La presente invención se refiere a las cepas microbianas de los géneros Te"ibacillus denominada Terribacillus sp. AE2B122, Bacillus, denominada Bacillus sp. HR21-6, Entembae/er, denominada En/erobae/er sp. AE1B89 y Pseudomonas, denominada Pseudomonas sp. AE2B120 con capacidad de llevar a cabo reacciones de alcoholisis y esterificación regioselectivas y el uso de las mismas en reacciones de acilación y/o desacilación, en general y más específicamente, en reacciones de acilación y/o desacilación para la producción de carbohidratos y polifenoles lip6filos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria. Asimismo, la invención también se refiere a un método para obtener estas cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo estas reacciones. Así como la obtención de regioisómeros de los azúcares y polifenoles parcialmente acilados. Por lo tanto, la invención es de utilidad en los campos de la Microbiología Industrial e Ingeniería Química, en particular, en el sector de la producción de compuestos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La protección y desprotección quimio-, regio-y estereoselectiva constituye una de las estrategias más utilizadas en síntesis orgánica, especialmente valiosa en la síntesis de moléculas complejas y polifuncionales, entre las que se encuentran los carbohidratos y los polifenoles. Aunque son muchos los avances que se han conseguido en este campo en las últimas décadas, aún se está muy lejos de alcanzar la perfección de las reacciones naturales, por lo que este aspecto sigue siendo hoy en día uno de los grandes retos en síntesis orgánica.
La biocatálisis, y particularmente el uso de enzimas hidrolíticas como las lipasas, constituye una alternativa a los métodos convencionales en síntesis orgánica y puede ser útil para realizar protecciones y desprotecciones estéreo-y regioselectivas en carbohidratos (Filice, M. et al. Na!. Protoc. 7, 1783-1796; 2012) Y polifenoles (Torres, P. et al. J. Agric. Food ehem. 58, 807-813; 2010). Detenninados carbohidratos y polifenoles son de interés en la industria farmacéutica y alimentaria como se explica a continuación.
Diversos estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto los efectos beneficiosos para la salud que se derivan del consumo de alimentos ricos en antioxidantes, ya que previenen el desarrollo de enfermedades crónicas degenerativas, incluidas enfermedades cardiovasculares y cáncer (Grez el al., Curr Opin Pharmaco/1 04, 362-368; 2010). Dichos compuestos evitan los daños producidos por el estrés oxidalivo en ciertas biomoléculas (ADN, lípidos, proteínas) , que se encuentran asociados con un incremento en el riesgo de problemas cardiovasculares, cáncer y olras enfennedades crónicas (Cilla el aL , Ann Nutr
Metab 54, 35-42; 2009).
Algunos estudios demuestran que los compuestos pOlifenólicos naturales son, in vitra, más efectivos como antioxidantes que la vitamina A o C (Miller et al. , J Nutr Enviran Med 12, 39-51; 2002) , por lo que existe un creciente interés de este tipo de compuestos, en especial aquellos que pueden ser obtenidos a partir de subproductos generados en la industria alimentaria. En este contexto, destaca el hidroxitirosol, que predomina en el olivo (Olea europea) , tanto en las hojas como en su fruto, ya sea libre o en forma de derivado, y que es un compuesto fenólico de una reconocida eficacia como antioxidante (Fernández-Bolaños et al. , Curr Org Chem 12, 442-463; 2008).
En los últimos afios, se ha comprobado que este antioxidante natural posee además importantes propiedades biológicas: antiagregante plaquetario (González Correa et al. Br
J Nutr, 101, 1157-1164, 2009) , antiinflamatorio (Gong et al., Phytother Res 23, 646-650, 2009) , cardioproleclor (Poudyal, H.J. Nutrition 140, 946-953; 2010) , anlimicrobiano (Medina el al. J Agric Food Ghem 55, 9817-9823; 2007) , Y anli-VIH (Lee-Huang el al., Biochem Biophys Res Gommun 354, 872-878; 2007). Actualmente, son numerosas las investigaciones que intentan demostrar el beneficio de este compuesto en el tratamiento de ciertas enfermedades neurodegenerativas (Schaffer el al., J Agric Food Chem 55,
5043-5049, 2007) , Y de la piel (Guo et al,. Phytother Res 24, 352-359; 2010) , en la prevención del ictus cerebral isquémico y en la prevención y tratamiento del cáncer
(Sirianni et al. , Mol Nutr Food Res 54, 833-840, 2010).
La aceituna contiene, ademas de hidroxitirosol, una amplia variedad de compuestos fenólicos, tales como el 3, 4-dihidrox~enilglicol (Brenes, M.J. Agric Food Chem 47, 35353540; 1999) Y el alcohol protocatecuico (Saitla, M. et al. Food Ghem 112, 525-532, 2009).
HO OH
HO~OH
OH H0X)
I """ OH
HO~ HO HO J
Hidroxitirosol 3, 4-Dihidroxifenilglieol Alcohol protoeateeuieo Diversos estudios sobre los compuestos fenólicos del olivo muestran la importancia de los acil derivados en la cadena lateral de estos compuestos polifenólicos naturales, ya que el 5 carácter lipófilo permite su dispersión en aceite, el atravesar membranas celulares y la captación por las células, y la protección de constituyentes de membrana y de LDL (Gupta et al., Adv. Food Nutr. Res. 69, 183-217; 2013). Es decir, se mejoran las propiedades físico-químicas y se conservan las propiedades antioxidantes. Por lo tanto, es de gran interés para la industria alimentaria la obtención de nuevos antioxidantes lipofílicos mediante modificación de polifenoles naturales. Estos análogos estructurales lipófilos tienen una mejor biodisponibilidad, son más eficaces que los polifenoles naturales utilizados como material de partida, y son útiles en la formulación de "alimentos funcionales" que presentan efectos beneficiosos para la salud.
Bouallagui y colaboradores (Bouallagui et al. , Appl Biochem Biotechnol 163, 592-599, 2011) han descrito la producción enzimática de hidroxitirosol acetato e hidroxitirosol oleato usando la lipasa de C. antarctica (Novozym 435) , obteniendo compuestos con actividades biológicas optimizadas en cuanto a la biodisponibilidad y actividad antioxidante. La acilación catalizada con lipasa de C. antarctica B tiene lugar quimioselectivamente sobre el
hidroxilo de la cadena alifática frente a los hidroxilos aromáticos (Torres de Pinedo et aL, Tetrahedron 61 , 7654-7660; 2005).
Por otra parte, azúcares esterificados parcialmente o con diferentes funciones en los distintos carbonos, constituyen importantes ~building blocks" para la síntesis de una amplia variedad de derivados más complejos. Así por ejemplo, los monosacáridos y oligosacáridos con un único hidroxilo libre son compuestos intermedios para la sintesis de heterooligosacáridos de interés biomédico y actividad farmacológica como antitumorales, antiinflamalorios, etc. (Plou et al. , J Biotechno/ 96, 55-66; 2002).
Desafortunadamente, el elevado número de grupos hidroxilo en los azúcares y su similar reactividad hace que en muchos casos no sea posible introducir regioselectivamente determinadas funciones, o requiera recurrir a una larga y costosa secuencia de síntesis, para llevar a cabo transformaciones en solo alguno de los grupos hidroxilo.
A pesar del interés de las reacciones de carbohidratos biocatalizadas con lipasas, los antecedentes de casos de protección o desprotección regioselectiva de monosacáridos en posiciones distintas a C-1 y e-6 son muy escasos. Asimismo, son también muy pocos los ejemplos en los que se describen reacciones de protección/desprotección regioselectiva en uno de los dos carbonos primarios (C-6 y C-6 ") de disacáridos de hexosas.
Por 10 tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de encontrar nuevas enzimas capaces de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación regioselectivas con la finalidad de obtener nuevos compuestos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
Para superar los problemas existentes en el estado de la técnica mencionados previamente, un primer aspecto de la presente invención describe cepas microbianas seleccionada de la lista que comprende cepa de Baciflus depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8484, cepa de Enterobacfer depositada en la Colección Espa"ola de Cultivos Tipo (CECn con el número de acceso CECT 8462, cepa de Pseudomonas depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8463 y cepa de Terribacillus depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8231 que tienen la capacidad de llevar a cabo reacciones regioseleclivas de acilación (esterificación) y/o desacilación (alcoholisis) , preferentemente sobre polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales, lo que permite la obtención de una colección de compuestos de interés acilados y/o eterificados en diferentes posiciones. Así, en base a la capacidad de estas bacterias de llevar a cabo estas reacciones de esterificación y alcoholisis, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán explicados en detalle a continuación.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al extracto enzimático obtenible a partir del cultivo de cualquiera de las cepas bacterianas descritas en la presente invención.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso de las cepas bacterianas o al uso del extracto enzimático de la invención como catalizadores para las reacciones enzimáticas de acilación y/o desacilación de compuestos, siendo preferidos los compuestos pollfenoles y/o carbohidratos o sus derivados acilados.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un método para obtener derivados aeilados de polifenoles y/o carbohidratos mediante reacciones enzimáticas de acilación o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas: a) poner el extracto enzimático según se describe en la presente invención, en contacto con pOlifenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados acilados, en presencia de un agente acUante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones enzimáticas de acilación o desacilación, respectivamente; y
b) purificar los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos en la etapa (a).
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al compuesto de fórmula general
(1)
25 (1)
30 donde: R, es un grupo alquilo (C, -C2lI) , un grupo alquenilo (C2-C2Q) , un grupo alquinilo (Cr ClO) , o un grupo arilalquilo; y R2 es un grupo acilo (-COR3) , donde R3 es un grupo alquilo C, -ClO, o un hidrógeno.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula general (1) descrito previamente para la elaboración de un medicamento.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1) según se ha descrito previamente junto con un vehiculo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto descrito en la presente invención hace referencia al uso de al menos un compuesto de fórmula general (1) según se ha descrito previamente para la elaboración de una composición alimenticia.
Otro aspecto descrito en la presente invención hace referencia al uso no terapéutico de al menos un compuesto de fórmula general (1) según se ha descrito previamente, como antioxidante, preferiblemente alimentario, o como componente de composiciones cosméticas.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a una composición alimen1icia o cosmética que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1) según se ha descrito previamente.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (1) según se ha descrito previamente a lo largo de la presente invención, que comprende:
a. la reacción enzimática del compuesto 3, 4-dihidroxifenilglicol peracilado con
R, OH; o
b. la reacción enzimática del compuesto 3, 4-dihidroxifenilglicol peracilado con
R, OH y posteriormente la reacción con metanol del compuesto obtenido en
el paso (a) bajo catálisis básica;
donde R, es un grupo alquilo (C, -C20) , un grupo alquenilo (Cr C2º) , un grupo alquinilo (C2-C20) , o un grupo arilalquilo; según se ha definido para el sustituyente R, del compuesto general de fórmula (1).
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula 2, 3, 4, 6, 6'-penta -O-acetil-a, a-D-trehalosa o 2, 3, 4, 6-tet ra-O-acetil-o:, a-D-trehalosa, así como al uso de dichos compuestos como intermediarios de reacción para la síntesis de derivados de trehalosa, así como en la preparación de análogos de glicolípidos presentes en Mycobacterium tuberculosis.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos 2, 3, 4, 6, S'-penta-O-acetil-a, a-D-trehalosa o 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a, a
D-trehalosa que comprende:
a. la reacción enzimática de per-O-acetil-a, a-o-trehalosa con metanol o metanol deulerado a una temperatura de entre 16-28°C.
DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Relación filogenética de las cepas Terribacillus sp. AE28 122, Bacillus sp. HR21-6 con otras bacterias Gram positivas (A) , y las cepas Enterobaeter sp. AE1889 Y Pseudomonas sp. AE2B120 con otras bacterias Gram negativas (B) filogenéticamente relacionadas. Para su realización se ha utilizado el método de Neighbor-Joining. Junto a las ramas se muestra el porcentaje de réplicas de los árboles que presentan esos taxones juntos en un mismo agrupamiento en el test estadístico boolslrap (500 réplicas). Las distancias evolutivas se han calculado con el método Maximum Composile Likelihood, y se expresa en unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Las secuencias comprendían entre 640 y 650 posiciones. Para los análisis filogenéticos se ha usado el programa MEGA4 (http://www.megasoftware.neUmega4/mega.html).
Figura 2. Se representa la actividad antirradicalaria (captación de radicales libres mediante donación de átomos de hidrógeno) frente al radical libre DPPH (2, 2-difenil-1picrilhidracilo) expresada en valores de ECso (f.lM) del acetato de hidroxitirosilo 2, de los éteres fenólicos 4a-4d, Sa-Sd. y del 3, 4-dihidroxifenilglicoI14.
Figura 3. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear CH-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1H-RMN) ampliado (8) del procedimiento de desacilación del compuesto 27 (metil 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a-o-glucopiranósido) mediante el extracto enzimático de la invención.
Figura 4. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear CH-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1 H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 30 (per-O-acetil-a, a-o-trehalosa) mediante el extracto enzimático de la presente invención.
Figura 5. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear CH-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 34 (per-O-acetilsacarosa) mediante el extracto enzimático de la presente invención.
DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN
Los inventores de la presente invención han identificado una serie de cepas microbianas, en particular, las cepas bacterianas Terribaeillus sp. AE2B 122, Baeillus sp. HR21-6, Enlerobaeler sp. AE1B89 y Pseudomonas sp. AE28120 depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con los números de registro 8231 (con fecha de depósito 20.11.2012) , 8484, 8462, 8463 (con fecha de depósito de 22 de Octubre de 2013) , respectivamente, que tienen la capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de acilación (por ejemplo esterificación) y/o desacilación (por ejemplo alcoholisis). Dichas reacciones de acilación y/o desacilación se llevan a cabo preferentemente sobre polifenoles y/o carbohidratos naturales, y de eterificación en posiciones bencilicas de pOlifenoles durante la alcoholisis de ésteres de hidroxilos fenólicos, lo que permite la obtención de una colección de compuestos de interés acilados y/o eterificados en diferentes posiciones. Así, en base a la capacidad de estas bacterias de llevar a cabo estas reacciones de esterificación y alcoholisis, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán explicados en detalle a continuación.
Cepas microbianas de la invención y sus usos Mediante métodos de screening sobre muestras obtenidas de diferentes lugares de procedencia, como por ejemplo almazaras, industrias de conservas de pescado, etc, se han seleccionado una serie de cepas microbianas con actividad lipolitica y capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de esterificación (aGilación) y/o alcoholisis (desacilación) , en particular sobre carbohidratos y/o polifenoles, preferentemente naturales.
Estas cepas microbianas fueron sometidas a un análisis filogenético mediante el análisis de la secuencia del gen 16S ARNr. De este análisis se identificaron las cepas con las que mayor valor de identidad presentaban las cepas microbianas de la invención, siendo Terribacillus gOriensis CL-GR16 (numero de acceso a GeneBank: NR_043895) , Bacillus stratosphericus JCM 13349 (numero de acceso a GeneBank NR_042336) , Enterobae/er ludwigii EN-119 (numero de acceso a GeneBank AJ853891 ) y Pseudomonas stulzeri ATCC 17588 (número de acceso a GeneBank NR_'03934).
Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a las cepas microbianas de la invención, que pertenecen a los géneros Terribacillus, BaciJlus, Enterobaeter y Pseudomonas que, en otra realización todavia más particular, son las cepas microbianas denominadas Terríbaeil/us sp. cepa AE2B122 (CECT 8231) , Baeillus sp. HR21 -6 (CECT 8484) , En/erobae/er sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
las cepas microbianas de la invención fueron depositadas bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) [Parc Científic Universitat de Valencia, calle Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ) el 20 de Noviembre de 2012 (CECT 8231) , y el22 de Octubre de 2013 (CECT 8484, CECT 8462 y CECT 8463).
Por lo tanto, un aspecto de la invención se relaciona con las cuatro cepas microbianas, con capacidad de llevar a cabo reacciones de acilación I desacilación que están depositadas en la CECT con los números de registro CECT 8231 , CECT 8464, CECT 8462 y CECT 8463. En una realización particular, las cepas preferidas son: CECT 8464, CECT 8462 y CECT 8463.
Como entiende el experto en la materia, las cepas microbianas de la invención pueden ser cultivadas en un medio de cultivo líquido para obtener un sobrenadante que, después de ser sometido a procesos de concentración y opcionalmente, liofilización y/o dialización, se obtiene un extracto enzimático que, al igual que cualquiera de las cepas de la invención, puede usarse para llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, siendo útil en la producción de los compuestos de interés.
Además, las cepas microbianas de la invención pueden ser cultivadas en presencia o en ausencia de un sustrato lipídico con el objetivo de obtener sobrenadantes que contendrán las enzimas y compuestos necesarios para llevar a cabo la reacción de acilación y/o desacilación.
A efectos de la presente invención, el término ~sustrato lipidico~ se refiere a un compuesto de naturaleza lipídica, sobre el cual actuarán las lipasas de las cepas microbianas. Ejemplos de sustratos lipídicos incluyen, sin limitar a, surfactanles, triglicéridos, aceites esenciales, más particularmente, tributirina, Tween 80, Tween 20 y aceites vegetales, tales como aceite de oliva y/o aceite de girasol. En una realización particular, el sustrato lipídico es tribulirina. La concentración del sustrato lipídico en el medio de cultivo puede ser variable, pudiendo emplearse concentraciones de entre 0, 1 4%, e incluso mayores. Preferiblemente, la concentración del sustrato lipídico en el medio de cultivo es de alrededor del 2% en peso con respecto al cultivo final.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un extracto enzimático obtenible a partir del cultivo de las cepas microbianas de la invención, capaz de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación. A efectos de la presente invención los términos sobrenadante y extracto enzimático se utilizan indistintamente.
A efectos de la presente invención, el término "extracto enzimático" o "sobrenadan te" se refiere al sobrenadante obtenible del cultivo de las cepas de la invención, que opcionalmente puede ser sometido a procedimientos de concentración, liofilización y/o dialización y que comprende las enzimas que las cepas microbianas descritas en la presente invención excretan al medio de cultivo y que presentan actividad lipolítica y que son capaces de llevar a cabo reacciones regioselectivas de esterificación (acilación) y/o alcoholisis (desacilación) , es decir se utilizan como catalizadores biológicos. El extracto enzimático o sobrenadante de la invención es, a efectos de la presente invención, un cóctel enzimático obtenido de los cultivos de las cepas de la invención.
Sin querer estar vinculado a ninguna teoría, los inventores consideran que, en el sobrenadante obtenido de los cultivos de las cepas de la invención, en medio líquido, están comprendidas las enzimas necesarias para llevar a cabo dichas reacciones de acilación y/o desacilación. Entre las enzimas que pueden formar parte de dicho sobrenadante se encuentran las lipasas que son enzimas que catalizan un amplio rango de reacciones (hidrólisis, interesterificaciones, alcoholisis, acidólisis, esterificación y
aminolisis, entre otras) , incluyendo las reacciones que se detectan y se muestran en los ensayos y ejemplos que se describen lo largo de la presente invención.
El sobrenadante obtenido mediante el cultivo de las cepas de la invención pueden contener no sólo las enzimas necesarias para llevar a cabo reacciones de acilación ylo desacilación, sino que también puede contener otro tipo de compuestos que pueden interaccionar con dichas enzimas, disminuyendo o potenciando la eficacia de conversión del sustrato a los productos resultantes de las reacciones. Por lo tanto, puede ser conveniente someter al sobrenadante a un proceso de concentración y de diálisis para eliminar aquellas partículas o compuestos no deseables.
En la presente invención se entiende por "concentración y/o diálisisn al proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus índices de difusión a través de una membrana semi permeable. Típicamente, una solución de varios tipos de 15 moléculas es puesta en una bolsa semipermeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de celulosa con poros, y la bolsa es sellada. La bolsa de diálisis sellada se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Las moléculas lo suficientemente pequeñas como para pasar a través de los poros (a menudo agua, sales y otras mOléculas pequeñas) tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera de la bolsa de diálisis en la dirección de la concentración más baja. La técnica de diálisis es ampliamente conocida en el estado de la técnica y su puesta en práctica es rutinaria para el experto en la materia. En la puesta en práctica de la presente invención, el sobrenadante de la invención se vertió en una bolsa de diálisis de 12 KDa y tras ser concentrado con polietilenglicol 8 KDa, se dializó con tampón fosfato potásico.
Por lo tanto, en una realización particular, el extracto enzimático descrito en la presente invención, obtenido a partir de los cultivos de las cepas de la invención, está concentrado y/o dializado.
Adicionalmente, tanto si el extracto enzimático de la invención está concentrado y/o dializado o no, éste puede ser sometido a un proceso de liofilización. Por lo tanto, en otra realización particular, el sobrenadante de la invención está liofilizado.
La liofilización es un proceso en el que se congela el producto y, posteriormente, se introduce en una cámara de vacio para realizar la separación del agua por sublimación. De esta manera se elimina el agua desde el estado sólido al gaseoso del ambiente sin pasar por el estado líquido. La técnica de liofilización es ampliamente conocida en el estado de la técnica y su aplicación es practica de rutina para el experto en la maleria.
Una vez obtenidas tanto las cepas microbianas de la invención, como los extractos enzimáticos producidos a partir del cultivo de éstas, y probado que son capaces de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, el experto en la materia entiende que, tanto las cepas microbianas, como los extractos enzimaticos de la invención, pueden emplearse para producir los compuestos de interés que se indican mas adelante.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de las cepas microbianas o de los extractos enzimáticos obtenidos de cultivos de dichas cepas, según la invención, para la producción de derivados acilados, siendo preferentemente los sustratos de partida, polifenoles y/o carbohidratos, naturales o no.
En una realización particular, la producción de derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos se lleva a cabo mediante reacciones regioselectivas de acilación o desacilación de pOlifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales.
A efectos de la presente invención los términos ~regioselectivo/an o "regioselectividadn se refieren a la preferencia de una reacción de esterificación o hidrólisis en un hidroxilo alifatico de varios posibles, o un hidroxilo aromático de varios posibles.
A efectos de la presente invención los términos "quimioselectivo/a" o "quimioselectividad" se refieren a la preferencia de una reacción de esterificación o alcoholisis en un hidroxilo alifático (alcohol) frente a un hidroxilo aromatico (fenal) o viceversa.
Más detalles sobre la prodUCCión de derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos mediante el empleo de las cepas microbianas o de los extractos enzimáticos de las mismas, descritos en la presente invención, puede encontrarse en los Ejemplos 3 y 5 donde se describe el método de producción de los mismos.
Siotransformaciones regioselectivas para la obtención de derivados acilados lipofílicos de polifeno/es y/o carbohidratos.
Como se ha explicado anteriormente, los inventores han descubierto nuevas cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales o no, por lo que tanto las cepas microbianas, como los extractos enzimáticos obtenidos a partir del cultivo de las mismas, pueden emplearse en la obtención de los compuestos que se indican a continuación.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener derivados aeilados de polifenoles ylo carbohidratos, preferentemente a partir de polifenoles y/o carbohidratos naturales, mediante reacciones de acilación o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas:
a) poner el extracto enzimático según se define a lo largo de la presente invención, en contacto con polifenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados acilados, en presencia de un agente acilante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones enzimáticas de acilación o desacilación, respectivamente y, opcionalmente b) purificar los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos en la etapa (a).
A efectos de la presente invención, el término gpurificar" o ~purificación" se refiere tal y como se emplea en la descripción, a la separación de los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos mediante el método descrito en la invención y a su concentración. La separación de dichos compuestos del resto de productos que le puedan acompañar y que no sean de interés, puede llevarse a cabo mediante técnicas de solubilidad diferencial, cromatografia, electroforesis o isoelectroenfoque. Las técnicas de cromatografía pueden estar basadas en el peso molecular, la carga o la afinidad de la proteína y puede realizarse en columna, en papel o en placa. La separación de los compuestos puede realizarse, por ejemplo, por cromatografia liqUida rápida (FPLC, del inglés Fast Protein Liquid Cromatography) , en un sistema automatizado que reduce notablemente el tiempo de purificación e incrementa el rendimiento de la purificación.
En una etapa previa a la etapa a) del método de la invención, las cepas microbianas de la invención son cultivadas en presencia o en ausencia de un sustrato lipídico con el objetivo de obtener unos extractos enzimáticos que contengan las enzimas y compuestos necesarios para llevar a cabo la reacción de acilación y/o desacilación sobre los polifenoles y/o carbohidratos.
Las cepas bacterianas de la invención se crecen en un medio de cultivo líquido para extraer el sobrenadante y posteriormente obtener los extractos enzimaticos. Para Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 6231) , Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 6234) se ha utilizado como medio de cultivo, PYA (agar, peptona y extracto de levadura). En el caso de Enterobactersp. AE1B69 (CECT 6232) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 6233) se ha utilizado como medio de cultivo, LB (Luria-Bertani) , aunque es importante mencionar que se pOdría utilizar cualquier otro medio de cultivo en el cual las cepas de la invención puedan crecer.
Opcionalmente, el cultivo líquido se puede suplementar con un sustrato lipídico para incrementar la secreción de las enzimas presentes en el extracto enzimatico de la !nvención, secretadas por las cepas de la invención y que son las responsables de llevar a cabo las reacciones de acilación/desacilación sobre los polifenoles y/o carbohidratos. Como se ha comentado previamente, dichas enzimas se considera que son, preferentemente, lipasas. Así, en una realización particular, el medio de cultivo puede estar suplementado con un sustrato lipídico, de acuerdo a como se ha descrito previamente en la presente descripción de la invención.
Los cultivos se realizan a temperatura de entre 22°C y 37°C, en agitación durante 2-3 días. Transcurridos estos días se extrae el sobrenadante que como hemos mencionado anteriormente, contendra las enzimas, preferentemente lipasas, encargadas de llevar a cabo las reacciones descritas en la presente invención.
El sobrenadante resultante de los cultivos puede aislarse por técnicas de rutina para el experto en la materia. Por ejemplo, una vez transcurrido el periodo de incubación, el cultivo puede dejarse reposar para que las células decanten o puede someterse a centrifugación, consiguiendo de ambas formas separar las células del medio de cultivo liquido. Posteriormente, puede obtenerse el sobrenadante, por ejemplo por aspiración con una pipeta.
Una vez obtenido el extracto enzimático, éste se pone en contacto con los compuestos que se quieran someter a las reacciones de acilación/desacilación [etapa (a) ]. Las condiciones adecuadas para llevar a cabo estas reacciones se explican detalladamente en cada uno de los ejemplos que contiene la presente invención.
En una realización preferida, los compuestos de partida son preferentemente polifenoles o carbohidralos.
En otra realización preferida, los sustratos de tipo fenólico de la etapa a) del método de la invención, se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de los siguientes: hidroxilirosol, 3, 4-dihidroxifenilglicol, alcohol protocatecuico y derivados acetilados de los mismos, preferiblemente: hidroxilirosol triacelilado, 3.4-dihidroxifenilglocol telraacilado y alcohol protocatecuico peracilado.
En otra realización preferida, los sustratos de tipo carbohidratos del paso a) del método de la invención, se seleccionan de entre mono-, di-, oligo-, polisacaridos o cualquiera de sus derivados acilados, preferiblemente: metil a-D-glucopiranosido per-O-acetilado, trehalosa octaacetilada y sacarosa octaace1i1ada.
Por "derivados acetilados· se refiere a compuestos fenólicos o carbohidratos con al menos un grupo -OH sustituido por un grupo -OCOCH3.
Tal como se ha explicado previamente, en el presente documento, los sobrenadantes obtenidos en una etapa previa a la etapa a) del método de la invención, pueden concentrarse y/o dializarse, según se ha explicado previamente, o pueden usarse tal cuales.
Por lo tanto, en una realización particular, el método de obtención de derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos de la invención comprende entre las etapas (a) y (b) , una etapa opcional dirigida a la concentración y/o dialización de los sobrenadantes, así como a su posterior liofilización. Las técnicas de concentración, dialización y liofilización se describen con detalle en el Ejemplo 2.
A continuación se detallan las diferentes reacciones de acilación/desacilación de compuestos fenólicos y/o carbohidratos mediante las reacciones enzimáticas catalizadas por las enzimas presentes en los sobrenadantes o extractos enzimáticos recogidos de los cultivos de las cepas descritas en la presente invención, para la obtención de compuestos fenólicos y/o carbohidratos acilados lipofilicos.
En una realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el politenol del paso (a) es un derivado acetilado de hidroxitirosol, 3, 4-dihidroxifenilglicol o alcohol protocatecuico, preferiblemente hidroxitirosol triacetilado, 3, 4-dihidroxifenilglocol tetraacilado o alcohol protocatecuico peracilado, y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático.
Por "alcohol alifáticon se entiende en la presente invención a un grupo alquilo (C, -C7) , lineal o ramificado, con al menos un radical -OH, por ejemplo, pero sin limitarse a metanol, etanol, propanol, butanol, entre otros. Preferiblemente el alcohol alifático es metanol (MeOH). El alcohol alifático puede estar opCionalmente deuterado a temperatura ambiente (aprox. 18-30'C).
En una realización más preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el pOlifenol del paso (a) es un hidroxitirosol triacetilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de metanol.
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación de los hidroxilos aromáticos, el polifenol del paso (a) es 3, 4-dihidroxifenilglicol tetraacilado o alcohol protocatecuico peracilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático para producir la eterificación en la posición bencílica.
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de aCilación, el polifenol del paso (a) es hidroxitirosol, 3, 4-dihidroxifenilglicol o alcohol protocatecuico y la reacción se lleva a cabo en presencia de un grupo acilante y opcionalmente de un co-disolvente.
Por "grupo acilante" se entiende a un reactivo capaz de reaccionar con un compuesto agregando un grupo acilo a su estructura, como por ejemplo, el grupo acilante puede ser sin limitarse a acetato de isopropenilo o acetato de vinilo, que a su vez actúan de disolvente.
La reacción de acilación se puede hacer en ausencia o presencia de un adsorbente del sobrenadante de los cultivos de las cepas de la invención, tal como ceJita. Se obtienen mejores resultados con el extracto enzimático soportado sobre celita. Si el compuesto fenólico empleado es poco soluble en el agente acilante se puede utilizar un codisolvente, por ejemplo DMF (N, N-dimetil formamida).
En otra realización preferida, la reacción enzimatica es de desacilación, el carbohidrato del paso (a) es metil a-o-glucopiranósido per-O-acetilado, per-O-acetil-a., a-D-trehalosa, per-O-acetil-sacarosa, trehalosa octaacetilada o sacarosa octaacetilada y la reacci ón se lleva a cabo en presencia de alcohol alifático, preferiblemente metanol o metanol deuterado a temperatura ambiente (16-28°C).
En un realización más preferida, la reacción enzimática es de per-O-acetil-a, a-Dtrehalosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28OC, obteniéndose los compuestos 2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetil-<x, <x-o-trehalosa o 2, 3, 4, 6-tetra-0acetil-a, a-o-trehalosa o la reacción enzimática de per-O-acetil-sacarosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C, obteniéndose los compuestos 2, 3, 4, 6, 1' , 6' -hexa-O-acetil-sacarosa o 2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetil-sacarosa.
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de acilación, el carbohidrato del paso (a) es metil a-O-glucopiranósido y la reacción se lleva a cabo en presencia de acetato de isopropenilo y DMF a una temperatura de entre 50-700C.
Otro aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula general (1)
OR,
HO~OR2
HO) l)
(1)
donde: R1 es un grupo alquilo (C1-C20) , un grupo alquenilo (Cr e20) , un grupo alquinilo (C, -C, , ) , Oun grupo arilalquilo; y R2 es un grupo aciJo (-COR3• donde R3 es un grupo alquilo Cr C20) o un hidrógeno.
Por "alquilo" se refiere en la presente invención a una cadena alifática, lineal o ramificada, que tiene de 1 a 20 átomos de carbonos, preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, ¡propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, entre otros.
Por "alquenilo" se refiere en la presente invención a cadena carbonada, lineal o ramificada, que presenta al menos un doble enlace y que contiene entre 2 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono.
Por "alquinilon se refiere en la presente invención a cadena carbonada, lineal o ramificada, que presenta al menos un triple enlace y que contiene entre 2 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono.
Por "arilalquilo" se entiende en la presente invención a un grupo arilo unido al resto de la molécula por un grupo alquilo (Cr C2º) , tal y como se ha definido anteriormente. Un ejemplo, no limitante, de arilalquilo es un grupo bencilo.
En una realización preferida, el compuesto de fónnula general (1) de la presente invención se caracteriza por que el R2 es un grupo acetilo (-COCH3).
En una realización preferida, el compuesto de fónnula general (1) de la presente invención se caracteriza por que el R2 es un hidrógeno.
En otra realización más preferida, los compuestos de fórmula general (1) se seleccionan de la lista que comprende: acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-metoxietilo, acetato de 2 (3, 4-dihidroxifenil) -2-etoxietilo, acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-propoxietilo, y acetato de 2- (3, 4-dihid roxifeni 1) -2 -butoxietilo.
En otra realización preferida, los compuestos de fórmula general (1) se seleccionan de la lisia que comprende: 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-metoxietanol, 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2etoxietanol, 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-propoxietanol y 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-butoxietanol.
La presente invención también describe el procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (1) descritos anteriormente, que comprende:
a. la reacción enzimática del compuesto 3, 4-dihidroxifenilglicol peracilado con R, OH; o b. la reacción enzimática del compuesto 3, 4-dihidroxifenilglicol peracilado con 10 R10H Y posteriormente la reacción del compuesto obtenido en el paso (a)
mediante catálisis básica, preferiblemente con CS2C03, en metanol; donde R1 es un grupo alquilo (Cr C2º ) , un grupo alquenilo (C2-C20 ) , un grupo alquinilo (C2C20) , o un grupo arilalquilo.
OR,
OAe OR, CtO Od
HO~OAe a oaCI.. HO~OH
AeO~OAe Extracto enzimático •
V HOJl) MeOH HOV
AeO
En una realización preferida, el procedimiento descrito anteriormente se caracteriza por que la reacción enzimática se lleva a cabo en presencia del extracto enzimático descrito 20 en la presente invención.
La presente invención se refiere también al uso de al menos un compuesto de fórmula general (1) , según se ha descrito previamente, para la elaboración de un medicamento o de una composición cosmética o de una composición alimenticia, dónde la composición alimenticia se selecciona de entre un alimento, complemento alimenticio, alimento funcional o nutracéutico.
A efectos de la presente invención el término "medicamento" hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de 30 enfermedades en el hombre y los animales.
A efectos de la presente invención el término "composición farmacéutica" tal y como se define en la presente invención se refiere a conjunto de componentes que están formados por al menos un producto de fórmula general (1) según se describe en la presente invención, en cualquier concentración, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o psicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud. Dichas composiciones comprenden además al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica puede comprender un "vehículo" o portador, que es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica.
Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fánnacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
A efectos de la presente invención el término "composición cosmética" o "cosméticon se refiere a aquellas preparaciones constituidas por sustancias naturales o sintéticas o sus mezclas, de uso externo en las diversas partes del cuerpo humano.
A efectos de la presente invención el término "composición alimenticia" se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composición puede ser destinada a la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o del factor causante de una enfennedad. Por tanto, el término "composición alimentaria" de la presente invención se puede emplear como sinónimo de alimento funcional o alimento para fines nutricionales especificas o alimento medicinal. A efectos de la presente invención, el término "composición alimenticia" es, o forma parte de un alimento, alimento funcional, nutracéutico o suplemento alimenticio.
A efectos de la presente invención el término "nulracéutico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a sustancias aisladas de un alimento y utilizadas de forma dosificada que lienen un efecto beneficioso sobre la salud.
A efectos de la presente invención el término "suplemento", sinónimo de cualquiera de los términos "suplemento dietético", "suplemento nulricional" o "suplemento alimenticio" es un "ingrediente alimenticio" destinado a complementar la alimentación.
La presente invención también se refiere al uso no terapéutico de al menos un compuesto de fórmula general (1) , según se ha descrito previamente, como antioxidante, preferentemente como antioxidante alimentario.
Por el término "antioxidante" se entiende una composición capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1) , según se ha descrito previamente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a una composición alimenticia o cosmética que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1) , según se ha descrito previamente.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a los derivados acilados de carbohidratos, preferentemente a los compuestos de fórmula 2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetilCl, a-D-trehalosa o 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a, a-o-trehalosa.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso de dichos derivados acilados de carbohidratos descritos previamente como intermedios de reacción para la síntesis de derivados de trehalosa o para la elaboración de análogos de glicolípidos presentes en Mycobacterium tuberculosis.
otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de los análogos de glicolipidos presentes en Mycobacterium tuberculosis que comprende:
8. la reacción enzimática de per-O-acetil-a, a-D-trehalosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C.
En una realización preferida, dicho procedimiento se lleva a cabo en presencia de un 5 extracto enzimático según se define en la presente invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invendón se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS.
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invendón.
Ejemplo 1: Análisis filogenético de las cepas Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT
8231) , Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) , Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
El estudio filogenético se llevó a cabo mediante análisis de la secuencia del gen ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) 16S. Para ello se amplificó el gen del ARNr 16S de cada una de las cepas de la invención mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los cebadores 16F27, cuya secuencia es 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (SEO ID NO: 1) , y 16R1488, con la secuencia 5'-CGGTTACCTTGTTAGGACTTCACC-3' (SEO ID NO: 2) (Moreno M.L., et al. FEMS Microbio/ Eco/, 2009; 68, 59-71.). Las condiciones de la reacción de PCR fue la Siguiente: un ciclo de 95 oC durante 5 minutos,
25 ciclos de 94 oC durante 1 minutos, 50 oC durante 1 minutos y 72 OC durante 2 minutos, y luego un paso de extensión de 10 minutos a 72 OC. Los productos de la amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El ADN amplificado es secuenciado mediante el método Sanger. Se utilizan entre 640 y 650 pb para la búsqueda de secuencias similares entre las secuencias depositadas en GenBank, usando el algoritmo BlastN, resultando ser Terribacillus goriensis CL-GR16 (Número de acceso a GeneBank NR_043895) , Bacillus stratosphericus JCM 13349 (número de acceso a GeneBank NR_042336) , En/erobac/er ludwigii EN-119 (número de acceso a GeneBank AJ853891) Y Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 (número de acceso a GeneBank NR_103934) los que mayor valor de identidad muestran con las secuencias de las cepas de la invención. Por lo tanto, las cepas de la invención se asignaron a los géneros Terribacillus como Terribacil/us sp. AE2B 122 (CECT 8231) , Bacil/us, como Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 8464) , En/erobac/er, como En/erobac/er sp. AE1 B89 (CECT 8462) y Pseudomonas como Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
Para la realización del árbol filogenético se utilizó el paquete de programas MEGA4. Primero se realizó un alineamiento múltiple, usando Clustal W, de las secuencias de 650 pb (correspondiente al fragmento entre las posiciones 53 hasta la 703 (Figura 1A) y entre las posiciones 80 hasta 730 (Figura 1 B) del ARNr 165 de Escherichia coll) de las cepas y
de las secuencias de mayor identidad obtenidas con BlastN. Finalmente los árboles se construyeron utilizando varios métodos, obteniendo resultados similares con todos ellos. En la presente invención se muestran los árboles construidos mediante el método Neighbor-Joining (Figura 1).
Ejemplo 2: Preparación de los sobrenadantes de las cepas Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231) , Bacillus.p. HR21-6 (CECT8464) , Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
Para la preparación de los extractos enzimáticos o sobrenadantes, se creció un pre
ináculo de cada una de las cuatro cepas descritas en la presente invención. Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231) se cultivó en medio PYA durante una noche. Al día siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio PYA. Tras crecer el cultivo en medio PYA, se recogió el sobrenadante.
Bacil/us sp. HR21-6 (CECT8484) se cultivó en medio LB durante una noche. Al dia siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio PYA. Tras crecer el cultivo en medio PYA, se recogió el sobrenada nte.
Enterobaeter sp. AE1889 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE28120 (CECT 8463) se cultivaron en medio LB durante una noche. Al día siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio LB + tributirina (TRI) 2%. Tras crecer el cultivo en medio LB+TRI 2%, se recogió el sobrenadante.
Cada uno de los sobrenadantes se vertió en una bolsa de diálisis de 12 KDa (SIGMA, 09527). Las bolsas de diálisis se dejaron toda la noche a 4 oC cubiertas en polietilenglicol de 8 KDa y cuando las bolsas de diálisis estaban completamente secas, se limpió el exterior con agua destilada y se dializaron con tampón fosfato potásico O, 05M pH 7, 8 a 4 oC y agitación magnética. Estos dializados se congelaron a -80 oC.
Dichos sobrenadantes pueden ser liofilizados para así evitar que se produzcan las reacdones de hidrólisis. Además, liofilizar el sobrenadante ayuda a concentrar y conservar la enzima de la cepa microbiana, y también para poder ser almacenado.
Ejemplo 3: Preparación de pollfenoles lipófilos. Reacciones de acilación/desacilación catatalizadas por los sobrenadantes/extractos enzimátlcos de las cepas de Terribacillus sp. AE28 122 (CECT 8231) , Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) , Enterobacter sp. AE1889 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
A continuación se muestran a modo de ejemplo ilustrativo y no limitativo, rutas sintéticas que conducen a la obtención de derivados fenólicos por desacilación regioselectiva catalizada por los extractos enzimaticos/sobrenadantes en medio alcohólico.
Ejemplo 3.1. Reacción de desacilación de compuestos fenóticos mediante catálisis enzimática para la obtención de polifenoles lipofllicos.
Ejemplo 3.1.1. Acetato de hidroxitirosilo (2) La desacilación del compuesto 1 (hidroxitirosol peracetilado) mediante alcoholisis (desacilación) catalizada por los extractos enzimáticos, obtenidos de los cultivos de las cepas de la invención, usando como disolvente un alcohol aljfático, tal como el MeOH, da lugar al derivado rnonoacilado (compuesto 2) mediante una reacción totalmente regioselectiva, según se describe en el Esquema 1.
ACO~OAC extracto enzimático HO~OAC
I • I
AcO h MeOH HO h
2
Esquema 1
A una disolución del compuesto 1 (hidroxitirosol triacetilado) (50 mg, 0.18 mmol) en MeOH se le añade el extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Terribaciffus sp. cepa AE2B122 (CEC T8231) (50 mg) y gel de sílice (63-200 ~m, 100
mg). Se agita a 40 oC durante 18 horas. Se filtra sobre cetita y se concentra a sequedad. El residuo se purifica por cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:2 _ 1:1) obteniéndose el acetato de hidroxitirosilo 2 (31 rng, 90%). (Ver Esquema 1). El rendimiento para la obtención del compuesto 2 purificado por técnicas cromatográficas fue del 75-91% dependiendo del extracto enzimático utilizado.
Ejemplo 3.1.2. La desacilación del compuesto 3 (3, 4-dihidroxifenilglicol peracetilado) mediante alcoholisis cata!izada por los extractos enzimáticos descritos en la presente invención y usando como disolvente un alcohol alifático de tipo R'OH, tiene lugar de manera totalmente regioselectiva en los ésteres fenólicos (Esquema 2). En la posición bencílica el grupo aciloxi es sustituido por el grupo alcoxi R, O procedente del alcohol dando lugar a la formación del compuesto 4 que puede ser aislado con rendimientos del 40-90%. El radical R' del alcohol alifático de tipo R 'OH se selecciona preferiblemente de entre cualquiera de los siguienles: -CH, (metilo) , -C, H, (elilo) , -C, H, (propilo) o -C, H, (bulilo).
En función del alcohol alifático utilizado como disolvente se obtienen los compuestos 4a, 4b, 4c o 4d (Esquema 2). Los tiempos de reacción van desde 24 h para la obtención del compuesto 4a hasta 6 días para la obtención del compuesto 4d. El grupo acetilo del compuesto 4 puede ser eliminado mediante una alcoholisis (desacilación) con catálisis básica, utilizando como catalizador cualquier catalizador básico, preferentemente CS2C03
en metanol.
De esta manera, los compuestos 4a-4d mediante una reacción de desacetilación dan lugar a los compuestos 5a-5d con rendimientos del 31-62% (Esquema 2).
OAc OR ACO~OAC Extracto enzimático HO~OAC Cs2C03
AcO) lJ ROH HO) lJ MeOH
4a R =Me 4b R=Et 4c R = Pr 4d R = Bu Esquema 2
Acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-metoxietilo (4a)
OMe HO
OAe HO
OR
HO~OH
Ho) lJ
5. R = Me 5b R = Et Se R = Pr 5d R = Bu Se disuelve el compuesto 3 (tetraacetilado) (28 mg, 0.08 mmol) en MeOH (3 mL) y se añaden 28 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Terribacillus sp. cepa AE2B122 (CEC T8231) y 56 mg de gel de sílice (63-200 ~m). Se agita a temperatura ambiente durante dos días. Se añaden otros 28 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana TeffibaciJIus sp. cepa AE2B122 (CEe T8231) y se prosigue con la agitación a temperatura ambiente durante dos días. Se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografía en columna (CH2Cb
MeOH 60:1). Rendimiento: 17 mg, 90%, R, 0.6 (CH, CI, -MeOH 10:1).
'H-RMN (300 MHz, CD30D) : 06.80 (d 1H, J,.• = 8.0 Hz, Ar-5) , 6.79 (d, 1H, J,.• = 2.0 Hz, Ar-2) , 6.68 (dd, 1H, J •. , = 8.0 Hz, J •. , = 2.0 Hz, Ar-6) , 4.32 (dd, 1H, J= 6.0 Hz, J= 3.9 Hz, CH) , 4.16 (dd, 1H, J= 11, 4 Hz, J= 8.0 Hz, CH, ) , 4.07 (dd, 1H, J= 11, 4 Hz, J= 3.9 Hz, CH, ) , 3.25 (5 3H, OMe) , 2.06 (5 3H, OAc). " C-RMN (75.5 MHz, CD30D) : O 173.6 (CO) ,
145.7 (Ar-3 y 4) , 131.4 (Ar-l) , 120.7 (Ar-6) , 117.2 (Ar-5) , 115.8 (Ar-2) , 83.4 (CH) , 69.5 (CH, ) , 57.7 (OMe) , 21.6 (OAc).
Acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-etoxietilo (4b) OEt HO OAe
HO
Se disuelve el compuesto 3 (60 mg, 0.18 mmol) en EtOH (6 mL) y se añaden 60 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteMana Baci"us sp. HR21-6 (CECT 10 8464) Y 120 mg de gel de silice (6~200 ~m). Se calienta a 60 oC durante 24 horas y
pasado ese tiempo se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de silice (CH, CI, -EtOH 60:1). Rendimiento: 24 mg, 55%, R, 0.5 (CH, CI, -MeOH 10:1).
'H-RMN (300 MHz, CDCI, ) : Ó 6.89 (d, lH, J,.• = 2.0 Hz, Ar-2) , 6.83 (d, lH, J,.• = 8.1 Hz, Ar5) , 6.72 (dd, lH, J •. , = 8.1 Hz, J •. , = 2.0 Hz, Ar-6) , 4.42 (dd, lH, J= 6.9 Hz, J= 5.0 Hz, CH) , 4.20-4.12 (m, 2H, CH, ) , 3.43 (2dd, lH cada uno, ' J= 16.4 Hz, ' J= 7.0 Hz, CH, CH, ) , 2.06 (s, 3H, OAc) , 1.17 (t, 3H, J= 7.0 Hz, CH, CH, ). "C-RMN (75.5 MHz, CDCI, ) : ó 172.0 (CO) ,
144.5 (Ar-4) , 144.4 (Ar-3) , 131.0 (Ar-l) , 119.9 (Ar-6) , 115.5 (Ar-5) , 113.9 (Ar-2) , 79.6 20 (CH) , 68.4 (CH, ) , 84.8 (CH, CH, ) , 21.3 (OAc) , 15.4 (CH, CH, ).
Acetato de 2-{3, 4-dihidroxifenil) -2-propoxietilo (4c)
OPr HO OAe HO
Se disuelve el compuesto 3 (190 rng, 0.56 mmol) en PrOH (4 mL) y se añaden 190 rng de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 (CECT
8484) y 380 mg de gel de sílice (6~200 ~m). Se agita a 60 oC durante dos dias. Se añaden otros 190 mg del mismo extracto y se prosigue con la agitación durante dos días.
Se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografía en columna (AcOEt
hexano 1:3 ~ 1 :1). Rendimiento: 81.4 mg, 57%, R, 0.6 (AeOEt-hexano 1 :1).
'H-RMN (300 MHz, COCI, ) : ~ 6.90 (d, 1 H, J,., = 2.0 Hz, Ar-2) , 6.84 (d, 1H, J,., = 8.1 Hz, Ar
5) , 6.73 (dd, 1H, J,., = 8.1 Hz, J,., = 2.0 Hz, Ar-6) , 4.41 (dd, 1H, J= 7.6 Hz, J= 4.5 Hz, CH) , 4.21-4.10 (m, 2H, CH, ) , 3.40-3.24 (m, 2H, OCH, CH, ) , 2.06 (s 3H, OAe) , 1.59 (sextete, 2H, J = 7.4 Hz, OCH, CH, ) , 0.88 (t, 3H, J = 7.4 Hz, CH, ). "C-RMN (75.5 MHz, COCI, ) : ~
171.9 (CO) , 144.4 (Ar-4) , 144.3 (Ar-3) , 131.2 (Ar-1) , 120.0 (Ar-6) , 115.5 (Ar-5) , 113.9 (Ar2) , 79.7 (CH) , 71.1 (CH, ) , 68, 4 (OCH, CH, ) , 23.1 (CH, CH, ) , 21.3 (OAe) , 10.8 (CH, ).
Acetato de 2- (3, 4-dihidroxlfenil) -2-butoxletilo (4d) OBu HO OAe
HO
Se disuelve el compuesto 3 (190 mg, 0.56 mmol) en BuOH (4 mL) y se añaden 190 mg
de extracto enzimatico obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6
(CECT 8464) y 380 mg de gel de silice (63--200 ~m) , calentándose a 60 'C durante 2
días. Se concentra a sequedad y se purifica por cromatografía en columna con AcOEt
Hex 1:2. Rendimiento: 91 mg, 61%, R, 0.6 (CH, CI, -MeOH 10:1).
' H-RMN (300 MHz, COCI, ) : ~ 6.90 (d, 1H, J,., = 1.9 Hz, Ar-2) , 6.84 (d, 1H, J,., = 8.0 Hz, Ar5) , 6.73 (dd, 1H, J", = 8.0 Hz, J,., = 1.9 Hz, Ar-6) , 6.50 (s, 1H, OH) , 5.95 (s, 1H, OH) , 4.44 (dd, 1 H, J= 7.7 Hz, J= 4.4 Hz, CH) , 4.22-4.10 (m, 2H, CH, ) , 3.45-3.28 (m, 2H, OCH, CH, ) ,
2.07 (s, 3H, OAc) , 1.55 (m, 2H, J = 6.6 Hz, OCH, CH, ) , 1.39-1.25 (m, 2H, CH, CH, ) , 0.86 (1, 3H, J= 7.3 Hz, CH, CH, ). " C-RMN (75.5 MHz, COCI, ) : ~ 172.1 (CO) , 144.4 (Ar-4) ,
144.3 (Ar-3) , 131.1 (Ar-1) , 120.0 (Ar-6) , 115.5 (Ar-S) , 113.9 (Ar-2) , 79.7 (CH) , 69.2 (OCH, CH, ) , 68, 4 (CH, ) , 32.0 (OCH, CH, ) , 21.3 (OAe) , 19.6 (CH, CH, ) , 14.2 (CH, CH, ).
2. (3, 4-Dihidroxifenil) -2-meloxietanol (5a)
OMe
HO OH
HO
A una disolución del compuesto 4a (54 mg, 0.24 mmol) en MeOH seco (1 mi) se añade Cs, C03 (231 mg, 0.72 mmol) y ascorbalo sódico (48 mg, 0.24 mmol) en presencia de Ar
y en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. Cuando se da por terminada la reacción se puriflca el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente,
por cromatografía en columna utilizando como eluyente CH, CI, -EtOH (1:0 ~ 1 :10). 10 Rendimiento: 23 mg, 53%, R, 0.2 (CH, CI, -MeOH 10:1).
'H-RMN (300 MHz, 0, 0) : 66.94 (d, 1 H, J,.• = 8.1 Hz, Ar-5) , 6.89 (d, 1 H, J,.•= 2.0 Hz, Ar2) , 6.80 (dd, 1H, J •. , = 8.1 Hz, J6., = 2.0 Hz, Ar-6) , 4.29 (dd, 1 H, J= 7.5 Hz, J= 4.6 Hz, CH) ,
3.71 (dd, 1H, J= 11.9 Hz, J = 7.5 Hz, CH, ) , 3.64 (dd, 1H, J = 11.9 Hz, J = 4.6 Hz,
CH, ) , 3.27 (s, 3H, OMe). " C-RMN (75.5 MHz, 0, 0) : 6 144.1 (Ar-1) , 144.0 (Ar-2) , 130.5 (Ar-4) , 119.8 (Ar-5) , 116.1 (Ar-6) , 114.7 (Ar-3) , 83.6 (CH) , 65.0 (CH, ) , 56.0 (OMe).
2. ( 3, 4-0ihidroxifenil) -2-eloxielanol (5b) OE!
HO OH
HO
A una disolución del compuesto 4b (25 mg, 0.10 mmol) en MeOH seco (1 mi) se anade Cs, C03 (66 mg, 0.20 mmol) y ascorbato sódico (20 mg, 0.10 mmol) en presencia de Ar y
en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente, 25 por cromatografía en columna utilizando como eluyente CH2Clr EtOH (1 :0 -1:10).
Rendimiento: 12.4 mg, 62%, R, 0.3 (CH, CI,. MeOH 10:1).
'H-RMN (300 MHz, CO, OO) : ~ 6.91 (d, lH, J,.•= 8.1 Hz, Ar-5) , 6.88 (d, lH, J".= 1.8 Hz, Ar-2) , 6.80 (dd, lH, J., , = 8.1 Hz, J.". 2.0 Hz, Ar-6) , 4.38 (dd, lH, J= 7.7 Hz, J= 4.4 Hz, CH) , 3.70 (dd, 1H, J= 11.7 Hz, J= 8.0 Hz, CH, ) , 3.61 (dd, 1H, J = 11.7 Hz, J= 4.4 Hz, CH, ) 3.48 (e, 2H, J= 6.9 Hz, CH, CH, ) , 1.19 (t, 3H, J= 7.1 Hz, CH, CH, ). 13C_RMN (75.5
MHz, CO, QO) : 15 146.1 (Ar-4) , 145.9 (Ar-3) , 133.1 (Ar-l) , 121.3 (Ar-6) , 117.7 (Ar-5) , 116.3 (Ar-2) , 83.9 (CH) , 67.3 (CH, ) , 66.3 (CH, CH, ) , 16.1 (CH, CH, ).
2. ( 3, 4-0ihidroxifenil) -2-propoxietanot (5c) OPr
HO~OH
HO) l)
A una disolución del compuesto 4c (55 mg, 0.22 mmal) en MeOH seco (1 mi) se añade Cs, CO, (66 mg, 0.20 mmol) y ascobalo sódico (44 mg, 0.22 mmol) en presencia de Ar y
en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente,
por cromalografia en columna ulilizando como eluyenle (AcOEI-hexano 1: 1). Rendimiento: 14.5 mg, 31%, RF 0.1 (AcOEl-Hex 1:1).
'H-RMN (300 MHz, CO, OO) : ~ 6.78 (d, lH, J".= 1.9 Hz, Ar-2) , 6.76 (d, lH, J,.•= 8.0 Hz, Ar-5) , 6.65 (dd, lH, J•., = 8.0 Hz, J., , = 2.0 Hz, Ar-6) , 4.22 (dd, lH, J= 8.0 Hz, J= 4.1 Hz, 20 CH) , 3.64 (dd, 1H, J = 11.6 Hz, J= 8.0 Hz, CH, ) , 3.51 (dd, lH, J= 11.6 Hz, J= 4.1 Hz, CH, ) , 3.37-3, 29 (m, 2H, OCH, CH, ) , 1.61 (s, 2H, J = 7.2 Hz, OCH, CH, ) , 0.93 (1, 3H, J =
7.4 Hz, CH, ). 13C-RMN (75.5 MHz, CO, OO) : ~ 147.3 (Ar-4) , 146.9 (Ar-3) , 133.3 (Ar-1) ,
120.6 (Ar-6) , 117.0 (Ar-5) , 115.8 (Ar-2) , 85.2 (CH) , 72.5 (CH, ) , 68.9 (OCH, CH, ) , 24.9 (OCH, CH, ) , 11.8 (CH, ).
2. (3, 4-dih idroxifenil) -2-butoxietanol (5d)
OBu
HO~OH
HO) l)
A una disolución del compuesto 4d (78 mg , 0.29 mmol) en MeOH seco (2 mi) , se añaden ascorbato sódico (58 mg, 0.29 mmol) y Cs, CO, (280 mg, 0.88 mmol) y se agita a temperatura ambiente, en oscuridad y atmósfera de argón durante 3 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el 5 disolvente, por cromatografía en columna utilizando como eluyente AcOEt-Hex (1 : 1).
Rendimiento: 28. t mg, 43%, R, 0.3 (CH, CI, -MeOH 10:1). 'H-RMN (300 MHz, CDCI, ) : ~
6.84 (d, 1H, J,.•= 1.8 Hz, Ar-2) , 6.83 (d, 1H, J,.• = 8.0 Hz, Ar-5) , 6.72 (dd, 1H, J •. , = 8.0 Hz, J,., = 1.8 Hz, Ar-6) , 6.04 (sa, 3H, OH) , 4.29 (dd, 1H, J= 7.8 Hz, J= 4.4 Hz, CH) , 3.69-3.57
(m, 2H, CH, ) , 3.47-3.28 (m, 2H, OCH, CH, ) , 1.60-1.51 (m, 2H, OCH, CH, ) , 1.43-1.26 (m, 2H, CH, CH, ) , 0.88 (t, 3H, J= 7.3 Hz, CH, CH3). 13C-RMN (75.5 MHz, CDCI, ) : ~ 144.3 (Ar4) , 144.2 (Ar-3) , 131.8 (Ar-1) , 119.9 (Ar-6) , 115.7 (Ar-S) , 114.1 (Ar-2) , 82.5 (CH) , 69.2 (OCH, CH, ) , 67.6 (CH, ) , 32.2 (OCH, CH, ) , 19.7 (CH, CH, ) , 14.2 (CH, CH, ).
Ejemplo 3.1.3.
La desacilación (alcoholisis) del compuesto 6 (alcohol protocatecuico peracilado) con un grupo acetoxilo en posición bencilica catalizada por los extractos enzimáticos usando como disolvente un alcohol alifático de tipo ROH, también tiene lugar de manera totalmente regioselectiva en los ésteres fenólicos (Esquema 3). De manera similar al 20 comportamiento observado en el compuesto 3, en la posición bencilica el grupo aciloxi es sustituido por el grupo alcoxi procedente del alcohol usado como disolvente. Así, por ejemplo, usando como disolvente el MeOH se puede obtener el compuesto 7 de forma cuantitativa en 24 h. El compuesto 7 ha sido aislado previamente del caldo de lenmentación del hongo marino Y26-02 iY'Iu, H. H. et al. J Asian Nat Prod Res " , 74725 750; 2009).
ACO~OAC Extracto enzimático HO~OMe
•
ACO~ MeOH HO~
7
Esq
uema 3
4. (Metoximetil) benceno-1, 2-diol (7)
H0X)
I '-'::: OMe
HO -&
A una disolución del compuesto 6 (30 mg, 0.19 mmol) en MeOH (1 mi) se añaden 30 mg
de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6
(CECT 8464) y 60 mg de gel de sílice (63-200 ~m) y se calienta a 40 oC durante 24 h. Se concentra a sequedad y se purifica mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1 :1) obteniéndose el producto como un sirupo rojizo. Rendimiento: 29 mg, cuantitativo RF
0.6 (AcOEI-hexano 1:1).
' H-RMN (300 MHz, CDC!, ) : ó 6.83-6.78 (m, 2H, Ar-3, Ar-5) , 6.70 (d, 1 H, J"s· 7.7 Hz, Ar6) , 4.30 (s, 2H, CH, ) , 3.33 (s, 3H, OMe).
Ejemplo 3.2. Reacción de acilación de compuestos fen61icos mediante catálisis enzimática para la obtención de polifenoles IIpofílicos.
Se llevaron a cabo reacciones de acilación (esterificación) regioselectiva de diversos polifenoles, preferentemente de polifenoles presentes en el aceite de oliva (Esquema 4).
Extracto HO~OHenzimático HO~OH ACO~OH
I • I
HO h !l.. J-.. AcO HO~+
O 9 10
HO~OAC ACO~OH
I +
HO AcO~
HO~OAC AcO~OAC
AcO ~ + HO~
13
OH Extracto if OH
HO~OH HOÁJ enzimático HO.!l..oJ-.. AcO ~~ l' OH ACO~OH + I HO A
14 DMF 15 16
OH OH
HO~OACACO~OH
I + I
HO AcO A
18
OH
HO~OAC
AcOÁJ
Esquema 4
Extracto
HO~OH HO h 20 enzimático • ) CoA HO~OH AcO h 21 +
HO~OAC HO h 23 +
HO~OAC + ACO~ 25
ACO~OAC AcO~ 6 Esquema 4 (continuación)
5 Dichos polifenoles son el compuesto 8 (hidroxitirosol) ,
ACO~OH
HO h
ACO~OH
AcO.d
ACO~OAC HO~
el compuesto 14 (3, 4
dihidroxifenilglicol) y el compuesto 20 (alcohol protocatecuico). Como agente acilante se empleo el acetato de isopropenilo, que a su vez actúan de disolvente del politenol y de sus derivados aeilados. La acilación se puede hacer en ausencia o presencia de un adsorbente del sobrenadante de los cultivos de las cepas de la invención, tal como celita.
Se obtienen mejores resultados con el extracto enzimático soportado sobre celita. Si el compuesto fenólico empleado es poco soluble en el agente acHante se puede utilizar OMF (N, N-dimetil formamida) como ca-disolvente. El resultado de la acilación se cuantifica mediante lH-RMN previa eliminación del sobrenadante o extracto enzimático que contiene las enzimas encargadas de llevar a cabo la reacción de acilación.
El producto mayoritario obtenido de la reacción de acilación (esterificación) del politenol hidroxitirosol (compuesto 8) tras 24 h (Tabla 1) es el compuesto 9 que es derivado monoacilado en posición 4 del anillo aromático. El compuesto 9 y su regioisómero en la posición 3 (compuesto 10) , se forman en la proporción de 2:1. Además, de los compuestos derivados monoacilados 2, 9 Y 10, se detectan, en menor cantidad, otros tres compuestos que son los derivados diacilado$ 11 , 12 Y 13. El grado de conversión oscila del 88 al 96%. Los resultados contrastan con la regioselectividad que se obtiene con la lipasa procedente de C. antarctica, que conduce exclusivamente al compuesto regioisómero 2, acilado en la cadena lateral.
La reacción de acilación (esterificación) del compuesto 14: 3, 4-dihidroxifenilglicol tras 24 h (Tabla 1) conduce a la obtención de una mezcla de los compuestos 15 y 16 que son 10$ derivados monoacilados en el anillo aromatico, y del compuesto 17 que es el derivado monoacilado en el extremo de la cadena lateral, en proporción 1:1:1, con los extractos de Terribacil/us sp. AE2B 122 (CECT8231) y Enterabacter sp. AE1 B89 (CECT 8462) , yen la relación 1:1:2 con Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8462) , Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 8464) y la lipasa pura de C. antarctica. El grado de conversión va del 53 al 70%. El menor grado de conversión se consigue con la C. antarctica. No se detecta la acilación del hidroxilo bencílico del compuesto 14 con ninguna de las enzimas, ni extractos enzimáticos.
La reacción de acilación (esterificación) del compuesto 20: alcohol protocatecuico tras 24 h (Tabla 1) conduce a la obtención de una mezcla de los derivados mono, di y triacilados. La relación de los derivados monoacilados en posición 4, 3 Y cadena lateral es sensible al extracto enzimático utilizado; asi, la proporciones son 1:1:1 para el sobrenadante del cultivo de Terribacil/us sp. AE2B 122 (CECT 8231) , 1:2:2 para el sobrenadante del cultivo de Enterabacter sp. AE1B89 (CECT 8462) , 1:3.5:1 para el sobrenadante del cultivo de Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8462) , 1:3:2 para el sobrenadante del cultivo de Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 8484) y 1:0:16 para la lipasa de C. antareliea. El grado de conversión va del 77 al 81% para los 4 sobrenadantes ensayados, mientras que con la lipasa de C. antárctica, la conversión es cuantitativa. La formación del compuesto 6: derivado triacetilado, solo se detecta con la lipasa de C. antártica.
Tabla 1. Porcentaje determinado por 'H-RMN en la mezcla de reacción formada por acilación de 105 compuestos 8, 14 Y 20 con extractos de los sobrenadante obtenido del cultivo de las cepas bacterianas de la invención o de una lipasa comercial.
Acllación del hidroxitirosol (compuesto 8). Se disuelve hidroxitirosol (50 mg) en acetato de isopropenilo (3.0 mi) y se añaden celita (50 mg) y el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 oC y en oscuridad 24 horas. Se filtra la disolución y se concentra a sequedad. Se analiza por ' H-RMN el resultado de la acilación (Ver Tabla 1).
Acilación del 3, 4-dihidroxifenilglicol (compuesto 14). Se disuelve 3, 4dihidroxifenilglicol (50 mg) en una mezcla de DMF/acetato de isopropenilo 1:1 (6.0 mi) y se añade el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 oC y en oscuridad 24 horas. Se elimina el disolvente y
el residuo que resulta se redisuelve en acetona seca y se filtra. Por último, se concentra a sequedad. Se analiza por 1H-RMN el resultado de la acilación (Ver Tabla 1)
Acilación del alcohol protocatecuico (compuesto 20). Se disuelve el alcohol (50 mg) en acetato de isopropenilo (3.0 mi) y se añade el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 oC y en oscuridad 24 horas. Se filtra la disolución y se concentra a sequedad. Se analiza por 1H_ RMN el resultado de la acilación (Ver Tabla 1)
Ejemplo 4. Evaluación de la capacidad antioxidante de los polifenoles lipófilos 15 descritos en la presente invención.
A continuación se representa los resultados obtenidos en la prueba de actividad antirradicalaria frente al OPPH para los compuestos 4a-4d, Sa-Sd, 2 y 14. La actividad antirradicalaria expresada como EC50 frente al OPPH (radical 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo)
representa la cantidad de antioxidante necesario para disminuir la concentración de OPPH al 50%. Se utilizó el método de Sánchez-Moreno (Sánchez-Moreno, C. et al. J. Sci. Food Agric. 1998, 76, 270-276) con las modificaciones de Jiménez y col. J. Agric. And Food Chem. 2005, 53, 5212-5217).
De los nuevos compuestos sintetizados, el más activo resultó ser el compuesto 4a con una actividad parecida al acetato de hidroxitirosHo (Compuesto 2) , aunque menor que el 3, 4-dihidroxifenilglicol (compuesto 14) (Tabla 2 y Figura 2)
Tabla 2. Actividad antirradicalaria frente a DPPH expresada en valores de ECso (JlM)
4a 14.5 ± 0.500
4c 21.7 ± 0.480
Tabla 2. Actividad antirradicalaria frente a DPPH expresada en valores de ECso (J.lM)
5b 20.3 ± 1.73
5d 16.7 ± 1.81
12.0 ± 0.550
Ejemplo 5: Preparación de carbohidratos parcialmente acilados. Reacciones de acilación/desacilación de carbohidratos catalizadas por los extractos enzimáticos 5 obtenidos de los cultivos de las cepas Terribacil/us sp. AE2B 122 (CECT 8231) , Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 8464) , Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462).
Ejemplo 5.1. Se ha llevado a cabo la reacción de desacetilación del compuesto 27 (metil (t-D10 glucopiranósido per-O-acetilado) por alcoholisis en medio metanólico catalizada por los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de las cepas bacterianas Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231) , Enterobaeter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Baeillus sp. HR21 -6 (CECT 8464). Se han comparado los resultados obtenidos con las cepas de la invención con los resultados obtenidos con las lipasas comerciales procedentes de Pseudomonas cepacea 15 30 U/mg (Sigma-Aldrich, EC 232-619-9) y C. antarctica soportada sobre resina acrílica 5, 000 U/g (Sigma-Aldrich, EC 3.1.1.3, Novozyme 435) (Esquema 5).
El medio de reacción consiste en una suspensión del compuesto 27 y del extracto enzimático o de la lipasa correspondiente, en metanol o en metanol deuterado (COJOO).
Una vez que se da por finalizada la reacción, las proporciones entre los distintos compuestos detectados en el crudo de reacción (compuestos 27-29) se obtienen a partir del correspondiente espectro de 1H_RMN en CDJOD, tras la eliminación del extracto enzimático o de las enzimas correspondientes.
OH
Extracto enzimático HO
• HO~.....,.....
CD30D, t.a.
28 29
Esquema 5
El extracto enzimático procedente de TelTibacil/us sp. AE2B 122 (CECT 8231) sólo 5 permitió un 28% de conversión (Tabla 3) tras 12 h de reacción. Dicha conversión resultó ser totalmente regioselectiva, ya que sólo se observó la presencia del compuesto 28 (derivado metíl 6-O-acetil-a. D-glucopiranósido) , junto con el compuesto 27 utilizado como materia prima (72%).
Destacan los extractos enzimaticos procedentes de los cultivos de Enlerobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 8484) , que mostraron un 84 y un 86'% de conversión, respectivamente en un tiempo de reacción sensiblemente inferior (6 h). Dichos extractos enzimáticos muestran una tendencia elevada a la desacetilación completa, para dar el compuesto 29 (metíl a-D-glucopiranósido) , que se encuentra en una proporción en la mezcla del 64% o del 65%, respectivamente. El compuesto 28 que es el derivado acetilado en e-6 se encuentra en una proporción del 20 y 21 %, respectivamente.
Las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antarctica, estando esta última soportada sobre resina acrílica, no condujeron a reacción alguna, a pesar de llevar a cabo la reacción a una temperatura sensiblemente superior (hasta 60 oC) y usar una mayor proporción de enzima (hasta 1.5 veces el peso del monosacárido).
Tabla 3. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 27 catalizada por los sobrenadantes de los cultivos de las cepas de la invención o por lipasas comerciales Porcentaje calculado (RMN)
(Sigma-Aldrich, EC 232-619-9)
..., -. • • V":'!'-rw-' ~ ~f" -, ""''"' '., -~ ~ ~
....., , ", , '~'. ' ".~ ~' ~
- " í :-. "'1'\<, A.., !
" "".. ~,. ,
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Oesacilación del compuesto 27 (metiI2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a-o-glucopiranósido).
Una suspensión del compuesto 27 (6.0 mg, 17 ~mol) y del sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en COlOD (1.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En el caso de las lipasas procedentes de p, cepacea y C. antaretica soportada sobre resina acrílica, se usó una relación monosacárido/lipasa 1: 1.5, una temperatura de 60 oC y un tiempo de reacción de 22 h. En la Figura 3 se muestra el espectro de lH-RMN de la mezcla de reacción CHRMN (300 MHz, CD, OD) ]; los resultados se muestran en la Tabla 3.
Ejemplo 5.2. Los sobrenadantes de los cultivos de las cepas descritas en la presente invención,
también permiten la desacetilación parcial del compuesto 30 (trehalosa octaacetilada) , usando las mismas condiciones que en el caso del monosacárido 27 (Esquema 6).
OAC
AcO O
~
AcO HO
OAc ~.... 'I
A~~O\ O
AcO 'CO~~:.-~ Extracto 31
enzimático
O
• + CD30D, t.a.~OR1 AcO R'0 O R0
' HO
AcO
OR' ~..- "\
O
= Ac
R' 33 R=H HO HO
'
Esquema 6
Los extractos enzimáticos de Terribacíllus sp. AE28 122 (CECT 8231) , Enterobacter sp. AE1889 (CECT8462) y Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) , permitieron una conversión entre el 89-91% en un tiempo de reacción comprendido entre 7-12 h (Tabla 4). Se observó la preferencia de las enzimas presentes en los sobrenadantes de 105 cultivos de las cepas mendonadas anteriormente por llevar a cabo la desacetilación sobre uno de los anillos de glucopiranosa (Tabla 4) , permitiendo la detección de dos compuestos nuevos,
el compuesto 31 (2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetil-a, a-D-trehalosa) (26-35%) y el compuesto 32
(2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a, a-D-trehalosa) (38-40%) , de los que no existen antecedentes en el estado de la técnica.
Cabe destacar, además, que el compuesto 32 es el resultado de una desimetrización en tan sólo dos etapas (acetilación y desacetilación selectiva) de la trehalosa. La desimetrización es el proceso mediante el cual se consigue que la trehalosa per-Oacetilada 30 pierda su simetría original y se transforme en 31 y 32, donde una unidad de azúcar se encuentra acetilada y la otra total o parcialmente desacetilada. Este proceso se ha conseguido en dos etapas (acetilación de la trehalosa comercial y desacetilación regioselectiva con el extracto enzimático de la invención y representa un número de etapas muy inferior con respecto a cualquier ruta puramente química conocida y utilizada en el estado de la técnica para el mismo fin.
Tabla 4. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 30 (trehalosa octaacetilada) catalizada por los sobrenadantes de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención o por I¡pasas comerciales Microorganismo llipasa t (h)
Lipasa P. cepacea 100%
0%
0%
0%
(Sigma-Aldrich, EC 232-619-9)
Este mismo ensayo también se llevó a cabo con fines cuantitativos utilizando el extracto enzimático de Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) , lo cual permitió el aislamiento de los compuestos 31 y 32 (29% Y 49%, respectivamente, tras purificación cromatográfica) y su caracterización.
Es destacable que los compuestos 31 y 32 pueden emplearse como materias primas en la preparación de glicolípidos derivados de trehalosa, que presentan interés como vacunas frente a la tuberculosis, provocada por el patógeno Mycobacterium tuberculosis (M. Gilleron el al. J. Exp. Med. 2004, 199, 649-659).
De nuevo, cuando la reacción se llevó a cabo usando las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antarctica soportada sobre resina acrílica, no se observó reacción alguna.
Desacilación del compuesto 30 (per-O-acetil-a, a-o-trehalosa)
Método A. Una suspensión de per-O-acetil-a, a-D-trehalosa (compuesto 30) (6.0 mg, 8.8 ~mol) y del sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 5 mg) en C030D (1.0 rnL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En la Figura 4 se muestra el espectro de lH-RMN de la mezcla de reacción ['H-RMN (500 MHz, CO, OO) ]; los resultados se muestran en la Tabla 3.
Método B. Una suspensión de per-O-acetil-a, a-o-trehalosa 30 (60.0 mg, 88, 0 IJmol) yel
sobrenadante del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 CECT 8464 (30.0 mg)
en MeOH (20 mL) se agita a temperatura ambiente durante 3.5 h. A continuación, se purifica mediante cromatografía en columna (CH2CI2 _ CH2Cb-MeOH 1:2) para dar lugar a 31 y 32 como sirupos.
2, 3, 4, 6, 6'·Penta·O·acetil-a, a·D·trehalosa (compuesto 31)
AcO...., ¡--...:~AcO~.....,.~
HO
AcO OH
Rendimiento: 14 mg (29%). 'H-RMN (500 MHz, CO, OO) ¡; 5.57 (dd. 1H. J,., = 10.2 Hz,
J".= 9.5 Hz, H-3) , 5.30 (d, 1H. J , = 3.7 Hz, H-1). 5.07 (dd, 1H. J., , = 10.3 Hz, H-4) , 5.04 "
(d, 1H, J1', 2'= 3.7 Hz, H-1 ') , 4.94 (dd, 1H, H-2) , 4.43 (ddd, 1H, J5.e;, = 4.1 Hz, J~.6b= 2.4 Hz, H-5). 4.28 (dd, 1H. J,., , ,.= 2.0 Hz. J", ", = 11.7 Hz. H-6a·) , 4.24 (dd, 1H, J", , , = 12.4 Hz, H· 6a). 4.15 (dd. 1H. J" , , , , = 7.3 Hz, H-6b') , 4.12 (dd, 1H, H-6b) , 3.82 (ddd, 1H. J•., , '= 9.7 Hz, H-5') , 3.74 (dd, 1H, J"., , = 9.7 Hz. J,..•, = 9.1 Hz, H-3') , 3.51 (dd. 1H, H-2') , 3.26 (dd, 1H, H4'). 2.08, 2.05 (x2) , 2.01 , 2.00 (55, 3H cada uno, 50Ac) ; 13C-RMN (125.7 MHz. CO, OO) 8
172.7, 172.4, 171.7. 171.5.171.3 (5 COl. 96.3 (C-1'). 92.8 (C-1). 74.6 (C-3'). 72.8 (C-Z') ,
72.2 (C-5'). 72.0 (C-4·). 71.9 (C-2) , 71.5 (C-3). 69.9 (C-4). 69.1 (C-5). 65.0 (C-6·). 62.9 (C
6).
2, 3.4.6-Tetra-O-acetil~a-o-trehalosa (compuesto 32).
AcO.- -"lN:...-
AcO~_~""'"
HO
HO HO
Rendimiento: 22 mg (49%). 'H-RMN (500 MHz, CD, OD) S 5.55 (dd, lH, J,., = 10.2 Hz,
J,..= 9.5 Hz, H-3) , 5.34 (d, lH, J", = 3, 7 Hz, H-l) , 5.07 (dd, lH, J., ' = 10, 3 Hz, H-4) , 5, 05 (d, lH, J", z= 3, 3 Hz, H-l') , 4.96 (dd, lH, H-2) , 4.46 (ddd, lH, J", , = 3, 8 Hz, J, , 5O= 2.4 Hz, H-5) , 4.23 (dd, lH, J" , 5O= 12.4 Hz, H-6a) , 4, 12 (dd, lH, H-6b) , 3, 75 (dd, lH, J,., , , , = 2.1 Hz, J,., , 5O'= 11, 3 HZ, H-6a') , 3, 75 (t, lH, J" ,., = 9, 7 Hz, H-3') , 3, 70 (ddd, lH, J.", '= 9, 8 Hz, J", 5O' =
5.7 Hz, H-5') , 3, 65 (dd, lH, H-6b') , 3, 50 (dd, lH, H-2') , 3.31 (m, lH, H-4') , 2.06, 2, 05, 10 2, 01 , 1.99 (45, 3H cada uno, 40Ac) ; " C-RMN (125.7 MHz, CD, OD) S 172.4, 171.7, 171.6,
171.3 (4CO) , 96-8 (C-l') , 93.3 (C-l ) , 74.7 (C-3', C-5') , 72.9 (C-2') , 71.7 (x2) , 71.6 (C-2, C3, C-4') , 69, 9 (C-4) , 69, 0 (C-5) , 62.9 (C-6) , 62, 6 (C-6')
Ejemplo 5.3
En la presente invención también se llevó a cabo el proceso de desacetilación parcial del compuesto 34 (sacarosa octaacetilada) (Esquema 7) , usando las mismas condiciones que en el caso del monosacarido 27.
AC, Rc~ OAc
cO
OH
AcO O
OAc
Ac~ Extracto
AcAcO
enzimático 35 OH
OAc +AcO O CD30D, t.a. OAc
OAc OH
OAc ACRc~
OH
AcO O OAc
OH
Esquema 7
Los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de Teffibacillus sp. AE28122 (CECT 8231) ,
En/erobac/er sp. AE1B89 (CECT 8462) y Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8464) permitieron una conversión comprendida entre el 82-90% (Tabla 5). Se observó la preferencia de las enzimas presentes en dicho sobrenadantes por llevar a cabo la desacetilación del anillo de truetoturanosa (Tabla 5) , permitiendo la detección de los compuestos 35 (2, 3, 4, 6, 1', 6'
hexa-O-acetilsacarosa) y 36 (2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetilsacarosa).
Adicionalmente, se observó una mayor conversión (90%) en un tiempo de reacción inferior (4h) para el caso del sobrenadante obtenido del cultivo de la cepa de Terribaci/lus sp. AE2B122 (CECT 8231).
Tabla 5. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 34 (sacarosa octaacetilada) catalizada por los sobrenadantes de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención o por lipasas comerciales Porcentaje calculado (RMN) Microorganismo/lipasa t (h)
35 36
I I CECT 8231 10% 38% 52% 4 CECT 8462 18% 43% 39% 7.5 CECT 8464 14% 44% 42% 8.5 Upasa P. cepacea 100% 0% 0% 10 (Sigma-Aldrich, EC 232-<>19-9)
Lipasa C. antárctica 100% 0% 0% 10 (Novozyme 435)
Para el aislamiento de los compuestos mencionados previamente, también se realizó este mismo ensayo con el sobrenadanle obtenido de los cultivos de Bacillus sp. HR21-6 5 (CECT 8464) y se efectuó una purificación cromatográfica, para dar lugar a los compuestos 35 (26%) Y36 (27%).
Con las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. anlarctica soportada sobre resina acrllica, tampoco se observó reacción alguna para este sustrato.
Desacilación de per-O-acetilsacarosa (compuesto 34)
Método A. Una suspensión de per-O-acetilsacarosa (compuesto 34) (6.0 mg, 8.8IJmol) y
el sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en C0300 (1.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En la Figura 5 se muestra el espectro de 1H-RMN de la mezcla de reacción CHRMN (500 MHz, C0300) ) ; los resultados se muestran en la Tabla 4.
Método B. Una suspensión de per-D-acetilsacarosa (compuesto 34) (50.0 mg, 74 IJmol) y
el sobrenadante del cuttivo de la cepa Baciffus sp. HR21-6 CECT 6464 (25.0 mg) en MeOH (16.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante 4h. A continuación, se purifica mediante cromatografía en columna (CH2Ch -+ CH2Cb-MeOH 1:2) para dar lugar al compuesto 35 (11.2 mg, 26%) yal compuesto 36 (10.9 mg, 27%) como sirupos.
Ejemplo 5.4. Acilación regioselectiva de carbohidratos Los extractos enzimaticos de las cepas bacterianas descritas en la presente invención también permiten las reacciones de acilación regioselecliva de carbohidratos. Así, por ejemplo la acilación, preferentemente acetilación del compuesto 29 (melil a-O
glucopiranósido) usando acetato de isopropenilo como agente acilante, el extracto enzimálico de Bacillus stratosphericus como catalizador enzimático y DMF como codisolvente (Esquema 8) , ha dado lugar a la obtención de los compuestos 37 y 28, que presentan grupos adlas en las posiciones 4 y 6, respectivamente.
OH JO~
HO HO "",..~.:,.- --=----> HO HO + AcO
~ Extracto enzimático "'....~....:,. HO"'....~....:,. OH Bacilfus stratosphericus OMe DMF
28 37 60'C
Esquema 8
A pesar de llevar a cabo calentamientos prolongados (60 oC durante 105 h) , la conversión es del 49%, aunque con una alta regioselectividad, ya que se observa la presencia del producto monoacetilado en C-6 (compuesto 28) (13%) , Yel compuesto 37 (metil4, 6-di-Oacetil-Cl-D-glucopiranósido) como derivado acetilado mayoritario (36%) , no detectado en los correspondientes ensayos de desacetilación.
Acilación del metiI2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a-o-glucopiranósido (compuesto 29) Una disolución del compuesto 29 (6.0 mg, 0.017 mmol) , el sobrenadante del cultivo de la cepa Bacil/us sp. HR21-6 CECT 8464 (3.0 mg) y acetato de isopropenilo (0.5 mL) en DMF (0.3 mL) se calienta con agitación a 60 oC durante 105 h. A continuación se concentra a sequedad y el residuo se analiza mediante lH-RMN, mostrando una mezcla de los compuestos 28, 29 Y 37 en una proporción de 13%, 51% Y 36%. respectivamente.
