APLICACIÓN TERAPÉUTICA DE ANÁLOGOS DE PERIMIDINONAS CONTRA LA LEISHMANIOSIS
SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a compuestos de estructura I y II para el tratamiento cutáneo y visceral de la Leishmaniosis. Específicamente se refiere al tratamiento frente a algunas especies del género Leishmania, en particular, L. amazonensis, L. infantum, L. braziliensis y L. guyanensis. La citotoxicidad de estos compuestos fue determinada frente a macrófagos de la línea celular 774.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Leishmania es una infección causada por un protozoo perteneciente a la familia Trypanosomatidae y género Leishmania. Se considera a esta enfermedad parasitaria una de las más relevantes e influyentes de las enfermedades tropicales y que afecta a millones de personas por todo el mundo, según registro de la Organización Mundial para la Salud.
Dicha enfermedad puede originar un amplio repertorio de síntomas clínicos, que pueden diferir según las diferentes enfermedades que pueden causar las especies que se incluyen dentro del género Leishmania. En este sentido, cabe destacar que el género Leishmania abarca especies diferenciadas geográficamente como L. major y L. infantum (especies del Viejo Mundo), o L. brasiliensis (especie del Nuevo Mundo), las cuales pueden ser identificadas empleando técnicas moleculares.
Entre las diferentes enfermedades causadas por este protozoo, la leishmaniosis cutánea es la forma más común y extendida de leishmaniosis humana. La Leishmaniosis visceral (VL, también conocido como Kala-azar) es la forma más severa y fatal sino es tratada adecuadamente. La leishmania genera una alta mortalidad en numerosos países, al ser causantes de un amplio espectro de enfermedades que se agrupan en tres formas principales: Leishmaniosis cutánea, muco-cutánea y visceral (Desjeux, P. Leishmaniasls: current situation and new perspectives. Comp. Immunol. Microbio!. Infect. Dis. 2004, 27, 305-318). Ante la no existencia de vacunas eficaces, el control de la enfermedad está basado principalmente en la quimioterapia, entre cuyos fármacos se incluyen los antimoniales pentavalentes como el estibogluconato de sodio y el antlmonlato de meglumina, desarrollados hace más de cinco décadas como los primeros fármacos de alta efectividad. En casos donde existe una recaída, los pacientes necesitan tratamientos con medicamentos de segunda generación como la Anfotericina B o pentamidlna (Mireille Basselln, Hubert Denlse, Graham H. Coombs and Michael P. Barrett. Antimicrob. Agents Chemother. 2002, 46, 3731-3738; Purkalt B, Kumar A, Nandi N, Sardar AH, Das S, KumarS, Pandey K, Ravidas V, Kumar M, De T, Slngh D, Das P. Antimicrob. Agents Chemother. 2012, 56, 1031-1041).
Aunque actualmente la administración de la Anfotericina B se basa actualmente en una formulación liposomal que hace que los efectos secundarios sean menores, los costos de producción de esta droga son altísimos para la disponibilidad y tratamiento real de la población afectada. Más aún, los actuales costos de las terapias contra la Leishmania, la citotoxicidad de los medicamentos usados comercialmente y el aumento de la resistencia de los parásitos hacen necesario la búsqueda de nuevas alternativas sintéticas o de fuentes naturales para el tratamiento de la enfermedad (Croft, S. L.; Coombs, G. H. Leishmaniasis-current chemotherapy and recent advances in the search for novel drugs. Trends Parásito!. 2003, 19, 502-508).
En este sentido, alcaloides de estructura química 7H-dibenzo[de,h]quinolin-7-ona denominados "oxoisoaporfinas" fueron altamente efectivos en ensayos in vitro e in vivo frente a L. amazonensis, L. infantum, L. braziliensis y L. guyanensis con una inhibición al crecimiento del parásito, en el hígado y el bazo, del 98 y 77 % respectivamente (Eduardo Sobarzo-Sánchez, Florencio Martínez Ubeira, Humberto González-Díaz, María Auxiliadora Dea-Ayuela, Francisco Bolás Fernández, Pablo Bilbao Ramos. "Uso de oxoisoaporfinas en el tratamiento contra la Leishmaniosis", International Patent (PCT) 2013, W02013045730 A1; Eduardo Sobarzo-Sánchez, Pablo Bllbao- Ramos, Maria Dea-Ayuela, Humberto González-Díaz, Matilde Yañez, Eugenio Urlarte, Lourdes Santana, Victoria Martínez-Sernández, Francisco Bolás Fernández, Florencio M. Ubeira. Synthetic Oxoisoaporphine Alkaloids: In Vitro, In Vivo and In Silico Assessment of Antileishmanial Activities. Píos One, 2013, 8(10), e77560).
Así, derivados de oxoisoaporfinas presentaron una baja citotoxicidad en ensayos in vitro e in vivo, lo que no enmascararía la posible actividad antiparasitaria, y una interesante efectividad y selectividad frente a determinadas especies de Leishmania, lo que los potenciaba como novedosas estructuras químicas que pudieran ser explotadas como posibles fármacos antiparasitarios.
Aún así, dada la relevancia de esta enfermedad parasitaria, sigue siendo necesario desarrollar nuevos compuestos de elevada especificidad y baja toxicidad para el tratamiento de la misma.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención diseñaron y desarrollaron nuevos alcaloides altamente efectivos contra diferentes especies de Leishmania. Estos compuestos difieren en la estructura química de las oxoisoaporfinas porque se ha introducido un átomo de nitrógeno adicional formando un anillo de pirimidina en estos alcaloides. De esta forma, se han obtenido compuestos con alta selectividad y eficiencia en contra de algunas de las cuatro especies de Leishmania (L. braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis y L. infantum) y una muy baja citotoxicidad, con la ventaja adicional de presentar una alta absorción de los mismos en el organismo sin ser excretados, debido a su alta lipofilicidad, y su fácil obtención por medios sintéticos.
En la presente invención se describen los compuestos de estructura I y II que presentan baja toxicidad y que son capaces de inhibir de forma efectiva y selectiva el crecimiento del parásito en experimentos in vitro frente a promastigotes de las especies Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis y
Leishmania infantum.
En un aspecto, la presente invención se dirige al uso de los compuestos de fórmula I y II, sus sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos, tautómeros, estereoisómeros y A/-óxidos, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leishmaniosis.
**(Ver fórmula)**
donde:
- R1, R1, R2, R2, R3, R3, R4, R4, R5, R5, y R6, R6 se seleccionan de forma independiente de entre el grupo consistente en hidrógeno, halógeno, formilo, alquilo sustituido y no sustituido, alquenilo, -ORb y-NRaRb;
Ra y Rb se seleccionan de forma independiente de entre el grupo consistente en hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, cicloheteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, o, Ra y Rb conjuntamente forman un anillo de heterociclo sustituido o no sustituido, de 4 a 7 miembros conteniendo 0-2 heteroátomos adicionales independientemente seleccionados entre oxígeno, azufre y N-Rc, donde Rc se selecciona entre hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o -C(0)Rb.
En otro aspecto la invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende los compuestos de fórmula I o II según se han descrito anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto de la invención se dirige al uso de una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I y II, como se describieron anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leishmaniosis.
En otro aspecto, la invención se dirige a los compuestos de fórmula II, como se han descrito anteriormente.
Descripción detallada de la invención
"Alquilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que no contiene ninguna insaturación, de 1 a 10 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con uno a tres sustituyentes seleccionados entre halógeno, ciano, -ORb, -NRaS(0)mRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -SRb, -S(O) mRb, -S(0)mNRaRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -NRaR£>, -C(0)Rb, -C02Rb, -C(0)NRaRb, -NRaC(0)Rb, -NRaC(0)0Rb, -NRaC(0)NRaRb, -CF3, -OCF3, cicloalquilo, cicloheteroalquilo, arilo y heteroarilo; donde Ra y Rb son como se definieron previamente.
"Cicloalquilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada cíclica que no contiene ninguna insaturación, de 3 a 10 átomos de carbono, preferiblemente de 5 a 6 átomos de carbono. El cicloalquilo puede ser monocíclico, bicíclico o tricíclico y puede incluir anillos fusionados. Opcionalmente el cicloalquilo puede estar sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados entre halógeno, ciano, -ORb, -NRaS(0)mRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -SRb, -S(O) mRb, -S(0)mNRaRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -NRaR, -C(0)Rb, -C02Rb, -C(0)NRaRb, -NRaC(0)Rb, -NRaC(0)0Rb, -NRaC(0)NRaRb, -CF3, -OCF3, alquilo, arilo y heteroarilo; donde Ra y Rb son como se definieron previamente.
"Alquenilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, cíclica o acíclica, que contiene al menos una insaturación, de 2 a 10 átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con uno a tres sustituyentes seleccionados entre halógeno, ciano, -ORb, -NRaS(0)mRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -SRb, -S(O) mRb, -S(0)mNRaRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -NRaRb, -C(0)Rb, - C02Rb, -C(0)NRaRb, -NRaC(0)Rb, -NRaC(0)0Rb, -NRaC(0)NRaRb, -CF3, -OCF3, alquilo, cicloalquilo, cicloheteroalquilo, arilo y heteroarilo; donde Ra y Rb son como se definieron previamente.
"Cicloheteroalquilo" se refiere a un cicloalquilo que contiene al menos un heteroátomo seleccionado entre oxígeno, nitrógeno o azufre, por ejemplo: pirrolidinilo, morfolinilo, piperazinilo y piperidinilo. Opcionalmente el cicloheteroalquilo puede estar sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -NRaS(0)mRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -SRb, -S(O) mRb, -S(0)mNRaRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -NRaRb, - C(0)Rb, -C02Rb, -C(0)NRaRb, -NRaC(0)Rb, -NRaC(0)0Rb, -NRaC(0)NRaRb, -CF3, -OCF3, alquilo, arilo y heteroarilo; donde Ra y Rb son como se definieron previamente.
"Arilo" se refiere a un hidrocarburo aromático de 6 a 10 átomos de carbono, por ejemplo: fenilo o naftilo; opcionalmente el arilo puede estar sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, - NRaS(0)mRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -SRb, -S(O) mRb, -S(0)mNRaRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -NRaRb, -C(0)Rb, -C02Rb, -C(0)NRaRb, -NRaC(0)Rb, -NRaC(0)0Rb, -NRaC(0)NRaRb, -CF3, -OCF3, alquilo, alquenilo, arilo y heteroarilo; donde Ra y Rb son como se definieron previamente.
"Heteroarilo" se refiere a un arilo que contiene al menos un heteroátomo seleccionado entre oxígeno, nitrógeno o azufre, por ejemplo: piridilo, pirazolilo, triazolilo, pirimidilo, isoxazolilo, indolilo y tiazolilo; opcionalmente el heteroarilo puede estar sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -NRaS(0)mRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -SRb, -S(0)mRb, -S(0)mNRaRb donde m se selecciona entre 1 y 2, -NRaRb, -C(0)Rb, - C02Rb, -C(0)NRaRb, -NRaC(0)Rb, -NRaC(0)0Rb, -NRaC(0)NRaRb, -CF3, -OCF3, alquilo, alquenilo, arilo y heteroarilo; donde Ra y Rb son como se definieron previamente.
"Halógeno" es flúor, cloro, bromo o yodo.
De acuerdo a una realización particular, los valores R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, y R8 en los compuestos de fórmula (I), según se definieron anteriormente, se seleccionan de forma independiente de entre el grupo consistente en hidrógeno, alquilo sustituido y no sustituido, alquenilo, formilo, halógeno, -ORb y -NRaRb; donde Ra y Rb son como se definieron anteriormente.
De acuerdo a otra realización particular, en el compuesto de fórmula (I) R1 se selecciona entre hidrógeno, metilo, formilo e hidroximetil y R2, R , R4, R5, R6, R7, y R8 se seleccionan de forma independiente de entre el grupo consistente en hidrógeno, metilo, halógeno, y -ORb; donde Rb se selecciona entre hidrógeno y alquilo sustituido o no sustituido
De acuerdo a una realización particular, los valores R1, R1, R2, R2, R3, R3, R4, R4, R5, R5, y R6, R6 en los compuestos de fórmula (II), según se definieron anteriormente, se seleccionan de forma independiente de entre el grupo consistente en hidrógeno, halógeno, formilo, alquilo sustituido y no sustituido, alquenilo, -ORb y -NRaRb; donde Ra y Rb son como se definieron anteriormente.
De acuerdo a otra realización particular, en el compuesto de fórmula (II) R2 y R2, se seleccionan independientemente entre hidrógeno halógeno, metilo y -ORb; donde Rb se selecciona entre hidrógeno y alquilo sustituido o no sustituido, y R1, R1, R , R3, R4, R4, R5, R5, R6, y R6 son hidrógeno.
De acuerdo a otra realización particular, los compuestos de fórmula I y II, son seleccionados entre:
1. 7/-/-benzo[e]perim¡d¡n-7-ona
2. 8-cloro-7H-benzo[e]perlmld¡n-7-ona
3. 6-h¡drox¡-7/-/-benzo[e]perlm¡d¡n-7-ona
4. 6-metox¡-7/-/-benzo[ejper¡m¡d¡n-7-ona
5. 4-met¡l-7/-/-benzo[e]perim¡d¡n-7-ona
6. 2-met¡l-7/-/-benzo[e]per¡m¡dln-7-ona
7. 7-oxo-7/-/-benzo[e]perlm¡d¡n-2-carbaldeh¡do
8. 6-h¡drox¡-2-met¡l-7H-benzo[e]per¡m¡d¡n-7-ona
9. 8-cloro-6-hidrox¡-7/-/-benzo[e]per¡m¡d¡n-7-ona
10. 8-cloro-6-h¡droxi-2-met¡l-7/-/-benzo[e]per¡m¡d¡n-7-ona
11. 2-(h¡drox¡metil)-7/-/-benzo[e]per¡m¡d¡n-7-ona
12. 8-cloro-2-metil-7/-/-benzo[e]per¡m¡d¡n-7-ona
13. 8-cloro-7-oxo-7/-/-benzo[e]perlm¡d¡n-2-carbaldeh¡do
14. 7/-/,7'/-/-[6,6'-bibenzo[e]perimid¡n]-7,7'-diona
15. 4,4'-d¡met¡l-7/-/,7'/-/-[6,6l-b¡benzo[e]perim¡din]-7,7'-d¡ona
16. 4,4'-d¡bromo-7/-/,77-/-[6,6l-b¡benzo[e]perlm¡d¡n]-7,7l-d¡ona
La actividad de los compuestos de la Invención fue probada frente diferentes especies de Leishmania, y se comprobó que los compuestos de la Invención son útiles para el tratamiento frente a las especies Leishmania amazonensis, L. infantum, L. braziliensis y L. guyanensis. Así, en una realización particular, la invención se refiere al uso de cualquiera de los compuestos anteriormente descritos para la preparación de un medicamento para el tratamiento de Leishmania amazonensis, L. infantum, L. braziliensis y L. guyanensis.
Los compuestos de la invención son adecuados para preparar composiciones farmacéuticas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leishmaniosis.
El uso de las composiciones farmacéuticas de la Invención se dirige a la administración por vía oral, inyectable o tópica. De entre las composiciones farmacéuticas que se pueden preparar son de especial interés para la Invención las composiciones útiles para la administración por vía tópica. Así, en una realización particular, el uso de cualquiera de las composiciones farmacéuticas anteriormente descritas se dirige a la vía tópica.
Las composiciones empleadas en la vía tópica pueden tener la forma de gel o pomada. En una realización particular, las composiciones administradas por vía tópica comprenden además carbopol®.
Los compuestos de la Invención (A1-A13) pueden prepararse mediante técnicas habitualmente empleadas en la química y conocidas por un experto en la materia. Algunos de los compuestos de fórmulas (I) se describieron en: [Synthesis, structure, geometrical, and spectral characteristics of the (HLn)2[CuCI4] complexes. Crystal and molecular structure of bls(2-methyl¡midazolium) tetrachlorocuprate(ll). Kovalchukova, O. V.; Palkina, K. K.; Strashnova, S. B.; Zaltsev, B. E. Russ. J. Coord. Chem. 2008, 34, 830-835.; Method of obtaining highly puré 7H- benzo[e]perlmld¡n-7-one. Golubskl, Zbigniew; Kowal, Ryszard. Polish Patent 2006, PL 192093 B1 2006083; Tetracycle formatlon from the reaction of acetophenones with 1-aminoanthraquinone, and further annulation of pyrldlne and dlazeplne rings. Deady, L. W.; Smith, C. L. Aust. J. Chem. 2003, 56(12), 1219-1224; Benzoperlmldlne-carboxyllc acids and derivatives as antagonists of corticotropin releasing factor receptors. Rabinovich, A. K.; Dhanoa, D. S.; Luthin, D. R.; Bychowski, R. A.; Bhumralkar, Dilip R. PCT Int. Appl. 1998, WO 9808821 A1 19980305; Synthesis of anthrapyrimidine derivatives. Nishio, Kazuo; Kasai, Toshiyasu; Tsuruoka, Shinzo. Kogyo Kagaku Zasshi 1968, 71(12), 2026-2033; Preparation of 6-hydroxy-7H-benzo[e]per¡m¡d¡n-7-one (4- hydroxyanthrapyrimidine). Kowal, Ryszard; Golubski, Zbigniew E. Polish Patent 2001, PL 180370 B1 20010131; Anthrapyrimidines. Weidinger, H.; Eilingsfeld, H.; Haese, G. Deutsche Patent 1963, 1159456 (B); Transformations of 4-methylpyrimidinoanthrone under the action of alkaline agents and amines. Kazankov, M. V.; Zotova, O. A. Russ. J. Org. Chem. 1999, 35(11), 1706-1710; Dimerization mechanism of 4-methylpyrimidanthrone. Kazankov, M. V.; Zotova, O. A.; Ulanova, L. A.; Pykhtina, E. V. Russ. J. Org. Chem. 2000, 36(2), 272-277; Synthesis and Cytotoxic Activity of 7-Oxo-7H-d¡benz[f,ij]isoquinoline and 7-Oxo-7H-benzo[e]per¡m¡dine Derivatives. Bu, X.; Deady, L. W.; Finlay, G. J.; Baguley, B. C.; Denny, W. A. J. Med. Chem. 2001, 44(12), 2004-2014; Synthesis and cytotoxic activity of N-[(alkylam¡no)alkyl]carboxamide derivatives of 7-oxo-7H-benz[de]anthracene, 7-oxo-7H- naphtho[1,2,3-de]qu¡nol¡ne, and 7-oxo-7H-benzo[e]perimidine. Bu, X.; Chen, J.; Deady, L. W.; Smith, C. L.; Baguley, B. C.; Greenhalgh, D.; Yang, S.; Denny, W. A. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13(11), 3657-3665; A facile and efficient method for hydroxylation of azabenzanthrone compounds. Ning, F. X.; Weng, X.; Huang, S. L.; Gu, L. J.; Huang, Z. S.; Gu, L. Q. Chin. Chem. Lett. 2011, 22(1), 41^4],
Los compuestos de fórmula (II) (DIME14-DIME16) pueden obtenerse a partir de los derivados sustituidos de 1- amino-4-bromo-antraquinona mediante la utilización de A/,A/-dimetilformamida dimetil acetal en MeCN a reflujo, generando in situ la pérdida del átomo de bromo en la posición 4 de la antraquinona. La dimerización de los derivados bromados iniciales de 1-amino-antraquinona se genera en alto rendimiento y sin mayor purificación ulterior.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención de compuestos con actividad antl-lelshmanlcida, y deben ser considerados para una mejor comprensión de la misma sin que supongan una limitación
1. SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE NUEVOS ANÁLOGOS DE BIS-PERIMIDINONAS (DIME14- DIME161
Ejemplo 1
7H,77-/-[6,6'-b¡benzo[e]per¡m¡d¡n]-7,7'-d¡ona (DIME14)
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**
A una solución de CH3CN (50 mL) fue agregado de una vez la 1-amino-4-bromo-antraquinona (A) (16,55 mmol, 5g) y A/,A/-dimetilformamida dimetilacetal (N.N-DFDA) (83,3 mmol, 12 mL) fue agregada gota a gota y reflujada por 3 horas. Posteriormente la solución resultante fue concentrada al vacío y el residuo generado fue hecho reaccionar con NH4OAc (99 mmol, 8 g) en EtOH (100 mL). Al cabo del tiempo transcurrido, el sólido obtenido de color anaranjado fue filtrado al vacío y lavado repetidamente con EtOH frío. El compuesto fue cristalizado en una mezcla CH2CI2/EtOH para dar DIME14 como cristales de color anaranjado [4.1 g, 53% de rendimiento],
RMN-1H (DIME14) (300 MHz, DMSO-de ppm) 5 7.82 (m, 5H), 8.11 (m, 2H), 8.29 (m, 1H), 8.47 (m, 2H), 8.93 (m, 2H). 9.35 (s, 1H), 9.54 (s, 1H). RMN-1iC (DIME14) (300 MHz, DMSO-de, ppm) 5 121.9, 122.1, 122.4, 122.7, 123.8, 124.0, 128.4, 129.8, 131.9, 132.4, 132.6, 133.1, 134.1, 134.7, 135.1, 135.3, 135.8, 136.0, 136.5, 140.1, 140.5, 146.7, 146.8, 147.1, 147.8, 148.0, 154.4, 155.2, 180.1, 180.7. AE: calculado para C30H14N4O2: C 77.91; H, 3.05; N, 12.12. encontrado, C, 77.83; H, 3.11; N, 12.09. IQ-EM (miz): 462.8 (M+, 100). IR (KBr, u, cnrf ): 1665 (0=0).
Ejemplo 2
4,4,-dimetil-7H,7'H-[6,6'-bibenzo[e]perimidin]-7,7'-diona (DIME15)
**(Ver fórmula)**
POCI3 (12,6 mmol, 1,2 mL) fue agregado gota a gota sobre una solución de A/,A/-dimetilformamida dimetilacetal (N.N-DFDA) (15,80 mmol, 2,1 mL) en CH3CN (40 mL) sobre un baño de hielo-agua a 0°C. Posteriormente se 5 dejó reaccionar la mezcla con agitación constante hasta alcanzar la temperatura ambiente, siendo agregado 1- amino-2-meil-4-bromo-antraquinona (B) (6,3 mmol, 2g) en una porción. La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente por 30 min. y a 80°C por un día. Al día siguiente se observó la formación de un sólido amarillo el cual fue filtrado al vacío y tratado con NH4OAC (2g) en EtOH (100 mL) a reflujo por 2 hr. Finalmente se generó DIME15 como un sólido cristalino color anaranjado oscuro [2,89g, 94% de rendimiento],
RMN-1H (DIME15) (300 MHz, DMSO-cfe, ppm) 5 2.85 (s, 6H), 7.79 (m, 4H), 8.10 (s, 2H), 8.42 (m, 2H), 8.85 {m, 2H), 9.50 (s, 2H). RMN-13C (DIME15) (300 MHz, DMSO-cfe, ppm) 5 17.6, 17.8, 121.4, 121.7, 123.6, 123.8, 125.1, 125.2, 125.3, 126.5, 126.6, 126.8, 127.9, 128.0, 128.4, 132.7, 133.0, 133.6, 133.8, 134.0, 134.5, 141.1, 141.3,
141.4, 145.3, 148.1, 148.3, 154.6, 155.2, 155.3, 180.3, 180.4. AE: calculado para C32H18N4O2: C, 78.36; H, 3.70; N, 11.42. encontrado, C, 78.31; H, 3.75; N, 11.31. IQ-EM (m/z): 490.8 (M+, 100). IR (KBr, u, cm'1): 1658 (OO).
Ejemplo 3
4,4'-dibromo-7/-/,7,/-/-[6,6'-bibenzo[e]perimidin]-7,7l-diona (DIME16)
**(Ver fórmula)**
POCfe (16,4 mmol, 1,6 mL) fue agregado gota a gota sobre una solución de A/,A/-dimetilformamida dimetilacetal (N.N-DFDA) (14,09 mmol, 2 mL) en CH3CN (70 mL) sobre un baño de hielo-agua a 0°C. Posteriormente se dejó reaccionar la mezcla con agitación constante hasta alcanzar la temperatura ambiente, siendo agregado 1-amino- 25 2,4-dibromo-antraquinona (C) (4,7 mmol, 1,79g) en una porción. La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente por 30 min. y a 50°C por un día. Al día siguiente se observó la formación de un sólido amarillo el cual fue filtrado al vacío y tratado con NH4OAc (2g) en EtOH (100 mL) a reflujo por 2 hr. Finalmente se generó DIME16 como un sólido cristalino color anaranjado oscuro [1,81 g, 62% de rendimiento].
RMN-1H (DIME16) (300 MHz, DMSO-cfe, ppm) 5 7.86 (m, 4H), 8.47 (m, 2H), 8.65 (m, 2H), 8.92 (m, 2H), 9.61 (s, 2H). RMN-13C (DIME16) (300 MHz, DMSO-cfe, ppm) 6 121.9, 122.5, 123.4, 123.8, 124.0, 124.5, 125.1, 125.3, 126.0, 126.8, 128.2, 128.8, 133.1, 133.3, 133.8, 134.0, 134.4, 135.7, 142.0, 142.4, 142.8, 144.4, 146.3, 147.4,
154.4, 155.3, 159.8, 160.2, 181.3, 181.6. AE: calculado para CsoH^BrzN^: C, 58.09; H, 1.95; N, 9.03. encontrado, C, 58.03; H, 1.97; N, 9.02. IQ-EM (miz): 620.8 (M+, 100). IR (KBr, u, cm'1): 1665 (C=0).
2. PRUEBAS DE EFICACIA IN VITRO FRENTE A LEISHMANIA SPP
Se dispusieron promastlgotes en fase de crecimiento logarítmico de las distintas especies de Leishmania (L. infantum, L. braziliensis, L. amazonensis y L. guyanensis) a una concentración de 1,25 x 10® promastigotes/mL, en un volumen final de 200 pL de medio Schneider en placas de cultivo de 96 pocilios. Para la determinación de la susceptibilidad a fármacos se prepararon diluciones seriadas de los compuestos en medio de cultivo Schneider (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56, 0.78 pg/mL), que se añadieron por triplicado a las placas de cultivo. Se dejaron en incubación a 26°C en contacto con los compuestos y después de 48 horas, se añadieron 20 pl de una solución de resazurina 2,5 mM en PBS, dejándose en incubación 3 h a 26° C. A continuación, se determinó la intensidad de fluorescencia en un espectrofluorímetro (Infinite Tecan l-control) a 535 nm (excitación) /590 nm (emisión) de longitud de onda. Finalmente, por comparación con los pocilios control se determinó el porcentaje de parásitos viables. La concentración inhibitoria media (IC5o) se calculó empleando el método de Regresión Probit utilizando el paquete estadístico SPSS v.15.0.
3. CITOTOXICIDAD CELULAR
Se dispusieron macrófagos J774 en fase de crecimiento logarítmico a una concentración de 2,5x105 células/ml, en un volumen final de 200 pl en placas de cultivo de 96 pocilios. Se prepararon diluciones seriadas de los compuestos de igual forma que en la determinación de la eficacia in vitro medio de cultivo RPMI-1640, que se añadieron por triplicado a las placas de mlcrotltulaclón. Se dejaron en incubación a 37° C en contacto con los compuestos y después de 24 horas, se añadieron 20 pl de una solución de resazurina 2,5 mM en PBS, dejándose en incubación 3 h a 37° C. A continuación, se determinó la intensidad de fluorescencia en espectrofluorímetro (Infinite Tecan l-control) a 535 nm (excitación) -590 nm (emisión) de longitud de onda. La concentración citotóxica media (CC50) se determinó por el método de Regresión Probit utilizando el paquete estadístico SPSS v.15.0.
EVALUACIÓN DE COMPUESTOS
Los compuestos evaluados en la presente Invención están basados en las siguientes fórmulas generales, correspondiente a la fórmula general (I) y (II):
A. 7H-BENZO[e]PERIMIDIN-7-ONA (3-AZAOXOISOAPORFINA), Fórmula general (I):
r2
**(Ver fórmula)**
R
**(Ver fórmula)**
r7
Re
En que:
a) en que si: - R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7y R8 es hidrógeno; se trata de 7H-benzo[e]perimidin-7- ona, llamado de aquí en adelante A1;
b) en que si: - R1, R2, R3, R4, R6, R7y R8 es hidrógeno y R5 representa un cloro; se trata de 8- cloro-7H-benzo[e]perlmidin-7-ona, llamado de aquí en adelante A2;
C) en que si: - R1, R2, R3, R5, R6, R7y R8 es hidrógeno, R4 representa un hidroxilo; se trata de 6- hidroxi-7H-benzo[e]perimidin-7-ona, llamado de aquí en adelante A3;
d) en que si: - R1, R2, R3, R5, R6, R7 y R8 es hidrógeno y R4 representa un metoxilo; se trata de 6- metoxi-7H-benzo[e]perimidin-7-ona, llamado de aquí en adelante A4;
e) en que si: - R1, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 es hidrógeno y R2 representa un metilo; se trata de 4- metil-7H-benzo[e]perimidin-7-ona, llamado de aquí en adelante A5;
f) en que si: - R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 es hidrógeno y R1 representa un metilo; se trata de 2- metil-7H-benzo[e]perimidln-7-ona, llamado de aquí en adelante A6;
g) en que si: - R2, R3, R4, R5, R6, R7y R8 es hidrógeno y R1 representa un aldehido; se trata de 7- oxo-7H-benzo[e]perlm¡d¡n-2-carbaldeh¡do, llamado de aquí en adelante A7;
h) en que si: - R2, R3, R5, R6, R7 y R8 es hidrógeno; R1 representa un metilo y R4 representa un hidroxilo; se trata de 6-hidroxi-2-metil-7H-benzo[e]perimidin-7-ona, llamado de aquí en adelante A8;
¡) en que si: - R1, R2, R3, R6, R7 y R8 es hidrógeno; R4 representa un hidroxilo y R5 representa un cloro; se trata de 6-hidroxi-8-cloro-7H-benzo[e]perimidin-7-ona, llamado de aquí en adelante A9;
j) en que si: - R2, R3, R6, R7 y R8 es hidrógeno; R1 representa un metilo, R4 representa un hidroxilo y R5 representa un cloro; se trata de 2-metilo-6-hidroxi-8-cloro-7H-benzo[e]perimidin- 7-ona, llamado de aquí en adelante A10;
k) en que si: - R2, R3, R4, R5, R6, R7y R8 es hidrógeno y R1 representa un hidroximetil; se trata de 2-(hidromet¡l)-7/-/-benzo[e]per¡m¡d¡n-7-ona, llamado de aquí en adelante A11;
|) en que si: - R2, R3, R4, R6, R7 y R8 es hidrógeno; R1 representa un metilo y R5 representa un cloro; se trata de 8-cloro-2-metll-7/-/-benzo[e]per¡m¡dln-7-ona, llamado de aquí en adelante A12; y
m) en que si: - R2, R3, R4, R6, R7y R8 es hidrógeno; R1 representa un aldehido y R5 representa un cloro; se trata de 8-cloro-7/-/-benzo[e]perim¡d¡n-2-carbaldeh¡do, llamado de aquí en adelante A13;
B. 7W,7,W-[6,6'-BIBENZO[e]PERIMIDIN]-7,7,-DIONA (BIS-3-AZAOXOISOAPORFINA), Fórmula general (II):
R4'
R
**(Ver fórmula)**
R3
R2
**(Ver fórmula)**
(II)
,Fv
R5
R4
En que:
a)
b)
c)
en que si: - R1, R1, R2, R2, R3, R3, R4, R4, R5, R5, y R6, R6 es hidrógeno; se trata de 7H,7'H- [e^'-bibenzoIeJperimidinHy-diona, llamado de aquí en adelante DIME1; en que si: - R1, R1, R3, R , R4, R4, R5, R5, y R6, R" es hidrógeno y R2, R2 representa un metilo; se trata de 4,4'-d¡metil-7H,7,H-[6,6'-bibenzo[e]perimidin]-7,7'-diona, llamado de aquí en adelante DIME2; y
en que si: - R1, R1, R3, R3, R4, R4, R5, R5, y R6, R6 es hidrógeno y R2, R2 representa un bromo; se trata de 4,4'-dibromo-7H,7,H-[6,6'-bibenzo[e]perimidin]-7,7,-diona, llamado de aquí en adelante DIME3;
RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD LEISHMANICIDA DE LAS PERIMIDINONAS
Considerando los análogos de perimidinonas y los dímeros obtenidos por los procedimientos experimentales mencionados anteriormente en la presente invención, y para determinar la actividad leishmanicida de estos derivados, se determinó la eficacia in vitro frente a promastigotes en fase de crecimiento logarítmico de cuatro especies de Leishmania-, L. amazonensis, L. braziliensis, L. infantum y L. guyanensis y se verificó la citotoxicidad de cada uno de ellos frente a macrófagos de la línea J774. De este modo, se pueden apreciar los valores de IC50 20 expresados en pg/mL en la siguiente tabla:
Tabla 1. Evaluación in vitro de la forma promastigote de varias especies de Leishmania y la citotoxicidad in vitro sobre macrófagos de la línea J774, expresados en IC50 (pg/mL).
| Compuestos | Actividades anti-Leishmania | Citotoxicidad J774 [CC50] |
| L. braziliensis | L. amazonensis | L. guyanensis | L. infantum | |
| IC50 | ic50 | IC50 | IC50 | |
| A1 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 91,033 |
| A2 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 |
| A3 | 0,41 | 3,12 | 1,415 | 0,78 | 3,586 |
| A4 | 9,581 | 7,47 | 2,97 | 14,39 | > 100 |
| A5 | 66,843 | 59,70 | 28,50 | > 100 | > 100 |
| A6 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 |
| A7 | 56,796 | 53,50 | 23,94 | 23,89 | > 100 |
| A8 | 3,27 | 8,14 | 1,50 | 3,01 | > 100 |
| A9 | 28,443 | 77,18 | 13,77 | 53,48 | > 100 |
| A10 | 52,655 | 61,22 | 49,40 | 78,28 | > 100 |
| A11 | 36,915 | 34,87 | 21,24 | 36,42 | > 100 |
| A12 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 |
| A13 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 |
| DIME1 | 0,501 | 2,74 | 2,44 | 3,70 | 19,244 |
| DIME2 | 14,712 | 35,78 | 16,67 | 69,08 | > 100 |
| DIME3 | 40,857 | > 100 | > 100 | 27,39 | > 100 |
De acuerdo con los datos experimentales, se puede concluir que tanto A4, A8 y A11 representan análogos muy interesantes en la actividad leishmanicida frente a las cuatro especies ensayadas. Más aún, se puede comparar las actividades de algunos derivados respecto al grado de sustitución, siendo A8 el compuesto que mejor actúa frente a las diferentes cepas, principalmente contra la L. guyanensis, responsable de generar lesiones cutáneas y mucocutáneas en animales y en el hombre, y la L. infantum, responsable en el hombre de generar lesiones viscerales. Las citotoxicldades de la mayoría de estos compuestos ensayados frente a la línea celular J774 son muy bajas (>100), lo que nos permite inferir que las actividades leishmanicidas no están siendo enmascaradas por la toxicidad del compuesto.
Finalmente podemos destacar la actividad antiparasitaria de los dímeros de perimidinonas obtenidos y evaluados en esta invención, donde el derivado DIME2 tiene una destacada y selectiva actividad anti-leishmania frente a L. brasiliensis y L. guyanensis. Estos antecedentes nos permiten asegurar el uso de estos derivados como una buena alternativa sin los efectos secundarios indeseables como la citotoxicidad que regularmente acompaña a los compuestos usados comercialmente para el tratamiento de la enfermedad, y una mejor tolerancia al momento de administrarlos a través de las diferentes formulaciones mencionadas en esta invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona posibles formulaciones farmacéuticas para la preparación de un medicamento, basadas sobre los compuestos presentados aquí, para el tratamiento terapéutico y selectivo contra la leishmaniosis.
Las dosis en las cuales el compuesto podría ser administrado varían dentro de un amplio rango, ajustándose a los requerimientos de cada caso en particular. Las diferentes composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por vía oral, tópica e inyectable de acuerdo a las diferentes formulaciones farmacéuticas descritas en las Tablas 2-6.
EJEMPLO A (Tableta)
Tabla 2. Formulación farmacéutica y peso del ingrediente activo más los excipientes de una tableta.
Componente
mg/Tableta
| Ingrediente activo | |
| Celulosa microcristalina | |
| Almidón | |
| Croscarmellosa de sodio | |
| Estearato de magnesio | |
| Peso de la Tableta | 500 |
EJEMPLO B (Cápsula)
Tabla 3. Formulación farmacéutica y peso del ingrediente activo más los excipientes de una cápsula.
| Componente | mg/Cápsula |
| Ingrediente activo | |
| Almidón de maíz pre-gelatinizada | |
| Microcristales de celulosa | |
| Opadry OYS 96-14 | |
| Peso de la Cápsula | 250 |
EJEMPLO C (Gel)
Tabla 4. Formulación farmacéutica y peso del ingrediente activo más los excipientes de un gel.
| Componente | Cantidad |
| Ingrediente activo | mg |
| Carbopol-940 | mg |
| Propilenglicol | 1 ml |
| 1M HCl | pl |
| Trietanolamina | pl |
| H2O | c.s.p. 10 ml |
EJEMPLO D (Pomada)
Tabla 5. Formulación farmacéutica y peso del ingrediente activo más los excipientes de una pomada. 5
| Componente | Cantidad |
| Ingrediente activo | 3 mg/g pomada |
| Óxido de zinc | 2 g |
| Vaselina | g |
EJEMPLO E (Solución inyectable)
Tabla 6. Formulación farmacéutica y peso del ingrediente activo de una solución inyectable.
| Componente | Cantidad |
| Ingrediente activo | mg |
| 1M HCl | pl |
| NaCl | 9 mg |
| H2O | c.s.p. 1 ml |
