OBJETO DE LA INVENCIÓN
En este documento se proponen un dispositivo y un método que hace uso de dicho dispositivo para poder llevar a cabo análisis de distintos analitos, preferentemente material biológico.
El objeto de la invención va dirigido al campo de la química analítica, más concretamente a la química analítica basada en microsistemas analíticos constituidos por una serie de microcanales.
15 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La microfluídica y tecnologías "lab-on-a-chip" (LOC) han generado microsistemas analíticos constituidos por una serie de microcanales y reservorios adecuadamente interconectados, que permiten la integración en un dispositivo miniaturizado de las 20 distintas etapas necesarias para llevar a cabo un análisis. Los distintos fluidos pueden ser movidos en su interior mediante la utilización de microbombas y actuadores, o más simplificadamente, mediante flujos electrocinéticos donde el movimiento es fácilmente controlado mediante la aplicación de campos eléctricos. Estos dispositivos LOC se caracterizan por mejorar las propiedades analíticas reduciendo los tiempos de análisis, 25 disminuyendo el consumo de reactivos, muestras y el riesgo de contaminación, consumiendo menos energía, incrementando la fiabilidad, funcionalidad y sensibilidad a través de la automatización, integrando el análisis multiplexado (varios analitos), y especialmente, favoreciendo la portabilidad y por tanto posibilitando el análisis "in-situ".
30 Los micromotores son vehículos ultra pequeños, diseñados para realizar movimientos mecánicos determinados en respuesta a estímulos específicos. Estos micromotores son capaces de transformar energía química en movimiento. Dentro de ellos, los micromotres catalíticos (microcohetes) actúan como motores impulsados por burbujas. El mecanismo principal de funcionamiento de estos micromotores consiste en la generación de burbujas
de oxígeno a partir de la descomposición espontánea de peróxido de hidrógeno en la capa catalítica interna y su eyección a través de la apertura del microcono. Además se caracterizan por su elevada energía propulsora, su control direccional (mediante fuerzas magnéticas) y su capacidad de interacción con analitos diana (pick-up), lo que los hace 5 muy atractivos para diversas aplicaciones tales como la detección "on-chip" en dispositivos LOC. Por tanto, una clara aplicación, se centra en el sensado de los biomarcadores característicos de sepsis neonatal. Para ello, tras su fabricación según se detalla a continuación, serán funcionalizados adecuadamente (anticuerpos específicos de cada analito) para la captura selectiva de las distintas moléculas diana.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un aspecto de la invención se detalla un método de fabricación de un dispositivo para análisis de material biológico, dispositivo que presenta unos micromotores
15 poliméricos catalíticos que se insertan en el interior de un dispositivo microfluídico y cuya fabricación se lleva a cabo preferentemente mediante electrodeposición sobre moldes de membranas de policarbonato de distintos diámetros de poro por ejemplo (2 pm o 5 pm); dicho procedimiento consta de:
20 1. Deposición de una capa de oro conductora mediante sputtering (70-80 nm de
espesor) en una mebrana de policarbonato dotada de poros, que actuará como electrodo de trabajo y como molde para que el material a depositar en dichas cavidades, polímero conductor, de lugar a las microestructuras como pueden ser los microtubos. A continuación, se ensamblará esta membrana en una celda de electrodeposición,
25 utilizando papel de aluminio como contacto para el electrodo de trabajo. Un hilo de platino y un electrodo Ag/AgCl actuarán como electrodos auxiliar y de referencia, respectivamente. Los poros de la membrana tienen forma esencialmente cilíndrica de distintas secciones transversales o de doble cono unido por sus bases, cuando la membrana presenta 1 micra de diámetro de poro la forma es más cilíndrica.
2. Electrodeposición amperométrica del polímero conductor en el interior de los poros de la membrana, a partir de una disolución inicial conteniendo el monómero adecuado para cada aplicación (anilina, pirrol, EDOT) y los aditivos adecuados para favorecer la deposición y solubilización del monómero. Preferentemente se emplearán
mezclas de monómeros conteniendo grupos carboxílicos (polipirrol carboxílico) que dotarán a la superficie del micromotor resultante con numerosos grupos carboxílicos expuestos, simplificando su posterior funcionalización con anticuerpos específicos.
5 3. Deposición de diferentes capas catalíticas metálicas en el interior del microtubo
resultante. En un primer lugar, se depositará una capa de Pt mediante un método galvanostático, con el objetivo de crear una superficie altamente conductora que favorecerá la posterior deposición de una capa magnética de Ni (mediante amperometría), esencial para el control magnético del micromotor y su orientación 10 adecuada para entre los distintos reservorios del chip propuesto. Por último, se deposita una tercera capa catalítica de Pt esencial para la descomposición del peróxido de hidrógeno y generación de las burbujas de oxígeno necesarias para el movimiento del micromotor.
15 4. Liberación de los microrockets de la membrana a través de la eliminación de la
capa conductora de oro mediante pulido mecánico con una mezcla de alúmina y agua. A continuación se disolverá la membrana con diclorometano y los micromotores resultantes se lavarán secuencialmente con isopropanol, etanol y agua destilada; separando los mismos de cada disolución mediante centrifugación.
Una vez constituidos los micromotores, y en función de sus aplicaciones en el campo del análisis de material biológico se procede a una funcionalización de los micromotores que no contengan grupos carboxílicos en su superficie, por incorporación de una capa de oro mediante sputtering o el recubrimiento de la 25 superficie con nanopartículas de oro utilizando la técnica "layer-by-layer".
Incorporación de los anticuerpos específicos para los distintos biomarcadores en la superficie de los micromotores parcialmente modificada. En esta etapa los micromotores, en buffer salino, se incubarán con los anticuerpos específicos, permitiendo que los grupos amino-éster mencionados anteriormente reaccionen con 30 los grupos amino primarios presentes en la superficie de los anticuerpos.
Posteriormente, los grupos reactivos residuales se bloquearan con una disolución de etanolamina.
En otra posible realización de la invención se propone también el desarrollo de nanohilos
Au-Ni-Au, cuya superficie se puede modificar con bioreceptores específicos (lectinas, antiproteína A) para la interacción selectiva con las bacterias objeto de análisis (Staphylococcus epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus). El método de fabricación es el mismo empleado anteriormente, pero en este caso se emplean 5 membranas de alumina de 200 nm de diametro de poro y disoluciones comerciales del metal deseado. El movimiento de estos nanohilos se basa principalmente en el gradiente de presión generado por las ondas de ultrasonidos, que penetran en la parte cóncava final del motor y lo propulsan hacia adelante. Es posible también realizar su guiado dirigido mediante medios magnéticos como puede ser un imán.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo 15 preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Figura 1. Muestra un esquema de la formación de los microtubos a partir de la membrana 20 porosa. Donde los poros de dicha matriz aparecen simétricos.
Figura 2. Muestra un esquema de la funcionalización de los micromotores.
Figura 3. Muestra un esquema del método de análisis de material biológico de un 25 aspecto de la invención.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto de la invención se tiene un método de fabricación de un 30 dispositivo para análisis de material biológico, dicho dispositivo presenta una serie de micromotores (5) que se fabrican mediante deposición una capa de material conductor, preferiblemente oro y de un espesor comprendido entre 70 nm y 80 nm, mediante pulverización catódica sobre una membrana (4) porosa que actúa como matriz y comprende una pluralidad de poros (41) tal y como la que se aprecia en la
figura 1, membrana (4) porosa que está destinada a actuar como molde o matriz para material depositado y como electrodo de trabajo.
El resultado del paso anterior se ensambla en una celda de electrodeposición, 5 utilizando papel de aluminio como contacto para el electrodo de trabajo; donde un hilo de platino y un electrodo de Ag/AgCl actúan como electrodos auxiliar y de referencia, respectivamente, para proceder a una electrodeposición amperométrica de un polímero conductor en el interior de al menos uno de los poros (41) de la membrana (4) actuando como molde para generar al menos un microtubo (3), pudiendo tener los 10 poros (41) de la membrana (4) una forma esencialmente cilíndrica de distintas secciones transversales, forma bicónica o forma de doble cono unido por sus bases. Dicha electropolimerización amperométrica se lleva a cabo a partir de una disolución inicial comprendiendo: un monómero que se selecciona de entre anilina, pirrol y EDOT, y aditivos para favorecer la deposición y solubilización del monómero. El 15 monómero puede comprender grupos carboxílicos, expuestos en superficie del micromotor (5), simplificando una posterior funcionalización con anticuerpos específicos.
Una vez se tiene el microtubo (3) se procede a depositar diferentes capas (31,32,33) 20 metálicas en el interior del microtubo (3), más concretamente se realiza una deposición de una primera capa (31) mediante un método galvanostático en las paredes interiores del microtubo (3), que comprende Pt, con el objetivo de crear una superficie altamente conductora para posteriormente realizar una deposición sobre la primera capa (31) de una segunda capa (32), que se realiza mediante amperometría, 25 segunda capa (32) que es magnética y comprende Ni, para a continuación llevar a cabo una deposición sobre la segunda capa (32) de una tercera capa (33) que es catalítica y comprende Pt.
Los microtubos (3) se liberan de la membrana (4) mediante: la eliminación de la 30 capa de oro conductora, mediante pulido mecánico con una mezcla de alúmina y agua, y posteriormente mediante disolución de la membrana (4) en diclorometano se liberan los micromotores (5).
Una vez se tienen micromotores (5) fabricados, éstos se pueden lavar secuencialmente y favorecer su dispersión en medio acuoso mediante tratamiento con disoluciones de polaridad intermedia, en el siguiente orden: i) isopropanol, ii) etanol, iii) agua, para posteriormente proceder a separar los micromotores (5) de cada disolución 5 mediante centrifugación. Los micromotores (5), para realizar su función en el dispositivo de análisis, pueden ser funcionalizados como se aprecia en la figura 2 mediante deposición sobre el micromotor (5) de una capa de oro para posteriormente incorporar anticuerpos específicos para los distintos biomarcadores en la superficie de los micromotores (5) parcialmente modificada, y producir un bloqueo de grupos 10 reactivos residuales mediante una disolución de etanolamina.
Con los micromotores (5) fabricados se procede a insertarlos en un dispositivo microfluídico (2) que a su vez comprende canales (21) y pocillos (221,222,223) obteniendo así un dispositivo de análisis que comprende el citado dispositivo 15 microfluídico (2) y los micromotores (5) en su interior.
En un segundo aspecto de la invención se tiene un dispositivo para análisis de material biológico obtenible según el método del primer aspecto de la invención, dicho dispositivo comprende el dispositivo microfluídico (2) y los micromotores (5) en su 20 interior.
Un tercer aspecto de la invención es el uso del dispositivo para análisis de material biológico del dispositivo del segundo aspecto de la invención para reconocimiento específico de biomarcadores y bacterias características de sepsis neonatal.
Este tercer aspecto de la invención se detalla a continuación a modo de ejemplo de la misma. Se describe un ejemplo de realización de la presente invención en reconocimiento específico de biomarcadores y bacterias características de sepsis neonatal que se centra en la determinación de reactantes de fase aguda y 30 bacteriológicas. Estos incluyen los niveles de proteína C reactiva (PCR), procalcitonina (PCT), citoquinas (IL-6), así como la determinación de bacterias del grupo estafilococo coagulasa negativo (Staphylococcus epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus), gérmenes más frecuentemente relacionados con esta infección.
Se proponen tres posibles realizaciones diferentes del tercer aspecto de la invención en función del tipo de detección utilizada, ya sea óptica (fluorimetría) o electroquímica (voltamperometría). Todas ellas están basadas en la utilización de micromotores (5) como soporte de inmovilización para una metodología ELISA, que gracias a su 5 movimiento autónomo y autopropulsado permiten la determinación de compuestos diana en el interior de una plataforma microfluídica sin la necesidad de utilizar el movimiento de fluidos.
Una realización preferente del tercer aspecto de la invención viene dada por una 10 detección fluorescente; la cual se basa en la utilización de distintas moléculas fluorescentes (Quantum dots -QDs-) como marcadores específicos de cada analito, que emiten radiación electromagnética a distintas longitudes de onda y con gran intensidad. Esto permite una detección simultánea y en un único sistema monocanal de los distintos analitos objeto de análisis. Dicho método de análisis se detalla a 15 continuación de manera esquematizada.
El análisis implica la utilización de distintas poblaciones de micromotores (5) funcionalizados con anticuerpos, en adelante Ab, específicos de cada una de las moléculas y bacterias que se van a analizar. La inmovilización de los Ab sobre la 20 superficie de los micromotores (5) se llevará a cabo siguiendo alguna de las químicas de reacción publicadas en la bibliografía, ya comentadas en el epígrafe anterior. El análisis está basado en una metodología ELISA en formato sándwich.
1. Esta batería de distintos micromotores (5), donde cada uno de los tipos lleva 25 inmovilizada una molécula de reconocimiento específico del analito diana, es añadida
a un primer pocillo (221), denominado pocillo de reconocimiento, junto a un mínimo volumen de muestra (nL-pL), además del "combustible" necesario para el movimiento del micromotor que pueden ser disoluciones acuosas comerciales de peróxido de hidrogeno (1-10%). Gracias a este movimiento autónomo y autopropulsado, dichos 30 micromotores (5) navegarán por la disolución encontrando y uniendo las correspondientes moléculas diana específicas de cada población de micromotor (5).
2. Una vez se han producido los eventos de reconocimiento molecular, se lleva a cabo la orientación y guiado de los micromotores (5), gracias a la utilización de campos magnéticos u otro tipo de inducción como puede ser ultrasonidos, siendo
conducidos a través de los canales (21) y pocilios (221,222,223) de tal manera que se lleva del primer pocillo (221) al segundo pocillo (222).
3. Una disolución en este segundo pocillo (222), denominado pocillo de marcaje, 5 contiene las distintas poblaciones de Ab secundarios específicos de los diferentes
analitos. Cada tipo de Ab secundarios se inmovilizará sobre la superficie de partículas (mesoporosas (41) como sílica) que además co-inmovilizan varias moléculas de un compuesto marcador (QDs de una característica longitud de onda de emisión). De este modo se favorece la amplificación de la señal correspondiente al evento de 10 reconocimiento. Al igual que en el apartado 1, este pocillo contiene el "combustible" necesario para que los micromotores (5) puedan navegar y se favorezca este segundo evento de reconocimiento molecular.
4. Del mismo modo que en el apartado 2, se produce el guiado de los 15 micromotores (5) por el microcanal (21) hacía un tercer pocillo (223), denominado
pocillo de detección.
5. En este tercer pocillo (223), tiene lugar la etapa de detección. Es importante remarcar que únicamente llegarán a este tercer pocillo (223) aquellas moléculas
20 fluorescentes (QDs) inmovilizadas en la superficie de los micromotores (5) como consecuencia de la reacción de afinidad a través del analito. Este tercer pocillo (223) contendrá una disolución que producirá la liberación de las moléculas fluorescentes, mediante la ruptura de la unión de estas moléculas con las partículas que los contienen. De este modo, en este tercer pocillo (223) se encontrarán distintas 25 concentraciones de cada uno de los QDs en función de la concentración de cada analito en la muestra.
La detección fluorescente puede realizarse fácilmente iluminando este tercer pocillo (223) con una única longitud de onda de absorción, a la que se excitan los distintos 30 QDs, obteniéndose señales diferenciadas de cada uno de los distintos QDs por su emisión característica a distintas longitudes de onda. Para evitar la posible dispersión de radiación por la presencia de los micromotores (5) en disolución, este tercer pocillo (223) no contendrá combustible por lo que no se moverán y podrán ser fácilmente retenidos en el fondo del tercer pocillo (223) mediante la utilización de un campo
magnético.
Otra posible realización del tercer aspecto de la invención es la detección electroquímica, la cual se lleva a cabo de manera muy similar a la realización expuesta 5 anteriormente del tercer aspecto de la invención en el que las moléculas utilizadas para su detección (QDs) son sustituidas por nanopartículas /nanobarras ("nanorods") de distintos metales, tantos como analitos se determinan. En este sentido, los Ab secundarios específicos de cada analito son co-inmovilizados en las partículas (mesoporosas de sílica) junto a nanopartículas de un determinado metal.
La detección se producirá tras la liberación de las distintas nanopartículas metálicas (un metal diferente por cada analito) y cuya cantidad vendrá dada por la concentración de analito en la muestra. Esta detección se realiza mediante una técnica electroquímica de redisolución sobre la superficie de un electrodo incluido en el tercer 15 pocillo (223) o pocillo de detección.
En una última posible realización del tercer aspecto de la invención se tiene una determinación enzimática, la cual se lleva a cabo de manera similar a las realizaciones anteriores del tercer aspecto de la invención, cuya diferencia fundamental estriba en la 20 determinación independiente de los distintos biomarcadores. Esto se llevará a cabo en un único microchip que incorpora los canales (21) y sus correspondientes pocillos (221,222,223), como sistemas paralelos para la determinación independiente y multiplexada de los distintos analitos.
25 Por tanto, las etapas del procedimiento se repiten para cada uno de los sistemas dedicados a un determinado analito y todos ellos incluidos en el mismo dispositivo.
1. Ahora, en el primer pocillo (221) se añade una única población de micromotores (5) específicos para ese analito particular, junto al volumen de muestra y el combustible para su movimiento.
2. Los apartados 2 y 4 se mantiene igual que en los procedimientos anteriores.
3. Los Ab secundarios (específicos para cada analito y en su sistema correspondiente) son co-inmovilizados junto a numerosas moléculas de la enzima
peroxidasa (HRP) en las partículas (mesoporosas de sílica). En este caso la amplificación de la señal se ve aumentada por la utilización de la enzima (por cada molécula de enzima se obtienen un gran número de moléculas de producto) favoreciendo una mejora en la sensibilidad analítica.
5. El pocillo de detección (223) contendrá una disolución del substrato enzimático y mediador electroquímico (HQ), que tras la correspondiente reacción enzimática dará lugar a la formación de un producto electroactivo que puede ser detectado sobre una superficie electródica y será directamente proporcional a la concentración de analito 10 presente en la muestra. En este caso no es necesaria la liberación de las moléculas de enzima de las partículas de inmovilización, ya que su catálisis no se verá afectada significativamente por dicha inmovilización. Este mismo procedimiento puede llevarse a cabo con detección fluorescente, sustituyendo el mediador electroquímico por un substrato tal como el HPPA (3-p-hydroxyphenylproprionic acid)), cuyo producto de 15 reacción con la enzima peroxidasa (HRP) de lugar a una molécula fluorescente
Finalmente, en un cuarto aspecto de la invención, tenemos un método de análisis de material biológico que hace uso del dispositivo del segundo aspecto de la invención, dicho método se encuentra representado en la figura 3 donde S es un sustrato (una 20 molécula) que reacciona específicamente con una enzima E y P es un producto generado de esa reacción enzimática que es la molécula que realmente se mide al final basándose en alguna propiedad de la misma (óptica o electroquímica) como en el tercer aspecto de la invención; el método de análisis de material biológico que hace uso del dispositivo del cuarto aspecto de la invención comprende los siguientes pasos: 25 - insertar en el primer pocillo (221) denominado pocillo de reconocimiento un volumen
de muestra a analizar,
- insertar en el primer pocillo (221) una serie de micromotores (5) que respectivamente comprenden inmovilizada una molécula de reconocimiento específico del analito diana para provocar uniones de las correspondientes moléculas diana específicas de
30 molécula de reconocimiento específico del analito diana de micromotor (5),
- insertar en el primer pocillo además "combustible" necesario para el movimiento del micromotor (5).
- realizar una orientación y guiado del micromotor (5) desde el primer pocillo (221) hasta un segundo pocillo (222) del dispositivo, denominado pocillo de marcaje el cual
contiene contiene moléculas secundarias específicas del analito, dicha orientación se puede hacer mediante inducción magnética y el guiado mediante propulsión por burbujas o ultrasonidos.
- realizar una orientación y guiado del micromotor (5) desde el segundo pocillo 5 (222) hasta un tercer pocillo (223) del dispositivo, denominado pocillo de detección en
el cual se produce una detección de concentración de analito presente en la muestra al igual que en el paso anterior, la orientación se puede hacer mediante mediante inducción magnética y el guiado mediante propulsión por burbujas o ultrasonidos.
