de ácido fórmico, en modo ¡socrático 50:50, a una tasa de flujo de 1, 0 mL/min, y un volumen de inyección de 10pL, En la tabla siguiente se indican las masas de los iones correspondientes para cada patrón de compuesto fenólico (m/z) obtenidos del análisis LC-ES-MS correspondiente para cada patrón. (Figura 2: Espectros de masas de compuestos fenólicos presentes en extractos de Mangifera indica Linn realizados en equipo LC-ES-MS cuadrupolo-ES negativo modo SIM|
Señales LC-ES-MS [M-H]` (m/z)
Compuesto fenólico
m/z
[M-H]
tr
(min)
Ácido gálico
4, 06
metil galato
10, 13
mangiferina
25, 94
3. D-galactosil-quercetina
38, 81
3. p-D-glucosil-quercetina
39, 66
3. O-L-arabopiranosil-quercetina
42, 39
1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galoil-P-D-glucosa
939
43, 50
quercetina
47, 86
Posteriormente, se realizó el análisis por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas HPLC-MS para separar e identificar los distintos compuestos fenólicos Se utilizó un LC-ES-MS con una columna Phenomenex C18 de fase reversa Synergi 4 pm Hydro-RP 150x3mm con precolumna C18 Como fase móvil se empleó una disolución A de agua al 0, 1% de ácido fórmico y una disolución B de acetonitrilo al 0, 1% de ácido fórmico, a una tasa de flujo de 0, 8 mL/min, y utilizando un gradiente de elución de: 0-0, 2 min, 0% B, 0, 20, 3 min, gradiente lineal 0-7% B; 0, 3-14, 7 min, gradiente lineal 7-8, 5% B; 14.7-40 min, gradiente lineal 8, 5-19% B, 40-45 min, gradiente lineal 19-33% B; 45-48 min, gradiente lineal 33-50% B, 48-50 min, gradiente lineal 50-95% B y finalmente una etapa de lavado y reacondicionamiento de la columna (50-57 min, gradiente lineal 95-0% B; 57-63 min, 0% B) , a una longitud de onda fijada a t=0 min 278 nm, t=18 min a 340 nm, t=43 min a 278 nm, t=45 min 340 nm, un volumen de inyección de 20pL. Como detector se empleó un cuadrupolo en modo de ionización SIM ES Negativo y ventanas de fragmentor de los iones seleccionados de los espectros de masas de los patrones: 0-7 min: 100V (169, 125) , 7-18 min: 120V (183, 124) , 18-33 min: 150V (421, 301) 33-41, 1 min: 160V (463, 301, 300) , 41, 1-43 min: 150V (433, 301, 300) , 43-45 min: 240V (939, 769, 617) , 45-63 min: 150V (301, 151, 179).
Un cromatograma tipo de una mezcla de los patrones se muestra en la Figura 3: Análisis LC-ES-MS y LC-UV para los patrones de posibles compuestos fenólicos presentes en los extractos sub- o supercríticos de Mangifera indica Linn
iii) Determinación de la actividad antioxidante con el radical a-a-difeml- (3-picnlhidrazil (DPPH) de los extractos sub- o supercríticos de Mangifera indica Linn.
Para medir la actividad antioxidante con el radical a-a-difenil- (B-picrilhidrazil (DPPH*) (Brand Williams et al. (1995) Use of a free radical method to evalúate antioxidant activity Lebensmittel. Wissenschaft. Und Technologie 28. 25-30) , se mide la disminución de la absorbancia a 515 nm, cada dos minutos hasta el estado estacionario, de una disolución de 3, 9 mL de DPPH 6 10-5 M en metanol y 10 pL del extracto antioxidante El extracto se evalúa a diferentes concentraciones entre 0 y 5000 ppm Para obtener la referencia de un antioxidante, se evalúa igualmente la actividad antioxidante del patrón comercial de a- tocoferol.
La concentración de DPPH* (CDpph) en el medio de reacción se calcula de la curva de calibrado determinada por regresión lineal con la siguiente ecuación:
= 12.709 CDPPH +- 0.002
El porcentaje de DPPH* remanente se calcula según la siguiente ecuación:
%DPPH remanente = C0pP¡tt/C0ppHf¡ x 100
La EC50 o concentración eficiente que inhibe el 50% del radical DPPH se calcula gráficamente utilizando una regresión no linear de la curva de concentración vs. % DPPH remanente en el estado estacionario La actividad antioxidante de los extractos se expresa como Indice de Actividad Antioxidante (IAA) que se calcula considerando la concentración final de DPPH* y la EC50 como lo expresa la siguiente ecuación:
IAA = Concentraron Final de DPPH (^) /^so (^)
Los extractos de planta presentan actividad antioxidante baja cuando IAA < 0, 5, moderada cuando IAA se encuentra entre 0, 5 y 1, 0, potente cuando IAA se encuentra entre 1, 0 y 2, 0, y muy fuerte cuando IAA > 2, 0
Los extractos objeto de esta patente presentan un valor de IAA mínimo de 4, 0, y superior al valor IAA obtenido para el a-tocoferol (AAI=3, 65). Esto nos indica la potente actividad antioxidante de los extractos sub- o supercríticos de Mangifera indica Linn, y su potencial uso como antioxidante en alimentos y cosméticos En cualquier caso, estos extractos también pueden presentar otras actividades/propiedades de interés para la industria alimentaria, dietética, cosmética y farmacéutica que también se incluirían en esta invención Así, por ejemplo, es de esperar que los extractos conteniendo alto contenido en mangiferina y quercetina presenten actividades descritas para las moléculas aisladas como actividades anticancerígenas, antibacterianas, antifúngicas, o cierta capacidad de prevención de enfermedades neurológicas o cardíacas
Ejemplo 3. Efecto del tratamiento con MGF sobre la memoria episódica
Como se muestra en la figura 4, el tratamiento crónico con el extracto de MGF (50mg/kg, peletizado en la comida) obtenido según el procedimiento descrito (en adelante MGF) , supuso una mejora en los procesos cognitivos de los animales db/db tratados Además, en un modelo clásico de EA, como es el ratón APP/PS1, también observamos una mejora significativa de los procesos cognitivos tras el tratamiento crónico con extracto MGF entre las 6 y las 26 semanas de vida Estas pruebas comenzaron a las 24 semanas de edad, se realizaron de modo consecutivo, y concluyeron a las 26 semanas de vida, inmediatamente antes del sacrificio de los animales Valoramos la memoria episódica mediante el test de NOD Los animales pasaron por una fase de habituación a la caja de registro (22cm longitud x 44cm ancho x 40cm alto) en el día 1, seguida de una fase de habituación a objetos (que no se usaron durante el test, en el día 2). El día 3 se llevó a cabo la fase de adquisición y durante 5 minutos el animal se colocó en la caja con 4 bolas azules en disposición triangular. Tras 30 minutos de descanso el animal volvió a la caja durante 5 minutos, esta vez con 4 conos rojos dispuestos en rectángulo. El test tuvo lugar 30 minutos después y el 5
animal se colocó en la caja con dos copias del objeto de la segunda muestra de ensayo (objetos recientes) , colocados en la misma posición y dos copias de los objetos de la muestra de ensayo 1 (objetos antiguos) colocados uno de ellos en la misma posición (objeto antiguo no desplazado) y el otro en una nueva posición (objeto antiguo desplazado). Se analizó la memoria episódica integrada para "qué", `dónde" y "cuándo" (Dere. £., et al. Episodic-like memor y in mice: simultaneous assessment of object. place and temporal order memor y Joumal/Brain Res Brain Res Protoc 16:10-19, 2005) "Qué" se define como la diferencia en el tiempo de exploración de objetos recientes y conocidos, "dónde" se define como la diferencia en el tiempo de exploración de los objetos desplazados y no desplazados y "cuándo" se define como la diferencia en el tiempo de exploración de los objetos antiguos no desplazados y los objetos recientes no desplazados Tras el análisis de los resultados observamos que el deterioro cognitivo propio de los animales db/db mejoraba tras el tratamiento con MGF, y estas diferencias resultaban significativas en el caso de los paradigmas "qué" y "cuándo" (Figura 4A). Del mismo modo, los ratones APP/PS1 tratados con MGF mejoraron significativa en la NOD, tras el tratamiento crónico con MGF (Figura 4B).
Ejemplo 4. Efecto del tratamiento con MGF sobre el aprendizaje y memoria espacial y de trabajo.
Los animales fueron evaluados además en una prueba clásica para comprobar la capacidad de aprendizaje y memoria espacial y de trabajo, el test del laberinto acuático de Morris Esta prueba comenzó 24 horas tras concluir el test de NOD. El laberinto consiste en un tanque de agua de 0.95 m de diámetro, dividido en cuatro cuadrantes marcados con figuras geométricas en las paredes. La plataforma de escape se situó 1-2 cm por debajo de la superficie y se camufló con carbonato de calcio disuelto en agua, a una Ta de 21+/-1°C El animal aprende la localización de la plataforma siguiendo las pistas geométricas del exterior de la piscina. La prueba se lleva a cabo en dos fases La adquisición consiste en 4 ensayos diarios durante 4 días consecutivos con la plataforma sumergida Durante esta fase, la plataforma se localiza en el cuadrante 2 El animal nada libremente durante un tiempo máximo de 60 segundos, con un intervalo entre los ensayos de 10min Si no encuentra la plataforma se coloca sobre ella durante 10 segundos. El tiempo empleado y la distancia recorrida para alcanzar la plataforma se graba y analizan con el software SMART (Letica, España). En los animales db/db tratados con MGF observamos una reducción en el tiempo que necesitaban para encontrar la plataforma oculta a lo largo de los 4 dias de entrenamiento, indicativo de la mejora de la capacidad de aprendizaje de estos animales (Figura 4C). De modo similar, los problemas de aprendizaje espacial de los ratones
APP/PS1 mejoraron significativamente a lo largo de los 4 días de experimento, tras el tratamiento con MGF (Figura 4D).
En la fase de retención, se quitó la plataforma, se dejó nadar al ratón durante un minuto y medimos el tiempo y distancia recorrida en cada cuadrante. La fase de retención se llevó a cabo a las 24 horas, y una vez más a las 72 horas, tras el último ensayo de adquisición. En este caso también observamos que los problemas de memoria que presentaban los ratones db/db, pasando tiempos significativamente menores en el cuadrante en el que anteriormente se encontraba la plataforma, se recuperaban en los ratones db/db tratados de modo crónico con MGF (Figura 4E) Del mismo modo, cuando analizamos los animales APP/PS1 en la fase de retención, observamos una mejoría en aquellos tratados con MGF (Figura 1F)
Ejemplo 5. Efecto del tratamiento con MGF sobre la atrofia cerebral El tratamiento crónico con MGF limitó la atrofia cerebral observada en ratones db/db, cuando comparamos los pesos cerebrales de los animales en estudio tras el sacrificio (Figura 5A). Con el fin de profundizar en la posible afectación de diferentes estructuras procedimos a realizar una tinción cresil violeta en todos los grupos de estudio Tras fijación en parformaldehldo al 4% del hemisferio izquierdo durante 2 semanas realizamos secciones coronales para los estudios histomorfológicos. Se realizaron cortes coronales de 30 pm a 1.5, 0 5, -0 5, -1 5, -2 5 y -.3 5 mm de Bregma, con la ayuda de un atlas histológico Las secciones se montaron en portas gelatinizados, posteriormente se sumergieron en etanol al 70% durante 15 minutos, para pasarlos a una solución de cresil violeta al 0.5% durante 10 minutos. Tras los lavados en agua destilada, se sumergieron en una solución de etanol absoluto y ácido acético (0 25%) durante 7 minutos. Finalmente, se realizaron lavados sucesivos en etanol y xilol, y las secciones se montaron con DPX. Estas secciones se fotografiaron y analizaron en un microscopio Olympus Bx60 (Japón) acoplado a una cámara Olympus DP71 A partir de las imágenes se cuantificó el área total de cada sección, así como las áreas de la corteza, hipocampo y ventrículo. Todas las medidas se realizaron usando los softwares Adobe Photoshop Elements e Image J. En los animales db/db tratados con MGF observamos la reversión de la atrofia cortical, propia de ratones db/db (Figuras 5B y 5C). En menor grado, observamos un perfil similar en el hipocampo de los animales tratados con MGF de modo crónico (Figura 2C). La tasa de apoptosis se cuantificó analizando la actividad caspasa 3/7. Se utilizaron homogenados de corteza o hipocampo en los que se midió la actividad caspasa mediante el ensayo caspase-Glo3/7 (Promega, Madrid España) , según indicaciones del fabricante Brevemente, 5-7 mg de tejido se homogenizaron en PBS suplementados con un coctel de proteasas (sigma USA) y se diluyeron hasta 2pg/pL. Se le añadieron 50 pl de solución Promega caspase glo 3/7 y las
muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y protegidas de la luz. Se midió la luminiscencia en un lector Biotek Synergy Mx microplate y los datos se expresaron como porcentaje de valores control. Como se observa en la figura 5D la actividad aumenta en ratones db/db y el tratamiento con MGF reduce la actividad caspasa en la corteza y en el hipocampo La reducción observada en la corteza es estadísticamente significativa
Ejemplo 6. Efecto del tratamiento con MGF sobre la hiperfosforilaclón de tau
La proteína tau es necesaria para la estabilización de los microtúbulos y por tanto para la integridad neuronal. Cuando se encuentra hiperfosforilada, como ocurre en diferentes procesos de demencia: EA, demencia frontotemporal, demencia con cuerpos de Lewy, o en las alteraciones en el SNC asociadas a la diabetes, la integridad neuronal queda comprometida De ahí que procediéramos a determinar los niveles de proteína tau anormalmente fosforilada en todos los grupos en estudio La fosforilación de tau, como marcador de daño neuronal, se evaluó mediante western blot en la corteza El tejido se homogeneizó en tampón de lisis (Cell Signaling, USA) suplementado con un cóctel de inhibidores de fosfatasas y proteasas (Sigma, USA). El homogenado se sonicó y centrifugó a 4°C durante 5 min para posteriormente recoger el sobrenadante La cantidad de proteina se determinó por el método Bradford (Biorad, Germany). Las proteínas se separaron en un gel de acrilamida-bisacrilamida al 10% seguido de una trasferencia en membrana de PVDF (Schleicher & Schuell, Keene.NH) Las membranas se bloquearon con tampón de bloqueo (Invitrogen, USA) durante 1 hora y se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios (clon AT8 para fosfo-tau o tau-total) diluidos 1.1000 en solución de bloqueo Las membranas se lavaron e incubaron con los anticuerpos secundarios Finalmente, se lavaron las membranas y se detectó la señal usando el sustrato quimiolumimscente Novex AP (Invitrogen, USA) y una película para revelado Kodak Biomax Light Film (Sigma, USA) Los inmunoblots se cualificaron calculando la densidad óptica de cada banda de proteína de las películas escaneadas usando el software Image J. Cada banda se normalizó por la proteina actina Los resultados se expresaron como ratio niveles de proteína tau hiperfosforilada/niveles de tau total Al comparar los grupos en estudio, observamos que el aumento de tau hiperfosforilada en los animales db/db se veía controlado en los animales tratados de modo crónico con MGF (Figuras 6A y 6B) Del mismo modo, la fosforilación de tau disminuía en ratones APP/PS1, aunque esta disminución no resultó estadísticamente significativa (Figura 3C).
Ejemplo 7. Efecto del tratamiento con MGF sobre las hemorragias espontáneas en el SNC
Para comprobar el efecto que el tratamiento crónico con MGF tiene sobre la patología vascular llevamos a cabo una cuantificación de hemorragias mediante tinción azul Prusia Se montaron en un porta gelatinizado 6 secciones de cada animal anexos a los utilizados para la tinción cresil violeta (cortes coronales de 30 pm a 1.5, 0 5, -0.5, -15, -2.5 y -.3.5 mm de Bregma, con la ayuda de un atlas histológico). Las secciones se deshidrataron e incubaron en solución azul Prusia (20% HCI y 10% ferrocianato potásico) durante 30 minutos. Se enjuagaron con agua destilada y se rehidrataron en tampón fosfato. Una vez secas, se sumergieron en una solución de rojo neutro (al 1% en ácido acético al 1%) durante 5 minutos El tejido se enjuagó y se deshidrató con concentraciones crecientes de etanol. Finalmente se sumergieron en xilol y las cubrimos con DPX Las secciones se fotografiaron con una cámara Olympus DP71 acoplada a un microscopio Olimpus Bx60 (Japón). Las imágenes se analizaron usando los softwares Photoshop Elements e Image J para cuantificar el número de hemorragias/mm2, el tamaño de cada hemorragia y la carga hemorrágica (% de área ocupado por hemorragias) en corteza e hipocampo En la corteza observamos que el tratamiento con MGF disminuye la carga hemorrágica (área cortical afectada por hemorragias) en los ratones db/db y este efecto es debido a la disminución del número de nuevas hemorragias, mientras que el tamaño de las mismas permanece inalterado (figuras 4A y 4B). Un perfil similar observamos en el hipocampo de los ratones db/db tratados con MGF, en los que observamos cierta reducción de la carga hemorrágica, como consecuencia de la disminución del número de hemorragias, mientras que el tamaño permaneció inalterado (figura 4C). En los ratones APP/PS1 no se encontraron hemorragias espontáneas
Ejemplo 8. Efecto del tratamiento con MGF sobre el proceso inflamatorio en el SNC
La inflamación está estrechamente relacionada a la DM2 y también en los cerebros de pacientes con lesiones cerebrales o demencias, como el Alzheimer, se ha visto incrementado el proceso inflamatorio Otros estudios también han mostrado que la inflamación en el SNC puede estar implicada en la disfunción de la barrera hematoencefálica y contribuir al daño vascular De ahí que como marcadores de inflamación en el SNC lleváramos a cabo inmunotinciones para microglia en corteza e hipocampo Para ello se tomaron secciones de 30 pm de grosor, contiguas a las anteriores Las secciones se bloquearon con albúmina sérica bovina al 3% (Sigma Aldrich) al 5% en PBS con Tritón X al 0 5%. Posteriormente se incubaron con el anticuerpo anti-microglia IBA-1 (1:1000, Sigma Aldrich) Tras lavados en PBS, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Flúor anti-Rabbit (Molecular Probes, USA) a una concentración
1:1000 Finalmente, las secciones se montaron con solución de montaje GVA (Invitrogen, USA) en portas gelatinizados y se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia Láser Olympus U-RFL-T (Olympus, Japan). Las imágenes se adquirieron usando el software MMIcelITools y se analizaron con Image J para cuantificar el número de células/mm2, el tamaño individual de las hemorragias y la carga microglial. En la corteza de los ratones db/db observamos un aumento significativo de la carga microglial (% área cubierta por microglia) , como se ha descrito previamente, y este efecto se veía significativamente disminuido en los ratones db/db tratados con MGF de modo crónico (Figuras 7A y 7B). Aunque observamos cierta reducción en el número de células microgliales/mm2 en los animales db/db-MGF, el efecto fue especialmente significativo cuando comparamos el tamaño de las células individuales En este caso observamos que el tamaño de la microglia en los animales db/db estaba significativamente aumentado, indicativo del proceso de activación microglial e inflamación asociada. Sin embargo, tras el tratamiento con MGF observamos que el tamaño de la microglia retornaba a valores control (Figuras 8A y 8C). Un perfil similar observamos en el hipocampo, donde el tratamiento con MGF es capaz de controlar el aumento de carga microglial en el hipocampo de los ratones db/db (Figura 5B). Del mismo modo, este proceso está mediado por una ligera disminución del número de células microgliales/mm2 y una disminución importante del tamaño de las mismas (Figura 5B).
En los animales APP/PS1 observamos que la carga microglial aumentaba en la corteza, indicativo del proceso de activación microglial e inflamación asociada El tratamiento con manguiferina reducía significativamente la carga microglial en la corteza Este efecto se detectaba en áreas libres de PS y a pesar de que cerca de las placas podía observarse una redución similar, no resultó estadísticamente significativa La reducción de la carga microglial se debía a una reducción en el número de las células microgliales lejos de las placas El tamaño de las células se mantenía entre los diferentes grupos De forma similar se observaba en el hipocampo que la carga microglial estaba reducida en los ratones tratados con MGF Estas diferencias eran estadísticamente significativas lejos de las placas seniles, y a pesar de que un perfil similar se podia observar en las proximidades de las placas, las diferencias no llegaban a ser estadísticamente significativas Al igual que en la corteza, la reducción de la carga microglial se debía al reducido número de células microgliales Estos resultados indican que en los dos modelos de patologías neurodegenerativas utilizados el tratamiento con MGF reduce la inflamación inducida por el proceso neurodegenerativo
