Cepa de Rhizobium leucaenae y su uso como biofertilizante
La presente invention se refiere a una cepa de Rhizobium leucaenae CECT8306 que, cuando se administra a una planta, tiene la capacidad de interactuar con ella y promover su crecimiento, consiguiendo incrementar tanto el desarrollo foliar como radicular de la misma. Por lo tanto, la cepa descrita en la presente invencion tiene su aplicacion en el campo de la agricultura como biofertilizante.
ESTADO DE LA TECNICA
Uno de los principales objetivos de la agricultura actual es la reduction del uso de fertilizantes qulmicos, debido tanto al creciente gasto que implican como a la reduccion de impactos ambientales minimizando la emision de gases de efecto invernadero derivados de su uso y evitando la contamination de ecosistemas. Sin embargo, la metodologla utilizada por la agricultura convencional para hacer frente a este reto solo es capaz de afrontarlo mediante la aplicacion de tecnicas que o bien implican una reduccion de la production o un incremento de los costes. Por esta razon, el uso de biofertilizantes es una alternativa eficiente, barata y sostenible capaz de hacer frente a este objetivo ademas de hacer eficiente el aprovechamiento de los recursos naturales del suelo. El grupo de bacterias denominadas bacterias promotoras del crecimiento vegetal o PGPR exhiben una serie de mecanismos que influyen sobre el balance de nutrientes disponibles para la planta, ademas de incrementar su resistencia a distintos tipos de estres y como elicitores de resistencia a patogenos, entre otras. Entre estos mecanismos encontramos la fijacion biologica de nitrogeno, tanto en simbiosis como en vida libre, la solubilization de fosfato bien mediante la produccion de acidos o la produccion de enzimas especlficas como las fitasas y fosfatasas, la produccion de sideroforos que incrementan el hierro disponible para la planta y la produccion de fitohormonas.
La interaction planta-microorganismo se vuelve mas directa y eficiente cuando las bacterias que muestran los mecanismos de promotion del crecimiento vegetal son capaces de colonizar el interior de la planta, ocupando los espacios intercelulares de ralz, tallo y hojas, comportandose como un organismo endofito, estableciendo una relation estrecha con la planta sin hacerle dano ni desencadenar los mecanismos de
defensa de la misma. Al mismo tiempo, un requisito necesario para la formulacion de biofertilizantes es la utilization de bacterias inocuas para el ser humano, puesto que algunas bacterias patogenas como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae o Burlkolderia cepacia presentan cualidades para promover el crecimiento vegetal pero desencadenan otra serie de problematicas en la salud. Asociados a las especies del genero Rhizobium se han descrito mecanismos de promotion del crecimiento vegetal como la solubilization de fosfato, la production de sideroforos y la production de diversas fitohormonas como el acido indol acetico, citoquininas y giberelinas (Mehbood, I. et al., 2009. Critical Reviews in Plant Science, 28: 432-456) haciendo estas especies idoneas para la utilizacion como movilizadoras, productoras o facilitadoras de la absorcion de nutrientes para la planta. Ademas, se ha demostrado que la caracterlstica simbiotica no esta dada solo entre Rhizobium-Leguminosa, donde forma nodulos fijadores de nitrogeno, si no entre plantas no leguminosas, ya que se han descrito complejas y especificas maquinarias moleculares que le permiten interactuar con plantas de diferentes generos, colonizando e ingresando en el interior de plantas como arroz y lechuga, promoviendo el crecimiento vegetal e incluso incrementando el rendimiento de la produccion.
Es conocido que plantas y animales normalmente se asocian con diversos microorganismos. En el intestino, las bacterias tienen un papel destacado para estimular la inmunidad y el desarrollo. Del mismo modo que las bacterias de las plantas estimulan las respuestas de defensa de estas, las bacterias de las ralces y de la rizosfera se benefician de los exudados de las ralces. Ademas, algunas bacterias y hongos son capaces de entrar en la planta como endofitos sin causar danos y pueden establecer asociaciones mutualistas. Las plantas constituyen grandes nichos de diversos organismos endofitos. Las bacterias endofitas han sido aisladas de una gran diversidad de plantas. Tanto las poblaciones de bacterias endofitas como las rizosfericas estan condicionadas por los factores bioticos y abioticos, pero las bacterias endofitas podrlan estar mejor protegidas del estres biotico y abiotico que las bacterias rizosfericas. Este hecho serla debido a que el interior de la planta es un ambiente mucho mas estable y homogeneo en el tiempo, independiente de las fluctuaciones de humedad, salinidad o pH que pueden acaecer en la rizosfera.
La solicitud de patente espanola ES2402039 describe una cepa del genero Rhizobium, en concreto la cepa Rhizobium leguminosarum CECT7758, la cual presenta la capacidad de promover el crecimiento en plantas no leguminosas.
Debido a esta razon, el uso de bacterias del genero Rhizobium se presenta como una herramienta basica e interesante para el desarrollo y utilization de futuros biofertilizantes, puesto que su uso no representa peligro alguno para la salud humana ya que dentro de este genero no se han descrito especies patogenas de humanos y sin embargo, si presenta connotaciones positivas en la agricultura y la economla. Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar fertilizantes alternativos a los existentes en el estado de la tecnica que no representen una amenaza ni para el medio ambiente ni para la salud humana.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
Los autores de la presente invention han aislado una cepa de Rhizobium, en particular Rhizobium leucaenae que, sorprendentemente, tiene la capacidad de promover el crecimiento de las plantas (tanto folicular como radial) y mejorar con ello el rendimiento de los cultivos. La cepa aislada por los inventores es la cepa de Rhizobium leucaenae CECT8306. Los inventores aislaron dicha cepa a partir de la ralz de Zea mays y mediante diversos ensayos (ver Ejemplo 1) , comprobaron que el crecimiento vegetal de las plantas se ve incrementado cuando estas crecen en presencia de Rhizobium leucaenae CECT8306 en comparacion con plantas control (ver Figuras 5 a 10).
En base a esta nueva cepa, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que seran descritos en detalle a continuation.
Cepa y composicion de la invencion
Tal como se ha descrito al comienzo de la presente description, los autores han aislado una cepa de Rhizobium leucaenae que tiene la capacidad de promover y/o incrementar el crecimiento vegetal de las plantas.
Asl, en un aspecto, la invencion se relaciona con una cepa de Rhizobium leucaenae depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo con el numero de deposito CECT 8306, de aqul en adelante "cepa de la invencion".
La cepa de la invention fue aislada a partir de Zea mays tal como se describe en el Ejemplo 1 y depositada el 19 de junio de 2013 bajo el Tratado de Budapest en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Deposito (Edificio 3 CUE, Parc Cientlfic Universitat de Valencia, Catedratico Agustln Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPANA). El numero de deposito asignado fue CECT 8306. El depositante fue D. Raul Rivas Gonzalez, con direction Departamento de Microbiologla y genetica, Lab 210, Edificio Departamental de Biologla, Campus Miguel de Unamuno, 37007 Salamanca. La clasificacion cientlfica de la cepa CECT 8306 de la presente invencion es: Reino: Bacteria, Filo: Proteobacteria, Clase: alfa- Proteobacteria, Orden: Rhizobiales, Familia: Rhizobiaceae, Genero: Rhizobium, Especie: Rhizobium leucaenae.
El analisis y estudio de la cepa de la invencion demostro que esta era capaz de producir sideroforos, solubilizar fosfatos en forma de Ca3 (PO4) 2) , producir acido indol- acetico o AIA (auxina que promueve el crecimiento de los tejidos meristematicos de las plantas) , colonizar la ralz de las plantas e interaccionar con ellas, producir celulosa y de formar biopellculas. Ademas, se observo que la cepa posee un inserto en el gen 16S de aproximadamente 70 pares de bases que esta ausente en el resto de especies del genero Rhizobium. Por otro lado, semillas inoculadas con la cepa de la invencion dieron lugar a plantas que mostraron un mayor crecimiento de la parte aerea y un mayor grosor y pilosidad de la ralz en comparacion con plantas obtenidas a partir de semillas no inoculadas con la cepa de la invencion. Por lo tanto, la cepa de la invencion es capaz de promover o incrementar el crecimiento de las plantas.
Dentro de la presente invencion, tambien estan contemplados aquellos microorganismos o bacterias que derivan de la cepa de la invencion y que conservan la capacidad de incrementar o promover el crecimiento de las plantas. Ejemplos de cepas o microorganismos derivados de la cepa de invencion pueden ser mutantes que presentan variaciones en su genoma respecto al genoma de la cepa de la invencion pero que no afectan a la capacidad de la cepa de incrementar o promover el crecimiento de las plantas. Asl, cepas mutantes derivadas de la cepa de la invencion que conservan la capacidad de incrementar o promover el crecimiento de las plantas tambien estan contempladas dentro de la presente invencion. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invencion tambien se refiere a una cepa derivada de la cepa de la invencion con capacidad para incrementar o promover el crecimiento de las plantas.
La cepa derivada de la cepa de la invencion puede producirse de forma natural, o bien de forma intencionada por metodos de mutagenesis conocidos en el estado de la tecnica como por ejemplo, sin limitarse a, el crecimiento de la cepa original en presencia de agentes mutagenicos o causantes de estres, o mediante ingenierla genetica dirigida a la modification de genes especlficos. Asl, dentro de la presente invencion tambien se contemplan mutantes geneticamente modificados derivados de la cepa de la invencion que conservan su capacidad de incrementar o mejorar el crecimiento de las plantas.
Por otro lado, dentro de la presente invencion, tambien se contemplan los componentes celulares, metabolitos y moleculas secretadas por la cepa de la invencion o por la cepa derivada de la cepa de la invencion, asl como las composiciones que comprenden dichos componentes y los usos de los mismos para incrementar o promover el crecimiento de las plantas. Entre los componentes celulares de la bacteria se podrlan incluir los componentes de la pared celular (como por ejemplo pero sin limitarse, peptidoglicano) , los acidos nucleicos, los componentes de la membrana, u otros como protelnas, llpidos e hidratos de carbono y sus combinaciones, como lipoprotelnas, glicollpidos o glicoprotelnas. Los metabolitos incluyen cualquier molecula producida o modificada por la bacteria como consecuencia de su actividad metabolica durante su crecimiento, su uso en procesos tecnologicos o durante el almacenamiento del producto. Ejemplos de estos metabolitos son, pero sin limitarse, los acidos organicos e inorganicos, protelnas, peptidos, aminoacidos, enzimas, llpidos, hidratos de carbono, lipoprotelnas, glicollpidos, glicoprotelnas, vitaminas, sales, metales o acidos nucleicos. Las moleculas secretadas incluyen cualquier molecula exportada o liberada al exterior por la bacteria durante su crecimiento, su uso en procesos tecnologicos (por ejemplo de elaboration de alimentos o farmacos) o el almacenamiento del producto. Ejemplos de estas moleculas incluyen, pero sin limitarse, acidos organicos e inorganicos, protelnas, peptidos, aminoacidos, enzimas, llpidos, hidratos de carbono, lipoprotelnas, glicollpidos, glicoprotelnas, vitaminas, sales, metales o acidos nucleicos.
En la presente invencion se entiende que una cepa (o compuesto derivado de ella) tiene la capacidad de "incrementar" o "promover" el crecimiento vegetal cuando dicha cepa es capaz de aumentar la cantidad de biomasa producida por una planta en unidad de tiempo. Asl, en igualdad de tiempo y condiciones, la biomasa producida por una planta que comprende la cepa de la invencion sera mayor que la biomasa
producida por una planta de la misma especie que no comprende la cepa de la invention (o que no ha sido puesta en contacto con la cepa o la composition de la invention).
En otro aspecto, la invencion se relaciona con un cultivo biologicamente puro de la cepa de la invencion. En la presente invencion, se entiende que un cultivo es biologicamente puro cuando al menos el 95% de los microorganismos presentes en el cultivo corresponden a la cepa de la invencion.
La cepa de la invencion puede crecer en cualquier medio de cultivo que sea adecuado para Rhizobia. Ejemplos de medio de cultivos adecuados para el cultivo de la cepa de la invencion incluyen, sin limitarse a, medio YMA y TY. No obstante, el medio de cultivo preferido es medio YMA. En la presente invencion se entiende por "medio YMA" o "medio de cultivo MYA" a aquel medio compuesto por K2HPO4 , MgSO4 , NaCl, extracto de levadura y agar, preferiblemente, en las siguientes concentraciones: K2HPO4 a una concentration de aproximadamente 0, 2 g/L, MgSO4 a una concentration de aproximadamente 0, 2 g/L, NaCl a una concentracion de aproximadamente 0, 1 g/L, extracto de levadura a una concentracion de aproximadamente 2 g/L, y agar a una concentracion de aproximadamente 20 g/L. La composicion del medio TY comprende extracto de levadura desde 0, 2 a 0, 4 %, triptona desde 0, 3 a 9, 5% y agar desde 1, 5 a 2%.
Como entiende el experto en la materia, la cepa de la invencion o la cepa derivada de ella o los componentes derivados de ella pueden estar formando parte de una composicion. Asl, en otro aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende la cepa de la invencion, la cepa derivada de ella y/o los componentes derivados de ella.
La composicion, definida de forma general, es un conjunto de componentes que esta formado al menos por la cepa de la invencion en cualquier concentracion. Cabe destacar con respecto a las cepas empleadas en la presente invencion, que resulta interesante que dichas cepas se encuentran en fase exponencial de crecimiento, ya que de esta forma se encuentran en una mejor disposition metabolica para su desarrollo y promover los efectos beneficiosos dentro de las plantas. No obstante, en una realization particular, la concentracion de la cepa de la invencion en medio llquido es de 1x108 UFC/mL y 3, 8x108 UFC/mL, en particular, entre 1, 8x108 UFC/mL y
3, 6x108 UFC/mL, mas particular, entre 2x108 UFC/mL y 3x108 UFC/mL, aun mas particular, 2, 5x108UFC/mL. En vehteulos o medios solidos la concentration de la cepa de la invention es de entre 1, 8x108 UFC/g y 3, 6x1011 UFC/g.
Acompanando a la cepa de la invencion, la composition puede comprender otros organismos que pueden resultar beneficiosos para las plantas, tales como bacterias (incluyendo actinomicetos) , hongos, algas y protozoos. Ejemplos de dichos microorganismos incluyen, sin limitar a, hongos del genero Trichoderma (tales como T. harzianum Rifai, T. viride Pers., T polysporum Link fr, T. reesei EG Simmons, T. virens, T. longibrachatum Rifai, T. parceromosum, T. pseudokoningii, T. hamatum, T. lignorum, T. citroviride, etc.) , micorrizas (Glomus sp., etc.) , bacterias del genero Rhizobium (tales como R. cellulosilyticum, R. daejeonense, R. etli, R. gallicum, R. hainanense, R. indigoferae, R. leguminosarum, R. loessense, , R. lusitanum, , R. mongolense, R. phaseoli, R. rhizogenes, R. sullae, R. tropici, R. yanglingense, etc.) , del genero Neorhizobium (N. galegae, N. huautlense, etc.) , Allorhizobium (A. undicola) , Pararhizobium (P. giardinii) , Mesorhizobium (M. loti, M, ciceri, M. mediterraneum, M. huakuii, M. tianshanense, etc.) , Ensifer (E. fredii, E. meliloti, etc.) , Bradyrhizobium (B. japonicum, B. lupini, etc.) , bacterias que colonizan tejidos vegetales internos (tales como Azospirillum sp., Herbaspirillum sp., Gluconacetobacter diazotrophicus, Paenibacillus sp, etc.) , algas marinas (tales como Ascophyllum nodosum, Fucus serratus, Laminaria sp., etc.) , etc. Por lo tanto, en otra realization particular, la composicion de la invencion comprende una bacteria del genero Rhizobium diferente de la cepa de la invencion, preferiblemente dicha bacteria del genero Rhizobium es Rhizobium leguminosarum CECT 7759 o Rhizobium leguminosarum CECT 7758.
Adicionalmente, la composicion de la invencion puede comprender compuestos que participen en el desarrollo vegetal, tales como las fitohormonas. Las fitohormonas son sustancias producidas por las celulas vegetales que intervienen en multitud de procesos biologicos y que son capaces de regular los fenomenos fisiologicos de las plantas. Ejemplos de fitohormonas que puede emplearse en la composicion de la invencion incluyen, sin limitar a, auxinas, giberelinas, citocininas y etileno.
Las auxinas son un grupo de fitohormonas que funcionan como reguladoras del crecimiento vegetal (esencialmente provocan la elongation de las celulas) y pueden ser naturales (sintetizadas por una celula vegetal de manera silvestre) o artificiales
(sintetizadas en el laboratorio). Ejemplos de auxinas naturales incluyen, sin limitar a, acido indol-3-acetico (AIA) , acido 4-cloroindol-3-acetico (4-Cl-IAA) y acido fenilacetico. Ejemplos de auxinas artificiales incluyen, sin limitar a, acido indolbutlrico (AIB) y acido naftalenacetico (ANA).
La giberelina es una fitohormona producida en la zona apical, frutos y semillas, cuyas principales funciones son la interruption del perlodo de latencia de las semillas, haciendolas germinar, la induction del desarrollo de yemas y frutos y la regulation del crecimiento longitudinal del tallo. Ejemplos de giberelinas incluyen, sin limitar a, el acido giberelico (GA3) , giberelina A1 (GA1) y giberelina A4 (GA4).
Las citocininas son fitohormonas que promueven la division y la diferenciacion celular. Ejemplos de citocininas incluyen, sin limitar a, la cis- y trans-zeatina, la isopenteniladenina, la dihidrozeatina (con sus respectivos derivados glicosilados) , la benciladenina, la kinetina y la topolina. Tambien se consideran citoquininas otros compuestos de origen no vegetal y derivados sinteticos de la difenilurea como el CPPU y el tidiazuron (TDZ) , que actuan como analogos estructurales de la molecula natural.
Como entiende el experto en la materia, en la composition de la invention tambien pueden ir macro y microelementos que proporcionen nutrientes a las plantas. Asl, en una realization particular, la composicion de la invencion comprende, ademas, macroelementos y/o microelementos.
Los macroelementos son aquellos elementos que se expresan como % en la planta o g/100g. Los principales son nitrogeno, fosforo, potasio, calcio, magnesio y azufre. Los microelementos se expresan como ppm (parte por millon) = mg/Kg = mg /1000g, y los principales son hierro, cinc, cobre, manganeso mobdileno, boro y cloro. Se sabe que existen unos 27 elementos qulmicos que tienen funciones en la planta que, debido a que la planta los requiere a unas concentraciones determinadas, hay que anadirlas al suelo. Existen ademas otros nutrientes beneficos como por ejemplo el silicio, el sodio y el cobalto que fortalecen algunas caracterlsticas de las plantas en diferentes especies. El experto en la materia sabe cuales son los macro- y micronutrientes adecuados a anadir a la planta de interes para cubrir las necesidades de la misma.
Asl, en una realization particular, los macroelementos de la composition de la invention se seleccionan del grupo que consiste en sales de nitrogeno, sales de fosforo, sales de potasio, sales de calcio, sales de magnesio, sales de azufre y combination de ellos.
En otra realization particular, los microelementos de la composition de la invention se seleccionan del grupo que consiste en sales de hierro, sales de zinc, sales de cobre, sales de manganeso, sales de molibdeno, sales de boro, sales de cloro y combinaciones de ellos.
La composition de la invention puede comprender adicionalmente la semilla de una planta cuyo crecimiento se quiere promover. De esta forma, la semilla se encuentra en contacto con la cepa de la invention (y con otros componentes que puedan incluirse en la composition de la invention) lo que permite un mejor desarrollo de la semilla y de la planta derivada de ella y finalmente, la obtencion de una planta con caracterlsticas optimas. La semilla puede pertenecer a cualquier planta, tanto plantas de cultivo, como ornamentales y forrajeras. Preferiblemente, la semilla pertenece a una planta no leguminosa, mas preferiblemente, a una planta de zanahoria, una planta de brocoli o una planta de malz.
La cepa o la composition de la invention puede encontrarse en cualquier forma de presentation adecuada para su administration o aplicacion al suelo que rodea la planta, a la propia planta o a la semilla. De esta forma, puede encontrarse por ejemplo, aunque sin limitarse a, en forma solida o llquida. Las formas de presentation llquidas son adecuadas para su pulverization sobre el suelo, la planta o el material vegetal, o bien para crear una solution en la que se sumergen las plantas o el material vegetal. Alternativamente las composiciones se pueden encontrar en forma solida mediante liofilizacion y posterior peletizacion de las mismas, las cuales pueden ser aplicadas directamente al suelo o resuspendidas en soluciones, preferentemente acuosas.
Usos de la composition de la invencion
La presente invencion se refiere a una cepa de Rhizobium leucaenae CECT8306 que, cuando se administra a una planta, tiene la capacidad de interactuar con ella y
promover su crecimiento, consiguiendo incrementar tanto el desarrollo foliar como radicular de la misma.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invention se relaciona con el uso de una cepa de Rhizobium leucaenae depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo con el numero de deposito CECT 8306, o la composition que la comprende, como biofertilizante.
En la presente invencion se entiende por "biofertilizante" a la composicion que esta destinada a abastecer y suministrar a la planta los componentes necesarios para su crecimiento y desarrollo, estando entre dichos componentes microorganismos (o sustancias producidas por los mismos) que proporcionan o mejoran la disponibilidad de nutrientes cuando se aplican a la planta favoreciendo el desarrollo y crecimiento de la misma. En la presente invencion, los microorganismos de la composicion comprenden, al menos, un microorganismo de la cepa Rhizobium leucaenae CECT 8306.
Los biofertilizantes pueden presentarse en forma llquida o en forma solida, dependiendo de la forma de administration que vaya a emplearse. Pueden aplicarse directamente al suelo antes o despues de la siembra del cultivo, mediante aspersion o en el surco de la siembra o sobre toda la superficie. Otra posibilidad es aplicar el biofertilizante a la semilla antes de ser sembrada. Las dosis y epocas de aplicacion del biofertilizante durante el ciclo del cultivo dependeran de la concentration de microorganismos y/o del tipo de cultivo. Tecnicas sobre como administrar biofertilizantes y la cantidad a administrar son ampliamente conocidas en el estado de la tecnica y su uso es practica de rutina para el experto en la materia. Preferiblemente, en una realization particular, la concentracion de la cepa de la invencion es de 1x108 UFC/mL y 3, 8x108 UFC/mL, en particular, entre 1, 8x108 UFC/mL y 3, 6x108 UFC/mL, mas particular, entre 2x108 UFC/mL y 3x108 UFC/mL, aun mas particular, 2, 5x108UFC/mL. En vehlculos o medios solidos la concentracion de la cepa de la invencion es de entre 1, 8x108 UFC/g y 3, 6x1011 UFC/g.
En la presente invencion, se analiza la capacidad biofertilizante analizando la diferencia en el peso seco de las plantas tratadas con respecto a las plantas control, suponiendo un mayor peso seco un mayor desarrollo como resultado de un mayor numero de estructuras o un mayor desarrollo de las mismas. Otros metodos
conocidos en el estado de la tecnica podrlan ser utilizados para determinar la capacidad fertilizante como por ejemplo, la determination de la biomasa o la medicion de la altura de las plantas respecto a los controles.
En base a la capacidad de la cepa de la invention de incrementar y/o promover el crecimiento de las plantas, en otro aspecto la invencion se relaciona con el uso de una cepa de Rhizobium leucaenae depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo con el numero de deposito CECT 8306, o la composition que la comprende, para incrementar o promover el crecimiento de las plantas.
Tal como se ha explicado en parrafos anteriores, se entiende que una cepa (o cepa o compuesto derivado de ella) tiene la capacidad de "incrementar" o "promover" el crecimiento vegetal cuando dicha cepa es capaz de aumentar la cantidad de biomasa producida por una planta en unidad de tiempo.
La cepa de la invencion o composicion que la comprende puede aplicarse a cualquier planta cuyo crecimiento se quiere incrementar, principalmente, plantas con algun interes comercial, optimizando asl su production y rendimiento. En una realization particular, las plantas se seleccionan entre plantas de cultivo y plantas ornamentales.
Ejemplos de plantas de cultivo incluyen, sin limitar a, cereales (tales como arroz, malz, trigo, escanda, cebada, avena, quinua, trigo, centeno, espelta, etc.) , hortalizas (tales como zanahoria, acelga, espinaca, remolacha, apio, apio nabo, chirivla, perejil, berenjena, patata, pimiento, tomate, ajo, ascalonia, cebolla, esparrago, puerro, acelga, borraja, endibia, escarola, hierba de los canonigos, lechuga, champinon, guisante, haba, judla verde, calabacln, calabaza, pepino, alcachofa, boniato, brocoli, col blanca, col china, col de Bruselas, col de Milan, col lombarda, coliflor, colinabo, colirabano, nabo, rabano, etc.) , plantas de tabaco y plantas de girasol. Otro tipo de plantas cuyo crecimiento puede incrementarse son los arboles frutales, tales como naranjos, manzanos, perales, etc., o frutales de baya, tales como fresas, frambuesas, arandanos, grosellas, etc. Ejemplos de plantas ornamentales incluyen, sin limitar a, claveles, rosas, tulipanes, flores de pascua y geranios.
En una realizacion particular, las plantas de cultivo son plantas no leguminosas. En la presente invencion, se entiende por "planta no leguminosa" a todas aquellas plantas que no pertenecen a la familia Fabaceae o Leguminosae dentro del orden Fabales.
Dentro de las plantas no leguminosas, una de las que presentan mayor interes agronomico es la familia de las solanaceas, dentro de las cuales se encuentra el tomate y el pimiento. No obstante, en otra realization mas particular, la planta no leguminosa se selecciona del grupo que consiste en una planta de zanahoria, una planta de brocoli y una planta de malz.
Metodo para incrementar o promover el crecimiento de las plantas
En otro aspecto, la presente invention se relaciona con un metodo para incrementar o promover el crecimiento de una planta, de aqul en adelante "metodo de la invencion" que comprende:
(a) poner en contacto una planta o la semilla de dicha planta con la cepa o con la composicion de la invencion, y
(b) desarrollar la semilla o la planta de la etapa (a).
La expresion "incrementar o promover" el crecimiento de una planta ha sido definida previamente en la presente description. Igualmente, plantas sobre las que se puede aplicar el metodo de la invencion tambien han sido mencionadas anteriormente. Asl, en una realizacion particular, las plantas se seleccionan entre plantas de cultivo y plantas ornamentales, que en otra realizacion mas particular, son plantas de cultivo no leguminosas, que en otra realizacion todavla mas particular, la planta de cultivo no leguminosa se selecciona del grupo que consiste en una planta de zanahoria, una planta de brocoli y una planta de malz.
En una primera etapa, el metodo de la invencion comprende poner en contacto una planta o la semilla procedente de dicha planta con la cepa o la composition de la invencion. La planta o la semilla de la misma puede ponerse en contacto con la cepa o la composicion de la invencion por cualquier tecnica conocida, como por ejemplo, pero sin limitarse a, a traves de hidroponla, a traves de una solution aplicada al suelo, por medio de la aplicacion de la cepa o composicion por pulverization, rociado, revestimiento, fumigation o impregnation de cualquier pate aerea de la planta o de la semilla, mediante la introduction de la cepa o la composicion de la invencion en el agua de riego, mediante la germination de semillas de la planta en presencia de dicha cepa o composicion, mediante cultivo de material vegetal in vitro en contacto con la cepa o composicion de la invencion, o mediante inmersion de la ralz de la planta en una solucion que comprende la cepa o la composicion de la invencion.
Asl, en una realization particular, la puesta en contacto entre la planta o la semilla procedente de la misma y la cepa o la composition de la invention, se lleva a cabo mediante el agua de riego, pulverization, rociado, revestimiento, fumigation, inmersion o impregnation.
En una segunda etapa, el metodo de la invention comprende desarrollar la semilla o la planta de la etapa (a). Dicho desarrollo comprende proporcionar a la planta o la semilla las condiciones adecuadas de luz, temperatura, humedad, nutrientes, etc. para que la planta crezca o para que la semilla germine y de lugar a una planta. Las condiciones adecuadas de crecimiento para las distintas plantas de cultivo pueden encontrarse en manuales ampliamente conocidos por el experto en la materia y disponibles al publico.
En otro aspecto, la presente invention se relaciona con una semilla que comprende la cepa de la invention, de aqul en adelante "semilla de la invention". La semilla puede proceder de cualquier planta de las mencionadas anteriormente. Como entiende en el experto en la materia a la vista de la presente invention, la planta procedente de la semilla de la invention mostrara un mayor crecimiento y desarrollo que plantas que proceden de semillas que no han estado en contacto y que no comprende la cepa de la invencion.
A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invention se desprenderan en parte de la description y en parte de la practica de la invention. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invention.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una imagen de fluorescencia que muestra un biopellcula formado en el portaobjetos despues de haberlo tenido y visto a traves de iluminacion con ultravioleta.
La Figura 2 una imagen obtenida mediante microscopla de fluorescencia que muestra la cepa R. leucaenae CECT8306 colonizando la superficie de la ralz de Zea mays. En
gris claro (puntitos) se observan las celulas de R. leucaenae CECT8306 y en gris oscuro las celulas vegetales tenidas con una solucion de yoduro de propidio (5 mM).
La Figura 3 es una imagen obtenida mediante microscopla de fluorescencia que muestra la cepa R. leucaenae CECT8306 colonizando la superficie de la ralz de Daucus carota. En gris claro (puntitos) se observan las celulas de R. leucaenae CECT8306 y en gris oscuro las celulas vegetales tenidas con una solucion de yoduro de propidio (5 mM).
La Figura 4 es una imagen obtenida mediante microscopla de fluorescencia que muestra la cepa R. leucaenae CECT8306 colonizando la superficie de la ralz de brocoli (Brassica oleracea italica). En gris claro (puntitos) se observan las celulas R. leucaenae CECT8306 y en gris oscuro las celulas vegetales tenidas con una solucion de yoduro de propidio (5 mM).
La Figura 5 es una fotografla de las plantas de malz cultivadas en invernadero a los 15 dlas de su siembra. A la derecha se encuentra la planta de malz control sin
inocular y a la izquierda la planta de malz inoculada con R. leucaenae CECT8306
donde se observa claramente la diferencia de altura en los primeros estadios de crecimiento.
La Figura 6 es una fotografla de las plantas de malz cultivadas en invernadero a los 40 dlas de su siembra. A la derecha se encuentra la planta de malz control sin
inocular y a la izquierda la planta de malz inoculada con R. leucaenae CECT8306
donde se observa claramente la diferencia de altura en los primeros estadios de crecimiento.
La Figura 7 es una fotografla de las plantas de malz cultivadas en invernadero a los 70 dlas de su siembra. A la derecha se muestra una planta de malz control sin inocular y a la izquierda una planta de malz inoculada con R. leucaenae CECT8306 donde se observa claramente la diferencia de altura entre ambas.
La Figura 8 es una fotografla de las plantas de malz cultivadas en invernadero. A la izquierda se muestra una planta de malz control sin inocular y a la derecha una planta de malz inoculada con R. leucaenae CECT8306 donde se observa la diferencia en la superficie radicular.
La Figura 9 es una fotografla de las plantas de zanahoria en invernadero. A la izquierda se muestra una planta control sin inocular y a la derecha una planta inoculada con R. leucaenae CECT8306.
La Figura 10 es una fotografla de las plantas de brocoli en invernadero. A la izquierda se muestra una planta control sin inocular y a la derecha una planta inoculada con R. leucaenae CECT8306.
EJEMPLOS
A continuacion se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.
Ejemplo 1
Aislamiento de la cepa Rhizobium leucaenae CECT8306 (cepa CRMZ151) y su uso como promotora del crecimiento vegetativo de las plantas
I - MATERIALES Y METODOS
Aislamiento de la Cepa
La cepa objeto de estudio fue aislada a partir del interior de ralz de Zea mays. Para asilar a los microorganismos endofitos se esterilizo la ralz en superficie. Para ello, la ralz se lavo con agua esteril para eliminar los restos de suelo que pudieran quedar. A continuacion, se cortaron pequenos trozos de ralces de unos 5 mm de longitud, que se trataron en tubos con etanol al 70% durante dos minutos, posteriormente se introdujeron en una solucion de lejla comercial al 20% (1% de cloro activo) durante 5 minutos y por ultimo de nuevo en etanol al 70% durante 1 minuto. Despues, y manteniendo las condiciones asepticas, se realizaron cuatro lavados con agua esteril para eliminar los restos de etanol y lejla. Acto seguido, se trituraron las ralces con ayuda de una varilla de cristal esteril, con la cual se sembro el triturado en placas Petri con medio de cultivo YMA (Vincent, J.M. 1970. A Manual for the Practical Study of Root Nodule Bacteria. Oxford: Blackwell Scientific) modificado (10 gL"1 manitol, 1 gL"1 extracto de levadura, 0, 2 gL"1 K2HPO4, 0, 2 gL"1 MgSO4.7H2O, 0, 5 gL"1 NaCl, 20 gL"1 agar). Las placas se cultivaron a 28°C durante 4 dlas.
El aislado objeto de estudio fue nombrado como cepa CRMZ151 (R. leucaenae CECT8306). El gen 16S rRNA de la cepa CRMZ151 fue analizado tal y como se describe en Rivas et al., 2007. La secuencia obtenida se identifico comparandola con las cepas tipo utilizando el programa Eztaxon 2.0 (Chun et al., 2007. Int J Syst Evol Microbiol 57: 2259-2261).
Ensayos empleados para caracterizar la cepa CRMZ151
La capacidad de las cepas para solubilizar fosfato in vitro se realizo en YED-P (Peix et al., 2003. Int J Syst Evol Microbiol 53: 2067-2072). tras ser incubadas a 28°C durante 7 dlas. La production de sideroforos se evaluo en el medio M9-CAS-AGAR (Schwyn y Neilands, 1987. Anal Biochem 160: 47-56) modificado con la HDTMA, un disolvente cationico que estabiliza el complejo Fe-CAS, dandole un color caracterlstico (Alexander y Zuberer, 1991. Biol Fertil Soils 12: 39-45). La produccion de acido indol acetico se llevo a cabo en el medio JMM (O'hara et al., 1989. Appl Emviron microbiol 55, 1870-1876) suplementado con 0, 17g/L de triptofano. Tras 7 dlas, se recuperaron los sobrenadantes mediante centrifugation y filtration utilizando filtro Millipore de 0, 22 pm (Millipore Co., Amicon, USA). A continuation, se anadio 1mL de agente Salkowsky por cada 2 mL de sobrenadante. La solution resultante se midio mediante espectrofotometrla a un longitud de onda de 550nm utilizando un espectrofotometro ATI Unicam 8625 (Mattson, USA) (Khalid et al., 2004. J Appl Microbiol 96: 473-480). El marcaje de la cepa CRMZ151 se realizo utilizando un conjugation biparental, empleando la cepa de Escherichia coli S17.1 transformada con el plasmido pHC60 (Cheng and Walter, 1998. J Bacteriol 180: 5183-5191). A partir de cultivos frescos de las cepas receptora y donadora, las cepas se mezclaron sobre placas de YMA y fueron incubadas 24 horas a 28°C. Los conjugantes fueron seleccionados en Medio mlnimo (OGara y Shanmugan, 1976. Biochim Biophys Acta 451: 342-352) suplementado con tetraciclina a una concentration de 10pg/mL. Una vez obtenido el cultivo puro de la cepa CRMZ151 transformada con el plasmido pHC60 se cultivaron en medio YMA suplementado con tetraciclina (10 pg/mL).
Para el estudio de la colonization de las plantas se utilizaron semillas de malz, zanahoria y brocoli esterilizadas superficialmente introduciendolas 30 segundos en etanol al 70% y en hipoclorito de sodio durante 5 minutos, en el caso del malz 20 minutos. Tras realizar 5 lavados con agua esteril, se colocaron en placas con agar agua sobre un papel de filtro. Las semillas se inocularon con la cepa CRMZ151
silvestre y se observaron las diferencias que apareclan entre aquellas inoculadas y aquellas que no hablan sido inoculadas.
Del mismo modo, se inocularon plantulas de malz, brocoli y zanahoria con la cepa transformada con el plasmido pHC60 y fueron observadas mediante microscopla de fluorescencia utilizando un microscopio NIKON eclipse 8Oi a diferentes tiempos.
La capacidad de producir celulosa se evaluo utilizando el medio de cultivo YMA convencional con 25 mg/L de Rojo Congo. El Rojo Congo es un compuesto capaz de unirse a pollmeros de 1, 4-p glucosa y es comunmente utilizado para la detection de celulosa. Sobre la superficie del medio se anadieron 5pl de suspension bacteriana, incubando las placas durante 3 dlas a 28°C.
Por otra parte, se realizaron ensayos relacionados con la formation de biopellculas que se llevaron a cabo segun (Fujishige, N.A. et al. 2006. FEMS Microbiol Ecol 56: 195-206) con algunas modificaciones. Se preparo un pre- inoculo incubando la cepa CRZM151 a 28°C con agitation orbital a 180 rpm, durante 2-3 dlas, hasta alcanzar la fase de latencia (densidad optica a 600 nm, alrededor de 2, 0). Cuando llego a esta fase se centrifugo y se lavo con agua destilada esteril. Despues se resuspendio el pellet en el mismo medio a una D.O.600 nm de 0, 2 (aproximadamente 1x107 celulas/mL) y se guardo para usarlo posteriormente. Por otro lado, se introdujo un portaobjeto previamente esteril dentro de un tubo falcon de 50 mL, se agregaron 25 mL de medio de cultivo para el microorganismo, en este caso YMB (10 gL-1 manitol, 1 gL-1 extracto de levadura, 0, 2 gL-1 K2HPO4, 0, 2 gL-1 MgSO4.7H2O, 0, 5 gl-1 NaCL, 20 gL- 1) y se inoculo con 10 pL de bacterias. A continuation se dejo incubando a 150 rpm a 28 °C durante 3 dlas. La formacion del biopellcula se observo al microscopio. Para ello, se saco el portaobjetos cuidadosamente del tubo falcon y se sumergio en una solution de blanco de calcofluor. A continuacion, en una solution de KOH al 10%, se miro en que cara del portaobjetos se habla adherido mejor la bacteria, eligiendo esta para verla al microscopio de fluorescencia y la otra cara se limpio bien evitando que queden restos del colorante. Por ultimo, se colocaron plantas de todas las especies sobre sustrato y fueron inoculadas con la cepa CRMZ151 para determinar si era capaz de promover el crecimiento vegetal en condiciones de microcosmos.
II - RESULTADOS
La cepa CRMZ151 fue aislada a partir del interior de ralz de Zea mays cultivada en suelo procedente de la localidad de Ciudad Rodrigo, situada en el suroeste de la provincia de Salamanca.
La secuencia obtenida del gen 16S rRNA de la cepa CRMZ151 fue analizada y comparada en GenBank utilizando los programas BLASTN (Alschul et al., 1990. J Mol Biol 215: 403-410) y EzTaxon (Chun et al., 2007. Int J Syst Evol microbiol 57: 22592261). La secuencia fue alineada utilizando el software Clustal_X (Thompson et al., 1997. Nucleic Acid Res 25: 4876-4882). La comparacion de la secuencia del gen 16S rRNA de la cepa CRMZ151 en la base de datos EzTaxon mostro que nuestro aislado presentaba una similitud del 100% con respecto a la cepa tipo de Rhizobium leucanae. Es la primera vez que se encuentra esta especie en suelos espanoles y como endofito de malz. La cepa CRMZ151 fue depositada en la Sociedad Espanola de Cultivos tipo con el numero de registro CECT8306.
La cepa CRMZ151 mostro que era capaz de producir sideroforos, solubilizar fosfato en forma de Ca3 (PO4) 2 y producir 0, 362 g/L de acido indol-acetico cuando estos mecanismos de promocion del crecimiento son probados in vitro.
La primera etapa en el estudio de la interaction planta-microorganismo fue la inoculation de semillas de Zea mays, Daucus carota y Brassica oleracea italica. En este ensayo se observo que las semillas de Zea mays inoculadas con la cepa a estudio presentaban un crecimiento superior al del control negativo y un mayor grosor de la ralz secundaria, por lo que le proporcionarla mayor anclaje y fijacion de la planta al suelo, ademas del soporte, al tener mayor superficie tambien se absorbe mas agua y los nutrientes minerales disueltos en ella, provocando un mayor crecimiento. Del mismo modo, esta relacionado con una mayor capacidad para soportar las fluctuaciones ambientales pues la ralz llega a capas mas profundas del suelo y es menos sensible a las situaciones de estres hldrico o nutricional. Las semillas Zea mays inoculadas, tambien presentaban ralces con un aspecto mas piloso, relacionado seguramente con la production de acido indolacetico que estimula el desarrollo de los mismos. Este caracter juega a favor de las semillas inoculadas ya que la superficie de absorcion de la planta se ve incrementada. Las plantas de Daucus carota inoculadas mostraban un desarrollo mas temprano de la ralz que aquellas que no hablan sido inoculadas y un mayor alargamiento del tallo que en el control negativo, esto supone un beneficio ya que si la ralz es mas larga, habra un mayor soporte para que se
produzcan las asociaciones simbioticas con los microorganismos. Ademas un tallo mayor implica que la competencia por el factor luz se decantarla hacia aquellas plantas inoculas. Por ultimo, las semillas de brocoli (Brassica oleracea italica) inoculadas muestran un desarrollo mas temprano de la ralz, lo que le proporciona un mayor soporte as! como un inicio mas temprano del desarrollo, y mas superficie para que absorba nutrientes, ademas de conferirle mayor resistencia al estres. Estos resultados tienen una estrecha relacion con la production de acido indol acetico, ya que se ha descrito que la inoculation de semillas y plantulas con bacterias productoras de acido indol acetico esta relacionada con un incremento del desarrollo en los primeros estadios y mayor numero de pelos radicales.
Para poder comparar la produccion de celulosa de la cepa CRZM151, se utilizaron cepas de controles (negativo y positivo) que ya estaban estandarizadas en el laboratorio. Una vez finalizado el experimento, se observo que la cepa era capaz de producir gran cantidad de celulosa. La produccion de celulosa por parte de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal puede ser un factor esencial en la formulacion de bioinoculantes, ya que estos endofitos son capaces de adherirse a las plantas por medio de la produccion de celulosa, formando posteriormente biopellculas que contribuyen al crecimiento, desarrollo y defensa de la planta.
Cuando se analizo si la cepa era capaz de formar in vitro estructuras de tipo biopellcula, se observo que la cepa CRZM151 era capaz de formar este tipo de biopellculas (Figura 1). Es muy importante, por lo tanto, una buena colonization por parte de las bacterias, ya que su formation en estructuras tridimensionales, como son los biopellculas, protege a los microorganismos de la action de los agentes adversos, incrementa la disponibilidad de nutrientes para su crecimiento, facilita el aprovechamiento del agua, reduciendo la posibilidad de deshidratacion y posibilita la transferencia de material genetico. Ademas de un aumento en la resistencia, la presencia de una matriz extracelular protege a las celulas constituyentes de las agresiones externas y actua como una barrera frente a la difusion de pequenas moleculas. De esta manera queda patente que la formacion de biopellculas es una estrategia adaptativa de los microorganismos, que les permite establecer interacciones positivas y beneficiosas con la planta que colonizan.
El marcaje con el plasmido pHC60 permitio realizar estudios de microscopia de fluorescencia. En un primer lugar, se llevo a cabo el estudio de la interaction entre
CRMZ151 y las plantulas de Zea mays. La colonization observada fue optima, creciendo la bacteria principalmente en la parte superior de la raiz pero extendiendose con el tiempo por toda la superficie radicular (Figura 2). En esta planta se observo un patron de colonizacion intercelular, donde la bacteria colonizo los espacios intercelulares formando un mosaico sobre la superficie de la raiz. Cuando se estudio la colonizacion en las partes mas antiguas de la raiz, es decir, aquellas mas cercanas a la semilla, se observaron gran cantidad de bacterias creciendo entre los pelos radicales de la raiz, tapizando la superficie radicular y formando estructuras tridimensionales adheridas a los pelos radicales donde las polimeros extracelulares secretados por la bacteria formaban grandes agregados similares a biopeliculas. Con referencia a este hecho, ya se ha mencionado que CRMZ151 fue capaz de producir celulosa in vitro, por lo que ambos resultados deben estar relacionados ya que la celulosa es uno de los componentes principales del exopolisacarido de Rhizobium, involucrado directamente en la formation de biopeliculas. En el caso del maiz, se observo que la colonizacion era altamente dirigida y localizada principalmente a las zonas superiores donde es capaz de reproducirse, pero ademas las zonas de crecimiento tambien son colonizadas aunque de manera mucho mas difusa, restringiendose unicamente a los espacios intercelulares.
Las plantulas de Daucus carota inoculadas con la cepa CRMZ151 marcada con el plasmido pHC60 fueron observadas al microscopio de fluorescencia mostrando una buena colonizacion. Al estudiar las raices de esta planta se vio una colonizacion continua y ligeramente dispersa por la superficie de la raiz, mostrando una destacada predileccion por las zonas superiores y disminuyendo hasta la zona de elongacion de la raiz (Figura 3). Se vio una relation directa entre las zonas donde abundaban los pelos radicales y la colonizacion por parte de la cepa CRMZ151, de tal manera que las zonas donde habia mayor cantidad de pelo radicales se encontraban colonizadas en mayor medida y las zonas donde habia menor numero de pelos radicales o estos eran de un menor tamano, el numero de bacterias que colonizaban la raiz era sensiblemente menor. Un hecho curioso observado fue la adhesion de esta bacteria durante los primeros dias tras la inoculation a los pelos radicales y que no se volvio a observar durante el estudio, apareciendo con el tiempo mayor cantidad de bacterias en los valles entre las celulas de la superficie de la raiz. La explication mas racional a este hecho es que durante la formacion de los pelos radicales hay importantes cambios en la pared celular de las plantas, excretandose al medio sustancias que pudieran ser captadas por las bacterias como indicadores de lugares de penetration
hacia el interior de la planta demostrando que las bacterias endofitas tienen especial capacidad para interactuar con las plantas huesped y responder a sus estlmulos.
La ultima de la plantas inoculadas fue el brocoli (Brassica oleracea italica). En ella, las imagenes obtenidas permitieron comprobar como desde los primeros dlas tras la inoculacion habla una colonization muy activa de la superficie de la ralz. La bacteria fue capaz de colonizar toda la superficie de ralz formando un tapiz homogeneo pero no excesivo (Figura 4). Con el paso del tiempo desde la inoculacion, la disposition de las bacterias evoluciono mostrando una importante predilection por los valles o depresiones formados entre las celulas de la ralz. En otros casos, se observo como a partir del septimo dla de inoculacion la cepa CRZM151, ademas de mostrar una disposicion caracterlstica sobre la ralz, tambien se disponla entorno a los lugares de emergencia de pelos radicales. Esta es una estrategia seguida por algunas especies del genero Rhizobium a la hora de formar nodulos fijadores de nitrogeno y tambien por muchos endofitos. De esta manera, el microorganismo aprovecha los lugares mas debiles de la superficie radicular para colonizar el interior de la planta, ocupando un espacio donde poder desarrollarse e interactuar con la ella. Otro de los aspectos destacables observados durante el estudio de la colonizacion de ralces de brocoli fue la formation de biopellculas o protobiopellculas entorno a la superficie de la ralz. Estos datos reafirman los resultados obtenidos a la hora de evaluar la capacidad de formar biopellculas in vitro. Esta cualidad aporta un beneficio mas a la planta ya que la bacteria es capaz de aumentar la superficie de contacto con el medio, incrementandose la superficie util para la absorcion de nutrientes. Tambien hay que destacar que este polisacarido puede proteger a la planta frente a fluctuaciones ambientes por su mayor capacidad para la retention de agua.
En ultimo lugar, se analizo la capacidad de esta cepa para promover el desarrollo en plantas de Zea mays, Daucus carota y Brassica oleracea italica.
Los ensayos de microcosmos fueron llevados a cabo en un invernadero con temperatura y luz controlada para evitar situaciones de estres para las plantas. Se selecciono como sustrato para desarrollar el experimento una mezcla de turba y vermiculita, en proportion 3:1. Se evaluo la capacidad para promover el crecimiento en las primeras etapas del desarrollo de las plantas para tal fin se cultivaron plantas de cada uno de los cultivos elegidos para inocular y otras plantas como control negativo que no serlan inoculadas (Figuras 5, 6 y 7).
La primera de las plantas evaluadas fue el maiz. El maiz inoculado con CRZM151 presento un 40% de incremento en la superficie radicular respecto al control sin inocular, lo que supone un incremento de la capacidad de la planta para absorber nutrientes y agua al incrementarse en gran medida la superficie util de absorcion de la ralz (Figura 8). El tallo central del maiz es un eje formado por nudos y entrenudos cuyo numero y longitud varlan notablemente en las plantas inoculadas. Los entrenudos tienen una zona activa en la que se producen nuevos tejidos, de esta manera, el tallo del maiz puede incrementar rapido en longitud durante el periodo de crecimiento, por eso es de gran importancia el mayor numero de nudos, que en el presente caso fue un 30% superior en la planta inoculada. El calibre del tallo de las plantas inoculadas fue un 10% superior, lo que les proporciono mayor porte y resistencia a la planta. Se pudo observar tambien que la parte aerea de las plantas inoculadas fue mucho mayor en los primeros estadios del crecimiento.
Las ralces de las zanahorias inoculadas con la cepa CRZM151 presentaron una longitud superior que las ralces de las zanahorias control que no hablan sido inoculadas. En concreto, la longitud de las ralces de las zanahorias inoculadas fue un 15% mayor que aquellas que no hablan sido inoculadas. Estas zanahorias presentaron tambien un incremento en el contorno de la ralz frente a las zanahorias sin inocular, cuyo diametro promedio fue inferior (Figura 9). Ademas las zanahorias control poselan un porte aereo inferior que aquellas otras zanahorias tratadas con la cepa CRZM151, en las que se observo un incremento del 10% en la longitud foliar, incrementandose la superficie fotosintetica y por tanto, la capacidad para sintetizar materia organica. Este hecho tiene relation con el incremento de peso seco observado en las zanahorias inoculadas correspondiente a un 10% con respecto de las zanahorias control.
Por ultimo en el caso del brocoli, se observo un tamano mayor de las hojas en las plantas inoculadas, con un area foliar superior a las plantas control sin inocular. Presentaron tambien un desarrollo radicular superior que los controles negativos sin inocular, ya que influye de forma directa sobre una mayor capacidad para absorber nutrientes (Figura 10).
III - CONCLUSION
La cepa CRZM151 {Rhizobium leucaenae CECT8306) es una bacteria endosimbiotica de Zea mays capaz de promover el desarrollo foliar y radicular en plantas de Zea mays, Brassica oleracea italica y Daucus carota, colonizando de forma activa la rizosfera de las plantas y actuando como endofito promotor del crecimiento vegetal en 5 ellas, por lo que es susceptible de utilizarse como biofertilizante en cultivos de estas plantas.