la presente invención se refiere a las cepas microbianas de los géneros T erribacillus denominada Te"ibacillus sp. AE2B122, Bacíllus, denominada Bacillus sp. HR21-6, Enlerobacter, denominada Enferobacfer sp. AE1889 Y Pseudomonas, denominada Pseudomonas sp. AE2B120 con capacidad de llevar a cabo reacciones de alcoholisis y esterificación regioselectivas y el uso de las mismas en reacciones de acilación y/o desacilación, en general y más específicamente, en reacciones de acilación y/o desacilación para la producción de carbohidralos y politenoles lip6filos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria. Asimismo, la invención también se refiere a un método para obtener estas cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo estas reacciones. Así como la obtención de regioisómeros de los azúcares y polifenoles parcialmente acilados. Por lo tanto, la invención es de utilidad en los campos de la Microbiología Industrial e Ingeniería Química, en particular, en el sector de la producción de compuestos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La protección y desprotección quimio-, regio-y estereoselectiva constituye una de las estrategias más utilizadas en síntesis orgánica, especialmente valiosa en la síntesis de moléculas complejas y pOlifuncionales, entre las que se encuentran los carbohidratos y los polifenoles. Aunque son muchos los avances que se han conseguido en este campo en las últimas décadas, aún se está muy lejos de alcanzar la perfección de las reacciones naturales, por lo que este aspecto sigue siendo hoy en día uno de los grandes retos en síntesis orgánica.
La biocatálisis, y particularmente el uso de enzimas hidrolíticas como las lipasas, constituye una alternativa a los métodos convencionales en síntesis orgánica y puede ser útil para realizar protecciones y desprotecciones estéreo-y regioselectivas en carbohidratos (Filice. M. et al. Nat. Protoc. 7, 1783-1796; 2012) Y politenoles (Torres, P. et al. J. Agric. Food ehem. 58, 807-813; 2010). Determinados carbohidratos y politenoles son de interés en la industria farmacéutica y alimentaria como se explica a continuación.
Diversos estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto los efectos beneficiosos para la salud que se derivan del consumo de alimentos ricos en antioxidantes, ya que previenen el desarrollo de enfermedades crónicas degenerativas, incluidas enfermedades cardiovasculares y cáncer (Grez el a!., Curr Opin Pharrnaco/1 04, 362-368; 2010). Dichos compuestos evitan los daños producidos por el estrés oxidativo en ciertas biomoléculas (ADN, lípidos, proteínas) , que se encuentran asociados con un incremento en el riesgo de problemas cardiovasculares, cáncer y otras enfermedades crónicas (Cilla el al., Ann Nutr Melab 54, 35-42; 2009).
Algunos estudios demuestran que los compuestos polifenólicos naturales son, in vitra, más efectivos como antioxidantes que la vitamina A o C (Miller et al., J Nulr Enviran Med 12, 39-51; 2002) , por lo que existe un creciente interés de este tipo de compuestos, en especial aquellos que pueden ser obtenidos a partir de subproductos generados en la industria alimentaria. En este contexto, destaca el hidroxitirosol, que predomina en el olivo (Olea europea) , tanto en las hojas como en su fruto, ya sea libre o en forma de derivado, y que es un compuesto fenólico de una reconocida eficacia como antioxidante (Femández-Bolaños et al. , Curr Org Chem 12, 442-463; 2008).
En los últimos años, se ha comprobado que este antioxidante natural posee además importantes propiedades biológicas: antiagregante plaquetario (González Correa et al. Br J Nulr, 101, 1157-1164, 2009) , antiinflamatorio (Gong el al., Phytolher Res 23, 646-650, 2009) , cardioprotector (Poudyal, H.J. Nulrition 140, 946-953; 2010) , antimicrobiano (Medina et al. J Agric Food Chem 55, 9817-9823; 2007) , Y anti-VIH (Lee-Huang et al., Biochem Biophys Res Commun 354, 872-878; 2007). Actualmente, son numerosas las investigaciones que intentan demostrar el beneficio de este compuesto en el tratamiento de ciertas enfermedades neurodegenerativas (Schaffer et a!. , J Agric Food Chem 55, 5043-5049, 2007) , Y de la piel (Guo et al,. Phytolher Res 24, 352-359; 2010) , en la prevención del ictus cerebral isquémico y en la prevención y tratamiento del cáncer (Sirianni et al., Mol Nulr Food Res 54, 833-840, 2010).
la aceituna contiene, además de hidroXitirosol, una amplia variedad de compuestos fenólicos, tales como el 3, 4-dihidroxifenilglicol (Brenes, M.J. Agric Food Chem 47, 35353540; 1999) y el alcohol protocatecuico (Saitta, M. et al. Food Chem 112, 525-532, 2009).
OH
HO
HO~OH
OH HO~OH HOA/ HO
HOA/
Hidroxitirosol 3, 4-Dihidroxifenilglicol Alcohol protocatecuico Diversos estudios sobre los compuestos fenólieos del olivo muestran la importancia de los aeil derivados en la cadena lateral de estos compuestos polifenólicos naturales, ya que el 5 carácter lipófilo permite su dispersión en aceite, el atravesar membranas celulares y la captación por las células, y la protección de constituyentes de membrana y de lDL (Gupta et al., Adv. Food Nutr. Res. 69, 183-217; 2013). Es decir, se mejoran las propiedades flsico-químicas y se conservan las propiedades antioxidantes. Por lo tanto, es de gran interés para la industria alimentaria la obtención de nuevos antioxidantes lipofílicos mediante modificación de politenoles naturales. Estos análogos estructurales lipófilos tienen una mejor biodisponibilidad, son más eficaces que los polifenoles naturales utilizados como material de partida, y son útiles en la formulación de "alimentos funcionales" que presentan efectos beneficiosos para la salud.
Bouallagui y colaboradores (Bouallagui et al. , Appl Biochem Biotechnol 163, 592-599, 2011) han descrito la producción enzimática de hidroxilirosol acetato e hidroxitirosol oleato usando la lipasa de C. antarctica (Novozym 435) , obteniendo compuestos con actividades biológicas optimizadas en cuanto a la biodisponibilidad y actividad antioxidante. la acilación catalizada con lipasa de C. antarctica B tiene lugar quimioselectivamente sobre el
hidroxilo de la cadena alifática frente a los hidroxilos aromáticos (TarTes de Pineda et al. , Tetrahedron 61 , 7654-7660; 2005).
Por otra parte, azúcares esterificados parcialmente o con diferentes funciones en los distintos carbonos, constituyen importantes "building blocks· para la sintesis de una amplia 25 variedad de derivados más complejos. Asi por ejemplo, los monosacáridos y oligosacáridos con un único hidroxilo libre son compuestos intermedios para la sintesis de heterooligosacáridos de interés biomédico y actividad farmacológica como antitumorales,
antiinflamatorios, ele. (Plou et al., J Biotechnoi 96, 5~6; 2002).
Desafortunadamente, el elevado número de grupos hidroxilo en los azúcares y su similar reactividad hace que en muchos casos no sea posible introducir regioselectivamente determinadas funciones, o requiera reCt:lrrir a una larga y costosa secuencia de slntesis, para llevar a cabo transformaciones en solo alguno de los grupos hidroxilo.
A pesar del interés de las reacciones de carbohidratos biocatalizadas con lipasas, los antecedentes de casos de protección o desprotección regioselectiva de monosacáridos en posiciones distintas a C-1 y e-6 son muy escasos. Asimismo, son también muy pocos los ejemplos en los que se describen reacciones de protecciónJdesprotección regioselectiva en uno de los dos carbonos primarios (C-6 y C-6<) de disacáridos de hexosas.
Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de encontrar nuevas enzjmas capaces de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación regioselectivas con la finalidad de obtener nuevos compuestos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
Para superar los problemas existentes en el estado de la técnica mencionados previamente, un primer aspecto de la presente invención describe cepas microbianas seleccionada de la lista que comprende cepa de BacJ1/us depositada en la Colección Española de Cuttivos Tipo (CECn con el número de acceso CECT 8464. cepa de En/erobacler depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECn con el número de acceso CECT 8462, cepa de Pseudomonas depositada en la Colección Española de Cultivos TIpo (CECn con el número de acceso CECT 8463 y cepa de TefTibacillus deposilada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8231 que tienen la capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de acilación (esterificación) y/o desacilación (alcoholisis) , preferentemente sobre polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales, lo que permite la obtención de una colección de compuestos de interés acilados y/o eterificados en diferentes posiciones. AsI, en base a la capacidad de estas bacterias de llevar a cabo estas reacciones de esteriflcación y alcoholisis, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán explicados en detalle a continuación.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al extracto enzim~tico obtenible a partir del cultivo de cualquiera de las cepas bacterianas descritas en la presente invención.
5 Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso de las cepas bacterianas o al uso del extracto enzimático de la invención como catalizadores para las reacciones enzimáticas de acilación y/o desacilación de compuestos, siendo preferidos los compuestos polifenoles y/o carbohidratos o sus derivados acilados.
10 '5 20 Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un método para obtener derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos mediante reacciones enzimáticas de acilación o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas: a) poner el extracto enzimático según se describe en la presente invención, en contacto con polifenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados acilados, en presencia de un agente acilante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones enzimáticas de acilación o desacilación, respectivamente; y b) purificar los derivados adlados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos en la etapa (a). Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al compuesto de fórmula general (1)
OR, HO~OR2
25 HO.Jl.) (1)
30 donde: R, es un grupo alquilo (C, -C, , ) , un grupo alquenilo (Cr C, , ) , un grupo alquinilo (C, -G, , ) , o un grupo arilalquilo; y R2 es un grupo acilo (·COR3) , donde R3 es un grupo alquilo C, -C2Q, o un hidrógeno.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula general (1) descrito previamente para la elaboración de un medicamento.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de 16nmula general (1) segun se ha descrito previamente junto con un vehículo farmacéulicamente aceptable.
Otro aspecto descrito en la presente invención hace referencia al uso de al menos un compuesto de fórmula general (1) según se ha descrito previamente para la elaboración de una composición alimenticia.
Otro aspecto descrito en la presente invención hace referencia al uso no terapéutico de al menos un compuesto de fórmula general (1) según se ha descrito previamente, como antioxidante, preferiblemente alimentario, o como componente de composiciones cosméticas.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a una composición alimenticia o cosmética que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1) segun se ha descrito previamente.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (1) segun se ha descrito previamente a lo largo de la presente invención, que comprende:
a. la reacción enzimática del compuesto 3, 4-dihidroxifenilglicol peracilado con R, OH; o b. la reacción enzimática del compuesto 3, 4-dihidroxifenilglicol peracilado con R10H y posteriormente la reacción con metanol del compuesto obtenido en el paso (a) bajo catálisis básica;
donde R1 es un grupo alquilo (C1-C20) , un grupo alquenilo (Cr C20) , un grupo alquinilo (Cr C20) , o un grupo arilalquilo; segun se ha definido para el sustituyente R1 del compuesto general de fónmula (1).
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula 2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetil-a, a-o-trehalosa o 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a, a. D-trehalosa, así como al uso de dichos compuestos como intermediarios de reacción para la síntesis de derivados de trehalosa, así como en la preparación de análogos de glicolipidos presentes en Mycobacterium tuberculosis.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos 2, 3, 4, 6, 6'-penta-G-acetihx, a-o-trehalosa o 2, 3, 4, 6-tetra-G-acetil-a, a
D-trehalosa que comprende:
a. la reacción enzimática de per-D-acetil-a, Cl-D-trehalosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28"C.
DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Relación filogenética de las cepas Terribacil/us sp. AE2B 122, Bacil/us sp. HR21-6 con otras bacterias Gram positivas (A) , y las cepas Enterobactersp. AE1B89 y
Pseudomonas sp. AE28120 con otras bacterias Gram negativas (B) filogenéticamente relacionadas. Para su realización se ha utilizado el método de Neighbor-Joining. Junto a las ramas se muestra el porcentaje de réplicas de los árboles que presentan esos taxones juntos en un mismo agrupamiento en el test estadístico bootstrap (500 réplicas). Las distancias evolutivas se han calculado con el método Maximum Composite Likelihood, y se expresa en unidades del número de sustituciones de bases por sitio. las secuencias comprendían entre 640 y 650 posiciones. Para los análisis filogenéticos se ha usado el programa MEGA4 (http://www.megasoftware.netlmega4/mega.html).
Figura 2. Se representa la actividad antirradicalaria (captación de radicales libres mediante donación de átomos de hidrógeno) frente al radical libre DPPH (2, 2-d~enil-1
picrilhidracilo) expresada en valores de ECso (J.lM) del acetato de hidroxitirosilo 2, de los éteres fenólicos 4a-4d, Sa·5d, Y del 3, 4-dihidroxifenilglicoI14.
Figura 3. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear CH-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1 H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 27 (metíl 2, 3, 4, 6-tetra- ()..acetil-a-o-glucopiranósido) mediante el extracto enzimático de la invención.
Figura 4. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear CH-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1 H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 30 (per- ()..acetil-a, a-D-trehalosa) mediante el extracto enzimático de la presente invención.
Figura 5. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear CH-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 34 (per-O-acetilsacarosa) mediante el extracto enzimático de la presente invención.
DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN
Los inventores de la presente invención han identificado una serie de cepas microbianas, en particular, las cepas bacterianas Terribacillus sp. AE2B 122, Bacil/us sp. HR21-6, Enterabacte, sp. AE1 B89 Y Pseudomonas sp. AE2B120 depos~adas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECn con los números de registro 8231 (con fecha de depós~o 20.11.2012) , 8484, 8462, 8463 (con fecha de depós~0 de 22 de Octubre de 2013) , respectivamente, que tienen la capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de acilación (por ejemplo esterificación) y/o desacilación (por ejemplo alcoholisis). Dichas reacciones de acilación y/o desacilación se llevan a cabo preferentemente sobre polifenoles y/o carbohidratos naturales, y de eterifrcación en posiciones bencllicas de polifenoles durante la alcoholisis de ésteres de hidroxilos fenólicos, lo que permite la obtención de una colección de compuestos de interés acilados y/o eterificados en diferentes posiciones. Así, en base a la capacidad de estas bacterias de llevar a cabo estas reacciones de esterificación y alcoholisis, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán explicados en detalle a continuación.
Cepas microbianas de la Invención y sus usos Mediante métodos de screening sobre muestras obtenidas de diferentes lugares de procedencia, como por ejemplo almazaras, industrias de conservas de pescado, etc, se han seleccionado una serie de cepas microbianas con actividad lipolítica y capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de esterificación (acilación) y/o alcoholisis (desacilación) , en particular sobre carbohidratos y/o polifenoles, preferentemente naturales.
Estas cepas microbianas fueron sometidas a un análisis filogenético mediante el análisis de la secuencia del gen 165 ARNr. De este análisis se identificaron las cepas con las que mayor valor de identidad presentaban las cepas microbianas de la invención, siendo Terribacil/us gOriensis CL-GR16 (número de acceso a Gene6ank: NR_043895) , Bacil/us s/ra/osphericus JCM 13349 (número de acceso a GeneBank NR_042336) , En/erobac/er ludwigii EN-119 (número de acceso a GeneBank AJ853891) y Pseudomonas slutzeri ATCC 17588 (número de acceso a GeneBank NR_103934).
Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a las cepas microbianas de la invención, que pertenecen a los géneros Terribscillus, Bacillus, En/erobae/er y Pseudomonas que, en otra realización todavía más particular, son las cepas microbianas denominadas Terribacil/us sp. cepa AE2B122 (CECT 8231) , Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 8484) , En/erobae/er sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
Las cepas microbianas de la invención fueron depositadas bajo el Tratado de Budapest
en la Colección Española de Cu~ivos Tipo (CECT) [Pare Cientifie Universitat de Valéncia,
calle Catedrático Agustin Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia») el 20 de Noviembre de 2012 (CECT 8231) , y el22 de Octubre de 2013 (CECT 8464, CECT 6462 y CECT 8463).
Por lo tanto, un aspecto de la invención se relaciona con las cuatro cepas microbianas, con capacidad de llevar a cabo reacciones de acilación / desacilación que están depositadas en la CECT con los números de registro CECT 8231, CECT 8484, CECT
8462 y CECT 8463. En una realización particular, las cepas preferidas son: CECT 8464,
CECT 8462 y CECT 8463.
Como entiende el experto en la materia, las cepas microbianas de la invención pueden ser cultivadas en un medio de cultivo Ifquido para obtener un sobrenadante que, después de ser sometido a procesos de concentración y opcionalmente, liofilización y/o dialización, se obtiene un extracto enzimático que, al igual que cualquiera de las cepas de la invención, puede usarse para llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, siendo útil en la producción de los compuestos de interés.
Además, las cepas microbianas de la invención pueden ser cultivadas en presencia o en ausencia de un sustrato lipídico con el objetivo de obtener sobrenadantes que contendrán las enzimas y compuestos necesarios para llevar a cabo la reacción de acilación y/o desacilaciOn.
A efectos de la presente invención, el ténnino ·sustrato lipídico· se refiere a un compuesto de naturaleza lipídica, sobre el cual actuarán las lipasas de las cepas microbianas. Ejemplos de sustratos lipidicos incluyen, sin limitar a, surfactantes, triglicéridos, aceites esenciales, más particulannente, tributirina, Tween 80, Tween 20 y aceites vegetales, tales como aceite de oliva y/o aceite de girasol. En una realización particular, el sustrato lipídico es tributirina. La concentración del sustrato lipídico en el medio de cultivo puede ser variable, pudiendo emplearse concentraciones de entre 0, 1 4%, e incluso mayores. Preferiblemente, la concentración del sustrato lipídico en el medio de cultivo es de alrededor del 2% en peso con respecto al cultivo final.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un extracto enzimático obtenible a partir del cultivo de las cepas microbianas de la invención, capaz de llevar a cabo reacciones de acHadón y/o desacilación. A efectos de la presente invención los términos sobrenadante y extracto enzimático se utilizan indistintamente.
A efectos de la presente invención, el término ·extracto enzimático· o ·sobrenadante" se refiere al sobrenadante obtenible del cultivo de las cepas de la invención, que opcionalmente puede ser sometido a procedimientos de concentración, liofilización y/o dialización y que comprende las enzimas que las cepas microbianas descritas en la presente invención excretan al medio de cultivo y que presentan actividad lipolítica y que son capaces de llevar a cabo reacciones regioselectivas de esterificación (acilación) y/o alcoholisis (desacilación) , es decir se utilizan como catalizadores biológicos. El extracto enzimático o sobrenadante de la invención es, a efectos de la presente invención, un cóctel enzimático obtenido de los cultivos de las cepas de la invención.
Sin querer estar vinculado a ninguna teorra, los inventores consideran que, en el sobrenadante obtenido de los cultivos de las cepas de la invención, en medio líquido, están comprendidas las enzimas necesarias para llevar a cabo dichas reacciones de acilación y/o desacilación. Entre las enzimas que pueden formar parte de dicho sobrenadante se encuentran las lipasas que son enzimas que catalizan un amplio rango de reacciones (hidrólisis, interesterificaciones, alcoholisis, acidólisis, esterificación y
aminolisis, entre otras) , incluyendo las reacciones que se detectan y se muestran en los ensayos y ejemplos que se describen lo largo de la presente invención.
El sobrenadante obtenido mediante el cultivo de las cepas de la invención pueden contener no s610 las enzimas necesarias para llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, sino que también puede contener otro tipo de compuestos que pueden interaccionar con dichas enzimas, disminuyendo o potenciando la eficacia de conversión del sustrato a los productos resultantes de las reacciones. Por lo tanto, puede ser conveniente someter al sobrenadante a un proceso de concentración y de diálisis para eliminar aquellas partlculas o compuestos no deseables.
En la presente invención se entiende por ·concentración y/o diálisis· al proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus Indices de difusión a través de una membrana semipermeable. Típicamente, una solución de varios tipos de moléculas es puesta en una bolsa semipermeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de celulosa con poros, y la bolsa es sellada. La bolsa de diálisis sellada se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Las moléculas lo suficientemente pequeñas como para pasar a través de los poros (a menudo agua, sales y otras moléculas pequeñas) tienden a moverse hada adentro o hada afuera de la bolsa de diálisis en la direcdón de la concentración más baja. La técnica de diálisis es ampliamente conocida en el estado de la técnica y su puesta en práctica es rutinaria para el experto en la materia. En la puesta en práctica de la presente invención, el sobrenadante de la invención se vertió en una bolsa de diálisis de 12 KDa y tras ser concentrado con polietilenglicol 8 KDa, se dializ6 con tampón fosfato potásico.
Por lo tanto, en una realización particular, el extracto enzimático descrito en la presente invención, obtenido a partir de los cultivos de las cepas de la invención, está concentrado y/o dializado.
Adicionalmente, tanto si el extracto enzimático de la invención está concentrado y/o dializado o no, éste puede ser sometido a un proceso de liofilización. Por lo tanto, en otra realización particular, el sobrenadante de la invención está liofilizado.
La liofilización es un proceso en el que se congela el producto y, posterionnente, se introduce en una cámara de vacío para realizar la separación del agua por sublimación. De esta manera se elimina el agua desde el estado sólido al gaseoso del ambiente sin pasar por el estado líquido. la técnica de liofilización es ampliamente conocida en el estado de la técnica y su aplicación es práctica de rutina para el experto en la materia.
Una vez obtenidas tanto las cepas microbianas de la invención, como los extractos enzimáticos producidos a partir del cultivo de éstas, y probado que son capaces de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, el experto en la materia entiende que, tanto las cepas microbianas, como los extractos enzimáticos de la invención, pueden emplearse para producir los compuestos de interés que se indican más adelante.
Asf, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de las cepas microbianas o de los extractos enzimaticos obtenidos de cultivos de dichas cepas, según la invención, para la producción de derivados acilados, siendo preferentemente los sustratos de partida, polifenoles y/o carbohidratos, naturales o no.
En una realización particular, la producción de derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos se lleva a cabo mediante reacciones regioselectivas de acilación o desacilación de polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales.
A efectos de la presente invención los términos "regioselectivo/a" o wregioselectividad" se refieren a la preferencia de una reacción de estertficación o hidrólisis en un hidroxilo alifático de varios posibles, o un hidroxilo aromático de varios posibles.
A efectos de la presente invención los términos "quimioselectivo/a" o Kquimioselectividad~ se refieren a la preferencia de una reacción de esterificación o alcoholisis en un hidroxilo alifático (alcohol) frente a un hidroxilo aromático (fenal) o viceversa.
Mas detalles sobre la producción de derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos mediante el empleo de las cepas microbianas o de los extractos enzimáticos de las mismas, descritos en la presente invención, puede encontrarse en los Ejemplos 3 y 5
donde se deseo be el método de producción de los mismos.
Biotransformacíones regíoselectivBs para la obtención de derivados Bellados /ipofí/iCO$ de polifeno/es y/o carIJohidratos.
Como se ha explicado anterionnente, los inventores han descublerto nuevas cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo reacciones de adlación ylo desacilación sobre polifenoles ylo carbohidratos, preferentemente naturales o no, por lo que tanto las cepas microbianas, como los extractos enzimáticos obtenidos a partir del cultivo de las mismas, pueden emplearse en la obtención de los compuestos que se indican a continuación.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener derivados acilados de pOlitenoles y/o carbohidratos, preferentemente a partir de polifenoles ylo carbohidratos naturales, mediante reacciones de acilación o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas:
a) poner el extracto enzimático según se define a lo largo de la presente invención, en contacto con polifenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados acilados, en presencia de un agente acilante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones enzimáticas de acilación o desacilación, respectivamente y, opcionalmente b) purificar los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos en la etapa (a).
A efectos de la presente invención, el término Mpurificar" o ~purificaciónn se refiere tal y como se emplea en la descripción, a la separación de los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos mediante el método descr~o en la invención y a su concentración. La separación de dichos compuestos del resto de productos que le puedan acompañar y que no sean de interés, puede llevarse a cabo mediante técnicas de solubilidad diferencial, cromatografla, electroforesis o isoelectroenfoque. Las técnicas de cromatografía pueden estar basadas en el peso molecular, la carga o la afinidad de la protelna y puede realizarse en columna, en papel o en placa. La separación de los compuestos puede realizarse, por ejemplo, por cromatografía líquida rápida (FPLC, del inglés Fast Protein Uquid Cromatography) , en un sistema automatizado que reduce notablemente el tiempo de purificación e incrementa el rendimiento de la purificación.
En una etapa previa a la etapa a) del método de la invención, las cepas microbianas de la invención son cultivadas en presencia o en ausencia de un sustrato lipidico con el objetivo de obtener unos extractos enzimáticos que contengan las enzimas y compuestos necesarios para llevar a cabo la reacción de acilación y/o desacilación sobre los polifenoles y/o carbohidratos.
las cepas bacterianas de la invención se crecen en un medio de cultivo liquido para extraer el sobrenadante y posteriormente obtener los extractos enzimáticos. Para Terribaciflus sp. AE2B 122 (CECT 8231) , Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8234) se ha utilizado como medio de cultivo, PYA (agar, peptona y extracto de levadura). En el caso de En/erobacter sp. AE1 B89 (CECT 8232) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8233) se ha utilizado como medio de cultivo, LB (Luria~Bertani) , aunque es importante mencionar que se podría utilizar cualquier otro medio de cultivo en el cual las cepas de la invención puedan crecer.
Opcionalmente, el cultivo liquido se puede suplementar con un sustrato lipídico para incrementar la secreción de las enzimas presentes en el extracto enzimático de la invención, secretadas por las cepas de la invención y que son las responsables de llevar a cabo las reacciones de acilación/desacilación sobre los polifenoles y/o carbohidratos. Como se ha comentado previamente, dichas enzimas se considera que son, preferentemente, lipasas. Asl, en una realización particular, el medio de cultivo puede estar suplementado con un sustrato lipídico, de acuerdo a como se ha descrito previamente en la presente descripción de la invención.
Los cultivos se realizan a temperatura de entre 22°C y 37OC, en agitación durante 2-3 días. Transcurridos estos días se extrae el sobrenadante que como hemos mencionado anteriormente, contendrá las enzimas, preferentemente lipasas, encargadas de llevar a cabo las reacciones descritas en la presente invención.
El sobrenadante resultante de los cultivos puede aislarse por técnicas de rutina para el experto en la materia. Por ejemplo, una vez transcurrido el periodo de incubación, el cultivo puede dejarse reposar para que las células decanten o puede someterse a centrifugación, consiguiendo de ambas formas separar las células del medio de cultivo líquido. Posteriormente, puede obtenerse el sobrenadante, por ejemplo por aspiración con una pipeta.
Una vez obtenido el extracto enzimatico, éste se pone en contacto con los compuestos que se quieran someter a las reacciones de acilaciónldesacilación [etapa (a) ]. las condiciones adecuadas para llevar a cabo estas reacciones se explican detalladamente en cada uno de los ejemplos que contiene la presente invención.
En una realización preferida, los compuestos de partida son preferentemente polifenoles o carbohidralos.
En otra realización preferida, los sustratos de tipo fenólice de la etapa a) del método de la invención, se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de los siguientes: hidroxilirosol, 3, 4wdihidroxifenilglicol, alcohol protocatecuico y derivados acetilados de los mismos, preferiblemente: hidroxitirosol triacetilado, 3.4-dihidroxifenilglocol tetraacilado y alcohol protocatecuico peracilado.
En otra realización preferida, los sustratos de lipa carbohidratos del paso a) del método de la invención, se seleccionan de entre monow, di-, oligo-, polisacáridos o cualquiera de sus derivados acilados, preferiblemente: metil owD-glucopiranosido per-Owacelilado, trehalosa octaacetilada y sacarosa oclaacetilada.
Por Kderivados acetilados~ se refiere a compuestos fenólicos o carbohidratos con al menos un grupo -OH sustituido por un grupo -OCOCH3.
Tal como se ha explicado previamente, en el presente documento, los sobrenadantes obtenidos en una etapa previa a la etapa a) del método de la invención, pueden concentrarse y/o dializarse, según se ha explicado previamente, o pueden usarse tal cuales.
Por lo tanto, en una realización particular, el método de obtención de derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos de la invención comprende entre las etapas (a) y (b) , una etapa opcional dirigida a la concentración ylo dialización de los sobrenadantes, así como a su posterior liofilización. Las técnicas de concentración, dializadó" y liofilización se describen con detalle en el Ejemplo 2,
A continuación se detallan las diferentes reacciones de acilación/desacilación de compuestos fenólicos y/o carbohidratos mediante las reacciones enzimáticas calalizadas por las enzimas presentes en los sobrenadantes o extractos enzimáticos recogidos de los cultivos de las cepas descritas en la presente invención, para la obtención de compuestos fenólicos y/o caroohidratos acilados lipofílicos.
En una realización preferida, la reacción enzimálica es de desacilación, el politenol del paso (a) es un derivado acelilado de hidroxilirosol, 3, 4-dihidroxifenilglicol o alcohol protocatecuico, preferiblemente hidroxitirosol triacetilado, 3, 4-dihidroxifenilglocol tetraacilado o alcohol protocatecuico peracilado, y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático.
Por ~alcohol alifático~ se entiende en la presente invención a un grupo alquilo (C1-C7) , lineal o ramificado, con al menos un radical -OH, por ejemplo, pero sin limitarse a metanol, etanol, propanol, butanol, entre otros. Preferiblemente el alcohol alifático es metanol (MeOH). El alcohol alifático puede estar opcionalmente deuterado a temperatura ambiente (aprox, 18-30'C) ,
En una realización más preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el polifenol del paso (a) es un hidroxitirosol triacetilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de metano!.
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación de los hidroxilos aromáticos, el polifenol del paso (a) es 3, 4-dihidroxifenilglicol tetraacilado o alcohol protocatecuico peracilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático para producir la eterificación en la posición bencílica.
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de acilación, el polifenol del paso (a) es hidroxitirosol, 3, 4-dihidroxifenilglicol o alcohol protocatecuico y la reacción se lleva a cabo en presencia de un grupo acilante y opcionalmente de un co-disolvente,
Por "grupo acitante" se entiende a un reactivo capaz de reaccionar con un compuesto agregando un grupo acilo a su estructura, como por ejemplo, el grupo acilante puede ser sin limitarse a acetato de isopropenilo o acetato de vinilo, que a su vez actúan de disolvente.
La reacción de acilación se puede hacer en ausencia o presencia de un adsorbente del sobrenadante de los cultivos de las cepas de la invención, tal como celita. Se obtienen mejores resultados con el extracto enzimático soportado sobre celita. Si el compuesto fenólico empleado es poco soluble en el agente acitante se puede utilizar un co
disolvente, por ejemplo DMF (N, N-dimetil formamida).
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el carbohidrato del paso (a) es metil a-Dijtucopiranósido per-O-acetilado, per-O-acetil-<l, a-D-trehalosa, per-O-acetil-sacarosa, trehalosa octaacetilada o sacarosa octaacetilada y la reacción se lleva a cabo en presencia de alcohol alifático, preferiblemente metanol o metanol deuterado a temperatura ambiente (16-28°C).
En un realización más preferida, la reacción enzimática es de per-O-acetil-a, a-Dtrehalosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-2SOC,
obteniéndose los compuestos 2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetil-a., a-D-trehalosa o 2, 3, 4, 6-tetra-0acetil-a., a-o-trehalosa o la reacción enzimática de per-O-acetil-sacarosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C, obteniéndose los compuestos 2, 3, 4, 6, 1' , 6'-hexa-O-acetil-sacarosa o 2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetil-sacarosa.
En otra realización preferida, la reacción enzimática es de acilación, el carbohidrato del paso (a) es metil n -o-glucopiranósido y la reacción se lleva a cabo en presencia de acetato de isopropenilo y DMF a una temperatura de entre SO-700C.
Otro aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula general (1)
OR,
HO~OR2
HOJvJ
(1)
donde: R, es un grupo alquilo (C, -C20) , un grupo alquenilo (C2-~O) , un grupo alquinilo (C, -C", ) , Oun grupo arilalquilo; y R2 es un grupo acilo (-COR3, donde ~es un grupo alquilo C, -C20) o un hidrógeno,
Por "alquilo" se refiere en la presente invención a una cadena alifática, lineal o ramificada, que tiene de 1 a 20 átomos de carbonos, preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, ipropilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, entre otros.
Por "alquenilo· se refiere en la presente invención a cadena carbonada, lineal o ramificada, que presenta al menos un doble enlace y que contiene entre 2 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono.
Por ·alquinilo~ se refiere en la presente invención a cadena carbonada, lineal o ramificada, que presenta al menos un triple enlace y que contiene entre 2 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono.
Por "arilalquilo" se entiende en la presente invención a un grupo arilo unido al resto de la molécula por un grupo alquilo (C1-C20) , tal y como se ha definido anteriormente. Un ejemplo, no limitante, de arilalquilo es un grupo bencilo.
En una realización preferida, el compuesto de f6nnula general (1) de la presente invención se caracteriza por que el R2 es un grupo acetilo (-COCH3).
En una realización preferida, el compuesto de fórmula general (1) de la presente invención se caracteriza por que el R2 es un hidrógeno.
En otra realización más preferida, los compuestos de fórmula general (1) se seleccionan de la lista que comprende: acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-metoxietilo, acetato de 2 (3, 4-dihidroxifenil) -2-etoxietilo, acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-propoxielilo, y acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-butoxietilo.
En otra realización preferida, los compuestos de fórmula general (1) se seleccionan de la lista que comprende: 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-metoxietanol, 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2etoxietanol, 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-propoxietanol y 2- (3, 4-dihidroxifenil) -2-butoxietanol.
La presente invención también describe el procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (1) descritos anteriormente, que comprende:
a. la reacción enzimática del compuesto 3, 4-dihidroxifenilglicol peracilado con R, OH; o b. la reacción enzimática del compuesto 3, 4-dihidroxifenilglicol peracilado con 10 R10H Y posteriormente la reacción del compuesto obtenido en el paso (a)
mediante catálisis básica, preferiblemente con C~C03, en metanol; donde R, es un grupo alquilo (C, -C, , ) , un grupo alquenilo (C, -C,.) , un grupo alquinilo (C, C20) , o un grupo arilalquilo.
OR,
OR, C t ' 'd
OAe HO~OAe a. ael a HO~OH
AeO~OAe ~E=xt=r-=
a:::et=o...:e::cn=z:.::imc::á::li~e, o HO~ MeOH HO~
'5 AeO~ R, OH
En una realización preferida, el procedimiento descrito anteriormente se caracteriza por que la reacción enzimática se lleva a cabo en presencia del extracto enzimático descrito 20 en la presente invención.
La presente invención se refiere también al uso de al menos un compuesto de fórmula general (1) , según se ha descrito previamente, para la elaboración de un medicamento o de una composición cosmética o de una composición alimenticia, dónde la composición alimenticia se selecciona de entre un alimento, complemento alimenticio, alimento funcional o nutracéutico.
A efectos de la presente invención el término "medicamento" hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de 30 enfermedades en el hombre y los animales.
A efectos de la presente invención el término "composición farmacéutica~ tal y como se define en la presente invención se refiere a conjunto de componentes que están formados por al menos un producto de fórmula general (1) según se describe en la presente invención, en cualquier concentración, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar flsico o fisiológico o psicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud. Dichas composiciones comprenden además al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica puede comprender un "vehículo" o portador, que es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehiculo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica.
los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
A efectos de la presente invención el término ~composición cosmética" o ~cosmético" se refiere a aquellas preparaciones constituidas por sustancias naturales o sintéticas o sus mezclas, de uso externo en las diversas partes del cuerpo humano.
A efectos de la presente invención el término ~composición alimenticia" se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composición puede ser destinada a la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o del factor causante de una enfermedad. Por tanto, el término "composición alimentaria" de la presente invención se puede emplear como sinónimo de alimento funcional o alimento para fines nutricionales especlficos o alimento medicinal. A efectos de la presente invención, el
término "composición alimenticia" es, o forma parte de un alimento, alimento funcional, nutracéutico o suplemento alimenticio.
A efectos de la presente invención el término "nutracéutico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a sustancias aisladas de un alimento y utilizadas de fonna dosificada que tienen un efecto beneficioso sobre la salud.
A efectos de la presente invención el término "suplemento", sinónimo de cualquiera de los términos "suplemento dietético", "suplemento nutricional" o "suplemento alimenticio" es un "ingrediente alimenticio" destinado a complementar la alimentación.
La presente invención también se refiere al uso no terapéutico de al menos un compuesto de fórmula general (1) , segun se ha descrito previamente, como antioxidante, preferentemente como antioxidante alimentario.
Por el término "antioxidante" se entiende una composición capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1) , según se ha descrito previamente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a Una composición alimenticia o cosmética que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1) , según se ha descrito previamente.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a los derivados acilados de carbohidratos, preferentemente a los compuestos de fórmula 2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetila, a -D-trehalosa o 2, 3, 4, 6-1etra-O-acetil-a, a-o-trehalosa.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso de dichos derivados acilados de carbohidratos descritos previamente como intermedios de reacción para la síntesis de derivados de trehalosa o para la elaboración de análogos de glicolípidos presentes en Mycobacterium tuberculosis.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de los análogos de glicolípidos presentes en Mycobacterium tuberculosis que comprende:
a. la reacción enzimática de per-O-acetil-a.a-O-Irehalosa con metanol o metanol
deuterado a una temperatura de entre 16-28°C.
En una realización preferida, dicho procedimiento se lleva a cabo en presencia de un 5 extracto enzimático según se define en la presente invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, olros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS.
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1: Análisis filogenético de las cepas Terribacil/us sp. AE2B 122 (CECT
8231) , Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) , Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
El estudio filogenético se llevó a cabo mediante análisis de la secuencia del gen ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) 168. Para ello se amplificó el gen del ARNr 168 de cada 25 una de las cepas de la invención mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los cebadores 16F27, cuya secuencia es·5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 1) , y 16R1488, con la secuencia 5'-CGGTTACCTTGTTAGGACTTCACC-3' (SEQ ID NO: 2) (Moreno M.L , el al. FEMS Microbio/ Eco/, 2009; 68, 59-71.). las condiciones de la reacción de PCR fue la siguiente: un ciclo de 95 oC durante 5 minutos, 30 25 ciclos de 94 oC durante 1 minutos, 50 oC durante 1 minutos y 72 OC durante 2 minutos, y luego un paso de extensión de 10 minutos a 72 oC. Los productos de la amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El AON amplificado es secuenciado mediante el método Sanger. Se utilizan entre 640 y 650 pb para la búsqueda de secuencias similares entre las secuencias depositadas en GenBank, usando el algoritmo BlastN, resultando ser Terríbacillus goriensis CL-GR16 (Número de acceso a GeneBank
NR_043895) , Baci/fus stratosphericus JCM 13349 (número de acceso a GeneBank NR_042336) , Enterobacter ludwigií EN-119 (número de acceso a GeneBank AJ853891) y
Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 (número de acceso a GeneBank NR_103934) los que mayor valor de identidad muestran con las secuencias de las cepas de la invención. Por lo tanto, las cepas de la invención se asignaron a los géneros Terribacillus como TelTibaci/fus sp. AE2B 122 (CECT 8231) , Bacillus, como Baci/fus sp. HR21-6 (CECT 8484) , Enterobacter, como Enterobactersp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas como Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
Para la realización del árbol filogenético se utilizó el paquete de programas MEGA4. Primero se realizó un alineamiento múltiple, usando Clustal W, de las secuencias de 650 pb (correspondiente al fragmento entre las posiciones 53 hasta la 703 (Figura 1A) y entre las posiciones 80 hasta 730 (Figura 1B) del ARNr 16S de Escherichia co") de las cepas y
de las secuencias de mayor identidad obtenidas con 8lastN. Finalmente los árboles se construyeron utilizando varios métodos, obteniendo resultados similares con todos ellos. En la presente invención se muestran los árboles construidos mediante el método Neighbor-Joining (Figura 1).
Ejemplo 2: Preparación de los sobrenadantes de las cepas Tembacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231) , Bacillus sp. HR21-6 (CECT8464) , Enterobactersp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
Para la preparación de los extractos enzimáticos o sobrenadantes, se creció un preinóculo de cada una de las cuatro cepas descritas en la presente invención. Teffibacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231) se cultivó en medio PYA durante una noche. Al dia siguiente,
se utilizó dicho cultivo para inocular medio PYA. Tras crecer el cultivo en medio PYA, se recogió el sobrenadante.
Bacillus sp. HR21-6 (CECT8464) se cultivó en medio LB durante una noche. Al día siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio PYA. Tras crecer el cultivo en medio PYA, se recogió el sobrenadante.
Entembacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463) se cultivaron en medio LB durante una noche. Al día siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio LB + tributirina (TRI) 2%. Tras crecer el cultivo en medio LB+TRI 2%, se recogió el sobrenadante.
Cada uno de los sobrenadantes se vertió en una bolsa de diálisis de 12 KDa (SIGMA, D9527). Las bolsas de diálisis se dejaron toda la noche a 4 oC cubiertas en polietilenglicol de 8 KDa y cuando las bolsas de diálisis estaban completamente secas, se limpió el exterior con agua destilada y se dializaron con tampón fosfato potásico O, 05M pH 7, 8 a 4 oC y agitación magnética. Estos dializados se congelaron a -80 oC.
Dichos sobrenadantes pueden ser liofilizados para así evitar que se produzcan las reacciones de hidrólisis. Además, liofilizar el sobrenadanle ayuda a concentrar y conservar la enzima de la cepa microbiana, y también para poder ser almacenado.
Ejemplo 3: Preparación de polifenoles lipófilos. Reacciones de acilación/desacilación catatalizadas por los sobrenadantes/extractos enzimáticos de las cepas de Terribaeillus sp. AE2B 122 (CECT 8231) , Baeillus sp. HR21-6 (CECT 8464) , Enterobaeler sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).
A continuación se muestran a modo de ejemplo ilustrativo y no limitativo, rutas sintéticas que conducen a la obtención de derivados fenólicos por desacilación regioselectiva catalizada por los extractos enzimáticoslsobrenadantes en medio alcohólico.
Ejemplo 3.1. Reacción de desacilación de compuestos fenólicos mediante catálisis enzimática para la obtención de polifenoles lipofrucos.
Ejemplo 3.1.1. Acetato de hidroxitirosilo (2) la desacilación del compuesto 1 (hidroxitirosol peracetilado) mediante alcoholisis (desacilación) catalizada por los extractos enzimáticos, obtenidos de los cultivos de las cepas de la invención, usando como disolvente un alcohol alifático, tal como el MeOH, da lugar al derivado monoacilado (compuesto 2) mediante una reacción totalmente regioselectiva, según se describe en el Esquema 1.
ACO~OAC extracto enzimático HO~OAC
I • I
AcO d MeOH HO d
2
Esquema 1
A una disolución del compuesto 1 (hidroxitirosol triacetilado) (50 mg, 0.18 mmol) en MeOH se le anade el extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Terribacillus sp. cepa AE28122 (CEC T8231) (50 mg) y gel de sílice (63-200 ~m, 100 10 mg). Se ag~a a 40'C durante 18 horas. Se filtra sobre celita y se concentra a sequedad. El residuo se purifica por cromatografla en columna (AcOEt-hexano 1:2 1: 1)
-----Jo
obteniéndose el acetato de hidroxitirosilo 2 (31 mg, 90%). 01er Esquema 1). El rendimiento para la obtención del compuesto 2 purificado por técnicas cromatográficas fue del 75-91 % dependiendo del extracto enzimático utilizado.
Ejemplo 3.1.2. La desacilación del compuesto 3 (3.4-dihidroxifenilglicol peracetilado) mediante alcoholisis catalizada por los extractos enzimáticos descritos en la presente invención y usando como disolvente un alcohol alifático de tipo R10H. tiene lugar de manera totalmente regioselectiva en los ésteres fenólicos (Esquema 2). En la posición bencílica el grupo aciloxi es sustituido por el grupo alcoxi R10 procedente del alcohol dando lugar a la formación del compuesto 4 que puede ser aislado con rendimientos del 40-90%. El
R1
radical del alcohol alifático de tipo R10H se selecciona preferiblemente de entre cualquiera de los siguientes: -CH, (metilo) , -C, H, (etilo) , -C, H, (propilo) o -C, H, (butilo).
En función del alcohol alifático utilizado como disolvente se obtienen los compuestos 4a, 4b, 4c o 4d (Esquema 2). Los tiempos de reacción van desde 24 h para la obtención del compuesto 4a hasta 6 días para la obtención del compuesto 4d. El grupo acetilo del compuesto 4 puede ser eliminado mediante una alcoholisis (desacilación) con catálisis básica, utilizando como catalizador cualquier catalizador básico, preferentemente CS2C03
en metanol.
De esta manera, los compuestos 4a-4d mediante una reacción de desacetilación dan lugar a los compuestos 5a-5d con rendimientos del 31-62% (Esquema 2).
OAc OR AcO~OAC Extracto enzimático HO~OAC Cs, CO;
AcOJl) ROH HoJl) MeOH
4a R= Me 4b R=Et 4c R = Pr 4d R = Bu Esquema 2
Acetato de 2- (3, 4-dihidroxifenit) -2-metoxietilo (4a)
OMe HO
OAc
HO
OR
HO~OH
HoJl)
5a R = Me 5b R=Et 5e R = Pr 5dR=Bu Se disuetve et compuesto 3 (tetraacetitado) (28 mg, 0.08 mmot) en MeOH (3 mL) y se ar.aden 28 mg de extracto enzimálico obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Terribacillus sp. cepa AE2B122 (CEC T8231) y 56 mg de get de sitice (63-200 ~m). Se agita a temperatura ambiente durante dos días. Se añaden otros 28 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Terribaci/Jus sp. cepa AE28122 (CEe T8231) y se prosigue con la agitación a temperatura ambiente durante dos días. Se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografía en columna (CH2Cb
MeOH 60:1). Rendimiento: 17 mg, 90%, R, 0.6 (CH, CI, -MeOH 10:1).
'H-RMN (300 MHz, CD, OD) : ~ 6.80 (d 1H, J". = 8.0 Hz, Ar-5) , 6.79 (d, 1H, J,.• = 2.0 Hz, Ar-2) , 6.68 (dd, 1H, J•., = 8.0 Hz, J., ' = 2.0 Hz, Ar-6) , 4.32 (dd, 1H, J= 8.0 Hz, J= 3.9 Hz, CH) , 4.18 (dd, 1H, J= 11 , 4 Hz, J= 8.0 Hz, CH, ) , 4.07 (dd, 1H, J= 11 , 4 Hz, J= 3.9 Hz, CH, ) , 3.25 (s 3H, OMe) , 2.06 (s 3H, OAe). "C-RMN (75.5 MHz, CD, OD) : ~ 173.6 (CO) , 145.7 (Ar-3 y 4) , 131.4 (Ar-1) , 120.7 (Ar-S) , 117.2 (Ar-5) , 115.8 (Ar-2) , 83.4 (CH) , 69.5 (CH, ) , 57.7 (OMe) , 21.6 (OAc).
Acetato de 2i3, 4-dihidroxifenil) -2-etoxletilo (4b) OE!
OAe Se disuelve el compuesto 3 (60 mg, 0.18 mmol) en EtOH (6 mL) y se añaden 60 mg de extracto enzimático obtenido del cu~ivo de la cepa bacteriana Baciffus sp. HR21-6 (CECT
8484) Y 120 mg de gel de silice (63--200 ~m). Se calienta a 60 oC durante 24 horas y pasado ese tiempo se concentra a sequedad y se pUrifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice (CH2Cb-EtOH 60:1). Rendimiento: 24 mg, 55%, RF 0.5 (CH, CI, -MeOH 10:1).
'H-RMN (300 MHz, CDCI, ) : 6 6.89 (d, 1H, J, , 6= 2.0 Hz, Ar-2) , 6, 83 (d, 1H, J5, 6= 8.1 Hz, Ar5) , 6.72 (dd, 1H, J6, 5= 8.1 Hz, J6, , = 2.0 Hz, Ar-6) , 4.42 (dd, 1H, J= 6.9 Hz, J= 5.0 Hz, CH) , 4.20-4.12 (m, 2H, CH, ) , 3.43 (2dd, 1H cada uno, 'J = 16.4 Hz, 'J = 7.0 Hz, CH, CH, ) , 2.06 (s, 3H, OAe) , 1.17 (t, 3H, J= 7.0 Hz, CH, CH, ). 13C-RMN (75.5 MHz, CDCI, ) : 6172, 0 (CO) ,
144.5 (Ar-4) , 144.4 (Ar-3) , 131.0 (Ar-1) , 119.9 (Ar-6) , 115.5 (Ar-5) , 113.9 (Ar-2) , 79.6 20 (CH) , 68.4 (CH, ) , 84, 8 (CH, CH, ) , 21.3 (OAe) , 15.4 (CH, CH, ).
Acetato de 2- (3, 4-dlhidroxifenil) -2-propoxietllo (4c) OPr
OAe Se disuelve el compuesto 3 (190 rng, 0.56 mmol) en PrOH (4 rnL) y se añaden 190 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8484) y 380 mg de gel de sílice (63--200 ~m). Se agita a 60 oC durante dos días. Se añaden otros 190 mg del mismo extracto y se prosigue con la agitación durante dos días.
Se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografla en columna (AcOEt
hexano 1:3 ~ 1 :1). Rendimiento: 81.4 mg, 57%, Rf 0.6 (AeOEt·hexano 1:1).
'H-RMN (300 MHz, CDCI, ) : O6.90 (d, 1H, J"o= 2.0 Hz, Ar-2) , 6.84 (d, 1H, J", = 8.1 Hz, Ar
5) , 6.73 (dd, 1 H, Jo,. = 8.1 Hz, J., , = 2.0 Hz, Ar-6) , 4.41 (dd, 1H, J= 7.6 Hz, J= 4.5 Hz, CH) , 4.21-4.10 (m, 2H, CH, ) , 3.40-3.24 (m, 2H, OCH, CH, ) , 2.06 (s 3H, OAe) , 1.59 (sextete, 2H, J =7.4 Hz, OCH, CH, ) , 0.88 (t, 3H, J =7.4 Hz, CH, ). 13C-RMN (75.5 MHz, CDCI, ) : O
171.9 (CO) , 144.4 (Ar-4) , 144.3 (Ar-3) , 131.2 (Ar-1) , 120.0 (Ar-6) , 115.5 (Ar-5) , 113.9 (Ar2) , 79.7 (CH) , 71.1 (CH, ) , 68.4 (OCH, CH, ) , 23.1 (CH, CH, ) , 21.3 (OAe) , 10.8 (CH, ).
Acetato de 2- (3, 4-<llhldroxifenil) -2-butoxletllo (4d) OBu HO
OAe HO
Se disuelve el compuesto 3 (190 mg, 0.56 mmol) en BuOH (4 mL) y se añaden 190 mg
de extracto enzimálico obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6
(CECT 8484) y 380 mg de gel de slJiee (6~200 ~m) , calentándose a 60 oC durante 2
días. Se concentra a sequedad y se purifica por cromatografía en columna con AcOEt
He. 1:2. Rendimiento: 91 mg, 61%, Rf 0.6 (CH, CI, -MeOH 10:1).
'H-RMN (300 MHz, CDCI, ) : O 6.90 (d, 1 H, J"o= 1.9 Hz, Ar-2) , 6.84 (d, 1 H, J"o= 8.0 Hz, Ar5) , 6.73 (dd, 1H, Jo,.= 8.0 Hz, J., , = 1.9 Hz, Ar-6) , 6.50 (s, 1H, OH) , 5.95 (s, 1H, OH) , 4.44 (dd, 1H, J= 7.7 Hz, J= 4.4 Hz, CH) , 4.22-4.10 (m, 2H, CH, ) , 3.45-3.28 (m, 2H, OCH"c:H, ) ,
,
2.07 (s, 3H, OAe) , 1.55 (m, 2H, J = 6.6 Hz, OCH, CH, ) , 1.39-1.25 (m, 2H, CH, CH, ) , 0.86 (t, 3H, J= 7.3 Hz, CH, CH, ). 13C-RMN (75.5 MHz, CDCI, ) : O 172.1 (CO) , 144.4 (Ar-4) ,
144.3 (Ar-3) , 131.1 (Ar-1) , 120.0 (Ar-6) , 115.5 (Ar-5) , 113.9 (Ar-2) , 79.7 (CH) , 69.2 (OCH, CH, ) , 68.4 (CH, ) , 32.0 (OCH, CH, ) , 21.3 (OAe) , 19.6 (CH, CH, ) , 14.2 (CH, CH, ).
2. C3, 4-Dihidroxifenil) -2-metoxietanol (5a)
OMe HO
OH HO
A una disolución del compuesto 4a (54 mg, 0.24 mmol) en MeOH seco (1 mi) se afiada Cs, CO, (231 mg, 0.72 mmol) y ascorbato sódico (48 mg, 0.24 mmol) en presencia de Ar
y en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente,
por cromatografía en columna utilizando como eluyente CH, Clr EtOH (1:0 ~ 1:10). 10 Rendimiento: 23 mg, 53%, R, 0.2 (CH, Clr MeOH 10:1).
'H-RMN (300 MHz, 0 , 0) : 06.94 (d, 1H, J5.'~ 8.1 Hz, Ar-5) , 6.89 (d, 1H, J,.• ~ 2.0 Hz, Ar2) , 6.80 (dd, 1H, J'.5~ 8.1 Hz, J •. , ~ 2.0 Hz, Ar-6) , 4.29 (dd, 1H, J~ 7.5 Hz, J~ 4.6 Hz, CH) ,
3.71 (dd, 1H, J~ 11.9 Hz, J ~ 7.5 Hz, CH, ) , 3.64 (dd, 1H, J ~ 11.9 Hz, J ~ 4.6 Hz,
CH, ).3.27 (s, 3H, OMe). 13C-RMN (75.5 MHz, 0, 0) : O 144.1 (Ar-1) , 144.0 (Ar-2) , 130.5 (Ar-4) , 119.8 (Ar-5) , 116.1 (Ar-6) , 114.7 (Ar-3) , 83.6 (CH) , 65.0 (CH, ) , 56.0 (OMe).
2. (3, 4-Dihidroxlfenil) -2-etoxietanol (5b)
OEI
HO
OH HO
A una disolución del compuesto 4b (25 mg, 0.10 mmol) en MeOH seco (1 mi) se.nade Cs, cO, (66 mg, 0.20 mmol) y ascorbato sódico (20 mg, 0.10 mmol) en presencia de Ar y
en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto. sin neutralizar ni evaporar el disolvente, 25 por cromatografía en columna utilizando como eluyente CH2Clr EtOH (1 :0 -1:10).
Rendimiento: 12.4 mg, 62%, R, 0.3 (CH, CI, -MeOH 10:1).
'H-RMN (300 MHz, CO, OO) : ~ 6.91 (d, 1H, J., , = 8.1 Hz, Ar-5) , 6.88 (d, 1H, J" , = 1.8 Hz, Ar-2) , 6.80 (dd, 1 H, J" , = 8, 1 Hz, J", = 2.0 Hz, Ar-6) , 4, 38 (dd, 1 H, J = 7, 7 Hz, J = 4.4 Hz, CH) , 3.70 (dd, lH, J= 11.7 Hz, J= 8.0 Hz, CH, ) , 3.61 (dd, 1H, J= 11.7 Hz, J= 4.4 Hz, CH, ) 3.48 (e, 2H, J= 6, 9 Hz, CH, CH, ) , 1, 19 (t, 3H, J= 7, 1 Hz, CH, CH, ) , " C-RMN (75, 5
MHz, CO, OO) : ~ 146.1 (Ar-4) , 145, 9 (Ar-3) , 133.1 (Ar-1) , 121.3 (Ar-6) , 117.7 (Ar-5) , 116.3 (Ar-2) , 83.9 (CH) , 67.3 (CH, ) , 66.3 (CH, CH, ) , 16, 1 (CH, CH, ).
2~3, 4-0ihidroxif.nll) -2-propoxi.tanol (Se)
OPr
HO~OH
N
HO
A una disolución del compuesto 4e (55 mg, 0, 22 mmol) en MeOH seco (1 mi) se añade Cs, CO, (66 mg, 0, 20 mmol) y ascobato sódico (44 mg, 0, 22 mmol) en presencia de Ar y
en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. Cuando se da por terminada la reacción se pUrifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente,
por cromatografla en columna utilizando como eluyente (AcOEt-hexano 1:1). Rendimiento: 14, 5 mg, 31%, RF 0.1 (AcOEt-Hex 1 :1).
'H-RMN (300 MHz, CO, OO) : ~ 6, 78 (d, 1H, J", = 1.9 Hz, Ar-2) , 6.76 (d, 1H, J., , = 8, 0 Hz, Ar-5) , 6.65 (dd, 1H, J".= 8.0 Hz, J", = 2, 0 Hz, Ar-6) , 4.22 (dd, 1H, J= 8, 0 Hz, J= 4.1 Hz, 20 CH) , 3.64 (dd, 1 H, J = 11.6 Hz, J = 8, 0 Hz, CH, ) , 3.51 (dd, 1 H, J = 11.6 Hz, J = 4.1 Hz, CH, ) , 3, 37-3, 29 (m, 2H, OCH, CH, ) , 1, 61 (s, 2H, J = 7, 2 Hz, OCH, CH, ) , 0.93 (t, 3H, J =
7.4 Hz, CH, ). " C-RMN (75.5 MHz, CO, OO) : ~ 147, 3 (Ar-4) , 146.9 (Ar-3) , 133.3 (Ar-l) , 120, 6 (Ar-6) , 117.0 (Ar-5) , 115.8 (Ar-2) , 85.2 (CH) , 72.5 (CH, ) , 68, 9 (OCH, CH, ) , 24.9 (OCH, CH, ) , 11.8 (CH, ) ,
2~3.4-dihidroxlf.nil) -2-butoxietanol (Sd)
OBu
HO~OH
HOJl)
A una disolución del compuesto 4d (78 mg, 0.29 mmol) en MeOH seco (2 mi) , se añaden ascorbato sódico (58 mg, 0, 29 mmol) y Cs, CO, (280 mg, 0, 88 mmol) y se agita a temperatura ambiente, en oscuridad y atmósfera de argón durante 3 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el 5 disolvente, por cromatografía en columna utilizando como eluyente AcOEt-Hex (1 :1).
Rendimiento: 28, 1 mg, 43%, RF 0, 3 (CH, CI, -MeOH 10:1). ' H-RMN (300 MHz, CDCI, ) : O 6, 84 (d, lH, J" , = 1.8 Hz, Ar-2) , 6, 83 (d, lH, J", = 8, 0 Hz, Ar-5) , 6, 72 (dd, lH, J", = 8, 0 Hz, J" , = 1 , 8 Hz, Ar-6) , 6, 04 (sa, 3H, OH) , 4, 29 (dd, lH, J= 7, 8 Hz, J= 4.4 Hz, CH) , 3, 69-3, 57
(m, 2H, CH, ) , 3.47-3, 28 (m, 2H, OCH, CH, ) , 1, 60-1.51 (m, 2H, OCH, CH, ) , 1.43-1.26 (m, 2H, CH, CH, ) , 0, 88 (t, 3H, J= 7.3 Hz, CH, CH3) , 13C-RMN (75, 5 MHz, CDCI, ) : O 144.3 (Ar4). 144.2 (Ar-3) , 131.8 (Ar-1) , 119.9 (Ar-6) , 115.7 (Ar-5) , 114.1 (Ar-2) , 82.5 (CH) , 69.2 (OCH, CH, ) , 67.6 (CH, ) , 32.2 (OCH, CH, ) , 19.7 (CH, CH, ). 14.2 (CH, CH, ).
Ejemplo 3.1.3. La desacilación (alcoholisis) del compuesto 6 (alcohol protocatecuico peracilado) con un grupo acetoxilo en posición bencílica catalizada por los extractos enzimáticos usando como disolvente un alcohol alifático de tipo ROH, también tiene lugar de manera totalmente regioselectiva en los ésteres fenólicos (Esquema 3). De manera similar al
comportamiento observado en el compuesto 3, en la posición bencílica el grupo aciloxi es sustituido por el grupo alcoxi procedente del alcohol usado como disolvente. As!, por ejemplo, usando como disolvente el MeOH se puede obtener el compuesto 7 de fonna cuantitativa en 24 h. El compuesto 7 ha sido aislado previamente del caldo de fermentación del hongo marino Y26-02 (lNu, H, -H, et al. J Asian Nat Prod Res 11 , 747
750; 2009).
ACO~OAC
ACO~
Extracto enzimático •
MeOH
uema3
HO~OMe HO~
Esq
4. (Metoximetil) benceno-1 , 2-diol (7)
HO) () OMe
I "'"
HO /:/
A una disolución del compuesto 6 (30 mg, 0.19 mmol) en MeOH (1 mi) se anaden 30 mg
de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana 8acillus sp. HR21-6
(CECT 8464) y 60 mg de gel de sílice (63-200 ~m) y se calienta a 40·C durante 24 h. Se concentra a sequedad y se purifica mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:1) obteniéndose el producto como un sirupo rojizo. Rendimiento: 29 mg, cuantitativo RF
0.6 (AcOEt-hexano 1:1).
'H-RMN (300 MHz, CDCI, ) : (; 6.83-6.78 (m, 2H, Ar-3, Ar-5) , 6.70 (d, lH, J•., =7.7 Hz, Ar6) , 4.30 (s, 2H, eH, ) , 3.33 (s, 3H, OMe).
Ejemplo 3.2. Reacción de aeilación de compuestos fenólicoa mediante catálisis enzimática para la obtención de polifenoles lipofilicos.
Se llevaron a cabo reacciones de acilación (esterificación) regioselectiva de diversos polifenoles, preferentemente de polifenoles presentes en el aceite de oliva (Esquema 4).
Extracto HO~OHenzimático HO~OH AcO~OH
I • I +
HO J.... Á. HO~AeO
O 9 10
HO~OAe AcO~OH
I +
HO AcO~
HO~OAe AcO~OAe I +
AcO HO~
13
OH Extracto OH OH
HO~OH enzimáti~ HO~OH AcO~OH
O I + I
HO~..Jl...OÁ. AcO H DMF 15 16
H~HOAe AcO~OHOH
I + I
H AcO
18
OH
HO~OAe
AeO~
Esquema 4
Extracto
HO~OH HO Ó 20 enzimático• ~O~ HO~OH AcO Ó 21 +
HO~OAC HO Ó 23 +
HO~OAC + AcO~ 25
ACO~OAC AcO~ 6 Esquema 4 (continuación)
5 Dichos polifenoles son el compuesto 8 (hidroxitirosol) ,
ACO~OH
HO Ó
ACO~OH
AcO Ó
ACO~OAC HO~
el compuesto 14 (3, 4
dihidroxifenilglicol) y el compuesto 20 (alcohol protocatecuico). Como agente acilante se empleo el acetato de isopropenilo, que a su vez actúan de disolvente del politenol y de sus derivados acilados. La acilación se puede hacer en ausencia o presencia de un adsorbente del sobrenadante de los cultivos de las cepas de la invención, tal como celita.
Se obtienen mejores resultados con el extracto enzimático soportado sobre celita. Si el compuesto fenótico empleado es poco soluble en el agente acilante se puede utilizar DMF (N, N-dimetil formamida) como ce-disolvente. El resultado de la acilación se cuantifica mediante 1H-RMN previa eliminación del sobrenadante o extracto enzimático que contiene las enzimas encargadas de llevar a cabo la reacción de acilación.
El producto mayoritario obtenido de la reacción de acilación (esterificación) del pOlitenol hidroxitirosol (compuesto 8) tras 24 h (Tabla 1) es el compuesto 9 que es derivado monoacilado en posición 4 del anillo aromático. El compuesto 9 y su regioisómero en la posición 3 (compuesto 10) , se forman en la proporción de 2:1. Además, de los compuestos derivados monoacilados 2, 9 Y 10, se detectan, en menor cantidad, otros tres compuestos que son los derivados diacilados 11, 12 Y 13. El grado de conversión oscila del 88 al 96%. Los resultados contrastan con la regioselectividad que se obtiene con la ¡¡pasa procedente de C. antarctica, que conduce exclusivamente al compuesto regioisórnero 2. aeilado en la cadena lateral.
La reacción de acilación (esterificación) del compuesto 14: 3, 4-dihidroxifenilglicol tras 24
h (Tabla 1) conduce a la oblención de una mezcla de los compueslos 15 y 16 que son los derivados monoacilados en el anillo aromático, y del compuesto 17 que es el derivado monoacilado en el extremo de la cadena lateral, en proporción 1:1:1, con los extractos de Tenibaeillus sp. AE2B 122 (CECT 8231) y Enterobactersp. AE1B89 (CECT 8462) , y en la relación 1:1:2 con Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8462) , Baeil/us sp. HR21-6 (CECT 8484) y la lipasa pura de C. antareliea. El grado de conversión va del 53 al 70%. El menor grado de conversión se consigue con la C. antarctica. No se detecta la acilación del hidroxilo bencllico del compuesto 14 con ninguna de las enzimas, ni extractos enzimáticos.
La reacción de acilación (estertficación) del compuesto 20: alcohol protocatecuico tras 24 h (Tabla 1) conduce a la obtención de una mezcla de los derivados mono, di y triacilados. La relación de los derivados monoacilados en posición 4, 3 Y cadena lateral es sensible al extracto enzimático utilizado; así, la proporciones son 1:1:1 para el sobrenadante del
cullivo de Terribaeil/us sp. AE2B 122 (CECT 8231) , 1 :2:2 para el sobrenadante del cultivo de Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) , 1:3.5:1 para el sobrenadante del cu~ivo de Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8462) , 1:3:2 para el sobrenadanle del cu~ivo de Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 8464) y 1:0:16 para la lipasa de C. antarctiea. El grado de conversión va del 77 al 81% para los 4 sobrenadantes ensayados, mientras que con la lipasa de C. antárctlca, la conversión es cuantitativa. La formación del compuesto 6: derivado triacetilado, solo se detecta con la ¡¡pasa de C. antártica.
Tabla 1. Porcentaje determinado por 'H-RMN en la mezcla de reacción formada por acilación de los compuestos 8, 14 Y 20 con extractos de los sobrenadante obtenido del cultivo de las cepas bacterianas de la invención o de una lipasa comercial.
Compuestos Extrac tos bacterian os y lipasa
CECT 8231 CECT 8462 CECT 8462 CECT 8464 Lipasa pura (Novozyme 435)
8 8% 12% 6% 4%
9 36% 34% 44% 38%
10 20% 16% 23% 21%
2 19% 21% 11 % 18% 100%
11 2% 2% 3% 3%
12 10% 9% 5% 9%
13 5% 6% 8% 7%
14 39% 30% 32% 34% 47%
15 17% 16% 14% 12% 10%
16 16% 16% 13% 11% 10%
17 15% 18% 22% 23% 20%
18 7% 11 % 10% 11 % 7%
19 7% 9% 9% 9% 6%
20 19% 20% 29% 23%
21 22% 12% 10% 10% 5%
22 22% 24% 35% 27%
23 20% 24% 13% 21% 82%
24 3% 1% 2% 1%
25 7% 10% 6% 9% 9%
26 7% 9% 5% 9%
6 5%
Ac ilación del hidroxitirosol (compuesto 8). Se disuelve hidroxitirosol (50 mg) en acetato de isopropenilo (3.0 mi) y se añaden celita (50 mg) y el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 oC y en oscuridad 24 horas. Se filtra la disolución y se concentra a sequedad. Se analiza por 'H-RMN el resultado de la acilación (Ver Tabla 1).
Acilación del 3, 4-dihidroxifenilglicol (compuesto 14). Se disuelve 3, 4dihidroxifenilglicol (50 mg) en una mezcla de DMF/acetato de isopropenilo 1:1 (6.0 mi) y se añade el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 oC y en oscuridad 24 horas. Se elimina el disolvente y
el residuo que resulta se redisuelve en acetona seca y se filtra. Por último, se concentra a sequedad. Se analiza por lH_RMN el resultado de la acilación (Ver Tabla 1)
Acilación del alcohol protocatecuico (compuesto 20). Se disuelve el alcohol (50 mg) en acetato de isopropenilo (3.0 mi) y se añade el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 oC y en oscuridad 24 horas. Se filtra la disolución y se concentra a sequedad. Se analiza por 1H_ RMN el resultado de la acilación (Ver Tabla 1)
Ejemplo 4. Evaluación de la capacidad antioxidante de los polifenoles lipófilos 15 descritos en la presente invención.
A continuación se representa los resultados obtenidos en la prueba de actividad antirradicalaria frente al DPPH para los compuestos 4a-4d, 5a-5d, 2 y 14. La actividad antirradicalaria expresada como EC50 frente al DPPH (radical 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo)
representa la cantidad de antioxidante necesario para disminuir la concentración de DPPH al 50%. Se utilizó el método de Sánchez-Moreno (Sánchez-Moreno, C. et al. J. Sei. Food Agric. 1998, 76, 270-276) con las modificaciones de Jiménez y col. J. Agric. And Food ehem. 2005, 53, 5212-5217).
De los nuevos compuestos sintetizados, el más activo resultó ser el compuesto 4a con una actividad parecida al acetato de hidroxitirosilo (Compuesto 2) , aunque menor Que el 3, 4-dihidroxifenilglicol (compuesto 14) (Tabla 2 y Figura 2)
Tabla 2. Actividad antirradicalaria frente a OPPH expresada en valores de ECso (JJ.M)
Compuesto EC", (~M)
4a 14.5 ± 0.500
4b 21.6 ± 2.84
4c 21.7 ± 0.480
Tabla 2. Actividad antirradicalaria frente a OPPH expresada en valores de ECso (~M)
5. 17.S±2.19
Sb 20.3 ± 1.73 Se 20.3 ± 1.74
Sd 16.7 ± 1.81
14.3 ± 0.800
12.0 ± 0.550
Ejemplo 5: Preparación de carbohidratos parcialmente acilados. Reacciones de acilación/desacilación de carbohidratos catalizadas por los extractos enzimáticos 5 obtenidos de los cultivos de las cepas Terribacillus sp. AE28 122 (CECT 8231) , Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) , Entefobactersp. AE1B89 (CECT 8462).
Ejemplo 5.1. Se ha llevado a cabo la reacción de desacetilación del compuesto 27 (metíl a-O
glucopiranósido per-O-acetilado) por alcoholisis en medio metanólico catalizada por los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de las cepas bacterianas Terribacillus sp. AE28 122 (CECT 8231) , En/embae/ersp. AE1889 (CECT 8462) y Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464). Se han comparado los resultados obtenidos con las cepas de la invención con los resultados obtenidos con las lipasas comerciales procedentes de Pseudomonas cepacea 30 U/mg (Sigma-Aldrich, EC 232-619-9) y G. antarctica soportada sobre resina acrílica 5, 000 U/g (Sigma-Aldrich, EC 3.1.1.3, Novozyme 435) (Esquema 5).
El medio de reacción consiste en una suspensión del compuesto 27 y del extracto enzimático o de la lipasa correspondiente, en metanol o en metanol deuterado (CD300).
Una vez que se da por finalizada la reacción, las proporciones entre los distintos compuestos detectados en el crudo de reacción (compuestos 27-29) se obtienen a partir del correspondiente espectro de 1H_RMN en C0300, tras la eliminación del extracto enzimático o de las enzimas correspondientes.
Extracto enzimálico HO
• HO·
CD30D, t.a.
29
Esquema 5
El extracto enzimético procedente de Terribacil/us sp. AE28 122 (CECT 8231) sólo 5 permitió un 28% de conversión (Tabla 3) tras 12 h de reacción. Dicha conversión resultó ser totalmente regioselectiva, ya que s610 se observó la presencia del compuesto 28 (derivado metU 6-O-acetil-a-o-glucopiranósido) , junto con el compuesto 27 utilizado como materia prima (72%).
Destacan los extractos enzimáticos procedentes de los cultivos de EnterobBcler sp. AE1889 (CECT 8462) y Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 8464) , que mostraron un 84 y un 86% de conversión, respectivamente en un tiempo de reacción sensiblemente inferior (6 h). Dichos extractos enzimáticos muestran una tendencia elevada a la desacetilación completa, para dar el compuesto 29 (metil a-o-glucopiranósido) , que se encuentra en una proporción en la mezcla del 64% o del 65%, respectivamente. El compuesto 28 que es el derivado acetilado en e-6 se encuentra en una proporción del 20 y 21%, respectivamente.
las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antarctica, estando esta última soportada sobre resina acrllica, no condujeron a reacción alguna, a pesar de llevar a cabo la reacción a una temperatura sensiblemente superior (hasta 60 OC) Y usar una mayor proporción de enzima (hasta 1.5 veces el peso del monosacárido).
Tabla 3. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 27
catalizada por los sobrenadantes de los cultivos de las cepas de la invención o por (¡pasas comerciales
Microorganismo/Lipasa CECT 8231 Porcentaje calculado (RMN) 27 I 28 I 29 72% 28% 0% t (h) 12 I
CECT 8462 CECT 8484 - 16% 14% 20% 21% 64% 65% 6 6
Lipasa P. cepacea (Sigma·Aldrich, EC 232·619·9) 100% 0% 0% 22
I Lipasa C. antarctica (Novozyme 435) 100% 0% 0% 22
Desacilación del compuesto 27 (metil 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a-o-glucopiranósido).
Una suspensión del compuesto 27 (6.0 mg, 17 IJmol) y del sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en C0300 (1.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En el caso de las lipasas procedentes de P. cepacea y e antarctica soportada sobre resina acrílica, se usó una relación monosacárido/lipasa 1: 1.5, una temperatura de 60 oC y un tiempo de reacción de 22 h. En la Figura 3 se muestra el espectro de l H-RMN de la mezcla de reacción CHRMN (300 MHz, C0300) ]; los resultados se muestran en la Tabla 3.
Ejemplo 5.2. Los sobrenadantes de los cultivos de las cepas descritas en la presente invención, 15 también permiten la desacetilación parcial del compuesto 30 (trehalosa octaacetilada) , usando las mismas condiciones que en el caso del monosacárido 27 (Esquema 6).
OAC
AcO O
~
AcO HO
OAcO~""----"'"\
A~~O\
ArD
, cO~~...- -"'"\ Extracto 31
enzimático
O
• +
ArD
CD, OD, la.~OR' R'O O R' O HO
AcO OR'......."'"1
O
R' =Ac 33 R' = H
Esquema 6
Los extractos enzimáticos de Terribaeillus sp. AE2B 122 (CECT 8231) , En/erobae/er sp. AE1B89 (CECT8462) y BaeiJIus sp. HR21-6 (CECT 8484) , perm~ieron una conversión entre el 89-91% en un tiempo de reacción comprendido entre 7-12 h (Tabla 4). Se observó la preferencia de las enzimas presentes en los sobrenadantes de los cultivos de las cepas mencionadas anteriormente por llevar a cabo la desacetilación sobre uno de los 10 anillos de glucopiranosa (Tabla 4) , permitiendo la detección de dos compuestos nuevos,
el compuesto 31 (2, 3, 4, 6, 6'-penla-O-acetil-a, a-o-trehalosa) (26-35%) y el compuesto 32
(2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a, a-o-trehalosa) (38-40%) , de los que no existen antecedentes en el estado de la técnica.
Cabe destacar, además, que el compuesto 32 es el resultado de una desimetrización en tan 5610 dos etapas (acetilación y desacetilación selectiva) de la trehalosa. La desimetrización es el proceso mediante el cual se consigue que la trehalosa per-Oacetilada 30 pierda su simetría original y se transforme en 31 y 32, donde una unidad de azúcar se encuentra acetilada y la otra total o parcialmente desacetilada. Este proceso se ha conseguido en dos etapas (acetilación de la trehalosa comercial y desacetilación regioselectiva con el extracto enzimático de la invención y representa un número de etapas muy inferior con respecto a cualquier ruta puramente química conocida y utilizada en el estado de la técnica para el mismo fin.
Tabla 4. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 30 (trehalosa octaacetilada) catalizada por Jos sobrenadantes de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención o por lipasas comerciales
Microorganismo I lipasa Porcentaje calculado (RMN) 30 31 32 33 t (h)
CECT 8231 11% 34% 38% 17% 12
CECT 8462 6% 26% 39% 29% 7
CECT 8484 9% 35% 40% 16% 7
lipasa P. cepacea (Sigma-Aldrich, EC 232-619-9) 100% 0% 0% 0% 22
I lipasa C. antarctica (Novozyme 435) 100% 0% 0% 0% 22 I
Este mismo ensayo también se llevó a cabo con fines cuantitativos utilizando el extracto enzimático de Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8464) , lo cual permitió el aislamiento de los compuestos 31 y 32 (29% Y 49%, respectivamente, tras purificación cromatográfica) y su caracterización.
Es destacable que los compuestos 31 y 32 pueden emplearse como materias primas en la preparación de glicolípidos derivados de trehalosa, que presentan interés como vacunas frente a la tuberculosis, provocada por el patógeno Mycobacterium tuberculosis (M Gilleron el al. J. Exp. Med. 2004, 199, 849-659).
De nuevo, cuando la reacción se llevó a cabo usando las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antarctica soportada sobre resina acrílica, no se observó reacción alguna.
Desacilación del compuesto 30 (per-O-acetil-a, a-o-trehalosa) Método A. Una suspensión de per-O-acetil-o., a-o-trehalosa (compuesto 30) (6.0 mg, 8.8 ~mol) y del sobrenadanle del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en CD30D (1.0 ml) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En la Figura 4 se muestra el espectro de lH-RMN de la mezcla de reacción ['H-RMN (500 MHz, CO, DO) ]; los resu~ados se muestran en la Tabla 3.
Método B. Una suspensión de per-O-acetil-a, <l-o-trehalosa 30 (60.0 rng, 88, 0 ~rnol) y el sobrenadante del cultivo de la cepa bacteriana Bscil/u. sp. HR21-6 CECT 8484 (30.0 rng) en MeOH (20 mL) se agita a temperatura ambiente durante 3.5 h. A continuación, se purifica mediante cromatografía en columna (CH2CIz _ CH2Clr MeOH 1:2) para dar lugar a 31 y 32 como sirupos.
2, 3, 4, 6, 6'-Penta-O-acetll~a. o-trehalo.a (compuesto 31)
Rendimiento: 14 mg (29%). 'H-RMN (500 MHz, CO, OO) ¡; 5.57 (dd, 1H, J,., = 10.2 Hz, J".= 9.5 Hz, H-3) , 5.30 (d, 1H, Ju = 3.7 Hz, H-1) , 5.07 (dd, 1H, J •. , = 10.3 Hz, H-4) , 5.04 (d, 1H, J,.,.= 3.7 Hz, H-1') , 4.94 (dd, 1H, H-2) , 4.43 (ddd , 1H, J,... = 4.1 Hz, J,., , = 2.4 Hz, H-5) , 4.28 (dd, 1H, J,.....= 2.0 Hz, J.....,.= 11.7 Hz, H-6a') , 4.24 (dd, 1H, J..... = 12.4 Hz, H20 6a) , 4.15 (dd, 1H, J".... = 7.3 Hz, H-6b') , 4.12 (dd, 1H, H-6b) , 3.62 (ddd, 1H, J •. , , '= 9.7 Hz, H-5') , 3.74 (dd, 1H, J,.,.= 9.7 Hz, J,..•. = 9.1 Hz, H-3') , 3.51 (dd, 1H, H-2') , 3.26 (dd, 1H, H4') , 2.08, 2.05 (x2) , 2.01, 2.00 (5s, 3H cada uno, 5OAc) ; "C-RMN (125.7 MHz, CO, OO) ¡; 172.7, 172.4, 171.7, 171.5, 171.3 (5 COl, 96.3 (C-1') , 92.8 (C-1) , 74.6 (C-3') , 72.8 (C-2') ,
72.2 (C-S') , 72.0 (C-4') , 71.9 (C-2) , 71.S (C-3) , 69.9 (C-4) , 69.1 (C-S) , 65.0 (C-6') , 62.9 (C
6).
2, 3, 4, 6-Tetra-O-acetil-«, <l-o-trehalo.a (compuesto 32).
AcO... "~"--AcO·~_"""'~
Rendimiento: 22 mg (49%). 'H-RMN (500 MHz, CD, OD) 65.55 (dd, 1H, J,., = 10.2 Hz, J,.• = 9.5 Hz, H-3) , 5.34 (d, 1H, J,., = 3.7 Hz, H-1) , 5.07 (dd, 1H, J •. , = 10.3 Hz, H-4). 5.05 5 (d, 1H, J,..,.= 3.3 Hz, H-1') , 4.96 (dd, 1H, H-2) , 4.46 (ddd, 1H, J,...= 3.8 Hz, J'.6b= 2.4 Hz, H-5) , 4.23 (dd, 1H, J.....= 12.4 Hz, H-6a) , 4.12 (dd, 1H, H-6b) , 3.75 (dd, 1H, J,.....= 2.1 Hz, J....".= 11.3 Hz, H-6a') , 3.75 (t, 1H, J,..•. = 9.7 Hz, H-3') , 3.70 (ddd, 1H, J •.. ,.= 9.8 Hz, J,.....=
5.7 Hz, H-5') , 3.65 (dd, 1H, H-6b') , 3.50 (dd, 1H, H-2') , 3.31 (m, 1H, H-4') , 2.06, 2.05, 2.01, 1.99 (45, 3H cada uno, 40Ac) : " C-RMN (125.7 MHz, CD, OD) 6 172.4, 171.7, 171.6,
171.3 (4CO) , 96-6 (C-1') , 93.3 (C-1) , 74.7 (C-3', C-5') , 72.9 (C-2') , 71.7 (x2) , 71.6 (C-2, C3, C-4') , 69.9 (C-4) , 69.0 (C-5) , 62.9 (C-6) , 62.6 (C-6').
Ejemplo 5.3 En la presente invención también se llevó a cabo el proceso de desacetilación parcial del 15 compuesto 34 (sacarosa octaacetilada) (Esquema 7) , usando las mismas condiciones. que en el caso del monosacárido 27.
OAc
Ac
AcrY-'\"-"~--U, Extracto
OAc
AcO'~_~-"
enzimático 35 H OAc C030D, t.a. + Ac Ac A
H
OAc H
Esquema 7
los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de Terribacillus sp. AE28122 (CECT 8231) ,
Enterobacfer sp. AE1B89 (CECT 8462) y Baci/lus sp. HR21-6 (CECT 8464) pennitieron una conversión comprendida entre el 82-90% (Tabla 5). Se observó la preferencia de las enzimas presentes en dicho sobrenadantes por llevar a cabo la desacetilación del anillo de fruclofuranosa (Tabla 5) , pennitiendo la detección de los compuestos 35 (2, 3, 4, 6, 1', 6'hexa-O-acetilsacarosa) y 36 (2, 3, 4, 6, 6'-penta-O-acetilsacarosa).
Adicionalmente, se observó una mayor conversión (90%) en un tiempo de reacción inferior (4h) para el caso del sobrenadante obtenido del cultivo de la cepa de Terribacillus sp. AE2B122 (CECT 8231).
Tabla 5. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 34 (sacarosa octaacetilada) catalizada por los sobrenadanles de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención o por lipasas comerciales
Porcentaje calculado (RMN)
MicroorganlsmolLipasa t (h)
35 36
I I
CECT 8231 10'.6 38% 52% 4 CECT 8462 18% 43% 39% 7.5 CECT8484 14% 44% 42% 8.5
Lipasa P. cepacea 100% 0% 0% 10 (Sigma-Aldrich, EC 232-<>1 S-9) lipasa C. antárcticB 100% 0% 0% 10 (Novozyme 435)
Para el aislamiento de los compuestos mencionados previamente, también se realizó este mismo ensayo con el sobrenadante obtenido de los cultivos de Bacílfus sp. HR21-6 5 (CECT 8464) y se efectuó una purificación cromatográfica, para dar lugar a los compuestos 35 (26%) Y 36 (27%).
Con las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antarctic8 soportada sobre resina acrílica, tampoco se observó reacción alguna para este sustrato.
Desacilación de per-O-acetilsacarosa (compuesto 34)
Método A. Una suspensión de per-D-acetilsacarosa (oompuesto 34) (6.0 mg, 8.8 ~mol) y
el sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en 15 C030 0 (1.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En la Figura 5 se muestra el espectro de 1H-RMN de la mezcla de reacción CH
RMN (500 MHz, CO, OO) ]; los resultados se muestran en la Tabla 4.
Método B. Una suspensión de per-D-acetilsacarosa (compuesto 34) (50.0 mg, 74 ~mol) y 20 el sobrenadante del cu~ivo de la cepa Bacil/u. sp. HR21-<> CECT 8484 (25.0 mg) en MeOH (16.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante 4h. A continuación, se purifica mediante cromatografía en columna (CH2CI2 --+ CH2Cb-MeOH 1 :2) para dar lugar al
compuesto 35 (11.2 mg, 26%) y al compuesto 36 (10.9 mg, 27%) como sirupos.
Ejemplo 5.4. Acllaclón regloselectiva de carbohidratos loS extractos enzimáticos de las cepas bacterianas descritas en la presente invención también penniten las reacciones de aeilación regioselectiva de carbohidratos. Así, por ejemplo la acilación, preferentemente acetilación del compuesto 29 (metil a-D
glucopiranósido) usando acetato de isopropenilo como agente acilante, el extracto enzimático de Bacillus stratosphericus como catalizador enzimático y DMF como cadisolvente (Esquema 8) , ha dado lugar a la obtención de los compuestos 37 y 28, que presentan grupos acilos en las posiciones 4 y 6, respectivamente.
OH O HO HO ""~~ ~O~. HO /\'~--- + AcO /\'~--
~ Extracto enzimático HO-\,. ~..l HOI-.\,.... ~~ OH OM Bacillus stratosphericus 29 e DMF 28 37 60·C
Esquema 8
A pesar de llevar a cabo calentamientos prolongados (60 oC durante 105 h) , la conversión 15 es del 49%, aunque con una alta regioselectividad, ya que se observa la presencia del producto monoacetilado en C-6 (compuesto 28) (13%) , Y el compuesto 37 (metiI4, 6-di-O
acetil-a. o-glucopiranósido) como derivado acetilado mayoritario (36%) , no detectado en los correspondientes ensayos de desacetilación.
Acilación del metll 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-a-o-glucopiranósido (compuesto 29) Una disolución del compuesto 29 (6.0 mg, 0.017 mmol) , el sobrenadante del cultivo de la cepa Bacil/us sp. HR21 -6 CECT 8464 (3.0 mg) y acetato de isopropenilo (0.5 mL) en DMF (0.3 mL) se calienta con agitación a 60 oC durante 105 h. A continuación se concentra a sequedad y el residuo se analiza mediante 1H-RMN, mostrando una mezcla de los compuestos 28. 29 Y 37 en una proporción de 13%, 51% Y 36%, respectivamente.
