Procedimiento para la valoracion secuencial por western-blot en una misma muestra de la protelna NCAM y de su cola de acido polisialico (PSA).
Sector de la Tecnica
El procedimiento objeto de invention se inscribe en el ambito de la biologla molecular, con utilidad tanto en la investigation basica de la protelna PSA-NCAM como en potenciales estudios de investigacion aplicada (cllnica) que incluyan su valoracion.
Estado de la tecnica: Antecedentes
Perfil estructural de la NCAM. La Molecula de Adhesion de Celulas Neurales (conocida por su acronimo internacional NCAM o CD56) fue la primera protelna de adhesion celular perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas (lgSF) en ser caracterizada (Rutishauser et al., 1976, Nature Rev Neurosci 9:26-35; Thier y et al., 1977, J Biol Chem 252:6841-6845). Codificada por un unico gen estructural (en position 11q23 en el genoma humano; Nguyen et al., 1986, J Cell Biol 102:711-715) , cuya transcription esta bajo el control de un caracterlstico promotor domestico (Barton et al., 1990, Biochem J 268:161-168) , sin embargo, mediante procesos de alternative splicing da lugar a una multiplicidad de variantes estructurales de la protelna (Reyes et al., 1991, Mol Cell Biol 11:1654-1661). De entre todas estas variantes o isoformas de la NCAM destacan 3, conocidas como isoformas principales, que en los mamlferos se distinguen por sus masas moleculares aparentes; 120 kDa, 140 kDa y 180 kDa (Barbas et al., 1988, EMBO J 7:625-632). Las dos isoformas mayores, al igual que el resto de integrantes de la lgSF, son protelnas transmembrana de tipo I, constituidas por un dominio citoplasmatico e- terminal pequeno (140 kDa) o grande (180 kDa) , un dominio transmembrana (TM) de paso unico y un gran dominio extracelular (ectodominio) con el extremo N-terminal. La isoforma menor, por su parte, carece de dominio TM y en su lugar presenta un grupo glicosilfosfatidilinositol para el anclaje a la membrana.
Como suele ser tambien habitual en la lgSF, el ectodominio de la NCAM esta dotado de una estructura modular (Shapiro et al., 2007, Annu Rev Neurosci 30:451-474) formada por la repetition en tandem de cinco motivos de plegamiento de tipo inmunoglobulina (Igl- lgV) en la portion distal (N-terminal) y dos de fibronectina de tipo Ill (FNl-II) , que proporcionan las conexiones con la membrana, en la region proximal.
A esta riqueza estructural de la NCAM lograda por procesos de regulation post-transcripcional se le suma la lograda mediante las modificaciones post- traduccionales (Walmod et al., 2004, Annu Rev Neurosci 30:451-474) , entre las que se encuentran la N-y O-glicosilacion, la sulfatacion, fosforilacion, palmitoilacion y, muy especialmente, la polisialilacion. Esta ultima es una modalidad de N-glicosilacion consistente en la transferencia de residuos de acido N-acetilneuramlnico (acido sialico) , unidos mediante enlaces a (2, 8) , a dos sitios especlficos de N-glicosilacion (en lgV) con una fuerte selectividad regional (van der Ohe et al., 2002, Glycobiology 12:47-63). El resultado es la incorporation a la NCAM de un homopollmero lineal de «50-200 unidades, o mas, conocido como acido polisialico o PSA (lnoue & lonue, 2001, Biochimie 83:605613; Nakata & Troy, 2005, J Biol Chem 280:38305-38316).
La polisialilacion destaca del resto de modificaciones post-traduccionales i) por el gran impacto que tiene sobre la estructura y actividad biologica de la protelna y ii) por su caracter atlpico entre los mamlferos, ya que no mas de 6 protelnas la experimentan (Rothbard et al., 1982, J Biol Chem 257:11064-11069; Finne et al., 1983, Biochem Biophys Res Commun 112:482-487; Mendiratta et al., 2005, J Biol Chem 280:3234032348) , entre ellas las dos enzimas polisialiltransferasas responsables de la slntesis del PSA, ST8Siall y IV (Muhlenhoff et al., 2001, J Biol Chem 276:34066-34073).
Perfil funcional de la NCAM. Como protelna de adhesion, su funcion es mediar en el reconocimiento de la superficie celular estableciendo contactos homofllicos independientes del Ca2+ (Edelman, 1986, Annu Rev Cell Dev Biol 2:81-116) con otras moleculas de NCAM de la misma celula (uniones en cis) o de una celula distinta (uniones en trans) (Rutishauser et al., 1982, Proc Natl Acad Sci USA 79:685-689). Ejerciendo dicha mision aparece en las celulas embrionarias tempranas, entre las cuales facilita la interaction y agregacion y de este modo contribuye a la morfogenesis de los tejidos (Cunningham et al., 1987, Science 236:799-806). Tras el desarrollo se expresa asimismo en diversos tejidos diferenciados y continua ejerciendo un papel central en, por ejemplo, el establecimiento de contactos entre las neuronas o en las uniones neuromusculares (Thier y et al., 1977, J Biol Chem 252:6841-6845).
No obstante lo anterior, el intenso trabajo desarrollado a lo largo de los ultimos anos ha revelado que la NCAM, aparte de establecer contactos con otras moleculas analogas de la misma membrana (cis) o de la membrana de una celula vecina (trans) , es capaz tambien de interaccionar mediante contactos heterofllicos con una variedad creciente de otras moleculas, tanto intracelulares como extracelulares. Asl, a traves de su ectodominio NCAM establece contactos, entre otros, con integrantes de su misma familia estructural (L1, PrP o TAG-1) , componentes de la matriz extracelular (proteoglicanos, colageno, etc) o receptores de factores de crecimiento (FGFR, GDNF) (Nielsen et al., 2010, Adv Exp Med Biol 663:23-53). Por otro lado, a traves del dominio citoplasmatico se han caracterizado contactos con al menos cinco ligandos proteicos intracelulares (Buttner & Horstkorte, 2010, Adv Exp Med Biol 663:55-66). De esta forma se ha pasado de conceptuar el papel biologico de la NCAM como el de una sencilla protelna de adhesion celular a considerarla un versatil transductor de senales, partlcipe en la mediation de una multiplicidad de procesos biologicos, entre los que cabe mencionar el crecimiento, mielinizacion y regeneration nerviosa, la plasticidad sinaptica, la migration celular, el aprendizaje y la memoria o la propagation de ciertos tipos tumorales (Cavallaro & Christofori, 2001, Biochim Biophys Acta 1552:39-45; Schauer, 2009, Curr Opin Struct Biol19:507-514).
Importancia de la polisialilacion en la estructura y funcion de la NCAM
La union del PSA a la NCAM le acarrea profundos cambios estructurales. De un lado, aumenta la microheterogeneidad de las formas moleculares de la protelna - segun el numero y longitud de las cadenas de PSA que se le unan - y, de otro, la alta densidad de carga negativa aportada por los grupos carboxllicos del PSA conlleva una fuerte retention de agua e iones y el correspondiente aumento del radio hidrodinamico del dominio extracelular de la molecula (Hildebrandt et al., 2010, Adv Exp Med Biol 663:95109).
La polisialilacion de la NCAM acarrea tambien singulares repercusiones sobre la funcion de la protelna. Las voluminosas cadenas de PSA actuan como espaciadores entre las
celulas, que debilitan los contactos homofllicos y heterofllicos de la NCAM (Kolkova, 2010, Adv Exp Med Biol 663:213-225) y, en consecuencia, interfieren dinamicamente tanto en su papel en la adhesion celular (Rutishauser & Landmesser, 1996, Trends Neurosci 19:422-427; Kiss & Rougon, 1997, Curr Opin Neurobiol 7:640-646; Bruses & Rutishauser, 2001, Biochimie 83:635-643; Rutishauser, 2008, Nature Rev Neurosci 9:2635) como en la senalizacion mediada por ella (Rutishauser & Landmesser, 1996, Trends Neurosci 19:422-427). En este sentido lo mas sugestivo es que la polisialilacion parece provocar un cambio cualitativo en la actuation de la NCAM, promoviendo el abandono de su funcion como protelna de adhesion para pasar a desempenar un papel activo en la senalizacion celular (Kiselyov et al., 2005, J Neurochem 94:1169-1179). De aqul la importancia de mantener bajo un estricto control la homeostasis del PSA, que se trasluce en la estrecha regulation regional y temporal observada en los niveles de expresion de PSA-NCAM (Schauer, 2009, Curr Opin Struct Biol 19:507-514). Asl, el pico de expresion de PSA durante los primeros momentos del desarrollo tendrla por objeto reducir la interaction entre celulas, actuando como un "aislante" de las acciones prematuras o inadecuadas a las que podrlan verse expuestas. Prosiguiendo el desarrollo ontogenetico, sin embargo, la expresion de PSA-NCAM decae progresivamente hasta practicamente desaparecer de los tejidos adultos, en los que prevalecerla el potencial de la NCAM como estabilizador de los contactos celula-celula y mediador de senalizacion. No obstante, la polisialilacion de la NCAM persiste en los tejidos de origen neuroectodermico, especialmente en aquellos que mantienen plasticidad neuronal, asl como en tejidos no neurales, en los que el PSA actuarla como promotor de cambios en la position, forma o estado de activation de ciertos tipos celulares.
Mention aparte merece el intrincado papel desempenado por la NCAM y su grado de polisialilacion en tejidos tumorales de diverso origen, aspecto intensamente estudiado los ultimos anos y aun pendiente de dilucidarse por completo (Zecchini & Cavallaro, 2010, Adv Exp Med Biol 663:319-333). En este sentido, por ejemplo, es sabido que la expresion de NCAM por si misma reduce la agresividad tumoral de algunos tipos de cancer, mientras que en otros actua como un factor facilitador de la progresion tumoral. En otros, por el contrario, la transformation maligna cursa con la transition de la isoforma mas frecuente en los tejidos del adulto (120 kDa) a las embrionarias (140 y 180 kDa). Causa de todo ello es el gran espectro de funciones desempenadas por esta protelna en la celula (tambien en la tumoral) , que van desde el control de sus propiedades (anti) adhesivas hasta las de modulation del trafico de information con su entorno. Para mayor complejidad, el papel asignado a la polisialilacion de la NCAM resulta asimismo intrigante, pues mientras en algunos tipos tumorales reduce el crecimiento tumoral, en otros la propagation y agresividad corren parejas al grado de polisialilacion de la protelna (Seifert et al., 2012, Arch Biochem Biophys 524:56-63).
En base a las anteriores consideraciones, los trabajos que hemos realizado sobre la NCAM (Fernandez-Briera et al., 2010, Oncology 78:196-204) han contemplado siempre la valoracion en paralelo de su estado de polisialilacion, cautela que nos ha permitido advertir del riesgo de malinterpretar la biologla funcional de la protelna.
El procedimiento objeto de invention, en este sentido, es una estrategia disenada para facilitar la valoracion conjunta, en optimas condiciones de determination y al menor coste de la protelna NCAM y de su estado de polisialilacion.
Explicacion de la invencion
La presente invencion tiene por objeto la mejora de los analisis de expresion de PSA- NCAM en muestras biologicas disponibles en pequenas cantidades o de acceso restringido (como es el caso de las humanas, especialmente si son de origen hospitalario).
El procedimiento a seguir consiste en la valoracion inmunoqulmica con anticuerpos monoclonales especlficos sobre la misma muestra biologica, en sendos ensayos consecutivos de western-blot acoplados a detection por quimioluminiscencia, del nivel de expresion de la protelna NCAM y de su cola de acido polisialico, o viceversa, seguidos del preceptivo control de carga.
Este metodo proporciona un valor anadido en terminos de eficiencia a las modalidades habituales de analisis inmunoqulmico independiente de NCAM y PSA, ya que comporta la disminucion a la mitad del consumo de muestra por ensayo (tambien del resto de consumibles) , ahorra tiempo, limita la magnitud del error experimental al preservar similares condiciones fisicoqulmicas y de manipulation durante la valoracion de ambas moleculas y el mismo analisis permite conocer la expresion de la protelna y su estado de polisialilacion, una information vital sobre su estructura molecular y clave para desentranar su desempeno funcional.
Entre la extensa literatura concerniente al estudio de la expresion, estructura y funcion de la NCAM, abundan los estudios que omiten el analisis en paralelo de su estado de polisialilacion. Sin embargo, la trascendencia de este ultimo sobre la estructura y funcionalidad de la molecula esta firmemente respaldada desde que en 1983 se asociara por vez primera la polisialilacion con la NCAM de cerebro de raton (Finne et al., 1983, Biochem Biophys Res Commun 112:482-487). Tal es el caso que uno de los aspectos mas intrigantes de la NCAM es la aparente dualidad de biologla funcional entre su forma polisialilada y no polisialilada, ya que el repertorio de funciones desplegadas por la protelna depende de la presencia del PSA. As! las cosas, cumple conocer el estado de polisialilacion de la NCAM en cualquier estudio que verse sobre el papel biologico de esta protelna.
La invencion se refiere al diseno de un procedimiento para realizar la valoracion conjunta de la expresion de NCAM y PSA sobre una misma muestra biologica. El procedimiento consiste en la realization secuencial sobre esta muestra unica de dos ensayos inmunoqulmicos con los respectivos anticuerpos monoclonales especlficos, mediante sendos western-blots acoplados a deteccion por quimioluminiscencia, uno para la protelna y otro para su cola de PSA, seguidos del preceptivo control de carga. Para ello, tras el ensayo de la primera de las moleculas analizadas se retira de la membrana su sistema de inmunodeteccion mediante un lavado qulmico de borrado (o stripping) , que elimina las uniones reversibles de los anticuerpos y de sus sistemas de deteccion, quedando disponible la membrana de blot para iniciar el ensayo de la segunda molecula. Completado este ultimo y repitiendo un nuevo ciclo de borrado, puede realizarse el control de carga proteica que debe acompanar todo analisis mediante western-blot.
La razon de valorar PSA-NCAM sobre una misma muestra es mejorar el rendimiento de los estudios sobre la biologla molecular de esta protelna, especialmente cuando partan del uso de material selecto, como ocurre con el de origen humano por las restricciones de acceso que impone la legislation y/o por la habitualmente pequena entidad de los
especlmenes disponibles. La posibilidad, por tanto, de completar sobre un mismo material la valoracion de la expresion de la NCAM y de su cola de PSA hace de esta invention una mejora cuantitativa y cualitativa de la alternativa habitual de estudiar separadamente la protelna y su grado de polisialilacion. De un lado, disminuye a la mitad la necesidad de muestra biologica y abarata el ensayo al reducir en la misma medida el consumo de tiempo y de ciertos consumibles (tampones, membranas de western-blot, etc). De otro, mejora la calidad de los ensayos al preservar condiciones (fisicoqulmicas y de manipulation) mas homogeneas durante la valoracion de ambas moleculas, que disminuyen la probabilidad de posibles errores de medida y con ello la variabilidad de las determinaciones. Se implementa as! la calidad y, al duplicar la information obtenible de un solo procedimiento analltico, tambien el rendimiento de los ensayos.
Description de un modo de realization
Tratandose de la valoracion de una macromolecula proteica, el material biologico debe mantenerse congelado o ultracongelado (-20°C o -80°C, respectivamente) desde su obtencion hasta el momento del ensayo y a una temperatura dentro del intervalo de seguridad (0°-4°C) durante el transcurso de este. En caso de que el material tenga estructura celular, debera mantenerse bajo condiciones de inhibition de la actividad de las proteasas endogenas (mediante la adicion de algun coctel de inhibidores) desde la rotura de las celulas hasta obtener la preparation de muestra para el ensayo.
El procedimiento propuesto requiere el procesamiento del material de partida para la obtencion de una preparacion purificada o enriquecida en la protelna de interes, PSA- NCAM. Para ello es preciso homogeneizar el material biologico mediante una tecnica ajustada a la naturaleza (tejido solido, cultivo celular, etc) , tamano y propiedades mecanicas de este, hasta obtener un extracto crudo libre de celulas. Es generalmente aconsejable mejorar las condiciones de detectabilidad de la protelna (sea cual fuere la fuente biologica de la que se parta) procediendo a una (pre) purificacion de la NCAM mediante inmunoprecipitacion o alguna estrategia convencional de purification de protelnas. Con tal proposito se llevaran a cabo las centrifugaciones o separaciones pertinentes del extracto inicial para disponer de una preparacion (pre) purificada o bien de una fraction enriquecida en membrana citoplasmatica o en membranas celulares totales. Es admisible aplicar la presente invencion a fluidos biologicos (suero, semen, llquido cefalorraquldeo, etc) , para los cuales, en caso de que tambien resulte preciso elevar la concentration relativa del analito, debera adoptarse tras su recogida alguna estrategia de prefraccionamiento de la muestra.
Una vez obtenida la fraccion final o muestra para el ensayo, se le realizara la valoracion del contenido en protelnas totales por medio de un ensayo ad hoc. La cantidad de protelna total por ensayo depende de la concentracion relativa de PSA-NCAM en la fuente de partida, y debera ser estipulada para cada aplicacion concreta. En el caso poco favorable de tejidos diferenciados de origen no neural de adulto humano (como, por ejemplo, el tejido colorrectal sano y tumoral empleado para el diseno de esta invencion) , se ha precisado generalmente una cantidad en torno a los 30-60 microgramos.
Tras los pasos anteriores, se inicia el procedimiento con la separation de las protelnas de la muestra mediante una electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) en condiciones estandar (Laemli, 1970, Nature 227:680-685) y acto seguido la electrotransferencia humeda de las protelnas separadas en el gel a una membrana PVDF (polifluoruro de vinilideno) o equivalente de western-blot.
Para continuar el protocolo formal deben conocerse con antelacion las concentraciones optimas de los anticuerpos monoclonales primarios contra ambas moleculas (NCAM y PSA) , asi como de los anticuerpos secundarios, de modo que el sandwich de cada inmunoensayo rinda resultados evaluables con el mmimo consumo de estos reactivos. A los valores optimos de anticuerpo debe llegarse mediante sendas titulaciones previas. Una vez conocidos dichos valores, puede comenzarse con el primer inmunoensayo espedfico (resulta indiferente que se trate de NCAM o de PSA). Las condiciones de ejecucion (medio de bloqueo, tiempo y temperatura de incubacion de los anticuerpos primario y secundario, etc) y revelado por quimioluminiscencia (lavados, tiempo de exposicion, etc) deberan ajustarse para cada tipo de muestra mediante ensayos de puesta a punto.
Una vez completada la documentation de la membrana revelada para el primer epitopo, se procede a su borrado o stripping mediante sendos lavados de 15 min a temperatura ambiente con una disolucion acida (pH 2.2) a base de glicina al 1% (p/v) , SDS al 0.1% (v/v) y el detergente Tween-20 al 1% (v/v). Completado el borrado, se elimina la solution por medio de dos lavados iniciales de 10 min con PBS y otros dos posteriores de 5 min con TBST (TBS y Tween-20 al 1%, v/v). Esta composition de la solucion de borrado se muestra eficaz en la elimination de las uniones reversibles de los anticuerpos y, sin embargo, respetuosa con las protemas de la muestra fijadas a la membrana. A continuacion se bloquea de nuevo la membrana y se procede con el segundo sandwich de inmunodeteccion.
Los resultados de western-blot resultan homologables, y susceptibles de ser utilizados en comparaciones de niveles de expresion entre muestras o grupos de muestras, si i) incorporan controles de carga proteica en el gel y ii) contemplan la realization de controles negativos de tincion.
Los primeros pueden llevarse a cabo sobre la membrana de blot en uso realizandole, tras el revelado y documentacion del segundo inmunoensayo, un nuevo borrado con solucion acida de glicina, en condiciones similares a las descritas. Una vez eliminado el complejo anticuerpo 1°-2°-sistema de detection, la membrana queda lista para el bloqueo e incubacion con el anticuerpo espedfico contra la protema de carga elegida y proceder a su revelado y documentacion posterior.
Para la realizacion de los controles negativos puede operarse de modo similar a la valoracion secuencial de NCAM y PSA, esto es, desarrollar el mismo protocolo formal pero substituyendo el anticuerpo monoclonal primario por solucion de bloqueo.
Resulta imprescindible mantener humeda la membrana en todo momento del proceso para obtener resultados satisfactorios. Es asimismo aconsejable someter finalmente la membrana a un proceso de tincion de protemas por algun procedimiento convencional (1 min en presencia de una solucion de azul brillante de Coomassie al 0.1%, p/v, metanol al 20%, v/v, y acido acetico al 10%, v/v, por ejemplo) , con la doble finalidad de comprobar el respeto del stripping por el bandeado proteico de la membrana y utilizar este ultimo como comprobante de la eficiencia de la transferencia y como control de carga de protema total, option mas representativa del conjunto de protemas de la muestra (Aidridge et al., 2008, J Neurosci Meth 172:250-254; Welinder & Ekblad, 2011, J Proteome Res 10:14161419).
La completion del protocolo formal descrito facilita, gracias al analisis seriado de una unica muestra, la valoracion completa de la molecula PSA-NCAM. Su incorporation a los estudios sobre la biologia molecular de esta protema ahorra muestra biologica, recursos y tiempo de ensayo, ademas de proporcionar resultados homologables tanto de expresion 5 de la protema como de su grado de polisialilacion.
La invention se refiere al procedimiento de analisis consistente en la concatenation de tres inmunoensayos consecutivos alternados con dos etapas de borrado o stripping de la membrana, cuya implementation comporta las ventajas referidas en el parrafo 10 precedente. No resultan objeto de la invention los protocolos de los inmunoensayos o del stripping, los procedimientos de obtencion y procesamiento de la muestra, como tampoco el resto de reactivos o procesos necesarios para la realization de los western-blots.
