La presente invención se relaciona con un patrón de péptidos característico de sujetos que padecen artrosis y el uso de dicho patrón en el diagnóstico de dicha enfermedad. Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con un método in vitro de diagnóstico y un kit para la puesta en práctica de dicho método de diagnóstico. Por tanto, la invención pertenece al campo técnico del diagnóstico de enfermedades, en particular, el diagnóstico de enfermedades reumáticas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La artrosis es una patología reumática que lesiona el cartílago articular. Las articulaciones son los componentes del esqueleto que nos permiten el movimiento y, por tanto, nuestra autonomía funcional, y están formadas por la unión de dos huesos a través de la cápsula articular. En el interior de las mismas existe, generalmente, un fluido llamado líquido sinovial que es producido por la membrana sinovial. Los extremos óseos que se unen para formar la articulación están recubiertos por el cartílago articular.
Cuando este cartílago articular se lesiona, se produce dolor, rigidez e incapacidad funcional. Normalmente la artrosis se localiza en la columna cervical y lumbar, y en algunas articulaciones del hombro y de los dedos de las manos, la cadera, la rodilla y la articulación del comienzo del dedo gordo del pie.
Esta enfermedad reumática no es hereditaria en el sentido de que no hay un patrón de herencia fijo como puede ser el caso de la hemofilia, pero sí tiene un componente de riesgo genético que, junto con otros factores, puede hacer que aparezca con más facilidad en los sujetos que tienen una historia familiar. En España, la artrosis afecta al 10% de la población general, representando casi la cuarta parte del total de pacientes atendidos en las consultas de los reumatólogos.
Actualmente, el diagnóstico de la artrosis se basa en la evaluación de los síntomas y en la exploración física que realiza el médico al paciente. El médico valora qué síntomas tiene el enfermo, dónde se localizan, cómo es el dolor, en qué circunstancias mejora (con el reposo) o empeora (al subir o bajar escaleras, al abrir o cerrar grifos.. ). También interroga sobre qué otras enfermedades padece el enfermo, qué tratamientos está recibiendo, y si él o algún familiar padecen o han padecido algún tipo de enfermedad reumática, traumatismo o lesión articular previos.
Las radiografías permiten confirmar el diagnóstico de artrosis, al poderse constatar en las articulaciones los cambios radiológicos típicos de los procesos artrósicos. Mediante los estudios radiológicos se puede determinar de una forma mucho más precisa la severidad de la artrosis.
Los análisis de sangre no tienen ninguna utilidad para diagnosticar la artrosis. Todos los resultados que se determinan son siempre normales, incluyendo las denominadas "pruebas reumáticas", es decir, no llevan a pensar que dichos sujetos padecen la enfermedad. La única indicación para realizarlos es para confirmar con su normalidad el diagnóstico de artrosis, descartando otras enfermedades reumáticas que sí producen algunas alteraciones en los análisis de laboratorio. Por ejemplo, en las artritis están alteradas la velocidad de sedimentación de la sangre, el factor reumatoide y otras pruebas reumáticas; en la gota, el ácido úrico está alto, etc. Hasta la actualidad, no se ha identificado ningún marcador diagnóstico en el suero o en el liquido sinovial de los pacientes que permita hacer un diagnóstico o un seguimiento de la enfermedad.
No obstante, se están realizando importante avances en el estudio de los denominados marcadores biológicos de la artrosis. Son productos que se liberan desde el cartílago articular al líquido sinovial, orina o sangre durante la síntesis y destrucción del cartílago. Algunos de ellos son productos del queratán-sulfato. del condroitín sulfato, del ácido hialurónico o la proteína oligomérica de la matriz cartilaginosa (COMP). El aumento de los conocimientos sobre los marcadores bioquímicos de la artrosis permitiría un mejor diagnóstico y una intervención más temprana en el tratamiento de la enfermedad, además de facilitar el desarrollo de fármacos, iniciar las terapias mejoradas, permitir mejores opciones de medicamentos, ofrecer opciones de dosificación seguras y finalmente disminuir los costos de atención de salud. Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de identificar marcadores de artrosis que permitan un diagnóstico temprano de la enfermedad de una forma más sencilla, fiable y segura.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
Los autores de la presente invención han descubierto que los sujetos que padecen artrosis presentan un patrón peptídico no presente en sujetos sanos, ni en sujetos que padecen otro tipo de enfermedades reumáticas, como la artritis psoriásica (APS) y la artritis reumatoide (AR) , lo que convierte a dicho patrón peptídico en una herramienta útil para el diagnóstico específico de la artrosis. Para obtener el mencionado patrón, los autores partieron de muestras de suero procedentes de pacientes diagnosticados con artrosis y sobre el mismo llevaron a cabo una depleción química con ditiotrietol (DTT) y acelonitrilo (ACN) , para después digerir las proteínas con tripsina acelerada con ultrasonidos. A continuación, los péptidos resultantes fueron retenidos en una punta comercial C18 y eluídos con diferentes cantidades de ACN. Finalmente, cada fracción de elución se analizó por quintuplicado mediante espectrometría de masas MALDITOFITOF (Ejemplo 1) , obteniendo las masas de los péptidos característicos del patrón peptídico presentes en sujetos que padecen artrosis. La posterior validación del patrón peptídico obtenido (Ejemplo 2) , confirmó la utilidad de este patrón en el diagnóstico de la artrosis.
A continuación, se describen los diferentes aspectos inventivos desarrollados por los inventores.
Patrón peptídico de la invención y sus usos Los autores de la presente invención han descubierto que pacientes con artrosis presentan un patrón peptídico característico el cuál no está presente ni en sujetos con enfermedades reumatoides distintas de la artrosis (como artritis psoriásica o artritis reumatoide) ni en sujetos sanos.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un patrón peptídico, de aquí en adelante, patrón peptídico de la invención, que comprende los siguientes péptidos: SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 4, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 7, SEO ID NO: 8, SEO ID NO: 9, SEO ID NO: 10 y SEO ID NO: 11.
En la presente invención se entiende por "patrón peptídico", al conjunto o grupo de péptidos que están presentes en una muestra biológica de un sujeto y que es característico de su estado fisiológico. En el contexto de la presente invención, el patrón peptídico aqu í descrito es característico de sujetos que padecen artrosis.
En la presente invención se entiende por "péptido" a la molécula formada por la unión de varios aminoácidos mediante enlaces peptídicos y que presentan, aproximadamente, entre 2 y 100 aminoácidos. Orientativamente, si el péptido comprende entre aproximadamente 2 y 15 aminoácidos se denomina oligopéptido, y si comprende entre aproximadamente 16 y 100 aminoácidos se denomina polipéptido.
Tal como se muestra en los ejemplos incluidos en la presente descripción, el patrón peptídico de la invención ha sido obtenido mediante espectrometría de masas MALDITOFITOF, por lo que los péptidos de la invención, además de estar caracterizados por su secuencia específica de aminoácidos, también están caracterizados por su valor masa/carga y su peso molecular (ver Tabla 1], los cuáles son parámetros estándar de este tipo de técnica.
Tabla 1. Valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometría de masas para cada péptido comprendido dentro del patrón peptídico de la invención. En la Tabla 1 se muestra también la secuencia peptídica de los péptidos que comprenden el patrón de la invención.
Masa/carga (miz) Peso molecular (Da) SEQID NO: Secuencia peptídica
Péptido 01 1392, 7526 1391, 7526 1 QLTPYAQRMER
Péptido 02 1532, 8060 1531, 806 2 QKWEAEPVYVQR
Péptido 03 1758, 9790 1757, 979 3 ELQQRLEPYADQLR
Péptido 04 1910, 0176 1909, 0176 4 LHELQEKLSPLGEEMR
Péptido 05 2165, 1272 2164, 1272 5 QKLHELQEKLSPLGEEMR
Péptido 06 2180, 1445 2179, 1445 6 LHELQEKLSPLGEEMRDR
Péptido 07 2280, 1501 2279, 1501 7 DSFHLDEQFTVPVEMMQAR
Péptido 08 2291 , 2260 2290, 226 8 ARAHVDALRTHLAPYSDELR
Péptido 09 2407, 2880 2406, 288 9 LHELQEKLSPLGEEMRDRAR
Péptido 10 2436, 2922 2435, 2922 10 QKLHELQEKLSPLGEEMRDR
Péptido 11 2663, 4314 2662, 4314 11 QKLHELQEKLSPLGEEMRDRAR
En una realización particular, el patrón peptídico de la invención comprende, además, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que se muestran en la Tabla 2, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/ca rga y su peso molecular.
Tabla 2. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por
espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención.
Masa/carga (miz) Peso molecular (Da) SEQID NO: Secuencia peptídica
Péplido 12 87 1, 502 870, 502 12 VLNQELR
Péplido 13 896, 490 895, 490 13 YLTWASR
Péplido 14 961, 627 960, 627 14 GVTFLLRR
Péplido 15 980, 529 979, 529 15 VGYVSGWGR
Péplido 16 1019, 604 1018, 604 16 AFKAWAVAR
Péptido 17 1108, 588 1107, 588 17 LQTDLSEFR
Péptido 18 1117, 669 1116, 669 18 GFSPKDVLVR
Péplido 19 1148, 634 1147, 634 19 DAVSAAFKGLK
Péptido 20 121 3, 667 1212, 667 20 WLQGSQELPR
Péptido 21 1237, 674 1236, 674 21 LETPDFQLFK
Péptido 22 1247, 652 1246, 652 22 LGMFNIQHCK
Péptido 23 1249, 655 1248, 655 23 LlCQATGFSPR
Péplido 24 1255, 716 1254, 716 24 LRCLAPLEGAR
Péplido 25 1263, 683 1262, 683 25 LGMFNIQHCK
Péplido 26 1299, 609 1298, 609 26 WQEEMELYR
Péplido 27 1380, 780 1379, 780 27 VQPYLDDFQKK
Péplido 28 1403, 749 1402, 749 28 RLGMFNIQHCK
Péptido 29 1449, 800 1448, 800 29 WAGVANALAHKYH
Péptido 30 1465, 689 1464, 689 30 DSGEGDFLAEGGGVR
Péplido 31 1467, 852 1466, 852 31 VEPLRAELQEGAR
Péptido 32 1470, 813 1469, 813 32 W LQGSQELPREK
Péplido 33 1502, 810 1501 , 810 33 VCPFAGILENGAVR
Péptido 34 1518, 710 1517, 710 34 ADSGEGDFLAEGGGVR
Péptido 35 1519, 750 1518, 750 35 ALYLQYTDETFR
Péplido 36 1568, 914 1567, 914 36 LAARLEALKENGGAR
Péplido 37 1569, 907 1568, 907 37 LAARLEALKENGGAR
Péplido 38 1585, 846 1584, 846 38 THLAPYSDELRQR
Péplido 39 1612, 849 1611 , 849 39 LLDNWDSVTSTFSK
Péplido 40 1641 , 892 1640, 892 40 ITPNLAEFAFSL YR
Péplido 41 1641 , 892 1640, 892 41 AGDFLEANYMNLQR
Péplido 42 1669, 862 1668, 862 42 VLGAFSDGLAHLDNLK
Péptido 43 1706, 931 1705, 931 43 QKVEPLRAELQEGAR
Peso
Masa/carga
SEQID
molecular
NO:
Secuencia peptídica (m/z) (Da)
) 44 1707, 875 1706, 875
'VMI
) 45 1736, 970
1735~970
) 46 17"
,
YAASS'
, 47 1745, 901 1 , 01
YVG ( LR
R Péptido 73 2565, 322
48 ~LGr::HI r EEF ) 49 17,
, 48 1771 , 885
1~
,
G 'uv ~~
) 50 18,
_TPLlK
) 51 1815, O??
) 52 1875, 005
1"~
i824, OO5
ILGGHI ) 53 1834, 946
1: ,
, 54 1 , 27 1
~
LR
, 55 1875, 997
1874, 997
liYAc =v nr::1
") 1
) 56 1876, 017 1875, 017 56
VTLT ) 57 1,
EIVL
) 58 1ROO, ORO
) 59 1906, 873
1~
1905, 873
"
l' , 877 1921 , 877
, 61 19:\?, O'R
19:31, 038
SLHT LC IVATLR
TFC nr'GLRPI , 63
, 62 2012, 011
2011 , 011
Vli' ~
) 64 21 ,
2152, 112
ERlli !IDGF ) 65 218 I, OO?
21"5~nO?
LYH~ =Acl ' ¡" ) 66 21' ,
,
I "uv rK , 67 ,
, LELI
,
, 68 2315, 195 2314, 195
OsNN<Y LSl ¡ 69 234·1, 169
2343~169
rK
"
, 71
, 70 ~I, 245
~7, 245
~T ~-'------I
~DEF I GAHGPRPDTVGQRGGSRPSPGPI
Péptido 72 2409, 281 2408, 281 72
2564, 322
DDLPI nv
Péptido 74 2602, 358 2601 , 358
~~'
;;'RT
Péptido 75 2652, 448 2651, 448
76 21 70, 387
.Al LK
Q~
,
LSL
) 78 27,
ITGlY
Péptido 79 2940, 755 2939, 755
En otra realización más particular, el patrón peptídico de la invención comprende, además, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que se muestran en la Tabla 3, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los péptidos mostrados en la Tabla 3 pueden usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales. En otra realización más preferida, los sujetos artrósicos muestran una presencia incrementada de los péptidos mostrados en la Tabla 3 respecto a los sujetos control sanos.
Tabla 3. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales.
Masa/carga (miz) Peso molecular (Da) SEQID NO: Secuencia peptídica
Péptido 13 896, 490 895, 490 13 YLTWASR
Péptido 14 961, 627 960, 627 14 GVTFLLRR
Péptido 15 980, 529 979, 529 15 VGYVSGWGR
Péptido 16 1019, 604 101 8, 604 16 AFKAWAVAR
Péptido 17 1108, 588 1107, 588 17 LQTDLSEFR
Péptido 18 1117, 669 111 6, 669 18 GFSPKDVLVR
Péptido 19 1148, 634 1147, 634 19 DAVSAAFKGLK
Péptido 20 1213, 667 1212, 667 20 WLQGSQELPR
Péptido 21 1237, 674 1236, 674 21 LETPDFQLFK
Péptido 24 1255, 716 1254, 716 24 LRCLAPLEGAR
Péptido 28 1403, 749 1402, 749 28 RLGMFNIQHCK
Péptido 32 1470, 813 1469, 813 32 WLQGSQELPREK
Péptido 33 1502, 810 1501, 810 33 VCPFAGILENGAVR
Péptido 36 1568, 914 1567, 914 36 LAARLEALKENGGAR
Péptido 38 1585, 846 1584, 846 38 THLAPYSDELRQR
Péptido 40 1641 , 892 1640, 892 40 ITPNLAEFAFSLYR
Péptido 41 1641, 892 1640, 892 41 AGDFLEANYMNLQR
Péptido 42 1669, 862 1668, 862 42 VLGAFSDGLAHLDNLK
Péptido 43 1706, 931 1705, 931 43 QKVEPLRAELQEGAR
Péptido 51 1815, 922 1814, 922 51 DSGRDYVSQFEGSALGK
Péptido 52 1825, 005 1824, 005 52 ILGGHLDAKGSFPWQAK
Péptido 53 1834, 946 1833, 946 53 VMPICLPSKDYAEVGR
Péptido 54 1884, 027 1863, 027 54 EVQLVESGGGLVQPGGSLR
Masa/carga (miz) Peso molecular (Da) SEQID NO: Secuencia peptídica
Péptido 55 1875, 997 1874, 997 55 VYACEVTHQGLSSPVTK
Péptido 56 1876, 017 1875, 017 56 VTLTCVAPLSGVDFQLR
Péptido 57 1884, 000 1883, 000 57 EIVL TQSPGTLSLSPGER
Péptido 65 2186, 092 2185, 092 65 LYHSEAFTVNFGDTEEAKK
Péptido 67 2296, 219 2295, 219 67 TPGAAANLELlFVGPQHAGNYR
Péptido 68 2315, 195 2314, 195 68 QSNNKYAASSYLSLTPEQWK
Péptido 70 2348, 245 2347, 245 70 AHVDALRTHLAPYSDELRQR
Péptido 75 2652, 448 2651, 448 75 TVRTPGAAANLELlFVGPQHAGNY R
Péptido 76 2670, 387 2669, 387 76 DEPPQSPWDRVKDLA TVYVDVLK
Péptido 77 2695, 362 2694, 362 77 QSNNKY AASSYLSL TPEQWKSHR
Péptido 78 2790, 425 2789, 425 78 YRSWVPHTFESELSDPVELLVAES
En otra realización más preferida, el patrón peptídico de la invención comprende, además, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que 5 se muestran en la Tabla 4, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los péptidos mostrados en la Tabla 4 pueden usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales. En otra realización preferida, los sujetos artrósicos muestran una presencia disminuida de los péptidos mostrados en la Tabla 4 respecto a los sujetos control sanos.
Tabla 4. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por
espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales.
Péptido 12 Péptido 34 Péptido 50 Péptido 60 Péptido 62 Péptido 64 Péptido 74 Masa/carga (miz) 871 , 502 1518, 71 1810, 992 1922, 877 2012, 011 2153, 112 2602, 358 Peso molecular (Da) 870, 502 1517, 71 1809, 992 1921 , 877 2011 , 011 2152, 112 2601 , 358 SEQID NO: 12 34 50 60 62 64 74 Secuencia peptídica VLNQELR ADSGEGDFLAEGGGVR SYFEKSKEQLTPLlK SEAEDASLLSFMQGYMK TFGSGEADCGLRPLFEKK SLEDKTERELLESYIDGR AVPPNNSNAAEDDLPTVELQGVVPR
En otra realización particular, el patrón peptídico de la invención comprende, además, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que se muestran en la Tabla 5, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los péptidos mostrados en la Tabla 5 pueden usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis reumatoide.
Tabla 5. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por
espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis reumatoide.
Masa/carga (miz) Peso molecular (Da) SEQID NO: Secuencia peptídica
Péptido 22 1247, 652 1246, 652 22 LGMFNIQHCK
Péptido 23 1249, 655 1248, 655 23 LlCQATGFSPR
Péptido 26 1299, 609 1298, 609 26 WQEEMELYR
Péptido 30 1465, 689 1464, 689 30 DSGEGDFLAEGGGVR
Péptido 31 1467, 852 1466, 852 31 VEPLRAELQEGAR
Péptido 35 1519, 75 1518, 75 35 ALYLQYTDETFR
Péptido 39 1612, 849 1611 , 849 39 LLDNWDSVTSTFSK
Péptido 45 1736, 97 1735, 97 45 LSQRFPKAEFAEVSK
Péptido 46 1743, 882 1742, 882 46 Y AASSYLSL TPEQWK
Péptido 47 1745, 901 1744, 901 47 YVGGQEHFAHLLlLR
Péptido 48 1771, 885 1770, 885 48 SLAELGGHLDQQVEEF
Péptido 58 1899, 060 1898, 060 58 FNKPFVFLMIEQNTK
Péptido 59 1906, 873 1905, 873 59 SEAEDASLLSFMQGYMK
Péptido 61 1932, 038 1931 , 038 61 SLHTLFGDKLCTVATLR
Péptido 63 2020, 138 2019, 138 63 VLDAVRGSPAINVAVHVFR
Péptido 66 2190, 132 2189, 132 66 CEGPIPDVTFELLREGETK
Péptido 69 2344, 169 2343, 169 69 SEAEDASLLSFMQGYMKHATK
Péptido 71 2394, 298 2393, 298 71 LTPYADEFKVKIDQTVEELR
Péptido 72 2409, 281 2408, 281 72 GAHGPRPDTVGQRGGSRPSPG PIR
Péptido 73 2565, 322 2564, 322 73 GPPGLPGLKGDPGVPGLPGAKG EVGADGV
En otra realización particular, el patrón peptídico de la invención comprende, además, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que se muestran en la Tabla 6, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los péptidos mostrados en la Tabla 6 pueden usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis psoriásica.
Tabla 6. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por
espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis psoriásica.
Masa/carga (miz) Peso molecular (Da) SEQID NO: Secuencia peptídica
Péptido 22 1247, 652 1246, 652 22 LGMFNIQHCK
Péptido 25 1263, 683 1262, 683 25 LGMFNIQHCK
Péptido 26 1299, 609 1298, 609 26 WQEEMELYR
Péptido 27 1380, 78 1379, 78 27 VQPYLDDFQKK
Péptido 29 1449, 8 1448, 8 29 VVAGVANALAHKYH
Péptido 30 1465, 689 1464, 689 30 DSGEGDFLAEGGGVR
Péptido 31 1467, 852 1466, 852 31 VEPLRAELQEGAR
Péptido 37 1569, 907 1568, 907 37 LAARLEALKENGGAR
Péptido 39 1612, 849 1611 , 849 39 LLDNWDSVTSTFSK
Péptido 46 1743, 882 1742, 882 46 Y AASSYLSL TPEQWK
Péptido 47 1745, 901 1744, 901 47 YVGGQEHFAHLLlLR
Péptido 48 1771 , 885 1770, 885 48 SLAELGGHLDQQVEEF
Péptido 49 1786, 909 1785, 909 49 GLPGPPDVPDHAAYHPF
Péptido 58 1899, 060 1898, 060 58 FNKPFVFLMIEQNTK
Péptido 59 1906, 873 1905, 873 59 SEAEDASLLSFMQGYMK
Péptido 66 2190, 132 2189, 132 66 CEGPIPDVTFELLREGETK
Péptido 69 2344, 169 2343, 169 69 SEAEDASLLSFMQGYMKHATK
Péptido 79 2940, 755 2939, 755 79 SASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQ LGITK
Los métodos y técnicas para obtener patrones peptídicos a partir de una muestra son ampliamente conocidos en el estado de la técnica, y serán explicados en detalle en la descripción del método de diagnóstico de la invención.
En otro aspecto, la invención también se relaciona con el uso del patrón peptídico de la invención como marcador de diagnóstico de artrosis en un sujeto.
Método de diagnóstico de la invención En un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar artrosis en un sujeto, o para monitorizar la eficacia de la terapia administrada a un sujeto que padece artrosis, de aquí en adelante "método de la invención", que comprende:
a) aislar la fracción proteica de una muestra biológica procedente del sujeto,
b) digerir la fracción proteica obtenida en la etapa a) con tripsina, y
c) detectar la presencia o ausencia del patrón peptídico de la invención, en donde si dicho patrón peptídico es detectado, entonces el sujeto padece artrosis o la terapia administrada al sujeto no está siendo eficaz.
En la presente invención se entiende por "diagnóstico" al procedimiento por el cual se identifica una determinada enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos o síntomas característicos de dicha enfermedad, y que la distinguen de otras enfermedades con cuadros clínicos semejantes. En la presente invención la enfermedad, entidad nosológica o síndrome a detectar es la artrosis, y los parámetros clínicos es el patrón peptídico de la invención.
En la presente invención, se entiende por "artrosis" o "osteoartritis" a la enfermedad articular crónica ocasionada por el deterioro del cartílago hialino e hiperreactividad osteoblástica del hueso subcondral. En la presente invención los términos "artrosis" y "osteoartritis" son equivalentes y pueden emplearse indistintamente a lo largo de la misma. Como sabe el experto en la materia, la artrosis puede clasificarse en artrosis idiopática y en artrosis secundaria (Modificada de Altman Re, Semin Arthritis Rheum
1991 ; 20:40-47).
La artrosis idiopática (se desconoce el origen de la enfermedad) puede ser, localizada, por ejemplo, en manos, pies, caderas, columna, etc., o generalizada, en la que están afectadas tres o más áreas articulares, tales como las articulaciones pequeñas y la columna, las articulaciones grandes y columna, o mixta, que es una combinación de las anteriores.
La artrosis secundaria se clasifica en enfermedades congénitas o del desarrollo (entre las que se incluyen, sin limitar a, la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de leggcalve, displasias óseas, etc.) , enfermedades por depósito de calcio (entre las que se incluyen sin limitar artropatía por hidroxiapatita, artropatía destructiva y depósito de pirofosfato cálcico) , en enfermedades postraumáticas, en enfermedades del hueso y articulares (entre las que se incluyen , sin limitar a necrosis avascular, artritis reumatoide, artritis gotosa, artritis séptica, enfermedad de Paget, osteopetrosis, osteocondritis) , y enfermedades varias que tienen su origen en la artritis (entre las que se incluyen, sin limitar a, articulación de Charcot, diabetes mellitus, acromegalia, hipotiroidismo, hiperparatiroidismo, enfermedad de Kashin-Beck, enfermedad de Caisson , etc.).
Por otro lado, la artrosis también puede clasificarse utilizando la escala KELLGREN Y LAWRENCE (KlL) radiológica, que clasifica a la artrosis en 5 grados radiológicos: Grado 0, 1, 11, 111, Y IV.
Cualquiera de las enfermedades incluidas dentro de la clasificación de artrosis puede ser diagnosticada mediante el empleo del patrón peptidico de la invención.
En la presente invención se entiende por "sujeto" o "individuo" a cualquier animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un primate, en particular, un ser humano, de cualquier raza, sexo o edad. No obstante, en una realización particular, el sujeto es una mujer, más en particular, es una mujer con una edad superior a 50 años.
La puesta en práctica de la invención comprende determinar la presencia o ausencia de los péptidos que comprenden el patrón peptídico de la invención en una muestra biológica procedente de dicho sujeto. En la presente invención se entiende por "muestra biológica" a cualquier material de origen animal, en particular, humano, que incluye excretas (heces y orina) , secreciones (genitales, respiratorias,.. ) , sangre o sus componentes, tejidos y fluidos orgánicos (biopsias, líquidos: cefalorraquídeo, sinovial, articular, ascítico,... ) , etc. En una realización particular, la muestra procedente del sujeto es un fluido biológico que, en otra realización todavía más particular, se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, líquido sinovial y orina.
Una vez que se ha obtenido la muestra biológica del sujeto, ésta debe ser procesada para obtener los péptidos objeto del análisis. Para ello, primero se lleva a cabo el aislamiento de la fracción proteica de la muestra biológica (etapa a) del método de la invención].
Así, la muestra biológica se puede tratar para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o la célula, liberando los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica. Una vez hecho esto, las proteínas son aisladas de la muestra. Cualquiera de las técnicas que existen en el estado de la técnica para aislar proteínas puede ser empleada en la presente invención como por ejemplo, centrifugación, depleción, etc. Una vez aisladas las proteínas, se procede a la digestión de las mismas para obtener el perfil péptido de la invención.
Así, en una segunda etapa (etapa b) del método de la invención], éste comprende digerir la fracción proteica obtenida en la etapa a) con tripsina, llevando a cabo la digestión enzimática de las proteínas y obteniendo péptidos. La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces peptídicos de las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos de menor tamaño y aminoácidos. La tripsina es producida en el páncreas y secretada en el duodeno (parte del intestino) , donde es esencial para la digestión. El pH óptimo es 8 y la temperatura óptima es 37 oC.
Una vez obtenidos los péptidos, éstos pueden ser detectados mediante técnicas ampliamente conocidas en el estado de técnica. Ejemplos de dichas técnicas incluyen, sin limitar a, espectrometría de masas, citometría de flujo, Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) , RIA (radioinmunoensayo) , EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo) , DAS-EUSA (ELlSA sandwich
con doble anticuerpo) y técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas. En una realización particular, la obtención del patrón peptídico de la invención se lleva a cabo mediante espectrometría de masas, ELlSA o citometría de flujo.
La espectrometría de masas es una técnica analítica que permite elucidar estructuras químicas, basada en la medición de la relación masa/carga de especies moleculares. Las determinaciones requieren de la generación de especies cargadas eléctricamente, lo cual se logra por diferentes metodologías como pueden ser el impacto electrónico, el bombardeo de átomos rápidos (FAS) , y la generación de iones enlazados. La medición de la relación masa/carga permite conocer el peso molecular exacto de la molécula.
Técnicas derivadas de la espectrometría de masas que también pueden emplearse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitarse a, la cromatografía de gases
espectrometría de masas (GC-MS) y cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).
La técnica ELlSA (acrónimo del inglés Enzyme-Unked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo.
En la presente invención, el término "anticuerpo" es interpretado de forma amplia e incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos y fragmentos de los mismos (F (ab') 2, Fab, scFv, etc.], siempre que sean capaces de reconocer al antígeno de interés, es decir, que sean capaces de unirse a los péptidos comprendidos dentro del patrón peptídico de la invención. Ejemplos de anticuerpos que pueden emplearse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitarse a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos totalmente humanos, etc. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc.
La citometría de flujo es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz láser, en la que las proteínas unidas a un anticuerpo marcado y suspendidas en un fluido, atraviesan un finísimo tubo transparente sobre el que incide un delgado rayo de luz láser, la luz transmitida y dispersada por el paso de las proteínas a través del tubo se recoge por medio de unos dispositivos de detección, permitiendo detectar y separar las proteínas unidas a los anticuerpos marcados.
Una vez obtenido el patrón peptídico del sujeto de estudio, si dicho patrón peptídico comprende los péptidos que aparecen en el patrón peptídico de la invención, entonces se puede concluir que el sujeto padece artrosis.
Kit Y array de la invención y sus usos En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, de aquí en adelante "kit de la invención", que comprende anticuerpos específicos contra los péptidos que comprenden el patrón peptídico de la invención. Los términos "patrón peptídico", "péptidos" y "anticuerpo" ya han sido descritos y explicados en la sección anterior y son aplicables al presente aspecto inventivo.
Por "kit" se entiende, en el contexto de la presente invención, un producto que contiene los diferentes reactivos para poner en práctica el método de la invención, empaquetados para permitir su transporte y almacenamiento. Materiales adecuados para el empaquetamiento de los componentes del kit incluyen, sin limitar a, cristal, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares) , botellas, viales, papel, sobres y similares.
Adicionalmente, los kits pueden contener instrucciones para el empleo de los distintos componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden encontrarse en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones de forma que puedan ser leídas por un sujeto, tales como medios de almacenamientos electrónicos (discos magnéticos, cintas y similares) , medios ópticos (CD-ROM, OVO) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de internet que proporcionen dichas instrucciones.
Como entiende el experto en la materia, la puesta en práctica del método de la invención puede hacerse mediante el empleo de un array que comprenda los anticuerpos que reconocen específicamente los péptidos comprendidos en el patrón peptídico de la invención. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un array que comprende un conjunto de anticuerpos, en donde dicho conjunto de anticuerpos comprende anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse específicamente con los péptidos comprendidos en patrón peptídico de la invención.
Alternativamente, la puesta en práctica del método de la invención también puede hacerse mediante el empleo de un array que comprenda los péptidos de la invención. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un array que comprende los péptidos comprendidos en el patrón peptídico de la invención.
En la presente invención se entiende por "arra'/' o "matriz" a la disposición ordenada (en un soporte generalmente en filas y columnas) de (i) los anticuerpos que reconocen de forma específica los péptidos comprendidos en el patrón peptídico de la invención (array de anticuerpos) , o de (ii) los péptidos que comprenden el patrón peptídico de la invención (array de péptidos).
En el caso del array de anticuerpos, una vez que las proteínas han sido aisladas de la muestra biológica y digeridas tal como se ha descrito anteriormente en el método de la invención, la disolución resultante se añade al array y se incuba la mezcla. Si los péptidos del patrón peptídico de la invención están presentes en la muestra, éstos quedaran unidos al array, siendo posible su detección. Cualquier método de detección de los habitualmente empleados en arrays puede ser empleado en la puesta en práctica de la presente invención.
Por otro lado, como entiende el experto en la materia, dentro de la invención también están contemplados el uso del kit o el array de la invención en el diagnóstico in vitro de artrosis.
Así, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso del kit o del array de la invención para el diagnóstico in vitro de artrosis. Alternativamente, el kit de la invención, también puede usarse para diferenciar entre pacientes que padecen artrosis de aquéllos que padecen otras patologías reumáticas diferentes a la artrosis, como por ejemplo, artritis o artritis psoriásica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Diagramas de los análisis de componentes principales (PCA) realizados con los péptidos de la invención obtenidos mediante la técnica de MALDI-TOF, para el grupo de pacientes artrósicos (gris) y para el grupo de pacientes control (negro) , en cada porcentaje de elución. Los PCAs muestran que en todas las condiciones de extracción la clasificación de las muestras se consigue en al menos dos planos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Ejemplo 1. MATERIAL Y MÉTODOS
1.1 Reactivos DL-ditiotreitol (DTT 2:99%) lodoacetamida (IAA 2:::99%) Ácido trifluoroacético (TFA 2:99%, para LC-MS) Acelonilrilo (ACN, LC-MS CHROMASOLV) Agua (LC-MS CHROMASOLV) Bicarbonato amónico (2:::99 %) Tripsina (grado de secuenciación, Rache) NuTips large 10-200 fLl, C-18 (Glygen, Columbia, EE.UU.)
ct-Cyano-4-hydroxycinnamic acid puriss., para MALDI-MS (Fluka, Alemania) Mezcla de calibración 1, 4700 Proteomics Analyzer (ABSciex, Framingham, MA, EE.UU.)
1.2. Muestras de suero Las muestras de suero humano se obtuvieron de donantes anónimos en el Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, España. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el comité de ética local en Galicia (España). Se escogieron 40 muestras de suero de donantes artrósicos (DA) , 40 muestras de suero de donantes diagnosticados con artritis reumatoide (AR) , 40 muestras de donantes diagnosticados con artritis psoriásica (APS) y 40 muestras de suero de donantes sin ninguna de las anteriores patologías, es decir, son sujetos que no presentan ningún tipo de patología reum.ática. Este último grupo es el grupo control (N). Se emplearon 20 sueros de cada grupo de pacientes para la búsqueda del patrón peptídico característico de cada patología. Posteriormente, se emplean los otros 20 sueros restantes de cada grupo de pacientes como muestras ciegas para comprobar la validez del patrón peptídico de la invención. Las muestras de suero se almacenaron a 80 oC hasta su procesamiento.
1.3. Depleción secuencial de proteinas en suero La depleción de proteinas se realizó de acuerdo con el protocolo desarrollado previamente en nuestro laboratorio (Fernández-Costa et aL, Proteome Sci 2012; 55). Cada uno de los sueros fueron sometidos a un protocolo de depleción secuencial que implica dos etapas de precipitación: primero con DTT y a continuación con ACN , de acuerdo con el protocolo descrito por Ka y et al. (Rapid Commun Mass Spectrom, 2008,
22: 3255-60) , con pequeñas modificaciones. Brevemente, 2, 2 JlI de DTT 500 mM se añadieron a 20 JlI de suero y se agitaron en vórtex. A continuación, la muestra se incubó 1 hora hasta la formación de un precipitado blanco viscoso persistente, que se sedimentó por centrifugación a 14, 000 xg durante 2 x 20 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio (LoBind, Eppendorf) y se deplecionó de nuevo mediante la adición de 57 % (v/v) acetonitrilo, seguido de dos ciclos de vórtex breve y 10 minutos de ultrasonidos en un baño de ultrasonidos (SONOREX, Bandelin). El precipitado de proteína formado se sedimentó por centrifugación a 14, 000 xg durante 10 minutos, yel sobrenadante se transfirió a un tubo limpio LoBind y se evaporó a sequedad empleando una centrífuga de vacío.
1.4. Digestión en solución La digestión ultrasónica en solución se realizó de acuerdo con el protocolo de digestión proteolítica ultrarrápida desarrollado previamente (HM Santos et al. J Proteome Res 2007, 6:3393-9). La muestra evaporada se resuspendió en 20 ¡..LI de bicarbonato amónico 25mM (AmBi) , se añadieron 10 ~d de acetonitrilo y se mezcló mediante vórtex y sonicación durante 1 minuto (50% de amplitud) en baño de ultrasonidos (SONOPULS HD 2200 con accesorio 886, Bandelin). Los residuos de cisteína de las proteínas se redujeron con 2 JlI de DTT 110 mM seguido de vórtex y 1 minuto de sonicación, y a continuación se bloqueó con 2 ~d de IAA 600 mM, vórtex y 1 minuto sonicación. Para inactivar la IAA se añadieron a la muestra 10 JlI de DTT 110 mM. Después, la muestra se diluyó hasta un volumen final de 200 JlI con AmBi 12, 5 mM, y se añadió tripsina de acuerdo con un ratio 1 :20 (p/p) de tripsina:proteína. La digestión se llevó a cabo en el aparato de ultrasonidos durante 5 minutos a un 50% amplitud. Finalmente, se añadieron 2 ~d de ácido fórmico al 50% (v/v) para parar la reacción enzimática. El suero digerido se evaporó a sequedad en una centrífuga de vacio.
1.5. Elución secuencial mediante NuTips (separación de péptidos)
Las muestras digeridas se reconstituyeron en 30 JlI de TFA al 0, 1 % (v/v) , y 20 Jlg de digerido se cargaron en una punta de tipo NuTip C18 (Iarge). La separación de los péptidos se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo:
Acondicionado: se aspiró y expulsó 5 veces 30 JlI de una solución de ACN al 60-80% (v/v) y TFA al 0, 1% (v/v) , y se lavó 3 veces con TFA al 0, 1%.
Unión: se aspiró y expulsó la muestra 50 veces, para permitir que los péptidos se adsorbieran al material de fase reversa empaquetado en la punta.
Elución secuencial: se aspiró y expulsó (20 veces cada uno) 30 1-11 de diferentes porcentajes de ACN , de baja a alta concentración de ACN. La elución secuencial se realizó con 4, 7, 10 Y 14% (v/v) de ACN. Los eluidos se evaporaron a sequedad.
1.6. Análisis mediante espectrometría de masas Las muestras evaporadas se resuspendieron en 6 1-11 de TFA al 0, 1 % (v/v) , y 1 1-11 de cada muestra se depositó por quintuplicado en una placa para MALDI (placa de 384 puntos recubierta de Tenón®) , y se dejó secar al aire a temperatura ambiente, Posteriormente, se añadieron a las muestras secas de péptidos 1 ~d de una solución de 3 mg/ml de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico en TFA al 0, 1% (v/v) y 50% (v/v) ACN, y se dejó secar de nuevo.
Las muestras se analizaron en modo de ion positivo usando un espectrómetro de masas MALDI-TOFITOF 4800 Prateamics Analyzer (ABSciex, Framingham, MA, EE.UU.) , equipado con un láser Nd:YAG (A.=355 nm) y el programa 4000 Series Explorer™ (ABSciex). La calibración interna, adquisición de datos, procesamiento e interpretación se llevaron a cabo según lo recomendado por el fabricante. Todos los espectros de masas deben ser calibrados externamente empleando una mezcla de péptidos estándar (ABSciex). Los datos de masas se exportaron de acuerdo con las siguientes caracteristicas: a) rango de masas: 500 -4000 (Da) ; b) densidad de picos: máximo 50 picos por 200 Da; e) relación señal/ruido: mínimo 20; d) área mínima: 100; e) picos máximos/spot: 500.
El análisis del espectro de masas para cada muestra corresponde a un promedio de 1.500 disparos de láser. Los espectros de fragmentación se adquieren mediante la selección de los precursores de interés en cada mapa de masas MALDI-TOF, con un promedio de 2.000 disparos de láser por espectro. Para la fragmentación (MS/MS) , todos los picos con un ratio señal/ruido (S/N» 10 se incluyeron en la búsqueda en bases de datos.
La secuenciación de péptidos se realizó mediante el software ProteinPilot™ (ABSciex) , con los siguientes parámetros: (i) Versión UniProt: 2013_09, que contiene 540, 958 entradas de secuencia, (ii) Taxonomía: Horno sapiens, (iii) Enzima: tripsina o sin enzima; (v) Modificaciones fijas: iodoacetamida. Sólo se informó de los péptidos identificados con al menos un 70 % de confianza.
1.7. Análisis bioinformático Cada espectro se pre-procesó empleando los siguientes parámetros: rango de masas de 500 a 4000 Da, densidad de picos máxima: 10 picos por 200 Da, relación señal/ruido mínimo (S/N) de 10, área mínima de 100, número máximo de picos por espectro: 120 Los picos se alinearon con una tolerancia de la masa del péptido de 150 ppm y, finalmente, se creó un espectro representativo para cada muestra con aquellos picos presentes en al menos 4 de las 5 réplicas espectrales de la muestra. De cada pico sólo se tuvo en cuenta su presencia o ausencia en cada espectro, descartándose el uso de su intensidad más allá del pre-procesamiento.
Con el objetivo de identificar picos diferencialmente expresados en los distintos grupos se aplicó el test de independencia de Fisher para comparaciones entre dos grupos y el test de independencia X2 para comparaciones entre los cuatro grupos analizados. Dado que estos tests se realizaron sobre todos los picos detectados, se aplicó posteriormente la corrección False Discover y Rate (FDR ) de Benjamini-Hochberg con el fin de reducir el número de falsos positivos.
Mediante el uso de Análisis de Componentes Principales (Principal Component Analysis, PCA) se analizó gráficamente la separación entre las muestras de distintas condiciones.
Por último, con el objetivo de comprobar la utilidad de los péptidos que comprenden el patrón peptídico descrito en la presente invención para el diagnóstico de artritis, se evaluó el rendimiento de clasificadores automáticos entrenados únicamente con la información de estos péptidos sobre un conjunto de muestras ciegas.
Ejemplo 2. RESULTADOS
2.1. Obtención del patrón peptídico característico de la artrosis Para la obtención del patrón peptídico descrito en la presente invención se utilizaron 20 muestras de suero de cada uno de los grupos de pacientes incluidos en el presente estudio (DA: artrosis, AR: artritis reumatoide, APS: artritis psoriásica y N; control) y mediante las técnicas descritas en el Ejemplo 1 se detectaron los péptidos característicos de cada uno de los grupos de estudio analizados. Brevemente, primero se seleccionaron los péptidos que se detectan de forma significativa en una patología con respecto a las otras en base al valor q < 0, 05 del test de Fisher corregido aplicado por parejas. Y después se seleccionaron los péptidos que se detectan de forma significativa en dos o más condiciones de acuerdo con un valor q < 0, 05 del test de independencia X2 corregido, como se ha indicado anteriormente.
Mediante dicha metodología se identificaron un total de 11 péptidos que se expresaban de forma significativa en el grupo de pacientes artrósicos respecto al resto de grupos incluidos en el estudio. Este patrón peptídico específico permite distinguir las muestras de los sujetos con artrosis (DA) de las muestras de sujetos control (N) , e incluso de las muestras de los sujetos que padecen otras enfermedades reumáticas, como la artritis psoriásica (APS) y la artritis reumatoide (AR).
Dicho conjunto de 11 péptidos que forman el patrón peptídico de la invención, se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7: Masas de los péptidos característicos que comprenden el patrón peptídico para el diagnóstico de pacientes que padecen artrosis (DA). Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes, APS: grupo de pacientes que padecen artritis psoriásica; AR: grupo de pacientes que padecen artritis reumatoide; N: grupo de sujetos control.
miz SEQ 10 No. APS (n=20) AR (n= 20) DA (n=20) N (n=20)
1392, 7517 1 0% 5% 50% 10%
1532, 796 2 5% 15% 40% 0%
1758, 979 3 5% 5% 40% 0%
1909, 9498 4 0% 5% 40% 0%
2165, 146 5 10% 5% 45% 0%
2180, 1414 6 15% 10% 70% 20%
2280, 1501 7 5% 5% 40% 5%
2291, 227 8 5% 10% 60% 20%
2407, 3042 9 5% 0% 45% 0%
2436, 3015 10 35% 25% 90% 40%
2663, 4382 11 5% 5% 60% 15%
Los péptidos escogidos como característicos de artrosis aparecen significativamente más en los sueros de donantes artrósicos que en los sueros de los pacientes controlo de los pacientes que padecen APS o AR.
2.2. Péptidos adicionales específicos para el diagnóstico de otras patologías comoAR y APS
Además de la detección del patrón peptídico descrito en la invención, mediante los métodos descritos previamente se seleccionaron un conjunto de péptidos adicionales a los 11 péptidos que comprenden el patrón peptídico de la invención para el diagnóstico de la artrosis, para mejorar la clasificación de las muestras, preferentemente muestras de suero, de donantes artrósicos. Dichos péptidos adicionales se seleccionaron de los datos procedentes del análisis de las 80 muestras de suero analizadas. En este caso, al
tratarse de comparaciones entre parejas de condiciones, los péptidos seleccionados fueron aquellos para los que se obtuvo un valor q < 0, 05 para el test de Fisher corregido.
En la Tabla 8 se muestran los péptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el
patrón peptídico de la invención y que son capaces de diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales, que no padecen ninguna patología artrósica.
Tabla 8. Masas de los péptidos adicionales al patrón peptídico de la invención, útiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (DA) de sujetos que no padecen ninguna patología artrósica. Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes.
miz 896, 490 961 , 627 980, 529 1019, 604 1108, 588 1117, 669 1148, 634 1213, 667 1237, 674 1255, 716 1403, 749 1470, 813 1502, 810 1568, 914 1585, 846 1641 , 892 1641, 892 1669, 862 1706, 931 1815, 922 1825, 005 1834, 946 1864, 027 1875, 997 1876, 017 1884, 000 2186, 092 2296, 219 2315, 195 2348, 245 2652, 448 2670, 387 2695, 362 2790, 425 SEQ ID No. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24 28 32 33 36 38 40 41 42 43 51 52 53 54 55 56 57 65 67 68 70 75 76 77 78 OA (n 20) 65% 70% 70% 65% 50% 55% 75% 60% 50% 50% 45% 70% 65% 75% 50% 85% 85% 80% 70% 60% 80% 45% 75% 75% 75% 65% 60% 80% 75% 95% 70% 50% 95% 55% N (n-20) 5% 15% 20% 10% 0% 5% 15% 5% 0% 0% 0% 5% 5% 20% 10% 35% 35% 45% 5% 10% 30% 5% 25% 20% 20% 20% 10% 20% 30% 30% 5% 15% 40% 15%
Alternativamente, en la Tabla 9 se muestran los péptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patrón peptídico de la invención y que también, son capaces de diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales, que no padecen ninguna patología artrósica. La diferencia entre los datos mostrados en la Tabla 8 y la Tabla 9 radica en que en la Tabla 8 los sujetos artrósicos muestran una mayor presencia de dichos péptidos, mientras que los datos mostrados en la Tabla 9 ponen de manifiesto que los sujetos artrósicos muestran una menor presencia de dichos péptidos respecto a los sujetos control, sanos.
Tabla 9. Masas de los péptidos adicionales al patrón peptídico de la invención , útiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que no padecen ninguna patología artrósica. Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes,
miz SEQ ID No. OA (n-20) N (n-20)
871 , 502 12 0% 30%
1518, 710 34 15% 55%
1810, 992 50 5% 40%
1922, 877 60 5% 50%
2012, 011 62 40% 80%
2153, 112 64 30% 90%
2602, 358 74 35% 65%
En la Tabla 10 se muestran los péptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patrón peptídico de la invención y que son capaces de diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis reumatoide. Es interesante destacar que,
como se puede apreciar en dicha Tabla 10, los sujetos que padecen OA presentan una mayor presencia de los péptidos SEO ID NO: 30, 59 y 69, respecto a los pacientes que padecen AR. En cambio, los sujetos artrósicos presentan una menor presencia de los péplidos SEa ID NO: 22, 23, 26, 31, 35, 39, 45, 46, 47, 48, 58, 61, 63, 66, 71, 72 Y 73, respecto a los sujetos que padecen AR.
Tabla 10. Masas de los péptidos adicionales al patrón peptídico de la invención, útiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (DA) de sujetos que padecen artritis reumatoide (AR). Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes.
mIz SEO ID No. AR (n-20) DA (n=20)
1247, 652 22 50% 25%
1249, 655 23 30% 0%
1299, 609 26 90% 20%
1465, 689 30 30% 80%
1467, 852 31 90% 45%
1519, 750 35 30% 0%
1612, 849 39 55% 20%
1736, 970 45 35% 0%
1743, 882 46 45% 10%
1745, 901 47 45% 5%
1771 , 885 48 90% 25%
1899, 060 58 55% 15%
1906, 873 59 5% 80%
1932, 038 61 45% 0%
2020, 138 63 60% 15%
2190, 112 66 85% 20%
2344, 169 69 5% 80%
2394, 298 71 60% 10%
2409, 281 72 50% 0%
2565, 322 73 70% 20%
En la Tabla 11 se muestran los péptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patrón peptídico de la invención y que son capaces de diferenciar entre sujetos 5 artrósicos de sujetos que padecen artritis psoriásic8. Es interesante destacar que, como se puede apreciar en dicha Tabla 11 , los sujetos que padecen DA presentan una mayor presencia de los péptidos SEa ID NO: 25, 29, 30, 59 Y 69, respecto a los pacientes que padecen APS. En cambio, los sujetos artrósicos presentan una menor presencia de los péptidos SEQ 10 NO: 22, 26, 27, 31, 37, 39, 46, 47, 48, 49, 58, 66 Y 79 respecto a los sujetos que padecen APS.
Tabla 11. Masas de los péptidos adicionales al patrón peptídico de la invención útiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que padecen artritis psoriásica {APS). Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes.
mIz SEO ID No. APS (n=20) CA (n=20)
1247, 652 22 55% 25%
1263, 683 25 10% 60%
1299, 609 26 90% 20%
1380, 780 27 30% 0%
1449, 800 29 25% 75%
1465, 689 30 5% 80%
1467, 852 31 95% 45%
1569, 907 37 50% 0%
1612, 849 39 75% 20%
1743, 882 46 55% 10%
1745, 901 47 25% 5%
1771 , 885 48 95% 25%
1786, 909 49 65% 20%
1899, 060 58 50% 15%
1906, 873 59 0% 80%
2190, 132 66 70% 20%
2344, 169 69 0% 80%
2940, 755 79 60% 20%
2.3. Análisis de componentes principales (peA).
Con los péptidos seleccionados en el perfil peptídico descrito en la invención obtenidos de las muestras de sueros del grupo de pacientes artrósicos y de las muestras del grupo control se realizó un análisis de componentes principales (peA) , comprobando que las muestras se separan en al menos dos planos para todas las condiciones de elución, con lo que los péptidos son capaces de diferenciar entre muestras de donantes artrósicos y
sujetos control.
Antes de realizar el peA, se creó un grupo de datos único para cada porcentaje de elución (4%, 7%, 10% Y 14%) , con el espectro representativo de cada muestra. Los espectros de cada grupo de datos se convirtieron en vectores 1 s y Os, donde 1 significa presencia de pico y O significa ausencia de pico.
El análisis peA y su visualización se realizaron usando el programa RapidMiner v5, 3 (http://rapid-i, com/contentlview/181/190/) , que configura el algoritmo peA para reducir la dimensionalidad de los grupos de datos hasta 3 componentes principales.
Estos resultados se muestran en la Figura 1.
2.4. Comprobación del clasificador con muestras ciegas Se comprobó la utilidad de los péptidos que comprenden el patrón peptídico descrito en la presente invención para el diagnóstico de artrosis en un grupo de pacientes del que no se conocía la patología que padecían (muestras ciegas). Las muestras de dichos pacientes (n=79) se procesaron de la misma manera que se ha descrito anteriormente en materiales y métodos.
Utilizando el conjunto de datos descrito en la sección 2.1 se evaluaron una serie de clasificadores automáticos mediante la herramienta de aprendizaje automático Weka 3.7 (hUp:/Iwww.cs.waikato.ac.nzlmllweka/). Estos clasificadores fueron entrenados con las distintas combinaciones posibles de los datos de cada elución. Esta evaluación se hizo utilizando el esquema de validación cruzada conocido como Leave-One-Out sobre dos problemas distintos: 1) clasificación de muestras de todas las condiciones y iI) clasificación de las muestras que presentan una condición relacionada con una patológica (grupos AR, APS y OA). Como resultado de esta evaluación se seleccionó como mejor clasificador para el problema de clasificar todas las condiciones a la implementación LibSVM del algoritmo Support Vector Machine (SVM) con kernel Radial Basis Function (RBF) entrenado con los datos de los porcentajes de elución 7% y 10% Y combinado con un optimizador de parámetros basado en una búsqueda en rejilla (algoritmo GridSearch) configurado para buscar el valor óptimo del parámetro "cost"
entre los valores 2.5, 2.3, 2.1, 21, 23, 25, 27, 29, 21\ 213 Y 215, Y del parámetro "gamma" 21
entre los valores Z 15, 2-13, Zl\ 2-9, 2-7, 2-5, 2-3, 2-\ Y 23. Por otro lado, se seleccionó como mejor clasificador para el problema de clasificar las condiciones patológicas al clasificador Artificial Neural Nelwork (ANN) entrenado con los datos del porcentaje 10%_
Con estos clasificadores entrenados con el conjunto de datos descrito en la sección 2_1 se realizó la clasificación del conjunto de datos de muestras ciegas. En el caso del clasificador SVM-RBF para el problema de todas las condiciones, el poder de clasificación fue moderado, al presentar un porcentaje de aciertos ligeramente superior al 60% y un valor del estadístico Kappa de Cohen (kappa) aproximado de 0, 48. Por otro lado, el clasificador ANN para el problema de las condiciones patológicas mostró unos resultados superiores, con un porcentaje de aciertos próximo al 75% y un valor de kappa de 0, 619. Los resultados de la clasificación se muestran en la Tabla 12.
Tabla 12: Clasificadores automáticos creados mediante el uso del patrón peptídico descrito en la presente invención obtenido a partir de muestras de suero analizadas de cada grupo de pacientes (n= 20 para cada grupo de pacientes). Conds.: condiciones, Clas.: clasificador, Elu.: porcentajes de elución, %Ac.: porcentaje de aciertos, K: kappa global, Cond.: condición, Sen.: sensibilidad por condición, Esp.: especificidad por condición, n: muestras por condición, N: total de muestras, OC: diagnóstico correcto, DCP: diagnóstico correcto por patología.
Conds. Clas. Elu. %Ac. K Cond. Sen. Esp. n N DC DCP
Todas SVMRBFOPT 7% 10% 60, 76 0, 477 APS 0, 80 0, 93 20 79 48 16
AR 1, 00 0, 92 19 19
OA 0, 45 0, 75 20 9
N 0, 20 0, 88 20 4
Patologías ANN 10% 74, 58 0, 619 APS 0, 55 0, 90 20 59 44 11
AR 0, 89 0, 38 19 17
OA 0, 80 0, 23 20 16
