El procedimiento analítico propuesto pennite la identificación y la cuantificación de genipósido en muestras de azafrán empleando la técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficacia con detección por Espectrometria de Masas. Teniendo en cuenta que la presencia de genipósido en azafrán revela la adulteración por gardenia, este procedimiento supone un gran avance por la posibilidad de emplear un solo compuesto, genipósido, como marcador de adulteraciones de azafrán con gardenia con el fin de evaluar la calidad del azafrán así como para evitar fraudes económicos.
SECTOR DE LA TÉCNICA
Esta invención permite detectar adulteraciones de azafrán con gardenia siendo el desarrollo del método analítico para la determinación de genipósido en azarrán de interés para el sector químico y el procedimiento para la detección de adulteraciones de azafrán con gardenia es de interés para el sector alimentario por su potencial para controlar la calidad del azafrán y evitar fraudes económicos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El azafrán se produce a partir de los estigmas secos de la planta CroclIs safivlIS L., siendo la especia más cara del mundo debido a la mano de obra necesaria para su cultivo, cosecha y manipulación, así como por tener una producción limitada.
Los tres principales metabolitos secundarios en el azafrán son: las crocinas (responsables del color) , una familia de pigmentos amarillos muy solubles en agua; la picrocrocina (responsable del sabor amargo) , un glucósido incoloro; y el safranal (responsable del olor) , un aceite volátil. Además, el azafrán también contiene flavonoides, proteínas, azúcares, vitaminas, aminoácidos, minerales y otros compuestos químicos (1). Durante mucho tiempo se ha usado como saborizante y colorante en la preparación de al imentos. sin embargo, también es conocido por una amplia variedad de beneficios para la salud 12). Estudios recientes muestran que el azafrán puede ofrecer cierta protección contra enfennedades coronarias y cáncer, así como un elevado potencial como potenciador de la memoria 13-61.
Debido a su alto precio, el azafrán ha sido sometido a diversos tipos de adulteración a lo largo de los siglos. Destacar que recientemente se ha publicado un informe donde se describe que el azafrán cs, junto con el aceite de oliva, la leche y la miel, uno de los ingredientes alimentarios que más comúnmente sufren adulteraciones 171. Las adulteraciones de azafrán se realizan con el fin de aumentar su peso con materias extrañas (nonnalmente plantas con cierto parecido externo) y/o para mejorar su color con colorantes naturales o sintéticos cuando el azafrán es antiguo o para enmascarar la adición de materias extrañas. Las prácticas fraudulentas más comunes incluyen la adición de difere ntes materias vegetales con color y morfología similares. Históricamente, los materiales más (recuentes utilizados en la adulteración del azafrán han sido estambres de la propia planta del azafrán (incluso estilos o tiras de la corola) , pétalos de las plantas Carthamus tinctorillS
L. (cártamo) y Hemerocal/is Ulioasphodelus L., rizomas de la Curcuma longa L. (cúrcuma) , nares de las plantas Caléndula officinalis L. (caléndula) y Arllica montana L. y semillas de Búa orel/ana L. 18, 9 (. Recientemente, se ha descubierto en el mercado europeo un nuevo y sofisticado método de adulteración de azafrán empleando extractos de Jos frutos de la planta Gardenia jasminoides E/lis L. (gardenia) 1101, la cual se utiliza ampliamente en países asiáticos en la medicina tradicional y como colorante natural debido a la presencia de un elevado número de flavonoides y crocinas similares a las presentes en el azafrán (responsables de la coloración amarilla) 111-141. estando prohibida su comercialización en Europa. Dadas las diferencias morfológicas de la gardenia frente a los estigmas del azafrán, este tipo de adulteración ocurre cuando el azafrán se encuentra en fa nna molida, pudiéndose ocultar más fácilmente el extracto de gardenia 18, 15 (. Por otro lado, los principales metabolitos secundarios de Jos frutos de gardenia que difieren del azafrán son glucósidos iridoides. los cuales incluyen: gcnipósido. gardenósido, genipina-Ifl-gentiobi6sido. ácido gcniposídico, acetilgenipósido y gard6sido (16-18].
Hasta el momento, la calidad del azafrán está certificada en el mercado intemacional a través de la normativa ISO 3632 (19, 201. Sin embargo, esta normativa s610 caracteriza al azafrán a través de los contenidos de picrocrocina, safranal y crocinas, así como la posible presencia de algunos de los colorantes artificiales que puedan resultar tóxicos. Por tanto, la metodología empicada en la normativa ISO es una combinación de medidas espectro fotométricas de picrocrocina a 250 11m y safranal a 310 nm con perfiles cromatográficos de colorantes y pigmentos polares (erecinas) a 440 nm. Esta normativa se encuentra actualmente en proceso de revisión dada su baja fiabilidad en la detección de materias vegetales con color y morfología similares al azafrán. En particular, se ha demostrado recientemente que no es posible detectar empleando la normativa ISO una adulteración en el azafrán con cantidades de hasta un 20% de cártamo, caléndula o cúrcuma 121 1. Por tanto, en los últimos años varios autores han propuesto nuevos métodos analíticos para la detección de adulterantes en azafrán empleando muy diversas técnicas de análisis: Espectrofotometría UV-Vis (22-24) , Espectrofotometría de Infrarrojo cercano (NIR) 125) , Espectroscopia Raman y Resonancia Magnética Nuclear (RMN) [26) , Electroforesis Capilar (CE) (27 ( Y CromatograOa Liquida de Aha Eficacia (HPLC) sin y con detección por Espectrometría de Masas (MS) 121, 28-301. Asimismo, destacar el empleo reciente de métodos moleculares novedosos para detectar marcadores de ADN de diferentes plantas (cártamo y cúrcuma) en azafrán los cuales han pennitido obtener resultados alentadores pudiéndose llegar a detectar hasta un 1% de adulteración ) 15, 31331·
Por otro Jado, recientemente se ha desarrollado una estrategia metabolómica basada en la utilización de RMN que ha sido aplicada a la diferenciación de azafrán auténtico de azafrán adulterado con 20 % de gardenia, cúrcuma, cártamo y estambres de azafrán 134). Sin embargo, existe una clara demanda de métodos sensibles que perm itan detectar bajos porcentajes de adulteración en azafrán.
Genipósido ha sido descrito como el glucósido iridoide mayoritario en la gardenia por lo que podría utilizarse como marcador de adulteraciones de azafrán con gardenia. Aunque se han desarrollado varios métodos para detenninar genipósido en el fruto de la gardenia utilizando como técnicas HPLC y CE 135-421. no existe ningún método que pennita la determinación de genipósido en azafrán.
El objetivo de esta invención es el desarro llo de un procedimiento por Cromatografia Líquida con detección por Espectrometría de Masas de Quadrupolo-Tiempo de Vuelo que permita determinar genipósido en aza Frán, con el fin de proponer por primera vez este compuesto como marcador de adulteraciones de azafrán con extractos de gardenia.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El procedimiento para la determinación de genipósido por cromatografia líquida se basa en la utilización de una columna C18 y un equipo de cromatografia líquida Agilent Technologies 1100 acoplado 8 un detector de espectrometría de masas (MS) de quadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) Agilent Tcchnologies 6530 a través de una fuente de ionización por elcctrospray ortogonal con tecnología de enfoque ténnico Jet Stream. El espectrómetro de masas está equipado con un software Mass Hunter de Agilent Technologies (8.040.00) para el control del espectrómetro de masas y la adquisición y análisis de los datos.
Tabla l. Resumen del procedimiento para la determinación de genipósido en azafrán por
LC-MS.
Ascenlis Express F'lSed-core CI8 (100 mm x 2.1 mm, con partlculas Columna pcliculnres de tecnología "fused-core" de 2.7 ~m (0.5 "m de espesor de fase estacionaria)
Fase móvil
Agua:Acetonitrilo (85: 15 v/v) conteniendo 0. 1 % de ácido fónnico Flujo de fase móvil 0.4 mUmin Volumen de inyecció n Temperatura 4O'C
Ionización por Electrospray en modo negalivo (ES! -l. Rango de masas de Detección l) (Ir Esp«trolllelría de 100-1700 miz (rango dinámico extendido) con una velocidad de Masas Quadrupolo-Tiempo de adquisición de 2 espectros/s. Condiciones para la fuente de ionización:
vuelo potencial de electronebulizaciÓn. 3500 V con un voltaje de tobera ("ozzle)
P~panción de l. muest ra 500 V; condiciones de gas de st<:ado, 10 Um;n y 350 OC; presión de nebulizador, 1.7 bar; gas envolvente, 7.5 Um;n y 350 OC. Otras condiciones: fragmcmador, ISO V. Vahajes de espumadera (Jkimmer) y oclopolo 60 Vy 750 V, respectivamente.
Las muestras de azafrán se trituran en un mortero y se pesan (0.3 g de muestra). Se eXlraen con 25 mL de disolución ctanol:tampón borato a pH
9.0 (50:50, v/v) mediante extracción sólido-liquido asistida por ultrasonidos durante 15 min a temperatura ambiente. Tras centrifugación (15 min, 40008 y 25 oC) d sobrenadantc se diluye l/50 con agua y 4 mL de esta disolución se someten a ultra-filtración a través de filtros de col1e de 3 kDa con el fin de eliminar carbohidratos y proteínas.
Prep (lración de patrones y mues/ras La preparación de las disoluciones patrón de genipósido se realiza a partir de una 5 disolución inicial de genipósido I mglmL en acetonitrilo. Esta disolución se guarda a 4°C y se toman distintas alicuotas que se diluyen en agua hasta la concentración requerida.
Se emplea el siguiente procedimiento de tratamiento de muestra: la muestra de azafrán se lritura en un mortero y se pesa (0.3 g de muestra). Se extraen con 25 rnL de disolución etanol:tampón borato a pH 9.0 (50:50, vlv) mediante extracción sólido-líquido asistida por ultrasonidos durante 15 min a temperatura ambiente. Tras centrifugación (J 5 min, 4000g y 25 OC) el sobrcnadante se diluye 1/50 con agua y 4 mL de esta disolución se someten a ultra-filtración a través de filtros de corte de 3kDa con el fin de eliminar carbohidratos y proteínas.
Características analí/icas del procedimiento Las características analíticas evaluadas para el procedimiento objeto de la invención son la linealidad, los límites de detección y de cuantificación, la precisión (instrumental e intennedia) y la e"actitud (Tabla 2).
La linealidad se comprueba en el intervalo de concentraciones de trabajo de 0.8 a 8 J.lg/rnL de genipésido inyectadas por triplicado durante tres días consecutivos.
El límite de detección se detennina como la concentración de genipósido que da lugar a un valor de la relación señaJlruido de 3. El límite de detección es 0.01 IlglmL lo que pennite detectar 41.7 Ilg de genipósido por gramo de muestra analizada, es decir. hasta un 0.004 % lo que demuestra la elevada sensibilidad del método desarrollado para la detenninación de genipósido en azafrán. Para el cálculo del límite de cuantificación se considera una relación señal/ruido de 10 Y se obtiene un valor de 0.03 J.1g1rnL.
La precisión se evalúa como repetibilidad instrumental y precisión intennedia. La repetibilidad instrumental se detennina como el valor de la desviación estándar relativa (RSD) en % para las áreas de pico obtenidas cuando se realizan 3 inyecciones consecutivas de una disolución patrón de genipásido a dos niveles de concentración (0.8 y 8 J.lg/mL) y de una disolución de una muestra de azafrán auténtico adulterado con porcentajes del 10 y 90 % de extracto de gardenia. Los valores obtenidos para la RSD fueron inferiores al 1.5 %. La precisión intennedia se detenninó a partir de los valores de RSD de las áreas de pico obtenidas al inyectar (por triplicado durante dos días consecutivos) tres replicados de una disolución patrón de genipásido a dos niveles de concentración (0.8 y 8 J.lg/rnL) Y de una disolución de una muestra de azafrán auténtico adulterado con porcentajes del 10 Y 90 % de extracto de gardenia. Los valores obtenidos para la RSD fueron inferiores al 1.8 % para las disoluciones patrón de genipásido y a12.9 % para las muestras de azafrán.
El procedimiento descrito en la presente invención es aplicable a la cuantificación de genipósido en azafrán. La cuantificación se lleva a cabo utilizando el método de calibrado del patrón externo. Este método de cuantificación se emplea porque se comprueba, mediante comparación de los intervalos de confianza de las pendientes obtenidas por los métodos de calibrado del patrón externo y de adiciones patrón, la ausencia de efectos de matriz, es decir, que la señal analítica para genipósido no se ve afectada por los demás componentes de la muestra.
La exactitud del método analítico desarrollado se evaluó como la recuperación obtenida para genipásido cuando una muestra de azafrán auténtico se enriqueció con genipásido patrón a una concentración de I J.1g/rnL. La media de los va lores de recuperación obtenidos fue de 89± 14%.
Tubla 1. Características analíticas del procedimiento desarrollado para la determinación de genipósi<!o en azafrán por LC-M8.
Intervalo linea l de tra bajo· 0.8-8 ¡.¡glmL
Pendiente ± l 'sb (1.91 ± 0.21) x 111
Ordenada en origen ± t-ss.p-vaJor de 'ANOVA1> (6.7 :1:: 9.5) x lOS 0.997 0.078
Interfere ncias de Matriz e MI/estro Illten'U/o de confianza
(n-<) (pet/dieme ± " sb)
Patron genipósido (1.91 ± 0.2 1) X ¡ () 6
Azafrán aUlénlico (2.06 ± 0.21) X 1 () 6
Azafrán/Extracto Gardenia (50:50) (2.06 ± 0.22) x I CI
LOO " 0.01 l1g/mL (41.7 Ilg/g extract) d LOQ' 0.03 J.lg/rnL (138.9 ", g/g extrael) f
EX8Ctilud f Coneen/ración alJadida (% medio ± r (n-I) ·sll1 '~ Recuperación I ¡.¡gfmL 89 ± 14
Precisión Nivel de CO/ICen/ración RSO (%)
- --;;-;;-:, -=c-=c:::::c:=------------------0.8 ~glmL patrón gcnipósido 1.5
Repetibilidad ' 8 ~g/mLpatrón genipósido 0.7
(n 3) 90 % de extncto de gardenia en azafrán 0.8
10 % de extrncto de gardenia en azafrán 0.6
0.8 ~glmLpatrón genipósido ._......... [8_.............
Precisión inlemledia ' 8 ~g/mLpatrón genipósido 1.6
(n 6) 90 % de extrncto de gardcnia en azafrán 0.9
10 % de extrncto de gardenia en azafrán 2.9
.. Cinco disoluciones de patrón de gcnipósido a diferentes niveles de concentración inyectadas por triplicado durante tres dlas consecutivos. //> p-valor del ANOVA para confinuar que el modelo experimental se ajusta a un modelo lineal.
lO e Comparación de las pendientes obtenidas por los métodos de patrón extemo y adiciones patrón. d[.QD calculado como la concentración de genipósido correspondiente a una relación señaUruido (SIN) igual a 3_
~ LOQ calculado como la concentración de genipósido correspondiente a una relación señaUruido (SIN) igual
a 10.
/ Exactitud calculada a partir de los valores de recuperación obtenidos al añadir I llyrnL del patron de
geni pósido a tres disoluciones diferenlcs de azafrán a uténtico inyectadas por duplicado.
S , Repetibilidad expresada como RSD (%) de las áreas obtenidas al inyeclar tres veces consecUlivas en un
mismo dla una d isolución de patrón de genipósido a dos niveles de concentración y una disolución de
azafrán auténtico adulterado con porcentajes del 10 Y 90 % de extracto de gardenia.
• Precisión inlermedia expresada como RSD (%) del valor medio de las áreas obtenidas al inyectar tres veces
consecutivas durante dos dlas consecutivos tres réplicas de una disolución patlÓn de genipósido a dos nivetes
10 de concentración y una disolución de azafrán autentico adulterado con porcentajes del 10 Y 90 % de extracto
de gardenia.
Ventajas principales del procedimiento
Las ventajas principales del procedimiento objeto de la presente invención son las
15 s iguientes:
El procedimiento descrito pennite detenninar el contenido de genipós ido en
aza frán.
El procedimiento desarrollado pennite separar el pico de geni pós ido del resto de
componentes del azafrán en un tiempo inferior a 2 mino
20 El procedimiento desarrollado pennite identificar el genipósido a través de su
espectro de masas.
El procedimiento desarrollado pone de manifiesto la ausencia de genipós ido en
aza frán auténtico, siendo una herramienta val iosa para los laboratorios de control
de calidad y para la industria alimentaria porque el genipósido puede emplearse
25 como marcador de adulteraciones de azafrán con gardenia.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura J. Cromatogramas de ión extraído a una relación miz 433. 1384 ± 50 ppm obtenidos
30 por cromatografia líquida con detección de espectrometría de masas de quadrupolo-tiempo
de vue lo, para cuatro muestras de azafrán sospechosas de haber sido adulteradas. A) , B) ,
C) muestras de azafrán adulteradas con gardenia. D) muestra de azafrán no adulterada con
gardenia. El procedimiento para la preparación de las muestras, las condiciones utilizadas
para el análisis por cromatografía de líquidos y las condiciones utilizadas para la detección
por espectrornctría de masas se han detallado en la Tabla 1.
MODO DE REALIZACIÓN
5
El procedimiento descrito en la presente invención se aplica a la detección de
adulteraciones de azafrán con extractos de gardenia. Para ello, se analizan muestras de
azafrán auténticas y muestras de azafrán sospechosas de haber sido adulteradas.
JO La preparación de muestra se lleva a cabo triturando las muestras de azafrán en un mortero
y pesando 0.3 g de muestra. Se extraen con 25 mL de di solución elanol:tampón borato a
pH 9.0 (50:50, v/v) mediante extracción 5ólido-líquido asistida por ultrason idos durante 15
min a temperatura ambiente, Tras centrifugación (1 5 min, 4000g y 25 OC) el sobrenadante
se diluye l/50 con agua y 4 mL de esta disolución se someten a ultra-fi ltración a través de
15 filtros de corte de 3 kDa. 5 ).1L del ultrafi ltrado se inyectan en una columna Ascentis
Express Fused-core CI8 (100 mm x 2. 1 mm, con partículas peliculares de tecnología
"fused-core" de 2.7 ).101 (0.5).1m de espesor de fase estacionaria) utilizando una eluc ión
isocrática con una fase móvil agua: acetonitril o (85: 15 v/v) con ácido f6nnico al 0. 1 %, un
flujo de fase móvil OA mUmin y una temperatura de 40 oc. La detección por
20 espectromelría de masas se realiza mediante Ionización por Electrospray en modo negativo
(ES I -) con un rango de masas de 100-1700 miz (rango dinámico extendido) y una
velocidad de adquisición de 2 espectros/s. Las condiciones para la fuente de ionización
son: un potenc ial dc clcctronebulización de 3500 V con un voltaje de tobera de 500 V,
unas condiciones de gas de secado de 10 U min y 350 OC, una presión de nebulizador de
25 1.7 bar y de gas envolvente de 7.5 U min y 350 oC. El fragmentador es 150 V Y los voltajes
de espumadera y octopolo son 60 V Y 750 V, respectivamente.
En la Figura 1 se muestran los cromatogramas de ión extraído a una relación miz 433.1384
± 50 ppm para tres de las muestras adulteradas con gardenia y para una muestra
30 sospechosa de adulteración para la que se confinna que no ha sido adulterada con gardenia.
Se observa el pico del genipósido en las tres muestras adulteradas con gardenia y la
ausencia del pico del genipósido en la muestra no adulterada con gardenia.
Para la determinación de genipósido en las tres muestras adulteradas con gardenia, se utiliza el método de calibrado del patrón externo utilizando disoluciones patrón de genipósido. Las cantidades detenninadas de genipósido en las tres muestras de azafrán adulterado (muestra 1, 2 Y 3, respectivamente) son 5.90 ± 0.0 1, 13.2 ± 0.2 y 15.30 ± 0.0 1
rng/g de muestra analizada.
Los resultados de los análisis confinnan la ausencia de gcnipósido en las muestras de azafrán auténticas por lo que se propone genipósido como marcador de adulteraciones de azafrán con gardenia. Los resultados también confinnan la presencia de genipós ido en algunas de las muestras sospechosas de haber sido adulteradas demostrando el nuevo método de adulteración de azafrán con gardenia que ha alcanzado el mercado europeo de azafrán.
APLICACIÓN INDUSTRIAL
Tanto a la industria alimentaria como a la administración les interesa que existan procedimientos analíticos sensibles que pennitan el control de calidad y seguridad del azafrán. El empleo de genipósido como marcador de adulteraciones de azafrán con extractos de gardenia pennjte realizar un control de calidad del azafrán y detectar
adulteraciones de azafrán con gardenia de fonna sensible e inequívoca.
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