Sistema para la administration de sustancias biologicamente activas preparado por tecnicas de espumado empleando gases comprimidos o fluidos supercriticos.
Sector de la tecnica
La invention se dirige a un sistema para la administration de sustancias biologicamente activas. Mas concretamente, el sistema comprende una matriz que comprende acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) (PLGA). La invention tambien se dirige a un procedimiento para la preparation de dichos sistemas, mas concretamente el procedimiento comprende una etapa de espumado empleando un gas comprimido o fluido supercritico. Alternativamente, se incorpora un agente porogenico para formar macroporos por descomposicion termica. La invention tambien se dirige a los usos de estos sistemas.
Estado de la tecnica
En medicina regenerativa se requiere disponer de implantes sinteticos que actuen como andamiajes (scaffolds) tridimensionales y participen activamente en la regeneration del tejido, actuando como sistemas de cesion de sustancias activas y guiando el crecimiento del tejido.
Los poliesteres son un grupo de poHmeros biodegradables ampliamente utilizados para construir andamiajes. Uno de los mas comunes es el acido poli (D, L-lactico-co- glicolico) (PLGA) , que se degrada dando lugar a oligomeros y monomeros por hidrolisis de sus enlaces ester. Las propiedades fisicas y mecanicas y la resistencia a la degradation de este poHmero se pueden ajustar regulando la relation de monomeros, el peso molecular y el grado de cristalinidad (Makadia HK, Siegel SJ, Poly lactic-co- glicolic acid (PLGA) as biodegradable controlled drug deliver y carrier. Polym 3, 13771397, 2011). Se ha descrito que microesferas de PLGA presentan un tiempo de degradation variable desde 8 a 35 semanas siendo particularmente dependiente de la relation lactico:glicolico del PLGA (Anderson JM, Shive MS, Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv Drug Del Rev 64, 72-82, 2012). Esta variedad de tiempos de degradacion permite adaptar la cinetica de degradacion del andamiaje a la velocidad de crecimiento del tejido en formation, lo cual es esencial para el buen funcionamiento del andamiaje y regenerar el tejido.
El empleo de PLGA de baja viscosidad intrinseca es especialmente adecuado para la regeneration de tejido oseo, ya que el tiempo de degradation es de entre 8 a 10 semanas. Sin embargo, se ha descrito que la preparation de una matriz porosa de PLGA de viscosidad intrinseca baja (0, 2 dL/g) mediante el metodo de espumado con CO2 ha resultado en un andamiaje con una inadecuada consistencia, ya que la matriz experimento una expansion por espumado tan pronunciada que el andamiaje perdio su integridad fisica y mecanica y por lo tanto resulto un andamiaje no util (Sheridan MH, Shea LD, Peters MC, Mooney DJ, Bioabsorbable polymer scaffolds for tissue engineering capable of sustained growth factor deliver y. J Control Release 2000, 64 (1-3) , 91-102).
Ademas, los andamiajes basados en PLGA de viscosidad intrinseca baja presentan una escasa capacidad de control de la cesion de las sustancias biologicamente activas que se incorporan a la matriz polimerica de PLGA (Graves RA, Pamujula S, Moiseyev R, Freeman Th, Bostanian LA, Mandal TK, Effect of different ratios of high and low molecular weight PLGA blend on the characteristics of pentamidine microcapsules. Int JPharm 2004, 270, 251-262).
Por otro lado, tecnicamente resulta muy dificil conseguir andamiajes de porosidad dual mediante espumado con gases comprimidos o fluidos supercriticos. Para obtener macroporos de 200-600 micras se suele recurrir a la incorporation en el andamiaje de particulas hidrosolubles como por ejemplo cloruro sodico, bicarbonato sodico, glucosa, dextrina o trehalosa que, mediante lixiviacion posterior, dan lugar a macroporos en la matriz polimerica. El proceso de lixiviacion tiene los inconvenientes de que durante el lavado se puede perder una proporcion significativa de las sustancias activas y de que requiere una etapa adicional de secado de los scaffolds, alargando el tiempo de procesado (Kim SS, Ahn KM, Park MS, Lee JH, Choi CY, Kim BS, A poly (lactide-co- glycolide) /hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. J BiomedMater Res A 2007, 80A (1) , 206-215).
De este modo, todavia existe la necesidad de proporcionar matrices porosas basadas en PLGA de viscosidad intrinseca baja con unas propiedades que la hagan utiles para la fabrication de andamiajes, y que sean capaces de incorporar sustancias biologicamente activas y cederlas de manera controlada a lo largo del tiempo.
Descripcion breve de la invencion
Los autores de la presente invencion han desarrollado un sistema para la administration de sustancias biologicamente activas basado en PLGA de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g, que permite ceder las sustancias biologicamente activas de manera 5 controlada a lo largo del tiempo. Ademas el sistema de la invencion comprende una matriz biodegradable, porosa, homogenea, de consistencia solida o semisolida, caracteristicas que lo hacen especialmente adecuado para medicina regenerativa y en particular para preparar andamiajes.
Asi, en un primer aspecto, la invencion se refiere a un sistema para la administracion de 10 sustancias biologicamente activas que comprende una matriz biodegradable homogenea de consistencia solida o semisolida de porosidad superior al 50%, dicha matriz comprende acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g, y al menos una sustancia biologicamente activa.
Un segundo aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento para la obtencion de 15 un sistema para la administracion de sustancias biologicamente activas que comprende una matriz biodegradable homogenea de consistencia solida o semisolida de porosidad superior al 50%, dicha matriz comprende acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) y al menos una sustancia biologicamente activa, que comprende:
a) preparar una mezcla fisica que comprende acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) y una 20 sustancia biologicamente activa, y opcionalmente un agente porogenico;
b) calentar la mezcla a una temperatura igual o inferior a 40°C;
c) poner en contacto la mezcla con un gas comprimido o fluido supercritico a una presion de entre 40 y 120 bar y a una temperatura de entre 20 y 40°C, entre 5 minutos y 24 horas; y
d) despresurizacion a una velocidad de entre 2 y 8 bar/min con enfriamiento mediante la adicion de un Hquido comprimido, que es gaseoso a 25°C y 1 atmosfera de presion, a una temperatura de entre -196° y 19°C.
En una realization particular del segundo aspecto de la invencion, el poli (D, L-lactico- co-glicolico) tiene una viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g.
Un tercer aspecto de la invention, se refiere a un sistema obtenible mediante el procedimiento descrito anteriormente.
Un cuarto y quinto aspecto de la invencion se refieren a un implante y un andamiaje que comprende un sistema segun se ha descrito anteriormente, respectivamente.
Un sexto aspecto de la invencion se refiere al uso de los sistemas de la invencion, del implante o del andamiaje de la invencion, para la fabrication de un medicamento. En una realization particular, la invencion se dirige a los sistemas, los andamiajes y los implantes como se han descrito anteriormente, para su uso como medicamento. En otra realizacion particular, el medicamento es para el tratamiento de estados patologicos o fisiologicos en humanos o animales. En una realizacion mas particular, el medicamento es para regeneration osea. En otra realizacion particular, el medicamento es para regeneration de cartHago. En otro aspecto, la invencion se dirige hacia el uso del sistema como se ha definido anteriormente para la preparation de andamiajes para medicina regenerativa e ingenieria de tejidos.
El andamiaje segun la invencion es adecuado como un implante monoHtico o como un sistema multiparticular, para cesion controlada de las sustancias biologicamente activas en el lugar de aplicacion y para induction de diferenciacion celular y regeneracion de un tejido. En una realizacion particular, los sistemas de la invencion, implantes y andamiajes segun se han descrito anteriormente, forman parte de un implante monoHtico o multiparticular. En una realizacion particular, el sistema de la invencion se puede obtener como un conjunto de particulas o como implante monoHtico para cesion controlada en el lugar de aplicacion sin efectos toxicos.
Description de las figuras
Figura 1. Imagen por microscopia confocal de un scaffold preparado a partir de PLGA, poli (s-caprolactona) (PCL) , almidon y lisozima marcada con isotiocianato de fluorescema (FITC) en proportion en peso 85:10:5.
Figura 2. Perfiles de cesion de dexametasona en medio tampon fosfato de matrices de 10 miligramos preparadas a partir de mezclas de (i) PCL:PLGA 50:50 peso/peso, dexametasona y almidon pregelificado en proporcion en peso 85:5:10 (diamantes) ; (ii
PCL:PLGA 50:50 peso/peso y dexametasona 85:5 (triangulos). Perfiles de cesion a (a) 6 horas y (b) 3 semanas.
Figura 3. Ensayo de citotoxicidad a 7 dias de scaffolds de PCL, PLGA, almidon y PRGF en proportion en peso 42, 5:42, 5:5:10 por sembrado de celulas madre mesenquimales. Las celulas vivas estan tenidas en verde con calcema (en gris en la figura) y las muertas en rojo con yoduro de propidio (ausente en la figura).
Figura 4. Ensayo Quant-IT PicoGreen dsDNA de proliferation a 3 (barras de color gris) y 7 dias (barras de color negro) de celulas madre mesenquimales sembradas en scaffolds de (a) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p PCL, (b) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p y PRGF al 5% en relation al peso de la mezcla PCL:PLGA; y (c) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p con almidon pregelificado a 90°C (st) y PRGF al 10 y 5%, respectivamente, en relacion al peso de la mezcla PCL:PLGA.
Figura 5. Imagen por microscopia SEM de un scaffold de porosidad dual preparado a partir de (a) mezclas de PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y un agente porogenico (bicarbonato amonico) en proporcion en peso 50:50; (b) mezclas de PCL:PLGA 50:50 p/p y un agente porogenico (bicarbonato amonico) en proporcion en peso 50:50; (c) mezclas de PCL:PLGA 50:50 peso/peso; (d) mezclas de PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p, almidon pregelificado a 120°C y bicarbonato amonico en proporcion en peso 45:5:50; y (e) mezclas de PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p, almidon pregelificado a 120°C en proporciones en peso 85:10. Escala: 50 p, m.
Description detallada de la invention
La invencion se refiere a un sistema para la administration de sustancias biologicamente activas, como se ha definido previamente, que presenta unas caracteristicas especialmente adecuadas para la regeneration de tejido oseo y cartilaginoso. Asi, en un primer aspecto, la invencion se refiere a un sistema para la administracion de sustancias biologicamente activas que comprende una matriz biodegradable, homogenea, de consistencia solida o semisolida, de porosidad superior al 5
50%, dicha matriz comprende acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g, y al menos una sustancia biologicamente activa.
El acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) (PLGA) es un poHmero sintetico biodegradable de la familia de los poliesteres alifaticos, en concreto es un alfa-hidroxiacido copoHmero de acido polilactico y acido poliglicolico. El acido poli (D, L-lactico-co- glicolico) para la presente invention tambien incluye los copoHmeros de acido polilactico y acido poliglicolico con un grupo terminal seleccionado de entre hidroxi, carboxilo y ester. El PLGA de la invencion tiene una relation lactico:glicolico de entre 85:15 a 40:60, preferiblemente entre 75:25 a 50:50.
El PLGA esta siendo objeto de especial atencion para aplicaciones biomedicas y ha sido aprobado para ciertas aplicaciones por la FDA. El PLGA se degrada por hidrolisis de sus enlaces ester en el medio acuoso del organismo. Las propiedades fisicas y mecanicas y la resistencia a la degradation de este poHmero se pueden ajustar regulando la relacion de monomeros, el peso molecular y el grado de cristalinidad (Makadia HK, Siegel SJ, Poly lactic-co-glicolic acid (PLGA) as biodegradable controlled drug deliver y carrier. Polym 3, 1377-1397, 2011).
Como se ha comentado anteriormente, el PLGA de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g se degrada a una velocidad mas adecuada que otros tipos de PLGA para la regeneration de hueso o de cartilago. Por este motivo, el tipo de PLGA preferido de la presente invencion es aquel PLGA que tiene una viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g.
La "viscosidad intrinseca" se refiere a la medida del tiempo de flujo de una solution polimerica a traves de un capilar estrecho respecto al tiempo de flujo del disolvente puro a traves del mismo capilar. Se trata de un metodo reologico para determinar el peso molecular de un poHmero y se expresa generalmente en unidades de decilitros por gramo.
La expresion "matriz homogenea" se refiere a aquella matriz con uniformidad espacial en su estructura y uniformidad en su composition. En una matriz homogenea, como la de la invencion, no hay trazas de las morfologias pulverulentas propias de los materiales de partida como se demuestra en los ejemplos y en particular en el ejemplo 1 y figura 1.
En la figura 1 se observa ademas la distribution uniforme de la lisozima, la sustancia biologicamente activa empleada en el correspondiente ejemplo.
En una realization particular, el sistema de la invention comprende ademas un compuesto regulador de la cesion seleccionado del grupo que consiste en un oligosacarido y un polisacarido. La adicion de un compuesto regulador de la cesion al sistema de la invencion permite modular el perfil de cesion de la sustancia activa. En la figura 2 se pueden comparar los perfiles de liberation de dexametasona cuando el sistema comprende almidon frente a un sistema que no lo comprende. Se observa que, a periodos cortos de tiempo, inferiores a 7 dias, la cantidad cedida de la sustancia biologicamente activa es hasta la mitad respecto al sistema que no comprende el polisacarido. Mientras que a periodos mas largos de tiempo, por ejemplo 21 dias, la cantidad de sustancia activa cedida es del mismo orden en ambos sistemas.
El termino "compuesto regulador de la cesion" se refiere a aquel compuesto que modula la cesion de sustancias biologicamente activas en una formulacion a fin de obtener un perfil de cesion adecuado para que se manifieste el efecto terapeutico.
En una realizacion particular de la invencion, el compuesto regulador de la cesion es almidon o un derivado de almidon. Por "derivado de almidon" se entiende un oligomero o poHmero obtenido a partir de almidon como producto de partida por modification fisica, qmmica o enzimatica. En una realizacion particular de la invencion, el componente regulador de la cesion es un derivado del almidon obtenido por modificacion qmmica total o parcial por acilacion, acetilacion u oxidation por sustitucion de parte de los grupos hidroxilo del almidon por grupos acilo, acetilo o eter.
De este modo es posible incrementar la hidrofobicidad y propiedades mecanicas del almidon.
El almidon es un polisacarido natural compuesto por una mezcla de amilosa y amilopectina, y algunos de sus derivados. En estado nativo, el almidon se presenta en forma de granulos parcialmente cristalinos dificiles de mezclar con poHmeros sinteticos, como por ejemplo el PLGA (Mani R, Bhattachar y a M, Properties of injection moulded blends of starch and modified biodegradable polyesters. Eur Polym J 37, 515-526, 2001; Wang N, Yu J, Chang PR, Ma X, Influence of formamide and water on the properties of thermoplastic starch/poly (lactic acid) blends. Carbohydrate Polym 71, 109-118, 2008). Ademas, la incorporation de almidon a los andamiajes puede facilitar la adhesion, proliferacion y diferenciacion celular.
Sin embargo, la incorporation de un oligosacarido o polisacarido a los sistemas de la invention esta dificultada por la baja compatibilidad entre el oligosacarido o polisacarido, en particular el almidon, y el PLGA. Si se aplica un tratamiento previo al almidon antes de emplearlo, es posible mejorar dicha compatibilidad. De este modo, en una realizacion particular, el compuesto regulador de la cesion es almidon pregelificado.
En una realizacion particular de la invencion, la proporcion del compuesto regulador de la cesion esta comprendida entre el 0, 1% y el 25% en peso respecto al PLGA de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g.
Otra ventaja de los sistemas de la invencion que comprenden almidon es que proporcionan un mayor grado de proliferation celular, como se demuestra en el ejemplo 3 y se ilustra en la figura 4. En una realization preferida, los sistemas de la invencion comprenden almidon pregelificado.
En una realizacion particular, los sistemas de la invencion como se han descrito anteriormente comprenden ademas un poliester sintetico o semisintetico biodegradable diferente al acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g. En una realizacion particular, el poliester sintetico o semisintetico se selecciona del grupo consistente en acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) con viscosidad intrinseca superior a 0, 5 dL/g, poli (epsilon-caprolactona) , acido polilactico, acido poliglicolico, polibutilensuccinato, poli (p-dioxanona) , policarbonato, polihidroxibutirato, y los copoHmeros de los mismos.
En una realizacion particular, en los sistemas de la invencion como se han descrito anteriormente, la matriz comprende ademas un componente regulador de la cesion como se ha descrito anteriormente y un poliester sintetico biodegradable diferente al acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g, como se ha descrito anteriormente.
En una realizacion mas particular, en los sistemas de la invencion como se han descrito anteriormente, la matriz comprende ademas almidon pregelificado y poli-epsilon- caprolactona.
Una realizacion preferida de la invencion se refiere a un sistema para la administration de sustancias biologicamente activas que comprende una matriz biodegradable homogenea de consistencia solida o semisolida de porosidad superior al 50%, dicha
matriz comprende acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g, al menos una sustancia biologicamente activa, un compuesto regulador de la cesion seleccionado del grupo que consiste en un oligosacarido y un polisacarido, y un poliester sintetico o semisintetico biodegradable diferente al acido poli (D, L-lactico-co- glicolico) de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g.
En una realization aun mas preferida, la invention se refiere a un sistema para la administration de sustancias biologicamente activas que comprende una matriz biodegradable homogenea de consistencia solida o semisolida de porosidad superior al 50%, dicha matriz comprende acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g, al menos una sustancia biologicamente activa, almidon pregelificado y poli (epsilon-caprolactona).
En otra realizacion particular, los sistemas de la invencion comprenden ademas un agente plastificante. En una realizacion particular, el agente plastificante se selecciona de entre agua, glicerol, sorbitol, maltitol, xilitol, polietilenglicol, formamida, urea, propilenglicol, trietilenglicol y acidos grasos.
En una realizacion particular de la invencion, el agente plastificante esta en una proportion de entre 0, 5 y 65% en peso respecto al componente regulador de cesion. El agente plastificante mejorar la compatibilidad del compuesto regulador de la cesion con el PLGA.
La presente invencion se refiere tambien a un procedimiento para la obtencion de un sistema para la administracion de sustancias biologicamente activas que comprende una matriz biodegradable homogenea de consistencia solida o semisolida de porosidad superior al 50%, dicha matriz comprende acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) y al menos una sustancia biologicamente activa, que comprende:
a) preparar una mezcla fisica que comprende acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) y una sustancia biologicamente activa, y opcionalmente un agente porogenico;
b) calentar la mezcla a una temperatura igual o inferior a 40°C;
c) poner en contacto la mezcla con un gas comprimido o fluido supercritico a una presion de entre 40 y 120 bar y a una temperatura de entre 20 y 40°C, entre 5 minutos y 24 horas; y
d) despresurizacion a una velocidad de entre 2 y 8 bar/min con enfriamiento mediante la adicion de un Hquido comprimido, que es gaseoso a 25°C y 1 atmosfera de presion, a una temperatura de entre -196° y 19°C.
En una realization preferida, el acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) empleado en la etapa a) del procedimiento de la invention tiene una viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g. El procedimiento de la invencion esta disenado particularmente para la obtencion de sistemas que comprenden una matriz basada en PLGA de viscosidad intrinseca baja, en concreto de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g, ya que evita los problemas encontrados en la tecnica para este material que pierde su integridad fisica y mecanica haciendolo inutil para su proposito como implante o andamiaje.
Desde el punto de vista del procesado, el uso de la tecnologia de gases comprimidos y fluidos supercriticos ha emergido como una alternativa viable, reproducible y respetuosa con el medio ambiente para obtener andamiajes y componentes de andamiajes libres de trazas de disolventes aplicando condiciones de procesado moderadas. Las tecnicas de espumado empleando CO2 en forma de gas comprimido o en condiciones supercriticas como soluto de un poHmero, permiten obtener, en pocas etapas, materiales de porosidad y distribution porosa controladas, a una temperatura compatible con componentes termosensibles y sin necesidad de utilizar disolventes organicos que pueden causar problemas medioambientales y comprometer la biocompatibilidad del andamiaje (De Ponti R, Lardini E, Martini A, Torricelli C, Use of supercritical fluids to obtain porous sponges of biodegradable polymers. WO1991009079 A1).
El procedimiento al que se refiere la invencion tiene las ventajas de que no requiere la incorporation de disolventes organicos o agua en ninguna de sus etapas, se lleva a cabo en un unico paso, y las temperaturas de trabajo estan comprendidas entre 20 y 40°C que son compatibles con la incorporacion de componentes termosensibles como las sustancias biologicamente activas, ademas transcurre en condiciones respetuosas con el medioambiente, y supera las limitaciones actuales de empleo de poHmeros de baja viscosidad intrinseca como PLGA de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g.
El procedimiento al que se refiere la invencion se basa en la fusion o el calentamiento de la mezcla polimerica por encima de la temperatura de transition vftrea de PLGA, o
de la mezcla polimerica conteniendo PLGA en el caso de que hubiese componentes adicionales como se ha descrito arriba.
En la etapa a) del procedimiento es posible anadir otros compuestos que son utiles para la funcionalidad del sistema obtenido. En una realization particular, la mezcla fisica de la etapa a) comprende ademas un compuesto regulador de cesion y/o un poliester sintetico biodegradable diferente al acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) de viscosidad intrinseca inferior a 0, 5 dL/g.
En una realizacion particular, el procedimiento segun se ha descrito anteriormente, comprende una etapa adicional, anterior a la etapa a) , en la que el compuesto regulador de cesion es pregelificado en medio acuoso a una temperatura entre 70 y 140°C, enfriado y secado previamente a la incorporation en la mezcla de la etapa a).
En una realizacion particular de la invencion, el almidon ha sido pregelificado en medio acuoso a una temperatura entre 70 y 140°C, enfriado y secado en un horno o mediante liofilizacion o secado supercritico tras paso previo de cambio de disolvente.
La invention proporciona ademas un metodo para eliminar un agente porogenico con la condition de que el agente porogenico se selecciona del grupo que consiste en bicarbonato amonico, carbonato amonico, bicarbonato sodico y fosfato amonico, mediante descomposicion termica. De este modo se evitan etapas como la lixiviacion que arrastra la sustancia biologicamente activa presente en el sistema. El secado tras la lixiviacion tampoco es necesario.
Asi, en una realizacion particular, el procedimiento segun se ha descrito anteriormente comprende una etapa adicional de eliminacion del agente porogenico, con la condicion de que el agente porogenico empleado en la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en bicarbonato amonico, carbonato amonico, bicarbonato sodico y fosfato amonico, que comprende calentar el material obtenido en la etapa d) a una temperatura de entre 20 y 50°C.
En una realizacion particular, el procedimiento segun se ha descrito anteriormente comprende ademas la formation de un andamiaje como un implante monolitico o un sistema multiparticular.
En otra realizacion particular, la proportion de acido poli (D, L-lactico-co-glicolico) , frente al compuesto regulador de cesion esta comprendida entre el 75% y el 99.9%.
La preparation de la mezcla fisica, segun la etapa a) del procedimiento, se puede realizar empleando tecnicas habituales de mezclado, como por ejemplo una mezcladora de paletas, una mezcladora planetaria o una mezcladora tipo turbula.
La aplicacion de un gas comprimido o fluido supercritico como medio de procesado, segun la etapa c) del procedimiento de la invention, se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante presurizacion de un autoclave termostatizado con un compresor o una bomba o introduction de CO2 Hquido o hielo seco en el citado autoclave. En esta etapa, las sustancias biologicamente activas se pueden encontrar disueltas o en suspension respecto a la mezcla polimerica. En una realization particular, el tiempo de contacto entre el gas comprimido o fluido supercritico y la mezcla es de entre 5 minutos y 24 horas. En una realizacion mas particular, es de entre 15 minutos y 1 hora. En una realizacion preferida, es de entre 20 minutos y 40 minutos.
La mezcla de la etapa c) se despresuriza y se enfria de manera secuencial o conjunta para obtener el sistema de la invencion anteriormente descrito con consistencia solida o semisolida y aspecto homogeneo. El dioxido de carbono interacciona con los poHmeros actuando de plastificante y agente de hinchamiento, reduciendo as! la temperatura de transition vftrea y/o la temperatura de fusion en el caso de que en la mezcla este presente un poliester sintetico biodegradable. La cantidad de dioxido de carbono absorbida durante el procesado y el consiguiente hinchamiento de la mezcla polimerica es proporcional a la temperatura y presion del medio de procesado. Durante la eliminacion del CO2, tiene lugar una inestabilidad termodinamica que conlleva la formation de volumen hueco (porosidad) por nucleacion. Cuando el CO2 abandona la matriz, la temperatura de fusion o de transicion vftrea aumenta por encima de la temperatura de trabajo y el scaffold se vitrifica. Durante la despresurizacion, segun la etapa d) , en condiciones ambientales, la velocidad de desgasificacion o despresurizacion influye en el tamano de poro y la interconectividad del scaffold final. La velocidad de enfriamiento durante la despresurizacion tambien influye en el tamano de poro y la interconectividad del scaffold final.
La resistencia a la expansion de los poros tras nucleacion es muy baja para matrices polimericas con componentes de baja viscosidad intrinseca (<0, 5 dL/g) , formandose poros muy grandes (superiores a un miHmetro). En esta realizacion particular, tras una despresurizacion parcial, se anade Hquido comprimido frio para enfriar la muestra, 5
reducir la viscosidad de la mezcla por descenso de temperatura y contener la expansion de los poros. Dicho Hquido comprimido ha de ser gaseoso a presion y temperatura ambiente. El CO2 Hquido o N2 Hquido se empleara preferentemente.
En una realization particular, un agente solido porogenico se incorpora a la matriz antes de la etapa de mezclado. En una realizacion mas particular, dicho agente porogenico se descompone termicamente mediante una etapa de post-procesado por calentamiento del material a temperatura comprendida entre 20 y 50°C. En una realizacion preferida, el agente porogenico es bicarbonato amonico. En una realizacion particular de la invention, la proportion de agente porogenico esta comprendida entre el 15% y el 65% en peso del material polimerico biocompatible.
En otro aspecto, la invencion tambien se dirige al sistema para la administracion de sustancias biologicamente activas, obtenible mediante el procedimiento segun se ha descrito anteriormente.
Poniendo en practica el procedimiento de la invention se obtienen sistemas con una porosidad superior al 50% (ver ejemplos) , que es una porosidad conveniente en implantes para la regeneracion osea teniendo en cuenta que los implantes para regeneration osea han de ser capaz de emular la morfologia osea. Para ello, es favorable emplear una matriz con propiedades texturales adecuadas para facilitar el ingreso, adhesion y proliferation celular as! como la neovascularization y difusion de gases y nutrientes a las celulas. Asi, resulta conveniente utilizar por tanto una matriz con porosidad analoga a la del hueso trabecular de entre 50 y 90%, preferiblemente proximo a su valor superior (Karageorgiou V, Kaplan D, Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis, Biomater. 2006, 26, 5474-5491) (Rezvan K, Chen QZ, Blaker JJ, Boccaccini AR, Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering, Biomater. 2006, 27, 3413-3431).
Como resultado del procedimiento de la invention, se obtienen sistemas con poros concavos (ver ejemplos). Esta geometria de los poros es adecuada para la aplicacion de los sistemas de la invention a regeneracion de tejidos ya que influye en el crecimiento (Zadpoor AA, Bone tissue regeneration: the role of scaffold geometr y , Biomater. Sci., 2015, 3, 231-245).
Los sistemas obtenibles mediante el procedimiento de la invention tienen un espesor de la pared del poro uniforme y netamente inferior al tamano de poro.
La presente invention emplea un medio de procesado en condiciones de gas comprimido o de fluido supercritico. Un fluido esta en condiciones supercriticas cuando su presion y temperatura estan por encima de las de su punto critico y se caracteriza por propiedades intermedias entre las de un Hquido y un gas. Ejemplos de fluidos que pueden ser utilizados con esta invention se seleccionan de dioxido de carbono (CO2) , agua, protoxido de nitrogeno, metano, etano, etileno, propano, pentano, benceno, metanol, etanol, isopropanol, varios fluorocarbonos tales como clorotrifluorometano y monofluorometano, tolueno, piridina, ciclohexano, decalina, ciclohexanol, o-xileno y tetralina. La presente invention contempla el uso de estas sustancias por separado o en combination, as! como el empleo de aditivos. En una realization particular de la invention, el gas comprimido o fluido supercritico es el CO2. El uso individual de CO2 como medio de procesado es preferido por su no inflamabilidad, bajo coste y su facil elimination del medio a la temperatura y presion ambiente. No habra, por tanto, CO2 residual en el producto final que pueda contribuir a problemas en su uso.
El termino "sustancia biologicamente activa" se refiere a cualquier sustancia que altera, promueve, acelera, prolonga, inhibe, activa o al menos afecta a los procesos biologicos o qmmicos que tienen lugar en seres humanos y animales. Cuando una o varias sustancias biologicamente activas se incorporan al sistema de la invention, estas se encuentran dispersas a nivel molecular o particular. El sistema es adecuado para incorporar sustancias biologicamente activas independientemente de las caracteristicas de solubilidad de las mismas. Debido a las caracteristicas de los componentes del sistema y las condiciones de procesado, este es especialmente adecuado para incorporar sustancias biologicamente activas termosensibles.
En una realizacion particular, los sistemas de la invencion pueden comprender ademas otra sustancia biologicamente activa.
En una realizacion particular, las sustancias biologicamente activas se seleccionan entre hormonas, antiinflamatorios, antineoplasicos, agentes antimicrobianos y sustancias morfogenicas para reparation de defectos oseos y otras aplicaciones en medicina regenerativa. En una realizacion mas particular, la sustancia biologicamente activa es la mezcla de factores de crecimiento contenido en una preparation rica en plaquetas (PRGF). En otra realization particular, la sustancia biologicamente activa es una preparacion rica en factores de crecimiento. Esta preparacion esta destinada a favorecer
la regulation de las interacciones de celulas entre si y con la matriz extracelular en tejidos blandos y huesos.
En otra realization particular, la proportion de sustancia biologicamente activa esta comprendida entre el 0, 1% y el 15% en peso respecto al acido poli (D, L-lactico-co- glicolico).
En una realizacion particular, la invention se refiere a una etapa adicional al procedimiento descrito, que comprende la formation de implantes: el sistema enfriado se puede dividir en porciones por corte. En una realizacion aun mas particular, la elimination de una peHcula externa fina, densa y no porosa puede ser necesaria antes de ser utilizada para propositos de implantacion.
Los sistemas obtenidos, en forma de particulas o con otra morfologia adecuada para su implantacion, son adecuados como implantes capaces de proporcionar una cesion de sustancias biologicamente activas ajustable a requerimientos espetificos.
En una realizacion preferida, la invention se dirige al uso de un sistema como el definido anteriormente en la preparation de un implante capaz de ceder una sustancia biologicamente activa para la reparation de defectos oseos.
En otro aspecto, la invention se refiere a un implante que comprende un sistema segun se ha descrito anteriormente.
En otro aspecto, la invention se refiere a una andamiaje que comprende un sistema segun se ha descrito anteriormente.
En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de los sistemas de la invencion descritos anteriormente, del implante de la invention o del andamiaje de la invention, para la fabricacion de un medicamento.
En una realizacion particular, el medicamento es para el tratamiento de estados patologicos o fisiologicos en humanos o animales.
En una realizacion particular, el medicamento es para regeneracion osea.
En una realizacion particular, el medicamento es para regeneration de cartilago.
A continuation, para una mejor comprension de la invention se proporcionan los siguientes ejemplos, sin que estos supongan una limitation a la invention.
Ejemplo 1. Preparacion de matrices de PLGA/PCL con almidon y lisozima
Se prepararon mezclas de PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p y se incorporaron lisozima marcada con FITC y almidon pregelificado a 90°C y secado al horno al 5 y 10% en relation al peso de mezcla PCL:PLGA, respectivamente, en una mezcladora tipo turbula (WAB AG Maschinenfabrik, T2C, Suiza). Dicha mezcla se proceso en forma de comprimidos de 400 mg en una maquina de comprimir excentrica (Erweka Apparatebau, E KOW, Frankfurt, Alemania). Se puso en contacto dicha mezcla con medio CO2 comprimido a 60 bar y temperatura ambiente (21°C) en un autoclave (100 mL, TharSFE) durante 30 min. A continuation, el CO2 se despresurizo hasta presion atmosferica a una velocidad de 5 bar/min con tres adiciones periodicas de 10-15 g de CO2 Hquido a 1°C y 60 bar. Se elimino la peHcula externa no porosa del scaffold con un bisturi y se procedio a la caracterizacion de dicho scaffold.
El scaffold obtenido presenta una porosidad del 75% por picnometria de helio y poros de alta curvatura con superficie concava, espesores de pared de 10-20 micras y un tamano medio de poro de en torno a 50 micras por microscopia SEM. La imagen por microscopio confocal (Figura 1) de la section del scaffold muestra una distribution homogenea de la lisozima dentro de dicho scaffold (regiones blancas intensas en la imagen).
Ejemplo 2. Preparacion de matrices de PLGA/PCL con almidon y dexametasona y ensayos de cesion de dexametasona
Se prepararon dos mezclas de: (a) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p con dexametasona al 5% en relacion al peso de mezcla PLGA:PCL y (b) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p con dexametasona y almidon pregelificado a 120°C y secado al 5 y 10% en relacion al peso de mezcla PLGA:PCL, respectivamente, en una mezcladora tipo turbula (WAB AG Maschinenfabrik, T2C, Suiza). Dichas mezclas se procesaron en forma de comprimidos de 400 mg en una maquina de comprimir excentrica (Erweka Apparatebau, E KOW, Frankfurt, Alemania). Se pusieron en contacto dichas mezclas con medio CO2 comprimido a 60 bar y temperatura ambiente (27°C) en un autoclave (100 mL, TharSFE) durante 30 min. A continuacion, el CO2 se despresurizo hasta presion atmosferica a una velocidad de 5 bar/min con tres adiciones periodicas de 10-15 g de CO2 Hquido a 1°C y 60 bar. Se elimino la peHcula
externa no porosa de los scaffolds con un bisturi y se procedio a la caracterizacion de los scaffolds.
Los scaffolds obtenidos presentan una porosidad del 75-85% por picnometria de helio y poros de alta curvatura con superficie concava, espesores de pared de 10-20 micras y un tamano medio de poro de en torno a 50 micras por microscopia SEM.
Para llevar a cabo el ensayo de cesion, se sumergieron porciones de 10 mg de scaffold en 50 mL de tampon fosfato pH 7.4 y el sistema se mantuvo en agitation a 60 rpm y 37°C. La cantidad de dexametasona cedida se monitorizo midiendo su concentration del medio de cesion mediante HPLC a una longitud de onda de 242 nm. Los perfiles de cesion obtenidos se muestran en la Figura 2. Los scaffolds dieron lugar a un perfil de cesion sostenido durante, al menos 21 dias (Fig. 2a) , apreciandose una cesion mas lenta a periodos cortos en el caso de la muestra conteniendo almidon (Fig. 2b).
Ejemplo 3. Preparation de matrices de PCL:PLGA:almidon con PRGF, y ensayos de citotoxicidad y proliferation celular
Se prepararon tres mezclas de: (a) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p, (b) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p con Preparacion Rica en Factores de Crecimiento (PRGF) al 5% en relation al peso de mezcla PCL:PLGA, obtenido mediante metodos de centrifugation (400g, 15 min) y ciclos de enfriamiento- congelacion (4 ciclos) seguido de separation por centrifugacion (14800g, 4°C, 10 min) y secado por liofilizacion (-80°C) a partir de donaciones de sangre por el metodo de capa leucoplaquetar (proveedor Centro de Transfusion de Galicia) ; y (c) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p con almidon pregelificado a 90°C al 10% en relacion al peso de mezcla PCL:PLGA y PRGF al 5% en relacion al peso de mezcla PCL:PLGA, en una mezcladora tipo turbula (WAB AG Maschinenfabrik, T2C, Suiza). Dichas mezclas se procesaron en forma de comprimidos de 400 mg en una maquina de comprimir excentrica (Erweka Apparatebau, E KOW, Frankfurt, Alemania). Se pusieron dichas mezclas en contacto con medio de CO2 comprimido a 60 bar y 25°C en un autoclave (100 mL, TharSFE) durante 30 min. A continuation, el CO2 se despresurizo hasta presion atmosferica a una velocidad de 5 bar/min con tres adiciones periodicas de 10-15 g de CO2 Hquido a 1°C y 60 bar. Se elimino la peHcula externa no porosa de los scaffolds con un bisturi y se procedio a la caracterizacion de dichos scaffolds.
Los scaffolds obtenidos presentan una porosidad del 75-85% por picnometria de helio y poros de alta curvatura con superficie concava, espesores de pared de 10-20 micras y un tamano medio de poro de en torno a 50 micras por microscopia SEM.
Para analizar la citotoxicidad de los scaffolds se realizo un ensayo LIVE/DEAD® (Molecular Probes; USA) , que consiste en la tincion mediante calcema (color verde; 1 mg/mL) y yoduro de propidio (color rojo; 1 mg/mL) en PBS (pH 7, 4; proportion 1:1:98) de celulas vivas y muertas, respectivamente. Para ello, se sembraron 20.000 celulas mesenquimales sobre cada scaffold (5x5x5 mm) y se cultivaron durante 7 dias en un incubador. A continuation, los scaffolds se lavaron con PBS y se anadieron 100 ^L de la tincion y se incubaron durante 10 minutos en oscuridad. Por ultimo, la citotoxicidad de los scaffolds se evaluo a partir de las imagenes de los scaffolds obtenidas mediante microscopia confocal (LCS, Leica Microsystems, Germany). En la Figura 3 se muestran los resultados del ensayo de citotoxicidad LIVE/DEAD® de la muestra (c) segun protocolo del fabricante con tincion verde (gris en la figura) indicando la viabilidad de celulas vivas madre mesenquimales en torno al 100% de los casos.
En la Figura 4, se muestra el ensayo de proliferation de celulas madre mesenquimales evaluado por cuantificacion de ADN usando el protocolo del ensayo comercial Quant- IT PicoGreen dsDNA (Life Technologies; USA). Para ello, se sembraron 20.000 celulas mesenquimales sobre cada scaffold (5x5x5 mm) y se cultivaron durante 3 y 7 dias en un incubador a 37 °C y 5% de CO2. A continuacion, los scaffolds se lavaron con PBS y se colocaron en tubos de ensayo de 2.5 mL (Eppendorf, Alemania) y se anadio 1 mL de agua ultrapura. Las muestras se sometieron a 3 ciclos de congelacion/descongelacion y, posteriormente, se sonicaron durante 5 min y se homogeneizaron en un vortex. Por ultimo, se realizo el ensayo de cuantificacion de DNA segun las instrucciones del fabricante y los resultados se evaluaron a partir de la absorbancia medida en un espectrofluorimetro Fluostar Optima (BMG Labtech, Alemania). Tras 7 dias de sembrado, se observa una mayor concentracion de ADN en la muestra conteniendo almidon y PRGF (muestra (c) ) que la muestra sin almidon (muestra (b) ) y que la muestra sin almidon ni PRGF (muestra (a) ) indicando un mayor grado de proliferacion celular para la muestra (c) durante este periodo.
Ejemplo 4. Preparacion de matrices de PLGA y PLGA:PCL con macroporosidad generada por descomposicion termica de bicarbonato amonico
Se prepararon cinco mezclas de: a) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y bicarbonato amonico en proporciones 50:50 p/p; b) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p y bicarbonato amonico en proporciones 50:50 p/p; c) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p; d) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p, almidon pregelificado a 120°C y bicarbonato amonico en proporciones en peso 45:5:50 p/p; y (e) PLGA (i.v. 0.2 dL/g) y PCL en proporciones 50:50 p/p, almidon pregelificado a 120°C en proporciones en peso 85:10 p/p. Dichas mezclas se procesaron en una mezcladora tipo turbula (WAB AG Maschinenfabrik, T2C, Suiza) y se conformaron en forma de comprimidos de 400 mg en una maquina de comprimir excentrica (Erweka Apparatebau, E KOW, Frankfurt, Alemania). Se pusieron en contacto dichas mezclas con medio CO2 comprimido a 60 bar y 27°C en un autoclave (100 mL, TharSFE) durante 30 min. A continuation, el CO2 se despresurizo hasta presion atmosferica a una velocidad de 5 bar/min con tres adiciones periodicas de 10-15 g de CO2 Hquido a 1°C y 60 bar. Se elimino la peHcula externa no porosa de los scaffolds con un bisturi y se procedio a la caracterizacion de dichos scaffolds. El scaffold obtenido se mantiene en aire a 37°C durante 24 horas para la descomposicion termica de la sal porogenica.
Se muestran las imagenes por microscopia SEM de los scaffolds obtenidos (Fig. 5). Se observa una homogeneidad estructural del material en todos los casos sin presencia de las morfologias pulverulentas de los materiales de partida, sin presencia de microesferas o nanoparticulas, y sin presencia de cuellos o bordes de grano en los poros. Los scaffolds obtenidos presentan una porosidad del 70-80% por picnometria de helio. En las Figuras 5a y 5b se muestran las imagenes por microscopia SEM de scaffolds de porosidad dual preparados a partir de mezclas de PLGA y un agente porogenico (bicarbonato amonico) en proportion en peso 50:50 (Fig. 5a) y de PCL:PLGA 50:50 peso/peso y un agente porogenico (bicarbonato amonico) en proporcion en peso 50:50 tras elimination del agente porogenico (Fig. 5b). No se observan restos de bicarbonato amonico en las estructuras porosas y se obtuvieron perdidas de peso del 50% (correspondientes a la eliminacion de la sal). Los poros obtenidos son de alta curvatura con superficie concava y espesores de pared de 10-30 micras. La estructura porosa resultante es de tipo dual segun microscopia SEM: poros de 50 micras formados por
espumado supercritico y de 100-300 micras formados por descomposicion termica del agente porogenico. A modo de comparacion, en la Figura 5c se muestra la imagen de un scaffold preparado a partir de mezclas de PCL:PLGA 50:50 peso/peso. En este caso, se observa una familia de poros mayoritaria de 50 micras, de alta curvatura con superficie 5 concava y espesores de pared de 10-20 micras.
En la Figura 5d se muestra la imagen por microscopia SEM de un scaffold de porosidad dual preparado a partir de mezclas de PCL:PLGA 50:50 p/p, almidon pregelificado a 120°C y un agente porogenico (bicarbonato amonico) en proportion en peso 45:5:50 tras elimination del agente porogenico. No se observan restos de bicarbonato amonico 10 en la estructura porosa y se obtuvieron perdidas de peso del 50% (correspondientes a la eliminacion de la sal). Los poros obtenidos son de alta curvatura con superficie concava y espesores de pared de 15-25 micras. La estructura porosa resultante es de tipo dual segun microscopia SEM: poros de 50 micras formados por espumado supercritico y de 100-300 micras formados por descomposicion termica del agente porogenico. A modo 15 de comparacion, en la Figura 5e se muestra la imagen de un scaffold preparado a partir de mezclas de PCL:PLGA 50:50 peso/peso, almidon pregelificado a 120°C en proporcion en peso 85:10. En este caso, se observa una sola familia de poros de 50 micras de alta curvatura con superficie concava y espesores de pared de 10-20 micras.
