BENZO-HETEROCICLOS DE SEIS MIEMBROS CON ÁTOMOS DE DXlGENO Y · NITROGENO CON ACTIVIDAD ANTITUMORAL
ESTADO DE LA TECNICA
El cáncer sigue siendo una de las causas principales de muerte en el mundo civilizado. A pesar de los grandes progresos que se han llevado a cabo en cuanto a la comprensión de las bases moleculares del cáncer, de la detección y del tratamiento, su mortalidad sigue siendo alta y no hay una cura definitiva a pesar de las mejoras que han experimentado las diversas terapias. Los regfmenes actuales muestran supervivencias limitadas cuando se aplican a la mayoría de cánceres en estadios avanzados. Con el auge de la bio-informática y la biologra molecular, se han desarrollado nuevas técnicas que permiten analizar las modificaciones globales del genoma y del proteoma de las células tumorales. La detección mediante estas técnicas de las modificaciones génicas y proteicas inducidas por nuevos fármacos antitumorales, permiten caracterizar las dianas potenciales de estos compuestos y el conocimiento más certero de cuál es el mecanismo de acción de los mismos. La profundización en los mecanismos de regulación de estos eventos apoya el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas basadas en el diseño racional de nuevos agentes antitumorales selectivos frente a sus dianas moleculares.
Uso de purinas en el tratamiento de cáncer
Entre los distintos principios activos para el tratamiento de cáncer conocidos en el estado de la técnica se encuentran las purinas. En el estado de la técnica más cercano a la presente invención se encuentra la patente ES200601538, donde se describen mezdas racémicas y sus usos en el tratamiento del cáncer de las estructuras 1 y 2.
x y
('YX~N-¡ (NyZ
CC>-~~~~
~O l"N~N O "N JlN""'-Z
y
, X.O; y. CI , z· H 2 X; () ; Y= CI, Z= H
X.~ y. Br, z· H X·O; y. 1, Z= H
X=O; Y= 1, z· H X=O; Y= CF3, Z= H
X.O; Y= CF3, Z= H x·O; Y=Z=CI
X.O: y, z, CI X'S: y, CI, z, H X·S; Y= CI, Z= H X.SO, ; Y= CI, Z= H X·SO, ; y. CI, Z= H
Dichas familias de compuestos 1 y 2 presuntan actividad antitumoral frente a diversas estirpes de cánceres y baja toxicidad frentle a una línea celular sana (linea epitelial de mama nonnal MCF-10A). En particular, ES200601538 divulga compuestos en los que en el anillo heptagonal los heteroátomos presentes son O y X, donde X se selecciona de entre O, S Y S02, y sus concentraciones inhibitorias 50 (CI50) sobre la linea celular humana derivada de cáncer
de mama MCF-7.
las actividades antitumorales de estos compuestos son notables y comparables a los agentes activos convencionalmente utilizados en terapia como el agente citotóxico 5
fluorouracilo (Dlaz-Gavilán, M.; Gómez-Vidal, J.A.; Rodríguez-Serrano, F.; Marchal, J.A.; Caba, O.; Aránega. A; Gallo, M.A.; Espínosa, A; Campos, J.M. Bioorg. Med. Chem. Len.2008, 18, 1457-1460).
En su esfuerzo por proporcionar agentes anti-proliferativos mejorados tos inventores posterionnente han divulgado nuevos compuestos, O, N-acetales y su síntesis en los que X en el anillo heptagonal es un átomo de N sustituido con un grupo nitrobencensulfonilo (Dlaz-Gavilán, M.; Ch4Jquesillo·lazarte, D.; González·Pérez, J.M.;
Gallo, M.A.; Espínosa, A ; Campos, J.M. rotrahedron 2007, 63, 5274-5286).
los resultados sobre las actividades anü-proliferaüvas de diversos compuestos O, Nacetales ~9 y N-7 pur (nicos o N-1 y N-3 pirimidfnicos in vitro frente a la Hnea celular
de cáncer de mama humano MCF-7 han sido publicadas (Dlaz-Gavilán, M.; GómezVidal, J.A.; Rodríguez-Serrano, F.; March, " , J.A.; Caba, O.; Aránega, A; Gallo, M.A.; Espinosa, A.; Campos, J.M. Bioorg. Med. Chem. Len. 2008, 18, 1457-1460). Estos resuHados, han puesto de manifiesto, entre otros aspectos, que los compuestos anlitumorales más potentes son los derivados de purina. También parecen en general
más potentes los compuestos que presentan un anillo de 4, 1·benzoxazepina frente a los compuestos que presenta un anillo de 4.1-benzoxatlepino o de 4.1benzodioxepino.
Por otro lado, en la patenle [ES200802431] se describe el (RS) -9-[1- (pnitrobencensulfonil}-1.2, 3, 5-tetrahidro-4, 1-t>enzoxazepin-3-il]-2, 6-dicloro-9H-purina. En una reciente publicación hemos demostrado el efecto inhibitorio sobre quinasas implicadas en carcinogénesis, prol~eración y angiogénesis (Ramlrez A ; Boulaiz H.; Morata-Tarifa C.; Perán M.; Jiménez G.; Picón-Ruiz M.; Agil A, Cruz-L6pez O.; ConejoGarcla A.; Campos JM.; Sánchez A; Garcia MA; Marchal JA Oneotargot 2014, 5, 3590-3606). Dicho compuesto inhibió la ruta de señalización de HER-2 y las Quinasas JNK y ERK1/2. Además tuvo un efecto inhibitorio de AKT y de VEGF. junto con actividades anti-migratorias y anti-angiogénicas. Por otro lado, dicho compuesto fue capaz de inhibir la formación de mamo y colonosferas, y eliminó las sub-poblaciones de CSCs aldehido deshidrogenasa positiv..s (ALDH1 +) a bajo rango micromolar. Esta acción fue debida a la regulación a la baja de c-MYC, ~-CATENINA y SOX2, y el
exceso de regulación del represor de la rula de señalización Hedgehog, GLI-3. Finalmente, también demostró eficacia l3lnti-tumoral y anti-metastásica in vivo en tumores inducidos (xenotransplantes) sin presentar toxicidad aguda o sub-aguda (Ramírez A.; Boulaiz H.; Morata-Tarifa C.; Perán M.; Jiménez G.; Picón-Ruiz M.; Agil A, Cruz-López O.; Conejo-Garcla A.; Campos JM.; Sánchez A.; Garcia MA.; Marchal 10 JA. Oncolargel2014, 5, 3590-3606).
Por otro lado, en la patente ES2010304'15 se presentan los dos enantiómeros del
(RS) -9-[1- (p-nitrobencensulfonil) -1 , 2, 3, 5-tetrahidro-4, 1-benzoxazepin-3-il]-2, 6-dicloro9H-purina , con inhibición de EGFR, HER-:2 Yde VEGF, con producción de un elevado nivel de apoptosis en células tumorales y además, sin manifestación de toxicidad aguda ni crónica.
Finalmente, en la patente ES201430048 se describe la preparación de sulfonamidas secundarias 3 (derivadas de aminas secundarias) , y a su uso como medicamentos para el tratamiento y prevención del cáncer, en particular para el tratamiento de cáncer
de mama, pulmón, colorrectal, páncreas, neoplasias y sfndromes mielo-proliferatiyos.
Las estructuras tipo 3, están relacionadas; con bozepinib y derivados, en cuanto que presentan unidades de purinas en su estructura, sin embargo como aspecto 25 diferenciador son estructuras acfclicas 'frente a la estructura del bozepinib que presenta un anillo de siete miembros heteroclclico. Otro aspecto diferenciador es que en la familia 3 no existe estereocentro que si está presente en el bozepinib, lo que Simplifica el procedimiento sintético.
Las principales dificultades que presentan los compuestos descritos en estas patentes son la escalabilidad y sus síntesis enantioméricas.
Células Madre Cancerígenas En la actualidad, uno de los conceptos más interesantes que se está explorando en la investigación de cáncer es la teoría de lais células madre cancerígenas (en adelante "CSCs·, del inglés "Cancer Stem Cel/s· ) o células iniciadoras de tumor. Las CSCs se pueden definir como las sub-poblaciones de células dentro de los tumores que poseen la capacidad de auto-renovarse y diferenciarse en las diferentes líneas de células cancerosas que componen el tumor. Es;te tipo de células es propuesto como el promotor de la resistencia frente terapias antitumorales, siendo capaz de mantener tumores benignos y malignos, así como provocar recidivas (Reya, T.; Morrison, S.J.; Clarke, M.F.; Weissman, I.lo Nature 2001, 414, 105-111). En comparación con las células madre normales, se cree que IHS cses no tienen ningún control en su proliferación. Estas eses, presentes en los tumores en pequeña cantidad, se caracterizan por su capacidad para penn;:mecer quiescentes durante largos periodos de tiempo, capacidad de auto-renovalción, mantenimiento del crecimiento y heterogeneidad del tumor, afinidad por ambientes hipó.icos, resistencia a qUimioterapia y desarrollo de metástasis (Tirino, V.; Desiderio, V.; Paino, F.; De Rosa,
A.; Papaccio, F.; La Noca, M.; Laino, L.; De Francesco, F.; Papaccio, G. FASEB J. 2013, 27, 13-24). Las CSCs se caracterizan por su capacidad para formar colonias esféricas al ser cultivadas en suspensión (Dontu, G.; Abdallah, W.M.; Foley, J.M.; Jackson, K.W.; Clarke. M.F.; Kawamura, M.J.; Wicha, M.S. Genes Dev. 2003, 17, 1253-1270). AI-Hajj et al. lograron demostrar que la inyección de 200 células tumorales que expresaban marcadores característicos de CSCs fue más eficaz a la hora de generar tumores en ratones inmuno-deprimidos que la inye1cción de 50.000 células tumorales con marcadores de células diferenciadas de la misma estirpe histológica (AI-Hajj, M.; Wicha, M.S.; Benito-Hemández, A.; Morrison, S.J.; Clarke. M.F. Proc Natl Acad Sc; U S A, 2003, 100:3983-3988). Se ha enconllrado que múltiples moléculas relacionadas con las propiedades características de las células madre tales como auto-renovación y pluripotencia, y detenninadas actividades onzimáticas se expresan en gran medida en CSCs, incluyendo c-MYC, ~-CATENINA (Moumen, M.; Chiche, A.; Decraene, C.; Petit, V.; Gandarillas, A.; Deugnier, M.A.; Glukhova, M.A.; Faraldo, M.M. Mol Caneer, 2013, 12, 132-140) , SOX-2 (leis, O.; Eguiara, A. ; lópez-Arribillaga, E.; Alberdi, M.J.; Hernández-Garcla, S.; Elorriaga, K.; Pandiella, A.; Rezola, R; Marlln, A.G. Oncogene 2012, 31, 1354-1365) , Y la actividad ald, ehído deshidrogenasa (AlDH1) (Deng, S.;
Vang, X.; lassus, H.; liang, S.; Kaur, S.; Ye, Q.; Li C.; Wang, L.P.; ROby, K.F.; Orsulic,
S.; Connolly, D.C.; Zhang, Y.; Montone, K.; Bülzow, R; Coukos, G.; Zhang, L. PLoS One 2010, 5, el0277, entre otras). Ac1uando selectivamente sobre las rutas o moléculas sobre-reguladas en las células cancerosas diferenciadas y/o en las poblaciones ese. pero no en las células normales, pueden proporcionar nuevas estrategias para una terapia selectiva y efectiva frente al cáncer.
Terapias dirigidas contra Células Madre O:lncerígenas En la actualidad, el tratamiento del cáncer se dirige a su potencial de proliferación y, por lo tanto, la mayoría de los tratamientOfE¡están dirigidos a las células que se dividen rápidamente. la presencia de las eses puede explicar el fracaso de los tratamientos para erradicar la enfermedad o la recurmncia del cáncer (Reya, T.; Morrison, S.J.; Cfarke, M.F.; Weissman, I.l. Nature2001 , 414, 105-111). la propiedad que tienen las eses para mantenerse en un estado de quiescencia, estado en el que la célula no se divide, permaneciendo en la fase Go del ciclo celular, (Arai, F.; Hirao, A.; Ohmura, M.; Sato, H.; Matsuoka, S.; Takubo, K.; Ito, K.; Koh, G.Y.; Suda. T. Ce/12004, 118, 149
161) les permite sobrevivir a la mayoría de los tratamientos anü-cancerígenos. Esta caracterlstica hace posible las recaídas o recidivas, incluso décadas después del tratamiento inicial, como es el caso del cáncer de colon o mama (Reya, T.; MOrOson,
S.J.; Clarke, M.F.; Weissman, I.L. Nature 2001, 414, 105-111 ; Dick J.E. BIood 2008, 112, 4793-4807). Aunque los tratamientos actuales pueden reducir el famano del
tumor. estos efectos son transitorios y gleneralmente no mejoran los resultados de supervivencia de los pacientes. Para tumlores en los que las eses desempeflan un papel, existen tres posibilidades. En pnmer lugar, la mutación de las células madre normales o células progenitoras de las eses puede conducir al desarrollo del tumor primario. En segundo lugar, durante la quimioterapia, se puede destruir la mayoria de las células del tumor primario, pero si la:s eses no se erradican, se convierten en esCs refractarios y puede conducir a la ", apanción del tumor (Stockler, M.; Wilcken, N.; Ghersi, D.; Simes, RJ. Caneer Treat Hev 2000, 26, 151-168). En tercer lugar, las eses pueden migrar a sitios distantes del tumor primario y provocar metástasis (Jordan, C.T.; Guzman, M.L. Oncogene 2004, 23, 7178-7187; Jordan, C.T.; Guzman, M.L.; Noble, M. New Eng. J Med2006, 351;, 1253-1261; Liu, H.G.; Chen, C.; Yang, H.;
Pan, Y.F.; Zhang, X.H. Tran./ Mee! 2011 , 9, 50-58). Teóricamente, la identificación de la. CSCs puede permitir el desarrollo de modalidades de tratamiento que se dirijan frente a dichas células en lugar de hacia las células que se dividen rápidamente (Jayesh, S.; Chaib, B. ; Sates, M.; Seifalian, A. Canear Ce///nt 2009, 7, 9-14).
Una de las aproximaciones terapéuticas que se estudian actualmente para combatir las eses está relacionada con las vias de! señalización implicadas en los procesos de su aulo-renovación, proliferación y diferenciación. Esto se debe a que la pérdida de la regulación de vías como Hedgehog (Hh) , Notch y Wntl~-catenina, da lugar a los procesos claves implicados en las caractorfsticas propias de las eses. Actualmente, la terapia dirigida frente a estas rutas repn*ienta uno de los mecanismos de actuación más prometedores frente a estas células iniciadoras del tumor (Maugeri-Sacca M.; Zeuner A.; De Maria R. Front Onco/2011, 1, 10; Takebe N.; Harris P.J.; Warren R.Q.; Ivy S.P. Nat Rev Clin Onco/2011, 8, 97-106).
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
OBJETO DE LA INVENCiÓN
En un primer aspecto, la presente invencilón se refiere a una nueva familia de benzoheterociclos de seis miembros con átomos de oxigeno y nitrógeno, unidos a purinas y a halógenos, en adelante "compuestos ele la invención~, que son útiles en terapia frente al cáncer, en particular en terapias c:uya diana terapéutica son las células madre cancerlgenas. También se considerarán objeto de la invención los enantiómeros,
isómeros, sales, o solvatos, de dichos compuestos. También son objeto de la invención los profármacos de los compuestos de la invención.
Otro aspecto de la invención son las composiciones farmacológicamente aceptables que los contienen los compuestos de la invención, en adelante "composiciones de la Invención".
Un tercer aspecto de la invención se relfoere al uso de los compuestos y/o de las composiciones de la invención para su uso como medicamento o su uso en terapia, en particular como medicamento para terapia frente al cáncer y más particularmente, como medicamento que actúa frente a células madre cancerlgenas. En ese sentido también se considera objeto de la invención el uso de los compuestos de la invención para la fabricación de un medicamento con las aplicaciones mencionadas.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere al procedimiento de sintesis de los compuestos de la invención, en adelante "procedimiento de la invención".
También son objeto de la invención los compuestos intermedios empleados en el procedimiento de síntesis.
DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema de reacción del proetKJimiento de slntesis de los compuestos de la invención.
Figura 2. Aislamiento y caracterización de las sub-poblaciones de eses a partir de las células MOA-MB 468 mediante separación por citometrfa de flujo según la aclividad aldehido deshidrogenasa; A: uso del inhibidor, B: sub-población ALDH (+) , C: sul>-población ALDH (-).
Figura 3. Imágenes obtenidas mediante microscopio óptico pertenecientes a mamosferas cultivadas tras el aislamiento de las sub-poblaciones de eses ALDH+ de la linea celular MDA-MB 468.
Figura 4. Westem blot de la linea celular MOA-MB 468 usando 13 a una concenlración de 5 ~M duranle 2h, 4h, 8h, 12h, 16h Y 24h. A. Efeclo sobre EGFR y ERKl/2 fosforilados. B. Análisis densilomélrico normalizado con la senal de ¡3-aclina Figura 5.Westem blot de Sox2 (SOX-2) de las sub-pobladones de eses AlDH+
aisladas de la línea celular MDA-MB 468 Y Iraladas con 13 a una concenlración de 1.43 ~M (CI", ) y 2.86 ~M (2 • CI", ) durante 24h.
Figura 6. Representación de la actividacj antitumoral in vivo de 13 sobre la línea melastásica de melanoma humano A375. A los ratones usados como control se les inyectó únicamente el vehículo (.) y los tratados con 13 se dividieron en dos grupos,
uno tratado con 50 mg/kg (.) y otro con 100 rng/kg (.. ).
Figura 7. Curva de supervivencia de K"plan-Meier de los ratones tratados con el vehiculo (controles, e) y tratados con 13 (.: 50 mg/kg,..: 100 rng/kg).
DESCRIPICION DETALLADA DE LA INVI:NCIÓN Definiciones
• En el presente documento los siguientes ténninos tienen los significados indicados: "Alquilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene ¡nsaturaciones, que tiene 1-12, preferiblemente de uno a ocho, más preferiblemente de uno a seis átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo, p. ej., metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, nbulilo, t-butilo, n-pentilo, etc.
• "Alquenilo" se refiere a un radical dl3 cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos una ¡nsaturación, que tiene 2-12, preferiblemente de dos a ocho, más preferiblemente de dos a seis átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo.
• nAlguinilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono, conjugado o no, que tiene de dos a doce, preferiblemente de dos a ocho, preferiblemente de dos a seis átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo, tales como -CCH, -CH, CCH, -CCCH" -CH, CCCH,.
• "Afilo" o "Ar" se refiere a un radical hidrocarbonado aromático tal como fenilo, naftilo o anlracilo.
• "Arilalqui/o" se refiere a un grupo arilo unido al resto de la molécula a través de un grupo alquilo, tal como bencilo y fenetilo.
• ·Cicloalquilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada cielico que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturación, que tiene de 3 a 8 átomos de carbono, unido al resto de la molécula por un enlace sencillo."Alcoxilo" se refiere a un radical de fórmula -Oalquilo, p. ej. metoxi, etoxi, propoxi, etc. "Ariloxilo" se refit3re a un radical de fórmula -Oarilo.
• "Heterocicloalquilo" se refiere a un anillo estable de 3 a 15 miembros que consiste en átomos de carbono y ele uno a cinco heteroátomos seleccionados del grupo constituido por nitrógeno. oxígeno y azufre, preferiblemente un anillo de 4 a 8 miembros con uno a más heteroátomos, más preferiblemente un anillo de 5 Ó 6 miembros con uno o más heteroátomos unidos al átomo de nitrógeno
de tipo aniHnico mediante un grupo alquilo, tal como metilo, etilo, propilo unido a cualquier átomo de carbono del sistema heterociclo. Para el propósito de esta invención, el heterociclo puede ser un sistema anular monocíclico, bicíclico o tricíclico, que puede incluir sistemsis de anillos condensados; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre en el heterociclo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuatemizado; y el heterociclo puede estar parcial o totalmente saturado o ser aromático. Los ejemplos de dichos heterociclos incluyen, pero no se limitan a azepinas, bencimidazol, benzotiazol, furan, a, isotiazol, imidazol, indol, piperidina, piperazina, purina, quinolina, tiadia2:01, tetrahidrofurano.
• YAcilo· se refiere a un grupo -C (=O) R4.
• "Alcoxiacilo· se refiere a un grupo -C (=O) OR4 tales como carbamato de metilo, carbamato de etilo, carbamato de bencilo, carbamato de p-nitrobencllo, carbamato de tero-butilo, carbamato de alilo, carbamato de 2, 2, 2-lricloroetilo, carbamalo de 2- (lrimelilsilil) elilo, y "arbamalo de aliJo.
• "Alcoxisulfonilo" se refiere a un gnupo -S0 20R4 tales como sulfato de metilo, sulfato de etilo, sulfato de bencile,. sulfato de p-nitrobencilo, sulfato de tercbutiJo, sulfato de alllo, sulfato de 2, 2, 2-tricloroetilo, sulfato de 2- (trimetilsilil) etilo, y sutfato de aliJo.
En las fórmulas anteriores R4 representa un grupo seleccionado del grupo constituido por alquilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, arilalquilo sustituido o no sustituido, y heterociclo.
Las funciones orgánicas que se encuentran unidas a un átomo de oxigeno son bien conocidas en la técnica y son representativas las siguientes: -Éleres de sililo de fórmula -Si (R'h, lales como éler de Irimelilsililo, éler de Irielilsililo, éler de tero-butildimetilsililo, éter de tero-bulildifenilsililo, éter de triisopropilsililo, éter de dietilisopropllsililo, éter de texlldlmetilsilllo, éter de trifenilsililo, éter de di-terc-butilmetilsililo: -Éteres de alquilo y arilalquilo tales como éter de metilo, éter de tero-butiJo, éter de bencilo, éter de p-metoxibencilo, éter de 3, ~imetoxibencilo, éter de lrililo; éter de alilo; -Éteres de alcoximetilo y ariloxilo de fórmula -CH20R4, tales como éter de metoximetilo, éter de 2-meloxieto) cimelilo, éter de bencíloximelilo, éter de p
metoxibenciloximetilo, éter de 2- (trimetilsilil) etoximetilo; tetrahidropiranilo y éteres relacionados; éter de metiltiometilo; -Esteres de fórmula -C (=O) R·, tale!s como éster acetato, éster benzoato, éster pivalato (dimetilacetato). éster metoxiacetato, éster c1aroacetato, éster levulinalo (4-0xopenlanoalo) ; -Carbonatos de fórmula -C (=O) OR·, tales como carbonato de bencilo, carbonato de p-nitrobencilo, carbonato de tere-bulila, carbonato de 2, 2, 2lricloroelilo, y carbonalo de 2- (lrimel1lsilil) elilo, carbonalo de alilo. -Sulfonalos de fórmula -S02R4, tales como sulfonalos de metilo, tosilato, brosilato, mesilato.
En todas las fórmulas anteriores R4 representa un grupo seleccionado del grupo constituido por alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no suslituido, alquinilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y arilalquilo sustituido o no sustituido.
El término "tratamiento" o "tratar' en el oontexto de este documento se refiere a la administración de un compuesto o una composición según la invención para prevenir, mejorar o eliminar la enfermedad, condición patológica o uno o más sfntomas asociados con dicha enfermedad o condic~6n en un mamifero, preferentemente en un ser humano. ~Tratamiento~ también abarCGt la prevención, mejora o eliminación de las secuelas fisiológicas de la enfermedad. C () ncretamente, el concepto "tratar" se puede interpretar como:
(i) Evilar que se produzca la enlennedad o la condición palológica en un mamífero, en particular, cuando dicho mamifero tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se diagnosticó que la tenga; En particular, el método de la invención permitiría, tras la detección de CSCs, oomenzar un tratamiento que podría prevenir el desarrollo del tumor con antelación; (ji) Inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
(iii) Aliviar la enlennedad o la condición palológica, es decir, causas la regresión de la enfermedad o la condición patológica;
(iv) Estabilizar la enfermedad o la condición patológica.
A lo largo de la desaipción y las reivindicadones el término ·comprende", que también podrá interpretarse como "consiste en", ) f sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
Compuestos de la invención En el contexto previamente definido, lal presente invención se refiere a nuevos compuestos ("compuestos de la invención") , de fórmula general IV.
() R'"
OC) '
I
RI IV
Donde • R puede ser un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, -C (=O) R", -C (=O) OR", o bien el resto de bencensul!onilo indicado a continuación: I
SO,
R'~ ~~
• R' puede ser H, OH, 3, 5-diOH, 2-NO" 3-NO" 4-NO" 2-NH" 3-NH" 4-NH"
4. Me, 4-0Me (Ts) , 3, 4-diOMe, :2-CI, 3-CI, 4-CI, 2-8r, 3-8r, 4-8r, 2-1, 3-1, 4-1, 20 3.5-diCI. 3.5-diBr. 3.5-dit o 3.5-diMe en un resto de bencensulfonilo;
• R'" se selecciona del grupo formado por:
""""::\
9N N X
(, lí '1
NI
W
"""\ W
7N~N
' (, JLJ... '
-CH, X , -CH, OZ
N N X
25 • X Y W representan cada uno. independientemente entre sí, un átomo
electronegativo seleccionado dE11 grupo formado por -CI, -8r, e -1;
• Z es un grupo de átomos que se encuentra integrado dentro de diversas
funciones orgánicas tales como éteres de sililo de fórmula -Si (R4) a. éteres
de alquilo y arilalquilo, éteres de alcoximetilo y ariloxilo de fórmula CH, OR'; esteres de fórmula -C (=O) R'; carbonatos de fórmula -G (=O) O R' y suffonalos de fórmula -SO, R'.
• R"" puede ser H, grupos aeilo de fórmula -C (=O) R· , de tal manera que el
grupo -QC (=O) R' puede ser un éster acetato, éster benzoato, éster
pivalato (dimetilacetato). éster metoxiacetato, éster cloroacetato, éster
levulinato (4-0xopentanoato) ,
R4
• representa un grupo selec:cionado del grupo constituido por alquilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido 10 o no sustituido, arilalquilo sustituido o no sustituido. y heterociclo.
En una realización particular, los compuestos de la invención se presentan en forma cristalina como compuestos libres o solvatos (por ejemplo hidratos) estando ambas formas comprendidas en el ámbito de protección de la presente invención. Los métodos de solvatación son generalmente conocidos en el estado de la técnica.
También son objeto de la invención los profármacos de los compuestos de la invención.
En una realización particular, son objeto de la invención los compuestos de fórmula generallVa.
(X°r COOEI
N
,
O, s~
l.~
rv. R' En otra realización particular, son objeto de la invención los compuestos de fórmula general IVb.
(X) ~OH
,
O, s~
l.~
M, R'
En otra realización particular, son objeto de la invención los compuestos de fórmula generallVc.
En otra realización particular, son objeto de la invención los compuestos de fórmula generallVc'.
En otra realización particular, son objeto de la invención los compuestos de fórmula general IVd.
(Y°y"'x
~tI)
,
o, S'Q
IVd R'
En otra realización particular, son objeto de la invención los compuestos de fórmula general IVe.
En otra realización particular, son objeto de la invención los compuestos de fórmula generallVf.
En otra realización particular, son objeto de la invención los compuestos de fórmula generallVg.
En una realización preferente, los compUEtstos objeto de la invención se seleccionan del grupo detallado en la Tabla 1:
Grupo Comp. R R'" W X
IVa 4 Ts CO, Et - -
IVb 5 Ts CH, OH - -
IVd 6 Ts eH, el - -
IVe 7 Ts eH, Ts - -
IVe 8 Me ":\ ' N~yX<, I N N " w el H
9 Me Br H
10 Me el el
11 Ts el H
12 Ts Br H
13 Ts el el
IVf 14 Ts eH, N, - -
IVg 15 Ts ~ ~ ~ " :}--QN"' N OH - -
Tabla 1. Realizaciones preferentes de 3, 4-dihidr<r2H-1 , 4-benzoxazina.
En un segunda aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden como ingrediente activo al ml9nos un compuesto de la invención. Dichas formulaciones farmacéuticas pueden contlener uno o más excipientes y/o sustancias transportadoras. Además dichas formulaciones puede contener cualquier otro ingrediente activo en el tratamiento de cáncer.
Los excipientes, sustancias transportadoras y sustancias auxiliares tienen que ser farmacéutica y farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan efectos adversos en el organismo tratado. las composiciones farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular e intravenosa) , aunque la mejor vla de administración depende del estado del paciente. Las formulaciones pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la farmacologlal. Las cantidades de sustancias activas para administrarse pueden variar en función de las particularidades de la terapia. Opcionalmente la composición farmacéutüca puede comprender otro principio activo. Además del requerimiento de la eficacia terapéutica, que puede necesitar el uso de agentes terapéuticos, además de los compuestos de la invención, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combinación de un compuesto de la invención y otro agente terapéutico, tal y como en el tratamiento de enfermedades o afecciones que directa o indirectamente modulan la función de la sustancia.
Los Mvehlculos farmacéuticamente aceptélbles· que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidc) s por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de compo, siciones terapéuticas. Las formulaciones farmacéuticas puedEm contener uno o más excipientes y/o sustancias transportadoras. Además dichas formulaciones pueden contener otros ingredientes activos con propiedades anti-cancerlgenas. Los excipientes, sustancias tran~port8doras y sustancias auxlliare~:; tienen que ser farmacéutlcamente y fannacológicamente tolerables. de modo que puedan ser combinados con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa) , aunque la mejor vía de administración depende del estado del paciente. Las formulaciones pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la farmacologlal. Las cantidades de sustancias activas para administrarse pueden variar en función de las particularidades de la terapia.
Las composiciones de la invención (ver c () mposiciones del primer o segundo aspecto de la invención) se preparan utilizando métodos habituales tales como aquéllos descritos o a tos que se hace referencia en las Farmacopeas Española y Estadounidense y textos de referencia simülares.
En un tercer aspecto, la invención se refiere al uso de los compuestos o las composiciones de la invención o en terapia o como medicamento. Concretamente, son objeto de la invención los compuestos o las composiciones de la invención para su uso en terapia o como medicamento. En una realización particular, la invención se refiere al uso de los compuestos o composiciones de la invención para el tratamiento del cáncer, preferentemente de los cáncere~; de mama, pulmón y colorrectal. En una realización preferente, su uso está dirigido a la inhibición de eses.
Por otra parte, se considera objeto de la invención el empleo de un los compuestos o composiciones de la invención en la E!laboración de un medicamento. En una realización particular, los compuestos o composiciones de la invención se emplean en la elaboración de un medicamento para el cáncer, preferentemente de los cánceres de mama, pulmón y colorrectal. En una realización preferente, su uso está dirigido a la elaboración de medicamentos para la inhibición de eses.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los compuestos o composiciones de la invención para su use) como medicamento para el tratamiento de patologías o enfermedades provocadas por procesos neoplásicos. Más concretamente, la invención se refiere a los compuestos para su uso como medicamentos para el tratamiento de cáncer. Más preferiblemente el cáncer de mama, colorrectal, melanoma y pulmón.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de pacientes afectados por cáncer medil:lnte el uso de los compuestos o las composiciones de la invención. Los e1fectos anticancerosos de un método de tratamiento de la presente invención incluyen, pero no se limitan, a los efectos antitumorales, la velocidad de respuesta, al tiempo de progresión de la enfermedad y al índice de supervivencia. Los efectos antitumorales de un método de tratamiento de la presente invención incluyen, pero no se limitan, a la inhibición del crecimiento tumoral, retraso en el crecimiento tumoral, regresión del tumor, contracción del tumor, aumento del tiempo para el crecimiento dl~ nuevo del tumor al cesar el tratamiento, y enlentecimiento de la progresión de la enflermedad. Se espera que cuando un método de tratamiento de la presente invención :se administre a un animal, preferiblemente mamífero, y más preferiblemente humano, con necesidad de tratamiento anticanceroso, el método de tratamiento producirá un efecto medido, por ejemplo por una o varias de las siguientes características: la extensión del efecto antitumoral, la velocidad de respuesta, el tiempo de la progresión de la enfermedad y el fr"ldice de supervivencia. Los efectos anticancerosos incluyen el tratamiento profiláctico.
Este tratamiento consiste en la administración a los individuos afectados por estas enfermedades de cantidades terapéuticclmente efectivas de un compuesto de la invención, o una composiCión farmacéuticcl que lo incluya.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamenle efectiva-se refiere a aquella cantidad de un compuesto de la invención que cuando se administra a un mamffero, con preferencia un humano, es suficiente para producir el tratamiento, tal como se define más abajo, de una enfermedad o condición patológica de interés en el mamlfero, con preferenci~1 un humano. La cantidad de un compuesto de la invención que constituye una cantidad terapéuticamente efectiva variará, por ejemplo, según la actividad del compllesto especifico empleado; la estabilidad metabólica y duración de la acción del compuesto; la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el tiempo de administración; la velocidad de excreción, I'a combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o la condición patológica particulares; y el sujeto que se somete a terapia, pero puede ser determinada por un eSipecfalista en la técnica según su propio conocimiento y esa descripción.
la administración de los compuestos de la invención, en fonna pura o en una composición farmacéutica apropiada, se puede llevar a cabo por medio de los modos de administración de agentes aceptados p;:lra servir a similares utilidades.
Procedimiento de la invención En otro aspecto la invención se refiere: a un procedimiento (Figura 1) para la preparación de los compuestos de la presente invención. los compuestos de la invención, de estructura general IV, que comprende la formación de un éster a partir de un intermedio de lónmula general I (Internledios 1).
En particular, el procedimiento para obtener compuestos de fórmula general IVa consiste en la formación de un éster a partir de un intermedio de fórmula general I
En otra realización particular, los compuestos de fórmula general IVb se obtienen mediante un procedimiento que consiste en la fonnación de un éster a partir de un intennedio de fónnula general I y una posterior reducción.
En una realización aún más particular, esta reducción se consigue mediante la acción del borohidruro de litio en THF.
En otra realización particular, los compuestos de fórmula general IVe o IVe' se obtienen mediante un procedimiento que consiste en realizar una reacción de Mitsunobu sobre un compuesto de fórmula generallVb.
En otra realización particular, los compuestos de fórmula general IVd se obtienen mediante un procedimiento que consiste en realizar una halogenación sobre un compuesto de lórmula generallVb.
En otra realización particular, los compuestos de fórmula general IVg se obtienen mediante un procedimiento que consiste en formar un triazol sustituido sobre un compuesto de lónmula general IVb.
En otra realización particular, los compuestos de fórmula general IVe se obtienen mediante un procedimiento que consiste on tratar un compuesto de fónnula general IVb con un equivalente (la misma cantidéld de moles) de TsCI calentando a reflujo, preferentemente durante 24 horas.
En otra realización particular, los compue'stos de lónmula general IVf se oblienen al tratar un compuesto de fórmula generallVo con azida sódica.
En una realización preferente, el procedirniento para obtener los distintos grupos de compuestos de 16nmula general IV, compre'nde los siguientes pasos:
1. Hacer reaccionar o-aminofenol con cloruro de bencensulfonilo con distintos sustituyentes en el anillo aromático (grupos electrón donantes o atrayentes)
para producir los intermedios I
'" /OH
oó ' NH
,
SD
Ix
R'
Intermedios I
2. Hacer reaccionar los intermedios I con el 2, 3-dibromopropionato de etilo racémioo para producir los IVa
crOJ COOEt
N
O, sl;~ ~. "J
lVa R'
"""
3. Reducir los IVa para obtener los inllsrmedios IVb
,
02S~
l-~
IVb R'
Las diferentes variaciones para pasar de IVb a IVe, IVe', IVd y IVg se describen a continuación:
d1) reacción de Mitsunobu UVe y IV~ 15
Hacer reaccionar los intermedios IIVb y una purins mono. o di-sustituida en presencia de azodicarboxilato de di/alquilo y de trifenilfosfina en un disolvente orgánico para obtener IVe (N-9) y/ó IVe' (N-7).
X
N"" W N
'" °y"'NY ccoy"'NJ;;rx
", ) c"N W 1", ) c"
, ,
N N
N
02S~ rP'Yso,
V o
lVe'lVe d2) halogenación (lVd) ;
Tratar IVb en una particularización l::on cloruro de tionila para sustituir el alcohol por el cloro. En general se procede a realizar una halogenación.
C: (j'x
N
I
o, s'Q
I'Vd 1
~R'
d3) formación de triazoles sustituidc~
d3a) Tratar IVb con un equivalente (la misma cantidad de moles) de Tsel
calentando a reflujo durante 24 horas. para obtener IVe.
d3b} Tratar IVe con azida sódica para obtener IVf.
d3c) Realizar la quimica click a IVf, para obtener los compuestos IVg.
~:) %'~OR
,
02S~
(, ~
IVg R'
A continuación, se describen las etapas del procedimiento de la invención de fanna más detallada:
Etapa a La 'onnación de los compuestos intermedios I se lleva a cabo por reacción entre el o
aminofenol (Mulzer, J. J. Org. Chem., 2000, 65, 6540-6546) Y cloruros de sulfonilo de acuerdo con procedimientos descritos previamente (Díaz-Gavilán, M.; Rodrlguez
Serrano, F.; Gómez-Vidal, J.A.; Marchal,.I.A.; Aránega, A.; Gallo, M.A.; Espinosa. A.; Campos, J.M. Tetrahedron 2004, 60, 1154"7-11557).
Los intennedios I son fenilsulfonamidas sustituidas en las que R' = H, 4-0H, 3, 5-diOH,
4-Me, 4-0Me, 3, 4-diOMe, 2-CI, 3-CI, 4-CI, 2-Br, 3-Br, 4-Br, 2-1, 3-1, 4-1, 3, 5-diCI, 3, 5diBr, 3, 5-dil, 3, 5-diMe.
Etapa b
Los compuestos IVa se sintetizan a partir de los correspondientes intermedios I por 20 reacción de doble intercambio de los átomos de bromo del 2, 3-dibromopropionato de etilo racémico, utilizando como base carbonato potásico en acetona y calentando a reflujo. Los compuestos IVa son fenilsulfonamidas sustituidas (R' = H, 4-0H, 3, 5-diOH, 4-Me. 4-0Me, 3, 4-diOMe, 2-CI. 3-CI, 4-CI. 2-Br. 3-Br, 4-Br, 2-1, 3-1. 4-1, 3, 5-diCI, 3.5
diBr, 3, 5-dil, 3, 5-diMe) , en las que el átomo de nitrógeno forma parte de un resto de 3, 4-dihidro-2H-1 , 4-benzoxaZina-2-carboxil"to de etilo.
Etapa e Los compuestos IVa se reducen, preferentemente con borohidruro de litio. en THF a temperatura ambienle para dar los interm.ldios compuestos IVb. Los compuestos IVb
son fenilsulfonamidas sustituidas (R' ~ H, 4~H, 3, 4-diOH, 4-Me, 4-0Me, 3, 4-diOMe, 2
CI, 3-CI, 4-CI. 2-Br. 3-Br, 4-Br, 2-1, 3-1, 4-1,. 3, 5-diCI, 3, 5-diBr, 3, 5-dil, 3, 5-diMe). en las que el átomo de nitrógeno forma parte de un resto de 3, 4-dihidro-2H-1, 4-benzoxazina2-hidroximetilo.
Etapa d1 íMitsunobul Los compuestos IVb y una purina mono-o di-sustituida por halógenos en las posiciones 2 y/o 6 que representan cada uno, independientemente entre si, un átomo seleccionado del grupo formado por el, -Br, e -1, se hacen reaccionar en presencia de azodicarboxilato de dialquilo y de trifenilfosfina en un disolvente orgánico para obtener compuestos de las familias IVc o IVe'.
Etapa d2 íhalogenaciónl Los compuestos lVb se hacen reaccionar con cloruro de tionilo (para obtener el derivado con cloro 6) o con tetrabromuro de carbono (para obtener el derivado con bromo) y a partir del derivado cloro, compuesto 6, por la reacción de Finkelstein, se sustituye el cloro por el yodo para obtener :Ia familia de compuestos IVd.
Etapa d3 (formación de triazoles sustiluido~ d3a) Protección de los compuestos IVb cc'" grupo saliente (IVe) , d3b) formación de la
azida (1Vf) y d3c) química click para formar el anillo de triazol sustituido. Finalmente obtenemos la familia de compuestos IVg.
MODOS DE REALIZACiÓN
Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención:
Materiales y Métodos Abreviaturas y Acrónimos (obtenido de la Gula para Autores; Abreviaturas y
Acrónimos J. Org. Chem. 2008, 78, lOA) : Ac: acetilo Bu: butilo ca!.: catalitico 13CRMN resonancia magnética nuclear de carbono d: doblete dd: doble doblete ddd: doble doble doblete
DMSO: dimetilsu~óxido DIAD: diisopropil azo dicarboxilato dq: doble cuartete dt: doblete de tripletes Et: etilo g: gramo Hz: hertzio
J: constante de acoplamiento medida en Hernios HRMS: espectroscopia de masas de alt:a resolución Ts: p-toluensulfonilo (Tosilo) mM: milimolar M+: pico molecular Me: metilo mg: miligramo ml: mililitro mmol: milimol mIz: relación masa/carga Pf: punto de fusión ppm: partes por millón
s: singlete t: triplete t.a.: temperatura ambiente THF: tetrahidrofurano
los reactivos y disolventes utilizados provienen de las casas comerciales Aldrich, Acros, SDS o Scharlau, y fueron purificados por procedimientos habituales (ver Armarego, W. L.; Pernn, D. D. Purification of Laborator y Chemicals; ButterworthHeinemann: Oxford, 1996.) cuando fue nec:esario.
La purificación de los productos de reacción se realizó por cromatografla en columna bajo presión (cromatografía flash) , utilizando como fase estacionaria gel de sílice 60 Merck (con un tamaño de partícula 230-400 mesh) y como fase móvil los disolventes que se indicarán en cada caso. El eluyente empleado se indica en cada caso y las proporciones de la mezcla de disolventes utilizadas son siempre volumen/volumen.
El seguimiento de las reacciones se realizó por cromatografía en placa fina (TLC) , empleando cromatofolios de gel de siliCla 60 F254 comercializados por Merck. El revelado de las placas se realizó empleando un visor de luz UV (A = 254 nm).
Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C (completamente desacoplados) se realizaron a temperatura ambiente en el disolvente indicado en cada caso (CDCI" y DMSO-d, ) empleando los "iguientes aparatos: Varia n INOVA-TM (300, 400, 500, 600 MHz). Los valores de los desplazamientos quimicos se expresan en partes por millón (~, ppm) , utilizando corno referencia interna la señal residual del disolvente: CDCI" 7.26 ppm eH RMN) y 77.0 ppm (13C RMN) ; DMSO-d" 2.50 ppm eH RMN) y41.1 ppme'CRMN). Los espectros 1H-RMN se describen indicando el número de protones y la multiplicidad aparente de cada señal. Las constantes de acoplamiento (J) son las aparentes y se expresan en Hz. Los puntos de fusión (Pf) se midieron en capilares abiertos en un aparato marca Electrothermal. Los datos obtenidos de los espectros de masa están expresados en unidades de masa (miz). El pico molecular se especifica como M+. Las sintesis en pequeña escala asistidas por microondas se han llevado a cabo en instrumento Initiator 2.0 de modo sencillo, produciendo una irradiación controlada a 2.450 GHz (Biotage AB, Uppsala). El tiEtmpo de reacción se refiere a cuando se alcanza la temperatura esperada, y no S81 refiere a todo el tiempo de irradiación. la temperatura se midió por medio de un 5¡enSOr de IR colocado fuera del medio de reacción. Las condiciones anhidras se lIeVC:lron a cabo bajo atmósfera inerte de argón.
Ejemplos del procedimiento de slntesis 1) Reactivos de partida conocidos 2- (Etoxicarbonil).3, 4-dihldro-2H.1, 4-benl<oxazina Obtenido de acuerdo con un procedimionto conocido (Augstein, J.; Monro, A.M.; Hessay, G. W. G.B. Patent 1.057.568, 196'1; Cham. Abstr.1967, 66, 95058z).
(Y0 y COOEt
~N)
H
2. (Etoxicarbonil) -4-meti~3, 4-dihidro-2H-·I, 4-benzoxazina Obtenido de acuerdo con un procedimi43nto conocido (Augstein, J.; Monro. A.M.; Hessey, G, W. G.B. Patent 1.057.568, 196'7; Chem. Abslr.1967, 66, 95058z).
COOEt I
Me 2- (Hidroximetil) -4-metil-3, 4-dihidro-2H-1, 4-benzoxazina Obtenido de acuerdo con un procedimiento conocido (Zhou, D.; Harrison, B.L.; Shah, U.; Andree, T.H.; Homby, G.A; Scemi, R.; Schechter, L.E.; Smith, D.L.; Sullivan, K.M.; Mewshaw, R.E. Bioorg.& Med. Chem. LeN. 2006, 16, 1338-1341).
"" O' ('OH
Ó N)
CC
I
Me 10 11) Preparación de sustancias de partida N-[2- (Hidroxifenil) -4-metilbencensulfona.mida (Intennedio 1) A una disolución de 2-aminofenol (8 g, 73.3 mmol) en CH2Ch anhidro (250 mL) , se le
añade piridina (7.09 mL, 88 mmol) y cloruro de tosilo (15.4 9, 80.6 mmol). La mezcla de reacción se calienta a reflujo durante 24 horas. Después de enfriada la mezcla de reacción se lava con H20 (250 mL). Tras s, ecado de la fase orgánica (Na2S04 anhidro) y filtración, se concentra al rota vapor y se precipita el intennedio I con hexano. Sólido blanco (19.19, 99 %). PI = 120-121 ·C;'H RMN (400 MHz, DMSO-d.) O9.46 (m, 2H) ,
7.80 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 7.47 (d, J = 8.1 H", 2H) , 7.31 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H) , 7.09 (t, J = 8.67, 7.98 Hz, lH) , 6.88 (m, 2H) , 3.52 (s, lH). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d, ) 6 150.06, 142.72, 137.74, 129.27, 126.73, 126.Q1, 124.27, 124.19, 118.90, 115.51,
20.92. HRMS TOF MSES' (miz) : Calculado para C13H13NNaO, S (M + Na) ': 286.0514,
encontrado: 286.0515. Análisis Elemental: C13H13N03S Teórico (%) : C 59.30; H 4.98, 25 N 5.32; S 12.18; Obtenido (%) : e 59.40, H 4.88, N 5.00; S 12.32.
EJEMPLOS DE SiNTESIS DE COMPUESTOS DE LA INVENCiÓN Los Siguientes ejemplos se presentan com, o ilustración de la presente invención:
4-Tosil-3, 4-dihidro-2H-1, 4-benzoxazina-¡~-carboxllato de etilo (compuesto 4)
A una mezcla del intenmedio I con clonuro de tosilo (6 g, 22.79 mmol) y K, CO, (7.66 g,
55.47 mmol) se le añade acetona (70 rnl) en primer lugar y posterionmente 2, 3
dibromopropionato de etilo (5.92 Q, 22.79 rnmol). La mezcla de reacción se mantiene a reflujo durante 8 horas. Tras enfriamiento de la mezcla se filtra, se concentra a rotavapor el disolvente quedando un crudo que se suspende en H20, se filtra y se obtiene el compuesto 4 en forma de sólido blanco (8.2 g, 99%). PI = 147-148 oC; 'H NMR (600 MHz, COC!, ) O7.83--7.78 (m, 1 H) , 7.55 (d, J = 8.3 Hz, 2H) , 7.24 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 7.12-7.06 (m, 1H) , 6.99-6.93 (m, 2H) , 4.51-4.48 (m, 1H) , 4.25 (q, J = 7.1 Hz, 2H) , 3.95 (dd, J= 9.5, 2.8 Hz, 1H) , 3.53-3.46 (m, 1H) , 2.39 (s, 3H). 13C NMR (150 MHz, COCI, ) O 167.50, 145.88, 144.73, 135.41;, 130.18, 127.38, 126.57, 124.45, 123.50, 121.69, 117.87, 70.37, 62.16, 45.82, 21.70, 14.25. HRMS TOF MSES' (mIz) : Calculado para C" H19NNaO, S (M + Na) ': 384.0882, encontrado: 384.0683. Análisis Elemental: C18H19NO, S Teórico (%) : C 59.82; H 5.30, N 3.88; S 8.87; Obtenido (%) : C 59.85, H 5.28, N 3.96; S 8.68.
2. Hldroxlmelll-2-tosll-3, 4-dihidro-2H-1, 4-·benzoxazina (compueato 5) A una disolución del compuesto 4 (8.23 g, 22.77 mmol) en THF (90 ml) , se le añade LiBH, (0.60 g, 27.33 mmol) a temperatura ambiente y gota a gota. La reacción es instantánea. Se elimina al rotavapor el disolvente, se añade H20 obteniéndose el
compuesto 5 en Ionma de precipitado blanco que se filtra y se seca. PI.: 133-134·C. ' H NMR (500 MHz, COCI, ) O7.84-7.79 (m, 1H) , 7.53 (d, J =8.3 Hz, 2H) , 7.24 (d, J =8.5 Hz, 2H) , 7.07 (dd, J = 11.3, 4.1 Hz, 1H) , 15.94 (t, J = 7.3 Hz, 1H) , 6.84 (d, J = 7.4 Hz, 1H) , 4.27 (dd, J = 14.4, 2.3 Hz, 1H) , 3.76 (dd, J = 12.0, 4.1 Hz, 1H) , 3.68 (dd, J = 12.0,
4.6 Hz, 1H) , 3.53 (m, 1H) , 3.38 (dd, J = 14.3, 10.0 Hz, 1H) , 2.39 (s, 3H). 13C NMR (125 MHz, COC!, ) O 146.87, 144.47, 135.84, 130.11, 127.33, 126.38, 124.59, 123.76, 121.26, 117.53, 72.11, 62.80, 45.54, 29.86, 21.74, 1.17. HRMS (mIz) : Calculado para C18H"NNaO, S TOF MSES' (M + Na) ': 342.0776, encontrado: 342.0773. Análisis Elemental: C"H"NO, S TeÓfico (%) : C 60.17; H 5.37, N 4.39; S 10.04; Obtenido (%) : C 59.99, H 5.29, N 4.48; S 9.91.
2. (Clorometil) -4-toall-3, 4-dihidro-2H-1, 4-benzoxazlna (compu.ato 6) A una disolución de 2- (hidroximetil) -4-metil-3, 4-dihidro-2H-1 , 4-benzoxazina, compuesto 5 (0.26 g, 0.081mmol) en CH, CI, anhidro (2.4 ml) , se le añade clonuro de tionilo (0.071 ml, 0.9769 mmol). Se deja agitar media hora a temperatura ambiente. Posterionmente se añade piridina anhidr¡, (0.072 ml, 0.9769 mmol). La mezcla de reacción se irradia en microondas a 100 oC durante 90 minoEl disolvente se evapora a vacio y el crudo de reacción se purific;~ por cromatograffa flash utilizando como eluyenle solo dicloromelano. Sólido blan!>" (0.27 9, 99 %) ; pI = 120-121 'c. 'H NMR (500 MHz, CDCI, ) 6 7.85 (dd, J =8.3, 1.5 Hz, 1 H) , 7.55-7.51 (m, 2H) , 7.25 (d, J =8.0 Hz, 2H) , 7.08 (ddd, J =8.3, 7.4, 1.6 Hz, 11~) , 6.96 (ddd, J =8, 6, 7.4, 1.5 Hz, lH) , 6.83 (dd, J = 8.2, 1.5 Hz, lH) , 4.45 (dd, J = 14.4, 2.4 Hz, lH) , 3.60 (dd, J = 11.2, 4.1 Hz, lH) , 3.57-3.50 (m, lH) , 3.46 (dd, J= 11.2, 6.7 Hz, lH) , 3.28 (dd, J= 14.4, 9.6 Hz, lH) ,
2.40 (s, 3H).13C NMR (125 MHz, CDCI, ) 6 146.56, 144.61 , 135.47, 130.16, 127.42, 126.51, 124.74, 123.61, 121.47, 117.51, 70.91, 46.47, 42.97, 29.65, 21.75. HRMS (miz) : Calculado para C16H16CINNaO, S TOF MSES' (M + Na) ': 360.0437, encontrado: 360.0438. Análisis Elemental: C16H16CINO, S Teórioo (%) : C 56.89; H 4.77, N 4.15; S 9.49; Obtenido (%) : C 56.77, H 4.53, N 4.21; S 9.54.
4. Melilbencensulfonato de 4-tosin-3, 4-dihldro-2H-l, 4-benzoxazin-2-il) metilo (<>empuesto 7) A una disolución del oompuesto 5 (2 9. 6.26 mmol) en CH, CI, anhidro (20 ml) se le añade sucesivamente piridina anhidra (0.6 g, 7.51 mmol) y cloruro de tosilo (1.2 g,
6.26 mmol). Tras calentar la disolución a reflujo durante 24 horas se elimina el disolvente al rotavapor tras enfriamiento, 191 crudo se suspende en H20 , se filtra y se pUrifica mediante cromatogralia flash en gradiente (EtOAcJhexano: 218, 317, 416 Y1/1). Tras eliminación de los disolventes, obtenomos el oompuesto 7 (2.71 9, 56.8%) , oomo un sólido blanco; pI: 84-85 oC. 'H NMR (300 MHz, CDCI, ) 6 7.63 (d, J =8.2 Hz, 3H) ,
7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 7.22 (d, J = 8.1 Hz, 2H) , 7.08 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 6.90 (dt, J = 8.3, 4.6 Hz, lH) , 6.78 (t, J = 7.2 Hz, lH) , 6.56 (dd, J = 8.1, 0.9 Hz, lH) , 4.14 (dd, J = 14.4, 2.3 Hz, lH) , 3.94 (dq, J =11.0, 4.5 Hz, 2H) , 3.43 (m, lH) , 3.07 (dd, J= 14.4, 10.1 Hz, 1 H) , 2.32 (s, 3H) , 2.23 (s, 3H). 13C NMR (75 MHz, CDCI, ) 6 146.05, 145.25,
144.47, 135.10, 132.16, 129.97, 129.91, 127.85, 127.04, 126.22, 124.34, 123.15,
121.13, 117.32, 68.92, 68.25, 44.98, 3O.74.HRMS (miz) : Calculado para G"H"NO, S, TOF MS ES' (M + H) ': 474.1040, enoontrado: 474.1040 Análisis Elemental: G"H" NO, S, Teórioo ('1.) : e 58.33; H 4.90, N 2.96; S 13.54; Obtenido (%) : e 58.19, H 4.80, N 3.08; S 13.87.
2. (Azidometil) -4-tosi~3, 4-dihidro-2H-l, 4-benzoxazin-2-il) metilo (compuesto 14) A una disolución del oompuesto 7 (3 g. 6.3mmol) en DMF (29 ml) se le añade azida sódica (0.6 g, 9.5 mmol). Tras calentar la r43acción a reflujo a 150°C durante 5 horas se deja enfriar y se elimina el disolvente al rntavapor. El crudo precipita con metanol, se filtra oon bushner y kitasato y se obtiene el oompuesto 14 (1.57 9, 72%) , oomo un sólido amarillento; pf: 136-140·C. 'H NMH (400 MHz, DMSO-d, ) 'H NMR (400 MHz, dmso) ~ 7.57 (d, J =8.3 Hz, 2H) , 7.38 (d, J =8.2 Hz, 2H) , 7.10 (m, 2H) , 6.97 (m, lH) ,
6.84 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, lH) , 4.33 (dd, J = 14.4, 2.5 Hz, lH) , 3.63 (dd, J = 12.7, 3.3 Hz. lH) , 3.55 (ddd, J = 9.2, 5.7, 2.7 Hz. lHI) , 3.49 (dd, J = 12.7, 5.6 Hz. lH) , 3.33 (dd, J = 12.7, 5.6 Hz, lH) , 2.38 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d, ) ~ 146.03, 144.57, 137.63, 134.69, 130.17, 127.02, 125.49, 123.68, 121.00, 117.28, 70.87, 50.88, 45.10,
20.99. HRMS (miz) : Calculado para C16H16N.O, NaS TOF MS ES' (M + Na) ': 367.0876, encontrado: 367.0841. Análisi.s Elemental: C16H16N.O, S Teórico (%) : C 55.80, H 4.68, N 16.27, S 9.31. Obtenido (%) : C 55.90, H 4.71 , N 15.99, S 9.27.
3. (1-«4-T osit-3, 4-dlhidro-2H-l, 4-benzoxalzin-2-it) mo1ito) -1 H-l, 2, 3-triazot-4-it) fenol (compuesto 15) A una disolución del compuesto 14 (0.2 g. 0.58mmol) en DMF (5 mL) se le añade 34hidroxifenilacetileno al 95% (0.1 g, 0.75 mmol) , bromuro de cobre (0.13 g, 0.58 mmol) y propilamina (0.03 mL, 0.35 mmol). S.. inradia la reacción a 140'C, durante 30
minutos. Se elimina la OMF y el crudo de reacción se pUrifica por cromatografía flash
utilizando como eluyente una mezcla de disolventes en gradiente (EtOAclhexano: 2/8, 317, 4/6 Y 1/1). Se obtiene el compuesto 115 (1.57 g, 72%) , como un sólido amarillento; pI: 153-160·C. 'H NMR (400 MHz, DMSO-d, ) ~ 9.56 (s, lH) , 8.45 (s, lH) , 7.68 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, lH) , 7.52 (d, J = 8.3 Hz, 2H) , 7.29 (m, 5H) , 7.09 (m, lH) , 6.97 (m, lH) ,
6.87 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, lH) , 6.75 (dt, J = 6.4, 2.5 Hz, lH) , 4.78 (dd, J = 14.4, 4.4 Hz, lH) , 4.65 (dd, J = 14.5, 6.2 Hz, lH) , 4.46 (dd, J = 14.5, 2.4 Hz, lH) , 3.74 (dd, J = 6.3,
3.4 Hz. lH) , 3.32 (dd, J =8.3, 1.5 Hz, 4H) , 2.33 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d, , ) ~ 157.77, 146.50, 145.77, 144.60, 134.4~;, 131.69, 130.17, 129.97, 126.96, 126.21 , 123.58, 123.18, 122.31, 121.17, 117.46, 116.07, 115.01, 111.89, 70.42, 50.41, 45.35,
20.98. HRMS (mIz) : Calculado para G.!4H23N40 4S TOF MS ES" (M + Hf: 463.1440.
encontrado: 463.1453. Análisis Elemental: C" H"N.O.S Teórico (%) : C 62.32, H 4.79, N 12.11, S 6.93. Obtenido (%) : C 62.38, H 4.70, N 12.30, S 6.78.
Mo1ºdología general de síntesis de los c:ompuestos 8-13 Bajo atmósfera de argón se prepara una mezcla de PPh, (2.2 equiv.) , compuesto 5 (1 equiv.) y la purina correspondiente (1 equiv.) en THF anhidro (5 mL) que se enfría a oC en un bai'lo de acetona y CO2 anb:ls de adicionar el OIAD (2.2 equiv.) gota a gota. Se eleva la temperatura de la meZlcla de reacción lentamente hasta 5 oC por adición de acetona al baño y se irradia on microondas a 140 oC durante 10min. B disolvente se evapora a vacío y el crudo de reacción se purifica por cromatografía flash utilizando como eluyente una mezcla de disolventes EtOAc:hexano (1:1) (Tabla 1).
2. [ (6-Cloro-9H-purtn-9-il) metll) -4-metll-3,.4-dlhldro-2H-l, 4-benzoxazina (compuesto 8)
Sólido amarillento (60%). PI: 143-144 · C. 'H NMR (600 MHz, CDCI, ) 6 6.89 (td, J = 7.7, 1.5 Hz, lH) , 6.79 (m, lH) , 6.71 (dd, J =12.0, 4.6 Hz, 2H) , 4.62 (dd, J =14.6, 3.6 Hz, 1 H) , 4.53 (dd, J =14.6, 7.6 Hz, 1 H) , 3.37 (dd, J =11.7, 2.7 Hz, 1 H) , 3.01 (dd, J = 11.6, 6.0 Hz, IH). "c NMR (150 MHz, CDCI, ) 151.96, 151.18, 146.15, 142.29, 135.50, 131.46, 122.22, 119.03, 116.28, 112.73, 77.19, 76.98, 76.77, 71.19, 50.40, 45.75,
38.62. HRMS (miz) : Calculado para C15H15CIN, O TOF MS ES· (M + H) ": 316.0965, enconlrado: 316.0963. Anélisis Elemental: C15H,.CIN, O Te6rico (%) : C 57.06, H 4.47, N 22.18. Obtenido (%) : C 57.23, H 4.71 , N 22.00.
2. [ (6-Bromo-9H-purin-9-II) metil) -4-metll-ll, 4-dihldro-2H-l, 4-benzoxazlna (compuesto 9)
Sólido amarillento (70%). PI: 137-138 ·C.'H NMR (600 MHz, CDCI, ) 6 8.73 (s, lH) ,
8.23 (s, 1 H) , 6.92 (td, J = 7.9, 1.5 Hz, 1 H) , 6.81 (dd, J = 8.4, 1.4 Hz, lH) , 6.74 (dd, J = 11.6, 4.5 Hz, 2H) , 4.70 (ddd, J = 9.7, 6.2, :l.2 Hz, lH) , 4.63 (dd, J = 14.6, 3.6 Hz, lH) ,
4.54 (dd, J = 14.6, 7.6 Hz, lH) , 3.40 (dd, J = 11.7, 2.7 Hz, lH) , 3.03 (dd, J = 11.7, 6.0 Hz, lH) , 2.90 (s, 3H). "c NMR (150 MHz, CDCI, ) 6 151.93, 150.72, 146.04, 143.28, 142.32, 134.50, 134.09, 122.25, 119.11 , 116.32, 112.80, 71.17, 50.42, 45.77, 38.68. HRMS (miz) : Calculado para C15H15BrN, O TOF MS ES· (M + Hf: 360.0454, encontrado: 360.0456. Anélisis Elemental: C15H"BrN, O Teórico (%) : C 50.02, H 3.92, N 19.44. Obtenido (%) : C 49.89, H 3.80, N 19.29.
2. [ (2, 6-Dlcloro-9H-purtn-9-II) metll) -4-motiil-3, 4-dlhldro-2H-l, 4-benzoxazlna (compuesto 10)
Sólido amarillento (85%). PI: 123-124 ·C. 'H NMR (400 MHz, CDCI, ) 6 8.14 (s, lH) ,
6.83 (m, lH) , 6.71 (dd, J =8.2, 1.6 Hz, lH) , 6.64 (m, 2H) , 4.61 (ddd, J =8.6, 5.9, 2.9 Hz, lH) , 4.55 (dd, J =14.5, 3.3 Hz, lH) , 4.43 (dd, J =14.5, 8.0 Hz, lH) , 3.35 (dd, J = 11.7, 2.8 Hz, lH) , 3.00 (dd, J = 11.7, 5.8 Hz, lH) , 2.84 (s, 2H). "c NMR (100 MHz, CDCI, ) 6 153.26, 152.83, 151.63, 146.9S, 142.05, 135.45, 130.54, 122.22, 118.91 , 116.17, 112.69, 71.01, 50.23, 45, 68, 38.57.. HRMS (miz) : calculado para C15H,.CI, N, O TOF MS ES' (M + Hf: 350.0570, encontrado: 350.0573. Anélisis Elemental: C15H13CI, N, O Teórico (%) : C 51.44, H 3.74, N 20.00. Obtenido (%) : C 51.58, H 3.81, N
20.30.
2. [ (6-Cloro-9H-purin-9-il) metiQ-4-tosiI-3, 'l-dihidro-2H-1, 4-benzoxazina (compuesto 11) Sólido blanco (45%). PI: 189-190"C.'H NMlR (400 MHz, CDCI, ) O8.77 (s, 1H) , 8.14 (s, 1H) , 7.75 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 7.50 (d, J = 0.2 Hz, 2H) , 7.19 (d, J = 8.1 Hz, 2H) , 7.07 (1, J =7.7 Hz, 1H) , 6.95 (1, J =7.7 Hz, 1H) , 6.llO (d, J =8.1 Hz, 1H) , 4.52 (dd, J =14.7, 3.6 Hz, 1H) , 4.37 (m, 2H) , 3.64 (m, 1H) , 3.15 (dd, J= 14.3, 9.6 Hz, 1H) , 2.34 (s, 3H). 13C
NMR (100 MHz, CDCI, ) O 152.28, 151.9:7, 151.53, 145.88, 145.72, 144.74, 135.51 , 131.56, 130.23, 127.28, 126.65, 124.49, 123.54, 121.97, 117.56, 69.77, 45.96, 45.52,
21.71. HRMS (miz) : Calculado para C"H, , , CIN, O, S TOF MS ES· (M + Hr: 456.0892, encontrado: 456.0890. Análisis Elemenlal: C"H" CIN, O, S Teórico (%) : C 55.32, H 3.98, N 15.36, S 7.03. Obtenido (%) : C 55.49, H 4.08, N 15.51, S 6.89.
2. [ (&-Bromo-9H-purin-9-il) metil) -4-t08i1-3, 4-dihldro-2H-1, 4-benzoxazina (compuesto 12) Sólido blanco (39%). PI: 168-169"C.'H NMlR (400 MHz, CDCI, ) O8.72 (s, 1H) , 8.15 (s, lH) , 7.75 (d, J = 8.1 Hz, lH) , 7.50 (d, J = 0.2 Hz, 2H) , 7.19 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.07 (1,
J =7.0 Hz, 1 H) , 6.95 (1, J =7.8 Hz, 1 H) , 6.1l0 (d, J =8.2 Hz, 1 H) , 4.51 (dd, J =14.7, 3.5 Hz, 1H) , 4.36 (m, 2H) , 3.83 (m, 1H) , 3.15 (dd, J= 14.4, 9.6 Hz, 1H) , 2.34 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCI, ) O 152.20, 150.7:1, 145.75, 145.71, 144.74, 143.60, 135.50, 134.16, 130.23, 127.27, 126.65, 124.49, 123.53, 121.97, 117.55, 69.75, 45.95, 45.53,
21.71. HRMS (miz) : Calculado para C15H15BrN, O TOF MS ES· (M + Hr: 500.0386,
encontrado: 500.0387. Análisis Elemenlal: C21 H" BrN, O, S Teórico (%) : C 50.41, H 3.63, N 14.00, S 6.41. Obtenido (%) : C 50.40, H 3.44, N 13.89, S 6.29.
2. [ (2, &-Dicloro-9H-purln-9-il) metll]-4-tosil-3, 4-dihidro-2H-1, 4-benzoxazina (13) Sólido blanco (62.8%). PI: 196-197 · C. 'H NMR (500 MHz, CDCI, ) O8.12 (s, 1H) , 7.77
(dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1 H) , 7.51 (d, J =8.3 ~Iz, 2H) , 7.24 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 7.09 -7.04 (m, lH) , 6.99-6.93 (m, lH) , 6.78 (dd, J = 13.2, 1.4 Hz, lH) , 4.51 (dd, J = 14.7, 3.3 Hz, 1 H) , 4.36 (dd, J = 14.4, 2.5 Hz, 1H) , 4.29 (dd, J =14.7, 7.4 Hz, 1 H) , 3.78 (ddl, J =9.9, 7.3, 2.9 Hz, lH) , 3.20 (dd, J = 14.4, 9.5 Hz, 1H) , 2.34 (s, 3H). 13C NMR (125 MHz, CDCI, ) O 153.31, 153.18, 152.22, 146.60, 145.49, 144.87, 135.29, 130.70, 130.29,
127.23, 126.69, 124.51 , 123.46, 122.04, 117.52, 69.41, 45.83, 45.70, 21.70. HRMS (miz) : Calculado para C21 H18CI, N, O, S TOF MS ES· (M + Hr: 490.0502, encontrado:
490.0500. Análisis Elemental: C21H17CI, N, O, S Teórico (%) : C 51.44, H 3.49, N 14.28, S 6.54. Obtenido (%) : C 51.56, H 3.49, N 14.65, S 6.20.
Conservación de los fármacos Los compuestos se disuelven en DMSO yse conselVan a -20 oC. la solución stock de diluye en el medio correspondiente para ol:>tener las concentraciones que se requieren en cada experimento, siendo la concentración final siempre menor al 0.1 % v/v de DMSO. Como controles se han utilizado cultivos paralelos de las lineas celulares MCF-7, MDA-MB 468, SKBR-3, HCT-116l1A-375 en el medio.
Lineas celulares utilizadas Se han utilizado cultivos de las siguientes lineas celulares MCF-7, MOA-MB 468, SKBR-3, HCT-116, HT-29, RKO, A-375, NCI-H460 y A-549.
Ensayos de citotoxicidad
las células se siembran en placas de 24 pocillos (1.000 células/pocillo) en su respectivo medio. Después de permitir la ¡adhesión celular durante la noche, se tratan durante 3 o 6 días con concentraciones ctrecientes de los compuestos 5-14. El medio se cambia a los 3 días, en el caso de experimentos a 6 días, adicionándole las respectivas concentraciones de los compuestos. Se utilizan como controles cultivos paralelos de las líneas celulares sin adiccilón de fármacos y con OMSO. Tras los 3 o 6 días de tratamiento, se lleva a cabo la tindón con sulforrodamina B (SRB) para determinar la tasa de supelVivencia. En primer lugar, se fijan las células con ácido tridoroacélico al 10% durante 20 min a 4 "C, y tras lavar las placas 3 veces con agua bidestilada, se dejan secar a temperatura ambiente. A continuación se agrega 0.4% de SRB en 1% de ácido acético y tras incubar 20 minutos a temperatura ambiente, se elimina la SRB y se lava tres veces con á (~do acético al 1 %. Finalmente, se solubiliza la SRB con una solución 10 mM Tris-base (pH 10.5) medianle agilación suave durante diez minutos. Posteriormente se transfimen 100 ~L a placas de 96 pocillos por triplicado y se analizan en un colorfmetro Multiscan Titertek a 492 nm. De esta manera se obtuvieron los datos que se utilizaron para realizar las gráficas de Densidad Optica (0.0.) (eje y de la gn:lfica) y concenlración (eje x) del fármaco. Mediante regresión mínimo cuadrática se calculó la ecuación de la curva y de aqul, la concentración del fármaco correspondiento a una 0.0. (eje y) =50.
Tratamiento de las líneas celulares con los fánnacos La Tabla 2 resume los resultados obtenidos en los ensayos realizados para experimentos con 6 días de incubación con cada compuesto_
Comp. A-375 HCT-116 MCF-7
4 10.9 t 0.012 13.6 tO.008 >20
5 1.34 t 0.012 7.65 t 0.005 >20
6 0.83±0.003 0.47 ± 0.006 1.32 ± 0.018
7 4.04 ±0.003 6.88 ± 0.004 >20
8 4.97 ± 0.004 6.88 ± 0.004 >20
9 2.96 ± 0.003 4.18 ± 0.004 >20
10 0.95 ± 0.010 1.05 ± 0.008 3.68 ± 0.016
11 0.63 ± 0.013 1.21 ± 0.024 4.78 ± 0.013
12 0.73 ± 0.037 1.30 t 0.040 2.61 ± 0.024
13 0.41 ± 0.022 0.37 ± 0.006 1.15 ± 0.017
Tabla 2. Concentraciones inhibitorias cinGuenta (CI50 ~M) de las 3.4-dihidro-2H-l.4
benzoxazinas sustituidas en posición 2 (4-13) frente a las líneas celulares A-375, HCT
116 Y MCF-7.
La Tabla 3 resume los resultados obtenidos en los ensayos realizados para 10 experimentos con 3 días de incubación con cada compuesto:
Comp. HT-29 HCT-116 RKO NCI-H460
6 2, 54 +/-0, 6 3.70+/-0, 9 3, 62 +/-1, 2 2.96 +/-1, 4
11 6, 13 +/-1, 3 6, 78 +/-1, 8 6, 67 +/-2, 6 7.21 +/-1 , 5
12 5, 38 +/-1, 1 5, 8 +/-1, 5 43, 18 +/-8, 3 8 , 53 +/-1, 6
13 5.52 +/-0.9 4, 01 +1-3 4.91 +/-1.2 5, 95 +/-1, 7
15 5, 52 +/-1, 2 9, 64 +/-1 , 3 3, 6 +/-1, 1 6, 33 +/-2, 6
Tabla 3. Concentraciones inhibitorias cin<, uenta (CI", f1M) de las 3.4-dihidro-2H-l, 4
benzoxazinas sustituidas en posición 2 (4--13) frente a las lineas celulares NCI-H460,
HCT-116 y HT-29 tratadas durante 3 dlas.
Las concentraciones inhibitorias cincuental (CI50 ~M) a 3 dlas fueron mayores que a los 6 dlas como corresponde pero equivalentes a las de fármacos utilizados actualmente en la clínica.
Además, la acción de 13 ha sido estudiadél en las líneas celulares SKBR-3 y MOA-MB
468, las cuales sobre-expresan los r.<:aptores de superficie HER-2 y EGFR
respectivamente, obteniendo unos valores de IC50 de 1.17 +/-O.OO5IJM Y 1.43 +/-0.006
~M.
Aislamiento de las CSCs El aislamiento de las CSCs se lIev6 a cabo mediante la detección de la actividad aldehldo deshidrogenasa (ALDH) por citornetrla de flujo, en la linea oolular de mama MOA-MB 468 (EGFR positiva). Se ha observado que un incremento de la actividad aldehído deshidrogenasa en células tumorales y oormales de mama está relacionada con una alta capacidad de auto-regeneración y de generación de tumores, además de ser capaoos de regenerar la heterogenicidad oolular del tumor (Ginestier C.;Hur MH.; Charafe-Jauffret E.; Monville F.; Dutcher J.; Brown M.; Jacquemier J.; Viens P.; Kleer CG.; Liu S.; Schott A.; Hayes D.;Bimbaulll D.; Wicha MS.;Dontu G. Celf Slem Celf 2007, 1, 555-567).
Para tal fin, se us6 el k~ Aldefluor (Stemeell Technologies, Vancouver, Canada) que mediante la metabolización de un suslrato, BODIPY-aminoacetaldehido (BAAA)
gracias a la actividad de la enzima ALOH, da lugar a un producto fluorescente, el 800lPY-aminoacetato (BAA). Este último ~~e acumula en el interior de la célula lo que pennite su detección y posterior separación mediante citometria de flujo. Estas células ALDW fueron separadas mediante un , eit6metra de flujo FACS Aria 111, siendo seleccionadas las células que presentaban una mayor fluorescencia para el fluorocromo FITC. El dietilbenzaldehido (OEAB) es utilizado como control negativo, al ser un potente inhibidor de la actividad aldlehldo deshidrogenasa. Tras la separación,
las células fueron sembradas en placas d, e cu~ivo de baja adherencia (Coming lne.,
Corning. NY. EEUU) y cultivadas en medio de esferas, para ser sometidas posterionnente a diferentes ensayos.
Para el aislamiento de las CSCs se siguió Etl s;guiente protocolo: Las células fueron despegadas mediante la utilización de tripsina-EOTA y recogidas en tubos de citometria con una densidad de 106 células/mL. Posteriormente fueron resuspendidas en Aldefluor Assay Buffer,. utilizándose un tubo como prueba y otro como control. Al tubo de prueba se le añiadió 1 mi de la suspensión celular mientras que al tubo control se le añadió 5~L de N, N-dietilaminobenzaldehido OEAB previo al inicio del ensayo. A continuación, se ariadió 5 IJL del sustrato boro-dipirometeno (BOOIPY) -aminoaoeta-aldehido (BAAA) , al tubo de prueba, se re-suspendió bien con la pipeta y se transfirieron 500 J.lL al tubo control. Las células fueron incubadas a 37°C durante 45 min, y centrifugadas. El pelle1t celular fue re~suspendido en 500 IJL de Aldefluor Assay Buffer y mantenido a 4°C hasta su análisis. En la Figura 2 se observa la imagen de los citogramas pertenecientes a la línea MOA-MB 468 con la separación de las sub-poblaciones celulares positivas y negativas para la actividad ALDH.
Ensayo de formación de esferas La capacidad de las CSCs para formar esferas fue estudiada cultivando las células en placas de cuhivo de baja adherencia de 6 pocillos (Coming Inc., Coming, NY, EEUU) , utilizando un medio de cultivo que permitel el mantenimiento de las carac1erfsticas de células madre denominado medio de esleras (OMEMIF12 (Sigma Chemical Co, St Luis, MO, EEUU) , suplementado con 1X de B27 (Gibco, Big Cavin, OK, EEUU) , 1 ~glmL de hidrocortisona, 4ng1mL de heparina, 10 ~glmL de insulina, 10 nglmL de Eg!, 20 ng/mL de FGF y 1% de una solución de penicilina/estreptomicina (10.000 U1mL penicilina G y 10 mg/mL de estreptom~cina; Sigma Chemical Co, St Luis, MO, EEUU).Las células mantenidas en este tipo de cultivo fueron despegadas mediante tripsina-EOT A y lavadas dos veoes con PBS, mediante oentrifugación de 5 min a 1500 rpm. A continuación, el pellet celular fUle re-suspendido en medio de esferas y sembrado de nuevo en las placas de baja adherencia. En la Figura 3 se observan imágenes de las mamosferas generadas.
Ensayo de inhibición de kinasas La capacidad inhibitoria de 13 sobre kinasas implicadas en vlas de señalización relacionadas con el cáncer, se demostró in vitro mediante la técnica de westem blot. Para ello se utilizó la linea oelular MOA-MB 466 de cáncer de mama, que sobreexpresa el receptor de superncie EGFR.. La sobre-expresión de este receptor en cáncer de mama está relacionado con un aumento del tamaño del tumor, una mayor expresión de características de células troncales (slem) y un mal pronóstico (Viale G, Rotmensz N, Maisonneuve P, el al., elin Caneer Res 13: 4429-4434, 2007). Además, 13 es capaz de inhibir rutas de señalización implicadas en la proliferación celular, que se encuentran alteradas en las células tumorales (Yu S.; Cai X.; Wu C.; Wu L.; Wang
Y.; Liu Y.; Yu Z.; Oin S.; Ma F.; Thier y JP.; Chen L. Oncotarget 2014. Tal es el caso de la quinasa ERK1/2, que juega un papel fundamental en la invasión, migración y
angiogénesis de diferentes tipos de células tumorales, tanto in vivo como in vitro (Wang, X.G.; Meng, O.; Oi, F.M. and Yang, O.F. European Review for Medica/ and Pharrnaco/ogica/ Sciences 2014, 18: 3844-3853.
Actualmente se están estudiando inhibidores de esta quinasa para ser utilizados como opción terapéutica en el tratamiento de pacientes que presentan tumores con mutaciones para BRAF, KRAS, o NRA, s, incluyendo pacientes que presentaban recaidas y que estaban utilizando terapias inhibitorias frente a BRAF o MEK (MorTis,
EJ. et al., Caneer Discov 2013, 3:742-750.) Para llevar a cabo nuestro estudio se indujo la sobreexpresión de pEGFR mediante la adición al medio de cultivo de EGF durante dos horas. Tras dicho tiempo se añadió 13 (5 ~M) Y se determinó su capacidad de inhibición de las quinasas pEGFR y pERK1/2 a d~erentes tiempos. la extracción de protelnas se realizó del cultivo de las células adherentes y CSCs AlDH+ en placas de 6 pocillos (normales y de baja adherencia) , tras los tratamientos con el compuesto. Po:steriormente, el medio de cultivo fue retirado y se procedió a lavar las células con PBS. A continuación, se añadieron 100 J, ll de la solución de extracción de proteínas y se despegaron las células de la supeñicie de la placa mediante la utilización de un cepilla celular rseraper"). En el caso de las CSCs, el medio fue centrifugado y tras ser lavado con PBS, se le añadió la solución de lisis, la cual fue recogkla y guardada en un tubo tipo Eppendorf de 1.5 ml, para posteriormente ser hervida a 100°C dur21nte 10 min en un thermoblock ThermoStat plus (Eppendort Corp., Hamburg, Germany). las muestras finalmente fueron almacenadas a -20 oC. Tras esto, se procedió a la separación de las protefnas en base a su carga y tamaño mediante geles de acrilamida (10%). El siguiente paso fue la transferencia de las protelnas separadas electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EEUU) mediante un TransBlot® Turbo-m Transfer System (Bio-Rad laboratories, Inc., Hercules, CA, EEUU) , Una vez transferida la membrana de nitrocelulosa se procedió al bloqueo para evitar uniones ¡nespecificas con las proteinas y a su posterior marcaje con los anticuerpos primarios (p-EGFR y p-ERK; Ce" Signaling). Tras un periodo de incubación, las proteínas se marcaron con el correspondiente anticuerpo secundario (Sigma Aldrich). Finalmente se procedió al revelado de la membrana usando el kit ECl (Bonus, Amersham, little Cha~ont, UK) , en un s, istema de imagen LAS-4000, utilizando el software Image Reader LA5-4000.
La Figura 4 muestra que 13 inhibió de forma significativa ambas quinasas a partir de las 12 horas de tratamiento.
De igual modo, se realizó un estudio acerc:a de la capacidad de 13 para modular rutas de señalización relacionadas con las propiedades de células troncales (stem) de las eses. Los resultados indican que 13 fue capaz de inhibir la formación de esferas tanto en número como en tamaño de las mismas en las eses ALOH+, asl como de inhibir la expresión de Sox-2 a muy bajas concentr.aciones (1.43 y 2.86 IJM) tras sólo 24 horas de tratamiento. Sox-2 ha sido asociado al mantenimiento de la pluripotencia y está considerado como un marcador de célula:s troncales (stem cells) (Lü, X.;Oeng, Q.; Li H.; Suo Z. Exp Ther Med. 2011 Sep; 2 (5) :821-826). De hecho se ha demostrado que juega un papel primordial en el desam>llo de la resistencia al tamoxifeno en las células de cáncer de mama receptor de e!;trógenos (ER) -positivas. La sobreexpresión de Sox2 aumenta la proporción de células madre mediante la activación de la vla de señalización Wnt, haciendo de ese modo las células resistentes a la quimioterapia. Estos hallazgos, junto con la observación de que los niveles de Sox2 están elevados en los tumores primarios de pacientes que no responden a la terapia endocrina, sugieren que la señalización de Wnt puode ser una diana terapéutica atractiva en estos pacientes. La implicación de estos hallazgos es que pequeñas moléculas inhibidoras de la señalización de Wnt podrían ser un nuevo tratamiento para prevenir la recurrencia en grupos definidos de pacientes con cáncer de mama (Piva M.; Domenici G.; lriondo O.; Rábano M.; Simoes BM.; Comaills V.; Barredo l.; López-Ruiz JA.; Zabalza l.; Kypta R.; Vivanco Md. EMBO Mol Med. 2014, 6, 66-79. Además, se ha descrito que la inhibición de Sox2 increm~9nta los niveles de apoptosis de las eses. De hecho, recientemente se ha demostradlo que Sox2 contribuye a la proliferación y a las caracteristicas stem del cáncer de páncreas a través de la regulación de genes que conlrolan la transición de la fase G1 a la S del ciclo celular y el fenotipo de la transición epitelio mesenquima (EMT) (Herreros-Villc:lnueva M.; Zhang JS.; Koenig A.; Abel EV.; Smyrk TC.;Bamlet WR.;de Narvajas AA.; Gomez TS.; Simeone DM.; Bujanda L.; Billadeau DO. Oncogenesis. 2013, 2; e61). Todo ello indica que la inhibición selectiva de Sox2 en CSCs mediante 13 es un prometedora estrategia terapéulica.
Ensayos de toxicidad in vivo los estudios de toxicidad aguda in vivo s;e llevaron a cabo con 13. la toxicidad del
compuesto se evaluó utilizando ratones BALBc (n= 40) hembra de 6 semanas de edad
y un peso de unos 20 mg a los que se les administra por vía oral mediante una sonda bucoesofágica una dosis diaria de hasta 250 mglkg/dla (50n5l100/150/250) de los compuestos durante 1 semana seguida dl;J 1 semana de descanso. El compuesto se disolvió en metilcelulosa al 1 %. los ratones se inocularon con el mismo volumen de metilcelulosa al 1% (grupo de control) y DMSO sólo (grupo de DMSO). Los ratones se mantuvieron bajo condiciones estándare's y se pesaron. Se evaluó la toxicidad sistémica: apatía, excitación, pérdida de poso; y local: alopecia, reacciones cutáneas y motilidad de una pata cada 24 horas. Durante el periodo de estudio no se observaron cambios en la conducta, signos clínicos ele toxicidad, ni muertes en el 100% de los animales tratados. El análisis macroscóp'ico de los órganos estudiados no mostró ningún dato de interés, siendo su aspecto normal.
Ensayos de actividad antitumoral en xenoinlertos Para evaluar el efecto de 13 sobre el crecimiento tumoral, se establecieron xenoinjertos de tumor heterotópico utilizando la línea celular de melanoma metastásico A375. Para ello, se indujo la formación del tumor mediante la inyección subcutánea de 5 ) ( 105 células/ratón en ratones hembra NaO scid gamma (NaO, Cg-Prkdcsdd 112rg""WjI/SzJ, NSG) de ocho semanas de..dad. Se alOjaron y se mantuvieron de 20 oC
a 240 e, 50% de humedad, un ciclo de luz-oscuridad de 14 a 10 h con comida yagua ad libitum. los tumores se dejaron crecer hasta un volumen medio de 100 mm 3, tras lo cual fueron asignados aleatoriamente como grupos control (metilcelulosa al 1%) y
de tratamiento con 13 (50 mg/kg, disueltcl en metilcelulosa al 1%) o 13 (100 mglkg,
disuelto en metilcelulosa al 1%) inyectados ip tres veces por semana durante 40 dlas. El peso del tumor se calculó de acuerdo c () n la fórmula: TW (mg) = volumen del tumor d2
(mm3) = ) ( 0/2, donde d y O son los diámetros más cortos y más largos,
respectivamente. El tratamiento con 13 inhibió significativamente el crecimiento del
melanoma en comparación con el grupo control a partir del dia 20 para ambas concentraciones, y dichas diferencias Significativas se mantuvieron para la concentración de 100 mg/kg hasta el dla 40 (Figura 6). Estos resultados indican la potente actividad antitumoral de 13 incluso en estirpes tumorales altamente tumorigénicas e invasivas y con altos niveles de eses y en tumores con pocas alternativas terapéuticas.
Tasa de supervivencia Para llevar a cabo los estudios de supervivencia, los ratones se monitorizaron estrechamente, al menos tres veces por semana, durante todo el periodo experimental. Como se muestra en la Figura 7 el tratamiento con 13 a ambas concentraciones (50 mglkg y 100 mgJkg) mostró mejor supervivencia en relación con el grupo control. Oicha supervivencia fue mejor en el grupo de animales tratados con 100 mglkg.
