Uso de la metformina y derivados con actividad como inductores de la fosforilación de 5 AMPK para el tratamiento de la fibromialgia
OBJETO DE LA INVENCiÓN
La presente invención tiene por objeto el uso de la metformina, derivados de la metformina y compuestos que contengan metformina con actividad como inductores de la activación de la fosforilación de AMPK para el tratamiento de la fibromialgia, reduciendo el dolor y depresión, así como parámetros biológicos disfuncionales. El principal sector de aplicación es el farmacéutico y médico, mediante el desarrollo de comprimidos a dosis menores de las actuales para estos pacientes.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La fibramialgia es un sindrame de dolor crónico generalizado acompa~ado de otras síntomas como la depresión·, ansiedad, fatiga o alteraciones del sueño. Su diagnóstico se realiza a partir de los criterios de clasificación establecidos por el Colegio Americano de Reumatologia (ACR) (Wolfe et aL , 1990) y no presenta alteraciones bioquímicas en ninguna prueba diagnóstica de rutina (Yunus et aL, 1981) , por lo que surge la necesidad de encontrar nuevos marcadores diagnósticos de la enfermedad. La prevalencia de la fibromialgia en los paises industrializados oscila entre el 2% y el 4% en la pOblación siendo 11 veces más frecuente en las mujeres que en los hombres (Lawrence et aL , 2008) , sin embargo los mecanismos etiopatogénicos de la enfermedad son aún desconocidos.
En los últimos años, nuevas investigaciones han aportado importantes datos para entender los mecanismos fisiopatológicos de la fibromialgia. Se ha determinado que diversas alteraciones en el metabolismo, transporte y recaptación de la serotonina (Cordero et aL, 2011) , así como en las citoquinas inflamatorias podrían tener un papel en la patogénesis de la fibromialgia (Cordero et aL, 2013) . Ningún medicamento ha mostrado una alta eficacia en el control de todos los síntomas de la fibromialgia, siendo una combinación racional e individualizada de fármacos el tratamiento más adecuado de está enfermedad. La medicación más usada en la actualidad para aliviar la sintomatología de la fibromialgia incluye analgésicos, ansiolíticos, antidepresivos tricíclicos y de otros tipos,
relajantes musculares, inhibidores duales de la recaptación de serotonina y noradrenalina, inductores del sueno no benzodiaceplnicos, modificadores del metabolismo de la dopamina, etc. No obstante, aunque existe un amplio numero de fármacos de prescripción destinados a aliviar los síntomas de la fibromialgia estos solo son altamente efectivos en un porcentaje bajo de los pacientes (alrededor del 20% de estos mejoran considerablemente) , pero acompañados de numerosos efecto secundarios.
Desarrollar un nuevo fármaco puede llevar enlre 10 Y 17 años con un coste superior a los 800 millones de euros. Una vía más rápida para encontrar nuevos tratamientos contra una enfermedad consiste en descubrir potenciales nuevas funciones en viejos fármacos ya autorizados para otras enfermedades. Es el caso de la metformina, uno de los anlidiabéticos más populares. La presente invención está basada en una nueva indicación para este viejo fármaco. La fibromialgia presenta una serie de características biológicas como estrés oxidativo, bajos niveles de ATP, disfunción mitocondrial, inflamación, baja biogénesis milocondrial, y baja expresión de AMPK asociados a síntomas clínicos como el dolor, la fatiga, la depresión (Cordero el al., 2013a, 2013b) . Todas las alteraciones descritas en la fibromialgia han sido restauradas mediante el tratamiento con metformina en células mononucleares y fibroblastos de pacientes con fibromialgia. Además, la metformina ha demostrado un fuerte efecto analgésico en otras patologías de dolor crónico como el dolor neuropálico (Russe et al., 2013) o la adiposis dolorosa (Labuzek el al., 2013) . A ese re~~pecto, nosotros hemos podido comprobar que tras la inhibición de AMPK mediante compuesto C (un inhibidor específico de la activación de AMPK) en ratones, estos presentaban slntomas propios de la frbromialgia como el dolor O la depresión. Estos animales, tras el tratamiento con metformina mostraron una recuperación en los síntomas (Ver figuras) .
Por otro lado, otro de los parámetros encontrados en pacientes con fibromialgia es la activación del complejo inflamasoma (Conjero el aL, 2013c) el cual, está relacionado con el dolor en ralones Irás la inhibición de AMPK (Ver figuras) . El inflamasoma es un grupo de protelnas que participan en el sistema de detección y erradicación intracelular, siendo un aspecto fundamental del sistema inmune innato. Los modelos animales relacionados con alteraciones moleculares del complejo inflamasoma son modelos genéticos y no existen referencias sobre su relación con el dolor generalizado. La metformina ha demostrado una inhibición del inflamasoma en las células de pacientes con fibromialgia así como en los ratonas con AMPK inhibido.
Por tanto, la metformina actúa activando el AMPK con las consecuentes reducciones de estrés oxidativo, disfunción mitocondrial e inflamación, asl como activación de la slntesis de ATP y biogénesis mitocondrial en la fibromialgia, y controlando los s[ntomas asociados a la fibromialgia. EN la actualidad, se han descrito nuevas funciones de la metformina, gracias a estas habilidades, que han servido para el tratamiento de otras patologías dilerentes a la Diabetes tipo 11, como el slndrome metabólico (WO/2013/159190) , Distrofia Miotónica tipo 1 (20130085169) , enlenmedades autoinmunes (1020130031229) , Cáncer (20120220664) .
Es de gran importancia el hecho do que la metformina sea una droga que ya está comercializada, ya que ha pasado la fase 1cHnica satisfactoriamente y ha sido aprobada para su uso en humanos por su seguridad. Por tanto, si se decidiera utilizarla para otra indicación terapéutica, se conseguiría alcé:lnzar la fase c1fnica de desarrollo en un tiempo mucho más corto que los modeJos tradicionales basados en nuevas entidades químicas de largo desarrollo preclinico. Nosotros proponemos utilizar la metformina como fármaco para la fibromialgia permitiendo, según nuestros datos, su uso a dosis reducidas respecto a su uso en la Diabetes tipo 11 .
La metformina cuenta con una amplia variedad de formas en venta que han demsotrado seguridad en los pacientes: COMPETACT Comp. recub. con película 15 mg/850 mg DIANBEN Comp. recub. con pelíCUla 850 rng DIANBEN Polvo para sol. en sobres 850 I1Ig DIANBEN Polvo para sol. oral en sobres 1000 mg EFFICIB Comp. recub. 50 mg/l000 mg EUCREAS Comp. recub. con pelícUla 50 mg/l000 mg EUCREAS Comp. recub. con película 50 mg/850 mg GLUBRAVA Comp. recub. con película 15 mg/850 mg ICANDRA Comp. recub. con película 50/1000 mg ICANDRA Comp. recub. con película 50/850 mg JANUMET Comp. recub. con pellcula 50 ", g/1000 mg JENTADUETO Comp. recub. con película 2, 5/850 mg KOMBOGL YZE Comp. recub. con pellcula. 2, 5/1000 mg KOMBOGL YZE Comp. recub. con película. 2, 5/850 mg METFORMINA ACTAVIS Comp. recub. ccn pellcula 850 mg METFORMINAADLER-APOTHEKE Comp. recub. con película 1000 mg METFORMINA ADLER-APOTHEKE Comp. recub. con pelicula 850 mg METFORMINA ALDO-UNION Comp. recub. con pelicula 850 mg
METFORMINA ALMUS EFG Comp. recub. con película 850 mg METFORMINA APOTEX Comp. recub. COI1 película 850 mg METFORMINA AUROBINDO Comp. recub. con película 850 mg METFORMINA BLUEFISH Comp. recub. con pellcula 850 mg
METFORMINA CINFA EFG Comp. recub. con película 850 mg METFORMINA COMBIX Comp. recub. con película 850 mg METFORMINA DAVUR Comp. recub. con pellcula 850 mg METFORMINA DRAGENOPHARM Comp. recub. con película 1000 mg METFORMINA DRAGENOPHARM Comp. recub. con pelicula 850 mg
METFORMINA EDIGEN Comp. recub. con pelicula 850 mg METFORMINA KERN PHARMA Comp. recub. con pellcula 1000 mg METFORMINA KERN PHARMA EFG Comp. recub. con película 850 mg METFORMINA MYLAN Comp. recub. con película 1000 mg METFORMINA MYLAN Comp. recub. con película 850 mg
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DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Niveles de síntesis de ATP intracelular en células mononucleares de sangre (BMCs) de pacientes con fibromialgia tras el tratamiento con metformina Figura 2: Niveles de producción de radicales libre de oxígeno (ROS) en BMCs de pacientes con fibromialgia tras el tratamiento con metformina.
Figura 3: Niveles séricos de IL-1~ (a) e IL-18 (b) en sobrenadantes de las células de 20 pacientes tratadas con metformina (pg/ml) .
Figura 4: Nieveles de protección de la metformina tras la exposición de fibroblastos de pacientes con fibromialgia a peróxido de hidrógeno. %muerte celular.
Figura 5: Niveles de síntesis de ATP intracelular en células mononucleares de sangre (BMCs) del modelo experimental por inhibición de la fosforilación de AMPK tras el 25 tratamiento con metformina Figura 6: Niveles de citrato sintasa (masa mitocondrial) en el modelo experimental por inhibición de la fosforilación de AMPK (Actividad enzimática) y tras el tratamiento con metformina.
Figura 7: Niveles séricos de peroxidación lipidica como marcador de estrés oxidativo en 30 el modelo experimental por inhibición del AMPK y tratamiento con metformina (nMol/ml) .
Figura 8: Niveles séricos de IL-1~ (a) e IL-18 (b) en sueros de ratones a los que se les inhibió la fosforilación de AMPK y tras el tratamiento con metofibromialgiairna (pg/ml) .
Figura 9: Evaluación nociceptiva del modelo (latencia en segundos) . Porcentaje de animales con dolor.
Figura 10: Evaluación de depresión (tiempo de inmovilidad, segundos) . Porcentaje de animales con síntoma.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
La fibromialgia es una enfermedad caracterizada por dolor crónico de gran prevalencia siendo casi un 5% de la población mundial (Lawrence et aL, 2008) . El estudio de los mecanismos moleculares del dolor, y más concretamente de la fibromialgia constituye uno de los retos de la ciencia, y por tanto para la industria farmacéutica en su misión de desarrollar fármacos cada vez más eficaces para su abordaje. Mediante los estudios en muestras biológicas procedentes de pacientes con fibromialgia, se han demostrado numerosas alteraciones asociadas a la fisiopatología de la fibromialgia como ya hemos descrito. La metformina ha demostrado un importante potencial para la restauración de estas alteraciones, siendo por ello objeto de nuevas funciones en otras patologías por las que ha generado patentes, enumeradas en el apartado anterior.
Nuestra invención ofrece un nuevo uso de un fármaco ya conocido, que ha pasado las fases clínicas que demuestras su seguridad, y que a dosis reducidas respecto a las de uso en la Diabetes tipo 11 que ofrecen nuevo y efectivo tratamiento para la fibromialgia. Su puesta en el mercado sería en poco tiempo a que solo habría que preparar comprimidos de menor dosis, y su efectividad en cuanto al dolor para la fibromialgia viene acompañada de la mejora de otros slntomas, eliminando aquellos efecto secundarios adscritos a los tratamientos comunes a la fibromialgia y con baja efectividad como el estrés oxidativo o la disfunción mitocondrial. Además, la metformina y compuestos inductores de AMPK son moléculas pequE!naS, lo que le confieren caracterlsticas idóneas para su conjugación en vehículos como nanopartículas o liposomas de cara a su direccionamiento a diferentes tejidos. Por otro lado. podrlan ser aplicadas mediante inyectables en pacientes con dificultades digestivas. La metformina es además, una molécula pequena 10 que es Idóneo para el desarrollo de fármacos a partir de metformina con otras moléculas que ayuden a la mejora de su función en la patologia como antioxidantes o aminoácidos que potencien su efecto, así como coadyuvantes que mejoren la disponibilidad biológica del princIpio activo.
La metformina ha demostrado su seguridad en pacientes con diabetes mellitus tipo 11, asl como nuevas funciones que se están desarrollando en la actualidad, por su efecto en la activación del metabolismo, vla AMPK, induciendo la baja de peso del paciente. Su mlnima dosis de uso es un comprimido al dla de alguna de sus formas comerciales que son 850mg o 1000mg. En nuestros estudios hemos comprobado que a niveles por debajo de la dosis de uso normal, la efectividad es significativa. Este efecto puede ser extrapolable a cualquier composición que contenga metformina, asl como inductores de la tostorilación de AMPK, siendo esle, el eje cenlral del mecanismo terapéutico de la metformina y compuestos inductores de AMPK en la fibromialgia.
Para estudiar el papel de la fosforilación de AMPK en pacientes con fibromialgia, se indujo la activación de AMPK en BMes de 20 pacientes con metformina, un potente estimulador de AMPK. Después de este tratamiento, en las BMes de los pacientes se mostrÓ una recuperación importante de los niveles de ATP (Figura 1) y una disminución de ROS mitocondrial (Figura 2) e interleuquinas del inflamasoma IL-1¡3 and IL-18 (Figura 3) , ambas alteraciones comunes que normalmente se encuentran en el BMCs de los pacientes con fibromialgia (Cordero et aL , 2013b) . Por otro lado, la metformina proporciona un efecto protector a las células de pacientes con fibromialgia sometidas a factores estresantes como el estrés oxidativo. Fibroblastos de pacientes con fibromialgia muestran un incremento de la muerte celular al ser sometidas a bajas dosis de peróxido de hidrógeno, mientras que al ser cometidas al mismo y añadiendo metformina, la muerte celular era reducida importantemente (Figura 4) .
La metformina ha demostrado también tener un efecto en los slntomas inducidos por la deficiencia de la activación de AMPK. Para ello, un modelo ha sido desarrollado en ratones no cosanguineos de la cepa Swiss de 2-3 meses de edad, mediante la inducción 25 de una deficiencia de la activación de AMPK por administración de compuesto e - (6-[4 (2-Piperidin-1-II-etoxi) -fenil) ]-3-piridin-4-il-pirazol (1, 5-a) pirimldina" un potente inhibidor de la fosforilación del AMPK. Los ratones inyectados intraperitonealmente 1 veces al días, siendo la dosis final diaria de 20 mg/Kg/día. Otro grupo de ratones recibió el tratamiento de compuesto e además de metformina. El tratamiento se realiza hasta el día del
sacrificio de los animales. La inhibición de AMPK indujo en los ratones alteraciones propias de la fibromialgia que fueron restauradas por la metformina como déficit de ATP (Figura 5) y citrato sintasa (masa mitocondrial) (Figura 6) , peroxidaciÓn lipldica (Figura 7) , así como activación de las interleuquinas del inflamasoma IL-1¡3 and IL-18 (Figura 8) .
Tras los cinco primero días de administración de compuesto C, se realizaron 35 determinaciones conducluales para evaluar los síntomas. El test de placa caliente muestra una disminución de la latencia de respuesta al estimulo térmico tanto a temperaturas no dolorosas (p<500e) como dolorosa (p>500e) , lo cual refleja alodinia e hiperalgesia respectivamente un incrernento de dolor en los ratones tratados con compoound c (Figura 9) . Otro síntoma élsociado con el dolor en la fibra mialgia es la depresión. Ratones tratados con compuesto e, además de mostrar dolor generalizado, al ser evaluados mostraron depresión, usando la prueba de suspensión de la cola, mostraron mayor parálisis a lo largo de la prueba, un rasgo que se considera refleja depresión (Figura 10) .
MODO DE REALIZACI6N DE LA INVENGI6N
Con el fin de evaluar el efecto de la metformina en modelos in vitro de fibromialgia, usaremos células mononucleares aisladas; de pacientes con fibromialgia y mantenidas en condiciones de cultivo, con medio RPMI al 10% de suero y 5% de CO2. Paralelamente, se usaran fibroblastos de piel, aislados de pacientes con fibromialgia y mantenidos en cultivo con medio DMEN al 20% de suero y 5% de CO2. Estos cultivos nos permitirán evaluar la toxicidad de diferentes dosis de metformina y compuestos inductores de la fosforilación de AMPK mediante la cuantificación de apotosis y crecimiento celular por conteo de nucleos de células vivas. Una vez encontrada la dosis idónea de trabajo, por debajo de 5mM, podremos cuantificar la protección frente a estímulos estresantes con el efecto de peróxido de hidrógenos, un radical libre muy potente. Por citometria de flujo, se evaluara la producción de ROS antes y después del tratamiento por debajo de 5mM. Otros parámetros a esas dosis a cuantificar serán el ATP, mediante luminometría, citrato sintasa como marcador de masa mitocondrial, mediante espectrofotometria de cinética enzimática, interleuquinas inflamatorias mediante ELlSA.
Con el fin de seguir el efecto de la metformina en un modelo in vivo de déficit de AMPK, usaremos ratones a los que se les administrará compuesto C, un inhibidor específico de la fosforilación de AMPK, en el tiempo, y se realizará una caracterización conductual de los ratones una semana antes de comenzar las administraciones de compuesto e, así como 7. días después de la primera administración. Este diseño experimental nos dará una visión de cómo la metformina inhibe los efectos inducidos por el déficit de AMPK y su influencia en la conducta de los ratones, siguiendo con espedal interés las pruebas que delaten una alteración de la nocicepción (hot plate. dolor visceral [J Neurochem (2007) 103:2629-39) y dolor muscular [J Neurosc; (2007) 27:10000-6) ) . Antes de comenzar la administración de compuesto e y metformina y posteriormente a las pruebas de conducta dolorosa se complementarán con otros test conductuales que denoten otros slntomas que presentan los enfermos de fibromialgia:
Test de depresión: Suspensión por el rabo, natación forzada.
Tras acabar el tratamiento con compuesto e y metformina, los ratones serán sacrificados y se obtendrán:
Sangre: La sangre será el punto de partida para obtener suero o bien aislar leucocitos. En el suero se realizarán medidas de glucClsa, triglicéridos, colesterol, lactato, protelnas, potencial redox, protelna oxidada, etc. En los leucocitos se medirá ATP, interleuquinas inflamatorias, estrés oxidativo, masa mitocondrial.
Músculo esquelético estriado: En las necrosias de músculo se realizarán mediciones de ATP, interleuquinas inflamatorias, actividades mitocondriales, actividad citocromo c oxidasa y morfologla y número de mitocondrias.
En pacientes, es posible el uso para evaluar sus efectos en la fibromialgia mediante dosis por debajo de su uso en la diabetes. La evaluación del paciente antes y después del tratamiento con metformina de 200 a 400 mg diarios sería posible mediante test de impacto de la fibromialgia, escalas visuales de dolor, test de depresión de Beck, etc.
