Empleo de probioticos en el incremento de la fertilidad masculina
La presente invention se refiere al uso de una composition que comprende dos cepas de las especies microbianas Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium longum con capacidad probiotica para incrementar la fertilidad masculina. Por lo tanto, la presente invencion se engloba dentro del campo de la reproduction humana y animal, con aplicaciones tanto en el sector farmaceutico como agroalimentario.
ESTADO DE LA TECNICA
Los probioticos son microorganismos vivos que cuando se ingieren en una dosis adecuada confieren un beneficio a la salud del consumidor. Basicamente se han usado como ingredientes en alimentos funcionales o en suplementos nutricionales, por ello han sido y son de gran interes para las industrias agroalimentaria y farmaceutica, respectivamente. La inmensa mayoria de los probioticos utilizados hasta la fecha suelen ser efectivos a nivel del tracto digestivo e influyen positivamente sobre patologias digestivas como la colitis, el estrenimiento o la inflamacion intestinal, entre otras. Ahora bien, existen casos aislados en la literatura cientifica que hacen referencia al empleo de probioticos en infecciones vaginales, en problemas de piel o incluso en obesidad o en autismo.
El empleo de probioticos en el campo de la reproduccion humana es limitado y se centra principalmente en el factor femenino y en los casos anteriormente descritos de infecciones vaginales. En este sentido, existen estudios en los que se han utilizado probioticos como terapia en vaginosis bacterianas, proporcionando resultados positivos en algunos estudios clmicos (Mastromarino et al., 2013. New Microbiol. 36 (3) : 229-38; Borges et al., 2014. Arch Gynecol Obstet., 289 (3) : 479-89). Por el contrario, no se ha descrito el efecto de los probioticos sobre la fertilidad masculina en humanos. En el modelo animal del pez cebra se ha constatado que la ingesta de probioticos incrementa de forma significativa marcadores moleculares asociados a calidad reproductora (Riesco et al., 2013. Evaluation of a probiotic diet on zebrafish sperm quality markers. 4th International workchop on the biology of Fish Gametes (Albufeira, Portugal) ) , pero hasta la fecha no existe ninguna publication cientifica que evalue el efecto de la ingesta de probioticos sobre parametros de calidad espermatica
en humanos, ni que correlacione la ingesta de dichos suplementos con mejoras en movilidad espermatica.
Por otro lado, el efecto antioxidante de las bacterias lacticas y de las bifidobacterias ha sido estudiado pero nunca en relacion con la calidad espermatica en humanos aunque si en animales (Riesco et al., 2013 citado ad supra). Durante las ultimas decadas, se han desarrollado estudios clmicos para establecer los efectos beneficiosos de los tratamientos con antioxidantes en la mejora de los parametros espermaticos en hombres, as^ como en los indices de fertilization o embarazo en sus parejas. Los antioxidantes mas comunmente estudiados han sido la vitamina C, la vitamina E, el selenio, el glutation, el zinc, la N-acetil-cistema y la L-carnitina (Gharagozloo et al., 2011. Hum Reprod. 26 (7) : 1628-40; Ko y Sabanegh, 2012. J Androl 33 (3) : 292-308; Showell et al., 2013. Cochrane Database Syst Rev, 5; 8:CD007807). Algunos de estos estudios evaluan el efecto de estos antioxidantes en ensayos in vitro (anadidos como suplementos en la solution de crioprotectores) y concluyen que existe un efecto beneficioso de estos aditivos en la protection del espermatozoide frente a las moleculas oxidativas generadas durante los protocolos de congelacion- descongelacion (Walczak-Jedrzejowska et al., 2013. Cent European J Urol. 66 (1) : 607). Otros estudios evaluan el efecto de la administration de antioxidantes orales en los parametros espermaticos. Por ejemplo, en 2010, Ross y colaboradores (Ross et al., 2010, Reprod Biomed Online, 20 (6) : 711-23) revisaron los efectos beneficiosos de la ingesta de antioxidantes orales en parametros espermaticos. La patente espanola ES2225625 describe una composition para mejorar la calidad del esperma humano que comprende, al menos, una fuente de zinc y, opcionalmente, vitamina B12, magnesio, betama, colina, SAM, vitamina B2 y vitamina B6. De forma similar, la patente espanola ES2397657 describe una preparation de combination para mejorar la calidad del esperma de un individuo, que comprende, como sustancias activas, la L- carnitina, la coenzima Q, la vitamina E, una fuente de zinc, la vitamina B, una fuente de selenio, el glutation, la L-arginina o las sales o derivados de ellos. Sin embargo, los efectos de estos tratamientos no siempre perduran en el tiempo y no se sabe si disminuyen la fragmentacion del ADN espermatico; uno de los parametros mas relevantes en la calidad del esperma.
Por lo tanto, existe en el estado de la tecnica una necesidad de proporcionar metodos alternativos para incrementar la fertilidad masculina, mejorando la calidad del esperma, que no presenten los inconvenientes antes citados.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
Los inventores de la presente invention han descubierto que la administration combinada de una cepa de Lactobacillus rhamnosus y una cepa de Bifidobacterium longum proporciona un incremento de la fertilidad masculina. En una realization particular, las cepas son Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 y Bifidobacterium longum CECT 7347. Tal como se muestra en el Ejemplo 1, la ingesta por parte de los sujetos de estudio de una composition que comprendia la combination de una cepa de Lactobacillus rhamnosus y una cepa de Bifidobacterium longum produjo un incremento en la motilidad espermatica y una reduction de la fragmentation del ADN espermatico; dos parametros clave en la evaluation de la calidad del semen. Asi, la ingesta de estas cepas en una combinacion probiotica mejora la calidad seminal y, por lo tanto, incrementa la fertilidad masculina. Ademas, este incremento en la fertilidad se mantiene incluso seis semanas despues de haber finalizado la ultima ingesta, consiguiendo con ello un efecto a largo plazo. Una posible explication a estos resultados seria que la combinacion de la capacidad antioxidante de la cepa Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 con la capacidad antiinflamatoria de la cepa Bifidobacterium longum CECT 7347 sea la responsable de dicho incremento en la motilidad espermatica y de la reduccion de la fragmentacion del ADN espermatico. Por todo ello, la invencion aqu descrita permite utilizar cepas bacterianas con propiedades probioticas para abordar terapias a fin de incrementar la fertilidad masculina antes de realizar una tecnica de reproduction asistida o de reproduction natural o incluso antes de realizar donaciones espermaticas para futuras inseminaciones.
En base a este descubrimiento, se ha desarrollado una serie de aspectos inventivos que seran descritos en detalle a continuation.
Uso de la administracion combinada de las cepas de las especies Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium longum para incrementar la fertilidad masculina de un sujeto.
Los inventores de la presente invencion han descubierto que la administracion combinada de una cepa de Lactobacillus rhamnosus y una cepa de Bifidobacterium longum proporciona un incremento de la fertilidad masculina. No obstante, debido a la extraordinaria capacidad antioxidante de Lactobacillus rhamnosus, en particular, L.
rhamnosus CECT 8361, en comparacion con otras especies de Lactobacillus, no puede descartarse la posibilidad del uso de Lactobacillus rhamnosus de forma individual en la elaboration de una composition farmaceutica para incrementar la fertilidad masculina. Los autores de la presente invention piensan que la capacidad antioxidante de Lactobacillus rhamnosus, en particular de la cepa L. rhamnosus CECT 8361, protege a los espermatozoides de las especies reactivas de oxigeno que pueden alterar las membranas de los espermatozoides, la integridad del ADN y la motilidad espermatica. Por lo tanto, los inventores piensan que la capacidad antioxidante de la cepa incrementa la calidad seminal; en particular, incrementa la motilidad espermatica y disminuye la fragmentation del ADN espermatico, lo que, en ultima instancia, incrementa la fertilidad masculina. Por otro lado, debido a la capacidad antiinflamatoria de Bifidobacterium longum, en particular, la cepa Bifidobacterium longum CECT 7347, en la presente invencion tambien se contempla la posibilidad de emplear Bifidobacterium longum, en particular Bifidobacterium longum CECT 7347, de forma individual para incrementar la fertilidad masculina. Los autores de la presente invencion piensan que la capacidad de Bifidobacterium longum CECT 7347 de reducir los niveles del factor inflamatorio TNF-a e incrementar la production de la citoquina antiinflamatoria IL-10 protege a los espermatozoides del estres oxidativo. Por lo tanto, composiciones que comprenden, al menos, L. rhamnosus CECT 8361 o Bifidobacterium longum CECT 7347 y su uso en el incremento de la fertilidad masculina de un sujeto tambien son contempladas en la presente invencion.
En un aspecto, la invencion se relaciona con el uso de Lactobacillus rhamnosus en combination con Bifidobacterium longum en la elaboracion de una composicion (de aqu en adelante, "composicion de la invencion") para incrementar la fertilidad masculina en un sujeto.
Lactobacillus rhamnosus es una bacteria usada habitualmente como probiotico, que se encuentra mayoritariamente en el yogur y otros productos lacteos. La clasificacion cientifica de Lactobacillus rhamnosus es: Reino: Bacteria, Division: Firmicutes, Clase: Bacilli, Orden: Lactobacillales, Familia: Lactobacillaceae, Genero: Lactobacillus, Especie: Lactobacillus rhamnosus. Por otro lado, Bifidobacterium longum es una bacteria Gram negativa, catalasa-negativa, con forma redondeada, que se encuentra en el tracto gastrointestinal donde produce acido lactico. La clasificacion cientifica de Bifidobacterium longum es: Reino: Bacteria, Division: Firmicutes, Clase:
Actinobacteria, Orden: Bifidobacteriales, Familia: Bifidobacteriaceae, Genero: Bifidobacterium, Especie: Bifidobacterium longum.
En la presente invention se entiende por "incrementar la fertilidad masculina" en un sujeto mejorar la calidad del semen de dicho sujeto, lo que conlleva incrementar las probabilidades de fecundar a una hembra y obtener descendencia. Como entiende el experto en la materia, en el contexto de la presente invencion, la calidad del semen de un sujeto es mejorada con respecto a la calidad del semen de dicho sujeto antes de haber ingerido las cepas de la invencion. La calidad seminal de un sujeto puede medirse por multitud de parametros tales como, pero sin limitarse a, la motilidad espermatica, la viabilidad del espermatozoide, su morfologia, la composition de la membrana del espermatozoide, la concentration de espermatozoides, el volumen del eyaculado y la integridad del ADN de los espermatozoides. Hay varios metodos descritos en el estado de la tecnica para medir todos estos parametros y su empleo es practica de rutina para el experto en la materia. Algunas evaluan la integridad del ADN espermatico: el ensayo TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling) , el ensayo del analisis de la estructura cromatmica del esperma (SCSA) , el ensayo cometa, y el test de de dispersion del cromatina espermatica (SCD). Otros ensayos identifican defectos en el empaquetamiento de la cromatina espermatica: tincion con azul de toluidina, con naranja acridina y cromomicina A. Ademas, existen diversos marcadores moleculares tales como distintos tipos de ARN (ARNm, microARNs, etc.) que pueden asociarse a una mayor calidad seminal a pesar de no ser realizados de forma rutinaria en clmica.
Por lo tanto, en una realization particular, el incremento de la fertilidad masculina comprende el incremento de la motilidad espermatica, de la viabilidad del espermatozoide, de la composicion de la membrana del espermatozoide, de la concentracion de espermatozoides morfologicamente normales y/o del numero total de espermatozoides en el eyaculado, y/o comprende la disminucion de la fragmentation del ADN de los espermatozoides y la mejora de la integridad de la cromatina espermatica.
Una disminucion en la fragmentacion del ADN de los espermatozoides evita perdidas de motilidad, fertilidad y disminuye la probabilidad de alteraciones durante el desarrollo embrionario temprano y en la progenie.
En la presente invention se entiende que la integridad de la cromatina espermatica esta mejorada cuando el ADN espermatico esta organizado de forma compacta y estable, consiguiendo un empaquetado del material genetico que asegura que el ADN sea entregado en una forma fisica y quimica tal, que es capaz de descondensarse en el momento apropiado del proceso de la fertilization y transmitir el ADN sin defectos.
En la presente invencion el termino "sujeto" es equivalente al termino "individuo"; por lo que ambos terminos pueden emplearse indistintamente en la presente invencion. Se entiende por "sujeto", ademas de cualquier individuo, cualquier animal macho perteneciente a cualquier especie que produzca gametos para reproducirse. Ejemplos de sujetos incluyen, sin limitar a, animales de interes comercial tales como peces (truchas, sardinas, carpas, salmones, etc.) , aves (gallinas, avestruces, pollos, ocas, perdices, etc.) , conejos, liebres, animales domesticos (perros, gatos, etc.) , ganado ovino, ganado caprino (cabras, etc.) , ganado porcino (jabalies, cerdos, etc.) , ganado equino ( caballos, ponis, etc.) , ganado vacuno o bovino (toros, bueyes, etc.) ; animales de interes cinegetico, tales como ciervos, venados, renos, etc.; animales de interes ecologico, es decir, animales que estan en peligro de extincion o cuyas poblaciones en la naturaleza son escasas como, por ejemplo, tigres blancos, rinocerontes, osos pandas, pumas, linces, etc.; y los seres humanos. No obstante, en una realization particular, el sujeto es un pez o un mamifero, preferiblemente, un mamifero seleccionado del grupo que consiste en un ser humano, un cerdo, un caballo, un conejo, un buey y un toro.
El uso descrito en la presente invencion puede aplicarse a cualquier sujeto macho para incrementar su fertilidad, independientemente de que la fertilidad este disminuida (subfertil) o no (fertil). En los sujetos machos fertiles, el incremento de la fertilidad puede ser interesante para incrementar la capacidad de reproduction. Por otro lado, el incremento de la fertilidad tambien puede ser interesante por representar, en general, una ventaja para las parejas humanos que deseen tener mayores posibilidades de embarazo. En individuos machos subfertiles se puede usar la composition de la invencion para tratar dicha subfertilidad, es decir, para mejorar las posibilidades de conseguir con exito una fecundacion.
En otra aplicacion ventajosa, la composicion de la invencion se puede administrar a un individuo macho de una especie de mamiferos y, en particular, a un hombre, sin saber a priori si dicho individuo macho es fertil o subfertil. A modo enunciativo, en esta
aplicacion se puede administrar la composition de la invention al individuo macho de una pareja cuando la fecundation tarda en realizarse, por ejemplo, para evitar tener que realizar pruebas y/o antes de realizar cualquier prueba. Esto es importante ya que la prueba del esperma es cara y molesta para el individuo en cuestion, porque la especificidad y la sensibilidad de los sistemas de prueba varian y porque puede haber fluctuaciones en la cantidad y/o en la calidad del esperma.
Tambien se pueden utilizar la composicion de la invencion en individuos machos de parejas que tienen la intention de tener un hijo, es decir para aumentar las posibilidades de fecundacion y/o para contrarrestar cualquier problema de fertilidad masculina, de nuevo sin necesidad de realizar pruebas previas.
Tambien se puede usar la composicion de la invencion para prevenir o contrarrestar a largo plazo los efectos de la fluctuation de la cantidad y la calidad del esperma con respecto a la reproduction.
Por otro lado, tambien se puede utilizar la composicion de manera profilactica para impedir una disminucion de la calidad del esperma en individuos de riesgo o individuos que padecen disfunciones del tracto urogenital, y/u otras disfunciones que pueden tener efectos sobre la calidad del esperma (por ejemplo, en individuos machos que estan (o deben ser) sometidos a un tratamiento farmacologico) y durante un tratamiento farmacologico o una radioterapia. Ademas, las composiciones y/o preparaciones de la invencion se pueden utilizar, por ejemplo, para mejorar la calidad del esperma que puede verse afectada por factores como la malnutrition, factores ambientales, y/o la exposition a sustancias nocivas.
La proportion de la cepa de Lactobacillus rhamnosus con respecto a la cepa de Bifidobacterium longum puede variar en un amplio intervalo. El ratio Lactobacillus. rhamnosus:Bifidobacterium longum en la composicion de la invencion incluye, sin limitarse a, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10 y 95:05. No obstante, en una realization particular, el ratio Lactobacillus rhamnosus: Bifidobacterium longum es, aproximadamente, 50:50.
Como entiende el experto en la materia, la composicion de la invencion puede ir formulada para su administration farmaceutica, es decir, formando parte de otros
productos farmacologicos consumidos o ingeridos por el sujeto, o para su administration alimentaria, es dedr, formando parte de los alimentos que son consumidos en la dieta por un sujeto. Por lo tanto, en una realization particular, la composition es una composition farmaceutica o una composition nutricional funcional.
La composicion farmaceutica es un conjunto de componentes que esta formada, al menos, por las cepas de la invencion en cualquier concentracion, que, adicionalmente, puede comprender uno o mas componentes o compuestos que posean alguna actividad biologica, farmacologica y/o veterinaria; en particular, compuestos que cuando son administrados oralmente a un sujeto puedan ejercer dicha actividad biologica. Estos compuestos adicionales pueden ser uno o mas compuestos que se sabe per se que presentan, al ser administrados (por via oral) a un sujeto o individuo macho de una especie, en particular, de una especie de mamiferos, una influencia beneficiosa sobre la fertilidad y/o sobre la calidad del esperma de un individuo macho; y/o pueden ser uno o mas componentes que, tras su administracion a un sujeto, pueden ulteriormente aumentar, reforzar y/o impulsar la actividad de las cepas de la invention. Como entiende el experto en la materia, los compuestos adicionales deben ser compatibles con las cepas de la invencion. Asi, en el contexto de la presente invencion, dentro del termino "composicion farmaceutica" tambien se engloban las composiciones veterinarias.
El o los compuestos adicionales pueden ser uno o varios compuestos que garanticen la espermatogenesis o cualquier parte y/o proceso de la espermatogenesis. Algunos ejemplos no limitativos de estos compuestos incluyen, sin limitarse a:
- Magnesio, es decir, en forma de una fuente de magnesio biodisponible como una sal de magnesio biodisponible (por ejemplo, citrato de magnesio) ;
- Una o mas vitaminas y, en particular, la vitamina B12 y/o la vitamina B2;
- Una fuente apropiada de grupos metilo, como la metionina, la betama y/o la colina; esta ultima, por ejemplo, en forma de fosfatidilcolina; o una fuente adecuada de la misma, como la lecitina;
- Un agente de metilacion apropiado como la S-adenosil metionina (SAM) ;
- Una fuente de glucosa;
- o cualquier combination adecuada de los mismos.
Estos componentes adicionales pueden ser tambien uno o varios compuestos que mejoran los niveles de glutation (reducido) de los espermatozoides. Un ejemplo no limitativo de este tipo de compuestos es la vitamina B6, que puede estar presente o ser administrada en forma de una piridoxina (estable) o de un derivado de la misma, como el piridoxal o la piridoxamina. La mejoria del estado de glutation de los espermatozoides es importante con el fin de mejorar la calidad del esperma, incluyendo, aunque no solo, el aumento de la vida media del espermatozoide, la movilidad del mismo y/o la capacidad para fertilizar un ovulo. Otros componentes adecuados para su uso en composiciones y preparaciones de la invencion pueden comprender una fuente apropiada de cobre y, en particular, iones de Cu2+, como el sulfato de cobre (II) , el carbonato de cobre (II) o el citrato de cobre (II).
Ejemplos de otros compuestos que ayudan a incrementar la fertilidad masculina, incluyen, sin limitarse a, el acido folico, el zinc, la glutation, la arginina y el acido alfa- lipoico.
En una realization particular, la composition farmaceutica comprende un vehiculo y/o un excipiente farmaceuticamente aceptable.
El termino "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorcion de cualquiera de los componentes de la composicion, es decir, de las cepas de la invention, o estabiliza dichos componentes y/o ayuda a la preparation de la composicion farmaceutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan mas agradable. Asi pues, los excipientes podrian tener la funcion de mantener los componentes unidos (por ejemplo, almidones, azucares o celulosas) , de endulzar, de aportar un colorante, de proteger el principio activo (por ejemplo, para aislarlo del aire y/o la humedad) , la de rellenar una pastilla, capsula o cualquier otra forma de presentation, de desintegrar para facilitar la disolucion de los componentes, etc., sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este parrafo. Por tanto, el termino "excipiente" se define como aquella materia que, incluida en las formas galenicas, se anade a los principios activos o a sus asociaciones para posibilitar su preparacion y estabilidad, modificar sus propiedades organolepticas o determinar las propiedades fisico-quimicas de la composicion farmaceutica y su biodisponibilidad. El excipiente "farmaceuticamente aceptable" debe permitir la actividad de los compuestos de la composicion farmaceutica, es decir, que sea compatible con las cepas de la invencion.
La "forma galenica" o "forma farmaceutica" es la disposition a la que se adaptan los principios activos y excipientes para constituir una composition o un farmaco. Se define por la combination de la forma en la que la composicion farmaceutica es presentada por el fabricante y la forma en la que es administrada.
El "vehiculo" o "portador" es, preferiblemente, una sustancia inerte. La funcion del vehiculo es facilitar la incorporation de otros compuestos, permitir una mejor dosificacion y administration y/o dar consistencia y forma a la composicion farmaceutica. Por tanto, el vehiculo es una sustancia que se emplea en el farmaco para diluir cualquiera de los componentes de la composicion farmaceutica de la presente invencion hasta un volumen o peso determinado; o bien que, aun sin diluir dichos componentes, es capaz de permitir una mejor dosificacion y administracion y/o dar consistencia y forma al farmaco. Cuando la forma de presentation es liquida, el vehiculo farmaceuticamente aceptable es el diluyente.
Ademas, el excipiente y el vehiculo deben ser farmacologicamente aceptables, es decir, que el excipiente y el vehiculo esten permitidos y evaluados para que no cause dano al sujeto a los que se administra.
En cada caso la forma de presentacion de la composicion farmaceutica se adaptara al tipo de administracion utilizada. Por ello, la composicion se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administracion clmicamente permitida y en una cantidad terapeuticamente efectiva. La composicion farmaceutica de la invention se puede formular en formas solidas, semisolidas o liquidas, tales como comprimidos, capsulas, polvos, granulos, soluciones, supositorios, geles o microesferas. En una realization particular, la composicion farmaceutica se presenta en una forma adaptada a la administracion oral.
La forma adaptada a la administracion oral se refiere a un estado fisico que pueda permitir su administracion oral. Dicha forma adaptada a la administracion oral se selecciona de la lista que consiste en, pero sin limitarse a, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspension, suspension extemporanea, vial bebible, comprimido, capsula, granulado, sello, pfldora, tableta, pastilla, trocisco y liofilizado.
Adicionalmente a lo descrito en parrafos anteriores, en la presente invencion tambien se contempla la posibilidad de que la composicion de la invencion se pueda
administrar a un sujeto de forma conjunta con otros compuestos, aunque estos no formen parte de la composition de la invention. Ejemplos de dichos compuestos han sido mencionados en parrafos anteriores.
As^ la administration al sujeto de dichos compuestos puede realizarse de forma simultanea o de forma secuencial a la composicion de la invencion.
En el caso de que la composicion de la invencion este formulada como una composicion nutricional funcional, dicha composicion nutricional puede ser un alimento o ir incorporada en un alimento o producto alimenticio destinado tanto a la alimentation humana como a la alimentation animal. Asi, en una realization particular, la composicion nutricional funcional es seleccionada de entre un alimento (que puede ser un alimento para fines nutricionales espedficos o un alimento medicinal o un alimento funcional) o un suplemento nutricional.
El termino "composicion nutritiva funcional" o "composicion nutricional funcional" de la presente invencion se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. En la presente invencion, dicha composicion nutricional funcional esta destinada a incrementar la fertilidad masculina.
El termino "suplemento", sinonimo de cualquiera de los terminos "suplemento dietetico", "suplemento nutricional", "suplemento alimentario" o "suplemento alimenticio", es un componente o componentes destinados a complementar la alimentacion. Algunos ejemplos de suplementos dieteticos incluyen, pero sin limitarse a, las vitaminas, los minerales, los productos botanicos, los aminoacidos y los componentes de los alimentos, como las enzimas y los extractos glandulares. No se presentan como sustitutos de un alimento convencional ni como componentes unicos de una comida o de una dieta alimenticia, sino como complemento de la dieta.
Ejemplos de alimentos que pueden comprender una cepa de Lactobacillus rhamnosus y una cepa de Bifidobacterium longum, o la composicion que las comprende tal como se ha explicado en parrafos anteriores incluyen, pero sin limitarse a, piensos, productos lacteos, productos vegetales, productos carnicos, aperitivos, chocolates, bebidas, alimentos infantiles, cereales, fritos, bolleria industrial, galletas, etc. Ejemplos
de productos lacteos incluyen, pero sin limitarse a, productos derivados de leche fermentada (por ejemplo, pero sin limitarse a, yogur o queso) o no fermentada (por ejemplo, pero sin limitarse a, helado, mantequilla, margarina o suero lacteo). El producto vegetal es, por ejemplo, pero sin limitarse a, un cereal en cualquier forma de presentation, fermentado o no fermentado, o un aperitivo. La bebida puede ser, pero sin limitarse a, leche no fermentada. No obstante, en una realization particular, el producto alimentario se selecciona del grupo que consiste en un producto lacteo, un producto carnico, un producto vegetal, un forraje y una bebida.
En otra realizacion particular, la composicion de la invencion es administrada a un sujeto a traves de la dieta.
Como entiende el experto en la materia, los microorganismos Lactobacillus. rhamnosus y Bifidobacterium longum tienen que estar presentes en la composition de la invention en una cantidad terapeuticamente eficaz para que puedan ejercer su efecto de incrementar la fertilidad masculina cuando es administrada a un sujeto. En la presente invencion se entiende por "cantidad terapeuticamente eficaz" aquella cantidad del componente de la composicion farmaceutica que, cuando se administra a un sujeto, es suficiente para producirle el efecto. Dicho componente de la composicion farmaceutica se refiere a las cepas de la invencion. La cantidad terapeuticamente efectiva variara en funcion de, por ejemplo, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del sujeto, al igual que en funcion del modo y del tiempo de administracion, de la velocidad de excrecion o de la combinacion de farmacos entre otros. Asi, en una realizacion particular, la concentration total de microorganismos de las cepas Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium longum en la composicion es de entre 106 y 1012 ufc, preferiblemente, 109 ufc. En otra realizacion particular, la dosis de administration de microorganismos de Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium longum en la composicion es de entre 106 y 1012 ufc/dia, preferiblemente, 109 ufc/dia, y en otra realizacion todavia mas particular, el regimen de administracion es de, al menos, una vez al dia, en particular, dos veces al dia, y mas en particular, tres veces al dia, una con cada ingesta de comida (desayuno, almuerzo y cena).
En una realizacion particular, la cepa de Lactobacillus rhamnosus es la cepa Lactobacillus rhamnosus CECT 8361, o una cepa derivada de la misma, y/o la cepa de Bifidobacterium longum es la cepa de Bifidobacterium longum CECT 7347, o una
cepa derivada de la misma. Esta realization particular de la invention sera descrita en detalle a continuation.
Composicion II de la invencion
En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con una composicion, de aqu en adelante, "composicion II de la invencion", que comprende Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 y Bifidobacterium longum CECT 7347, o cepas derivadas de las mismas, cuya combination presenta la capacidad de incrementar la fertilidad masculina.
La cepa Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 fue aislada a partir de heces de un nino de menos de tres meses de vida, sano y alimentado con lactancia materna. Esta cepa fue depositada el 27 de mayo de 2013 bajo el Tratado de Budapest en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Deposito (Edificio 3 CUE, Parc Cientific Universitat de Valencia, Catedratico Agustm Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPANA). El numero de deposito asignado fue CECT 8361 (de aqu en adelante "cepa de la invencion CECT 8361" o "Lactobacillus rhamnosus CECT 8361"). La clasificacion cientifica de la cepa de la invencion CECT 8361 es: Reino: Bacteria, Division: Firmicutes, Clase: Bacilli, Orden: Lactobacillales, Familia: Lactobacillaceae, Genero: Lactobacillus, Especie: Lactobacillus rhamnosus. Durante el aislamiento de la cepa de la invencion CECT 8361, los inventores observaron que Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 tiene, sorprendentemente, una mayor actividad antioxidante que otros aislados del genero Lactobacillus, es decir, ofrece una mayor protection frente al estres oxidativo a las celulas. Asi, en una realizacion particular, la cepa de Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 presenta una actividad antioxidante mayor que otras cepas de Lactobacillus. Por ello, los inventores piensan que la capacidad antioxidante de la cepa es relevante para explicar el incremento de la calidad del semen, en particular, en el incremento de la motilidad espermatica y en la disminucion de la fragmentation del ADN espermatico; lo que, en ultima instancia, incrementa la fertilidad masculina.
La cepa Bifidobacterium longum CECT 7347 fue aislada a partir de heces de un nino sano de menos de tres meses de edad sometido a lactancia materna y depositada el 20 de diciembre de 2007 bajo el Tratado de Budapest en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Deposito (con sede en Burjassot, Valencia). El numero de deposito asignado fue CECT 7347 (de aqu en adelante "cepa
de la invention CECT 7347" o "Bifidobacterium longum CECT 7347"). La clasificacion cientifica de la cepa de la invencion CECT 7347 es: Reino: Bacteria, Division: Firmicutes, Clase: Actinobacteria, Orden: Bifidobacteriales, Familia:
Bifidobacteriaceae, Genera: Bifidobacterium, Especie: Bifidobacterium longum. La cepa de de la invencion CECT 7347 presenta actividad antiinflamatoria.
Dentro de la presente invencion, tambien estan contemplados aquellos microorganismos o bacterias que derivan de la cepa de la invencion CECT 8361 y de la cepa de la invencion CECT 7347 y que conservan la capacidad de incrementar la fertilidad masculina debido a que mejoran la calidad del semen y/o disminuyen la fragmentation del ADN espermatico y mejoran la integridad de la cromatina. Ejemplos de cepas o microorganismos derivados de las cepas de invencion pueden ser mutantes que presentan variaciones en su genoma respecto al genoma de las cepas de la invencion pero que no afectan a la capacidad de las cepas de incrementar la fertilidad masculina. Asi, cepas mutantes derivadas de las cepas de la invencion que conservan la capacidad de incrementar la fertilidad tambien estan contempladas dentro de la presente invencion. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invencion se refiere a cepas derivadas de la cepa de la invencion CECT 8361 y de la cepa de la invencion CECT 7347, con capacidad para incrementar la fertilidad masculina cuando se administran de forma combinada a un sujeto.
Las cepas derivadas de la cepa de la invencion CECT 8361 y de la cepa de la invencion CECT 7347 pueden producirse de forma natural o bien de forma intencionada, por metodos de mutagenesis conocidos en el estado de la tecnica como, por ejemplo, pero sin limitarse a, el crecimiento de la cepa original en presencia de agentes mutagenicos o causantes de estres o mediante ingenieria genetica dirigida a la modification, deleccion y/o inclusion de genes espedficos. Asi, dentro de la presente invencion tambien se contemplan organismos geneticamente modificados derivados de las cepas de la invencion que conservan su capacidad de incrementar la fertilidad masculina.
Por otro lado, dentro de la presente invencion, tambien se contemplan los componentes celulares, los metabolitos y las moleculas secretadas por la cepa de la invencion CECT 8361 y por la cepa de la invencion CECT 7347 o por las cepas derivadas de la cepa de la invencion CECT 8361 y de la cepa de la invencion CECT 7347, asi como las composiciones que comprenden dichos componentes y los usos
de los mismos para incrementar la fertilidad masculina. Entre los componentes celulares de la bacteria se podrian incluir los componentes de la pared celular (como, por ejemplo, pero sin limitarse a, el peptidoglicano) , los acidos nucleicos, los componentes de la membrana u otros, como protemas, Kpidos e hidratos de carbono y sus combinaciones (como lipoprotemas, glicolipidos o glicoprotemas). Los metabolitos incluyen cualquier molecula producida o modificada por la bacteria como consecuencia de su actividad metabolica, durante su crecimiento, su uso en procesos tecnologicos o durante el almacenamiento del producto. Ejemplos de estos metabolitos son, pero sin limitarse a, los acidos organicos e inorganicos, las protemas, los peptidos, los aminoacidos, las enzimas, los Kpidos, los hidratos de carbono, las lipoprotemas, los glicolipidos, las glicoprotemas, las vitaminas, las sales, los metales o los acidos nucleicos. Las moleculas secretadas incluyen cualquier molecula secretada o liberada al exterior por la bacteria durante su crecimiento, su uso en procesos tecnologicos (por ejemplo, de elaboration de alimentos o farmacos) o el almacenamiento del producto. Ejemplos de estas moleculas son, pero sin limitarse a, acidos organicos e inorganicos, protemas, peptidos, aminoacidos, enzimas, lipidos, hidratos de carbono, lipoprotemas, glicolipidos, glicoprotemas, vitaminas, sales, metales o acidos nucleicos.
En la presente invention se entiende que una cepa o la combination de ellas, tiene/n la capacidad de "incrementar la fertilidad masculina" cuando, tras su ingesta por un sujeto, dicha/s cepa/s es/son capaz/ces de aumentar la calidad del semen de dicho sujeto y, con ello, de incrementar las probabilidades de fecundar a una hembra y obtener descendencia.
La proportion de la cepa de la invencion CECT 8361 y de la cepa de la invencion CECT 7347 en la composition de la invencion puede variar en un amplio intervalo. El ratio Lactobacillus rhamnosus CECT 8361:Bifidobacterium longum CECT 7347 en la composicion de la invencion incluye, pero sin limitarse a, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10 y 95:05. No obstante, en una realization particular el ratio Lactobacillus rhamnosus CECT 8361:Bifidobacterium longum CECT 7347 es, aproximadamente, 50:50.
Tal como se ha explicado anteriormente para el uso de la composicion de la invencion para el incremento de la fertilidad masculina, la composicion II de la invencion puede ir
formulada para su administration farmaceutica o para su administration alimentaria, Por lo tanto, en una realization particular, la composition es una composition farmaceutica o una composicion nutricional funcional.
La composicion farmaceutica es un conjunto de componentes que esta formado, al menos, por la cepa de la invention CECT 8361 y la cepa de la invention CECT 7347, en cualquier concentracion, que, adicionalmente, puede comprender uno o mas componentes o compuestos que posean alguna actividad biologica, farmacologica y/o veterinaria; en particular, compuestos que cuando son administrados oralmente a un sujeto puedan ejercer dicha actividad biologica. Estos compuestos adicionales pueden ser uno o mas compuestos que se sabe per se que presentan, al ser administrados (por via oral) a un sujeto o individuo macho de una especie -en particular, una especie mamifera-, una influencia beneficiosa sobre la fertilidad y/o sobre la calidad del esperma de un individuo macho y/o pueden ser uno o mas componentes que, tras su administracion a un sujeto, pueden, ulteriormente, aumentar, reforzar, y/o impulsar la actividad de la cepa de la invencion CECT 8361 y la cepa de la invencion CECT 7347. Como entiende el experto en la materia, los compuestos adicionales deben ser compatibles con las cepas de la invencion. Asi, en el contexto de la presente invencion, dentro del termino "composicion farmaceutica" tambien se engloban las composiciones veterinarias.
El o los compuestos adicionales pueden ser uno o varios compuestos que garanticen la espermatogenesis o cualquier parte y/o proceso de la espermatogenesis. Algunos ejemplos no limitativos de estos compuestos se han descrito para el aspecto inventivo anterior y son aplicables a la composicion II de la invencion.
En una realizacion particular, la composicion farmaceutica comprende un vehiculo y/o un excipiente farmaceuticamente aceptable. Los terminos "vehiculo" y "excipiente" "farmaceuticamente aceptables" han sido definidos previamente en la presente descripcion y son aplicables al presente aspecto inventivo.
En cada caso, la forma de presentation de la composicion farmaceutica se adaptara al tipo de administracion utilizada. La composicion farmaceutica se puede formular en formas solidas, semisolidas o liquidas, tales como comprimidos, capsulas, polvos, granulos, soluciones, geles o microesferas. En una realizacion particular, la
composition farmaceutica se presenta en una forma adaptada a la administration oral. Ejemplos de administracion oral han sido explicados previamente.
Adicionalmente, en la presente invention tambien se contempla la posibilidad de que la composicion de la invencion se pueda administrar a un sujeto de forma conjunta con otros compuestos. Ejemplos de dichos compuestos tambien han sido citados previamente. Asi, la administracion al sujeto de dichos compuestos puede realizarse de forma simultanea o de forma secuencial a la composicion de la invencion.
En el caso de que la composicion que comprende la cepa de la invencion CECT 8361 y la cepa de la invencion CECT 7347 este formulada como una composicion nutricional funcional, dicha composicion nutricional puede ser un alimento o ir incorporada en un alimento/producto alimenticio destinado tanto a la alimentation humana como a la alimentacion animal. Asi, en una realization particular, la composicion nutricional funcional es seleccionada entre un alimento (que puede ser un alimento para fines nutricionales espedficos o un alimento medicinal) o un suplemento nutricional. Los terminos "composicion nutricional funcional", "suplemento" y ejemplos de alimentos que pueden comprender las cepas de la invencion o la composicion II de la invencion, han sido descritos en parrafos anteriores. No obstante, en una realizacion particular, el producto alimentario se selecciona del grupo que consiste en un producto lacteo, un producto carnico, un producto vegetal, un forraje y una bebida. En otra realizacion particular, la composicion de la invencion es administrada a un sujeto a traves de la dieta.
Como entiende el experto en la materia, las cepas de la invencion tienen que estar presentes en la composicion de la invencion en una cantidad terapeuticamente eficaz para que puedan ejercer su efecto de incrementar la fertilidad masculina cuando son administradas a un sujeto. El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" ha sido descrito previamente, asi como las vias, las dosis y los regimenes de administracion que pueden emplearse en el contexto de la presente invencion. En una realizacion particular, la concentration total de microorganismos de Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 y Bifidobacterium longum CECT 7347 en la composicion de la invencion es de entre 106 y 1012 ufc, preferiblemente, 109 ufc.
Metodo para incrementar la fertilidad masculina en un sujeto
En otro aspecto, la invention se relaciona con un metodo para incrementar la fertilidad masculina, de aqu en adelante "metodo de la invencion", que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composition que comprende Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium longum, en particular, las cepas Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 y Bifidobacterium longum CECT 7347.
El experto en la materia entendera que todas las realizaciones particulares descritas anteriormente para el uso de Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium longum son aplicables al metodo de la invencion: formas de administration, formas de presentation, tipos de composicion, dosis, sujetos que pueden ser tratados, etc.
A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es un grafico de barras que describe la vvariacion de espermatozoides motiles (%) a lo largo del diseno experimental: C (control; n=9) , T1 (tratamiento 1; n=8) , T2 (tratamiento 2; n=7) , L1 (lavado 1; n=8) , L2 (lavado 2; n=7). Los valores (media ± error) con asterisco son significativamente diferentes al control tras realizar un analisis estadistico t de Student para muestras relacionadas (p<0, 05).
La Figura 2 es un grafico de barras que describe la variation en el mdice de fragmentation del ADN (DFI) espermatico (%) a lo largo del diseno experimental: C (control; n=9) , T1 (tratamiento 1; n=9) , T2 (tratamiento 2; n=7) , L1 (lavado 1; n=8) , L2 (lavado 2; n=6). Los valores (media ± error) con asterisco son significativamente diferentes al control tras realizar un analisis estadistico t de Student para muestras relacionadas (p<0, 05).
La Figura 3 es un grafico de barras que muestra la capacidad antioxidante de Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 en Caenorhabditis elegans (en adelante, C. elegans). Escrutinio de veintitres aislados del genero Lactobacillus de la coleccion de
uno de los dos solicitantes de la presente invention, a saber, Biopolis, S.L., sobre la actividad antioxidante en C. elegans. Se representa el porcentaje de supervivencia de C. elegans alimentado con cada aislado frente a supervivencia de C. elegans en condiciones control (E. coli OP50). Los valores positivos indican actividad antioxidante y los valores negativos indican un posible efecto prooxidante.
EJEMPLOS
A continuation se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.
Ejemplo 1: Mejora de la calidad espermatica tras la administration conjunta a un sujeto de la cepa Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 y la cepa Bifidobacterium longum CECT 7347
Para abordar este estudio se seleccionaron las cepas Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 y Bifidobacterium longum CECT 7347. Esta selection se baso en la elevada actividad antioxidante que presenta la cepa Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 y en la actividad antiinflamatoria descrita previamente para la cepa Bifidobacterium longum CECT 7347.
El formato de administracion fue una capsula que contema una combination de ambos microorganismos al cincuenta por ciento (50%). La dosificacion fue de una capsula al dia, correspondiente a la administracion de 109 ufc/dia.
Bajo la aprobacion del Comite de Bioetica de la Universidad de Leon, tras haber firmado el correspondiente consentimiento informado siguiendo la normativa establecida por la declaration de Helsinki y cumpliendo la legislation vigente en el estado espanol, hombres astenozoospermicos que no se encontraban bajo medication y con habitos de alimentation homogeneos participaron en el experimento.
Los voluntarios donaron su muestra de eyaculado siguiendo las indicaciones del manual de la Organization Mundial de la Salud (WHO, 2010) tras tres dias de abstinencia sexual y utilizando contenedores esteriles. Las donaciones fueron recogidas con rapidez tras el muestreo para ser procesadas en el laboratorio a la mayor brevedad posible.
Las muestras biologicas solicitadas a los donantes fueron las siguientes: control, C (previo al comienzo de la ingesta de los probioticos) ; tratamiento 1, T1 (3 semanas de ingesta de probioticos) ; tratamiento 2, T2, (6 semanas de ingesta de probioticos) ; lavado 1, L1 (3 semanas despues de la finalizacion de la ingesta de probioticos) ; y lavado 2, L2 (6 semanas despues de la finalizacion de la ingesta de probioticos).
La ingesta de los probioticos fue diaria. El formato de administration fue una capsula al dia contenedora de las dos cepas Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 y Bifidobacterium longum CECT 7347 a una concentration de 109 ufc/capsula.
El esperma fue diluido en tampon PBS 1X hasta una concentracion final de 10 a 20 * 106 celulas/mL Esta dilution fue cargada en una camara de contaje Makler de 10-^m a 37 °C. Se evaluo la motilidad de los espermatozoides, del mismo modo en cada uno de los muestreos, con un sistema computerizado de analisis espermatico (CASA) consistente en un microscopio triocular de contraste de fases, utilizando un objetivo contrastador de fase negativo 10 X, equipado con una placa calefactora a 37°C y una camara digital Basler A312fc. Las imagenes fueron capturadas y analizas utilizando un analizador computerizado de motilidad con ajustes espedficos para los espermatozoides humanos. El sistema proporciono a nivel global los siguientes tres parametros: (1) porcentaje de espermatozoides moviles, (2) porcentaje de espermatozoides progresivos y (3) porcentaje de espermatozoides estaticos.
Se realizo la tecnica SCSA ("Sperm Chromatin Structure Assay") (Evenson) para evaluar la fragmentation del ADN. Se realizo una tincion metacromatica con naranja de acridina (AO) con una alicuota de la muestra. Esta molecula emite fluorescencia en la banda roja cuando se combina con ADN desnaturalizado y en la banda verde cuando se combina con una doble helice de ADN en buen estado. Los eyaculados se diluyeron con tampon TNE (NaCl 0, 15 M, M Tris-HCl 0, 01, EDTA 1 mM; pH 7, 4) a una concentracion celular final de aproximadamente 1-2 x 106 celulas/mL. Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrogeno liquido hasta su procesamiento. Posteriormente, las muestras se descongelaron en un bano a 37°C y se mezclaron con 200 ^l de una solution de detergente acido (HCl 0, 08 N, NaCl 0, 15 M, 0, 15 Triton X 100; pH 1, 4). Despues de 30 segundos de exposition al acido detergente, se realizo la tincion con naranja de acridina mediante la adicion de 1, 2 mL de la solucion de tincion que contema 6 g de AO por mL de tampon (0, 037 M de acido dtrico, 0, 126 M Na2HPO4, 0, 0011 M EDTA (di-sodico) , NaCl 0, 15 M, pH 6.0). Exactamente 3 minutos despues de la tincion, las muestras se analizaron en un citometro de flujo equipado con optica estandar y un laser de argon sintonizado a 488 ^m. El flujo celular se
mantuvo alrededor de 200 celulas/s y se contaron 5000 eventos para cada muestra. Los datos correspondientes al rojo (fotodetector FL3; filtro de paso 670 de largo) y la fluorescencia verde (FL1 fotodetector; filtro de paso de banda 530/30) de partmulas adquiridas fueron registrados y analizados con el software libre Weasel 3.1. Se analizo el principal parametro, el mdice de fragmentation del ADN (DFI) , que se corresponde a una relation entre la fluorescencia roja y la fluorescencia total (rojo y verde).
El analisis estadistico se llevo a cabo utilizando el programa SPSS version 20. Los datos se presentan como media ± SE en todos los casos. Los valores medios de cada variable se compararon mediante un test t de Student para muestras relacionadas (p<0, 05).
El estatus de motilidad de los donantes fue corroborado en el muestreo control donde se certifico que los voluntarios se clasificaban como astenozoospermicos siguiendo los estandares de la Organization Mundial de la Salud (WHO, 2010). El valor de celulas motiles registradas en este muestreo fue de 5, 56 ± 2, 51 % (valor medio ± error). Tras tres semanas de administration de probioticos (T1) , el porcentaje de espermatozoides moviles aumento alrededor de cinco veces comparado con el muestreo anterior, alcanzando un valor de 31, 88 ± 6, 01% (valor medio ± error). Este incremento se mantuvo a las seis semanas de ingesta de probioticos (T2) , asi como en los dos muestreos posteriores realizados a las 3 y 6 semanas tras el fin de la administracion de probioticos (L1 y L2). Los datos recogidos fueron respectivamente: 28, 14 ± 8, 79; 33, 25 ± 6, 38 y 39, 57 ± 8, 52 % (valor medio ± error) (Fig. 1). Despues de realizar el analisis estadistico, se encontraron diferencias significativas entre el control y los demas muestreos (t de Student para muestras relacionadas, p<0, 05). Ver Figura 1.
La Figura 2 muestra los valores medios porcentuales obtenidos en cada punto clave a lo largo del diseno experimental para el mdice de fragmentacion del ADN. En el muestreo control (C) se encontro el DFI (mdice de fragmentacion del ADN espermatico) mayor: 25, 74 ± 0, 59%. Tras las seis semanas de la administracion de probioticos se redujo el porcentaje de ADN danado hasta 21, 11 ± 1, 00 y 21, 58 ± 0, 94% (T1 y T2 respectivamente). Esta tendencia se mantuvo en el primer lavado (L1) cuya media fue 21, 64 ± DFI 1, 73%. Seis semanas despues de la finalization de la exposition a las cepas, la mejora registrada vista durante los muestreos anteriores comenzo a cambiar en el lavado 2 (L2) donde se registro un DFI mayor en comparacion con T1, T2 y L1 con un mdice de fragmentacion de 23, 09 ± 1, 28%, 5
cambiando por lo tanto la tendencia. Se encontraron diferencias significativas (t de Student para muestras relacionadas, p<0, 05) con el muestreo control en T1, T2 y L1.
Los resultados demuestran el papel estimulador sobre la motilidad espermatica de las cepas Lactobacillus rhamnosus CECT 8361 y Bifidobacterium longum CECT 7347 cuando son ingeridas como composition nutricional funcional. Tambien se ha confirmado una reduction significativa de la fragmentation del ADN espermatico tras el tratamiento.
Ejemplo 2. Actividad antioxidante de Lactobacillus rhamnosus CECT 8361
Se realizo un escrutinio de 23 aislados del genero Lactobacillus pertenecientes a la coleccion de uno de los dos solicitantes de la presente invention, a saber, Biopolis, S.L., en base a su actividad antioxidante en C. elegans. Las cepas incluidas en el estudio se aislaron a partir de heces de ninos con lactancia materna exclusiva de menos de 3 meses de edad.
La Figura 3 muestra los resultados obtenidos con la cepa de Lactobacillus del estudio. Los datos representan el porcentaje de incremento de supervivencia del modelo animal C. elegans alimentado con cada cepa bacteriana respecto a C. elegans cultivado en condiciones estandar (cepa Escherichia coli OP50). Como se puede observar, el aislado 1, identificado como Lactobacillus rhamnosus, fue el que proporciono mayor supervivencia a C. elegans, tras aplicar un estres oxidativo con agua oxigenada (un incremento de la supervivencia del 27% respecto a condiciones control).
La identification inequivoca del aislado 1 se llevo a cabo mediante la secuenciacion del ADN ribosomico (ADNr) 16S y posterior comparacion de la secuencia obtenida con el total de secuencias del gen depositadas en las bases de datos publicas utilizando la herramienta en lmea BLAST (
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
) del NCBI (National Center for Biotechnology Information). La cepa de la presente invencion CECT 8361 se identifico como Lactobacillus rhamnosus obteniendose la mayor homologia (100%) con las secuencias publicas pertenecientes a esta especie. La cepa se deposito en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) como CECT 8361.
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