Metodo de diagnostico y pronostico de melanoma cutaneo CAMPO TECNICO DE LA INVENCION
La presente invention se encuadra, en general, dentro del campo de diagnostico y pronostico de enfermedades; en particular, con el diagnostico y pronostico de melanoma cutaneo y con el diagnostico diferencial entre melanoma cutaneo y una lesion cutanea no tumoral.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El melanoma maligno representa la mayor causa de mortalidad asociada al cancer de piel y su incidencia esta incrementando en los ultimos anos, especialmente entre la poblacion de raza blanca y piel clara, diagnosticandose en el mundo 160.000 nuevos casos al ano.
Las alteraciones moleculares implicadas en la patogenia del melanoma maligno se encuentran en constante estudio, lo que ha permitido determinar alteraciones geneticas que afectan a genes reparadores del ADN, oncogenes y genes supresores de tumores, ademas de genes implicados en las rutas de pigmentation. Sin embargo, estos avances siguen siendo insuficientes para establecer marcadores biologicos y dianas moleculares que faciliten un diagnostico precoz y permitan desarrollar terapias mas eficaces frente a esta neoplasia.
Se conocen diversos marcadores tumorales de melanoma, entre ellos LDH serica, 5- S-CD, S-100P y MIA (Garbe C. et al Cancer. 2003 Apr 1;97 (7) :1737-45). Sin embargo, ninguno de estos marcadores tumorales da resultados positivos a menos que el melanoma este en fase muy avanzada, tal como el estadio IV.
El tumor primario de un melanoma maligno tiene un comportamiento biologico donde se distinguen dos fases de crecimiento. La primera fase se denomina de crecimiento radial (FCR) , porque los melanocitos proliferan intraepidermicamente. La FCR puede durar meses o anos, hasta que el tumor adquiere la capacidad de invadir la dermis, comenzando asi lo que se denomina la fase de crecimiento vertical (FCV). La FCV implica mal pronostico, dado que la infiltration de las celulas neoplasicas a las capas
inferiores de la piel posibilita su diseminacion a traves de los vasos linfaticos a los ganglios linfaticos o, a traves de los vasos sangumeos a cualquier organo donde las celulas tumorales pueden proliferar con exito generando metastasis.
En la actualidad la posibilidad de curacion del melanoma esta estrechamente ligada a la precocidad del diagnostico y extirpation quirurgica del tumor. As^ en la actualidad, el pronostico de la enfermedad se basa fundamentalmente en la evaluation histologica de las biopsias y el tamano de las lesiones cutaneas. Aproximadamente el 70% de los pacientes con melanoma son diagnosticados en estadios tempranos de la enfermedad (estadios I y II segun la clasificacion AJCC AJCC; Melanoma Staging Database, 2008) , y se les considera pacientes de "bajo riesgo" por su elevada probabilidad de curacion mediante la cirugia. Sin embargo, para los casos de melanoma metastasico todavia no existen metodos diagnosticos ni terapias eficaces capaces de mejorar la supervivencia de los pacientes.
La probabilidad de supervivencia de los pacientes con melanoma se relaciona con la ausencia de afectacion ganglionar y de metastasis. La prueba del ganglio centinela (que consiste en la detection de celulas tumorales en la cadena de nodulos linfaticos mas proxima al tumor) se ha convertido en un poderoso marcador pronostico para determinar la supervivencia de los pacientes con melanoma maligno cutaneo con lesiones de un tamano entre 1 y 4 mm.
La mortalidad detectada en los estadios tempranos de la progresion tumoral puede deberse, a menos en parte, a que a los pacientes con lesiones menores de 1 mm no se les realiza la biopsia del ganglio centinela. Por otro lado, un resultado negativo en la biopsia del ganglio centinela no excluye de la posibilidad de desarrollar una metastasis. De hecho, aproximadamente un 10% de los pacientes con ganglio centinela negativo desarrollan metastasis
Los unicos marcadores pronosticos utilizados en clmica hasta la fecha son los recogidos en el sistema de estadificacion de la AJCC (American Join Committee of Cancer) que se basa en la clasificacion TNM (Tumor, Ganglios linfaticos afectados y Metastasis).
En la actualidad, y a diferencia de otros tumores como el carcinoma de colon o el de mama y pulmon, no se ha demostrado ningun marcador molecular que sea de utilidad
en la practica clmica ya que no permiten predecir el riesgo en estadios tempranos (AJCC estadio I a III).
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos metodos de diagnostico de melanoma y de metodos para determinar la probabilidad de que un sujeto con melanoma desarrolle metastasis, de manera que pueda aplicarse un tratamiento adicional a la extirpacion quirurgica del tumor, en caso de que las celulas tumorales hayan adquirido ya el fenotipo invasivo.
COMPENDIO DE LA INVENCION
En un primer aspecto, la invencion se refiere a metodo in vitro para diagnosticar melanoma cutaneo que comprende:
a) determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1 y sus combinaciones en una muestra de un sujeto, y
b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador, en donde un nivel de expresion aumentado de BCL3 y/o un nivel de expresion disminuido de PIR y/o PEBP1 con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicho sujeto padece un melanoma cutaneo.
En otro aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para determinar la probabilidad de metastasis en un sujeto diagnosticado con melanoma cutaneo que comprende:
a) determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por M-MITF, PIR, BCL2 y sus combinaciones en una muestra obtenida de un sujeto, y
b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador, en donde un nivel de expresion disminuido de M-MITF, PIR y/o BCL2 con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicho sujeto tiene alta probabilidad de desarrollar metastasis.
En otro aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para diferenciar nevus benigno de melanoma en una lesion cutanea que comprende:
a) determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1 y sus combinaciones en una muestra de tejido de dicha lesion cutanea, y
b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador, en donde un nivel de expresion aumentado de BCL3 y/o un nivel de expresion disminuido de PIR y/o PEBP1 con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicha lesion cutanea es melanoma.
En otro aspecto, la invention se relaciona con un kit que comprende un reactivo capaz de determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1, M-MITF, BCL2 y sus combinaciones.
En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de un kit de la invencion para diagnosticar melanoma cutaneo, para determinar la probabilidad de metastasis de un sujeto diagnosticado con melanoma cutaneo o para diferenciar un nevus benigno de melanoma.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. Expresion relativa del gen PIR en lmeas de melanoma y cultivos primarios de melanocitos. Todas las lmeas de melanoma analizadas muestran una reduction significativa de los niveles de expresion de PIR con respecto a los cultivos primarios de los melanocitos. La media de expresion de PIR en los cultivos primarios de los melanocitos es de 134 y se indica en la grafica con una lmea de puntos discontinua. El porcentaje (%) de expresion es de al menos un 75% menos respecto a los melanocitos.
Figura 2. Expresion relativa del gen PEBP1 en lmeas celulares de melanoma y cultivos primarios de melanocitos. La cuantificacion de la expresion genica mediante RT-qPCR muestra un silenciamiento del gen PEBP1 en todas las lmeas de melanoma analizadas con respecto a los cultivos primarios de los melanocitos. La media de expresion de PEBP1 en cultivos primarios de los melanocitos es de 20, 9 y se indica en la grafica con una lmea de puntos discontinua. El % de expresion es de al menos un 75% menos respecto a los melanocitos.
Figura 3. Expresion relativa del gen BCL3 en lmeas de melanoma y cultivos primarios de melanocitos. Las lmeas de melanoma analizadas muestran una sobreexpresion estad^sticamente significativa del gen BCL3 en relacion a los niveles encontrados en los cultivos primarios de los melanocitos. La media de expresion de BCL3 en los cultivos primarios de los melanocitos es de 1, 1 y se indica en la grafica con una lmea de puntos discontinua. El % de expresion es de al menos un 75% mas que los melanocitos.
Figura 4.Expresion relativa de M-MITF en lmeas de melanoma y cultivos primarios de melanocitos. Las lmeas con fenotipo invasivo de melanoma A375, Hs294T, HT-144, 1205Lu, WM793B, JSG y RPMI7951 muestran una reduction significativa de M-MITF, mientras que las lmeas con fetopito proliferativo MEL-HO, MEL-Juso y COLO-800 presenta niveles de ARNm transcritos a partir de este gen similares a los encontrados en los cultivos primarios de los melanocitos. La media de expresion de M-MITF en los cultivos primarios de los melanocitos es de 356, 1 y se indica en la grafica con una lmea de puntos discontinua. El % de expresion en las lmeas invasivas es de al menos un 90% menos respecto a los melanocitos normales y los melanomas no invasivos.
Figura 5. Expresion relativa del gen BCL2 en lmeas de melanoma y cultivos primarios de melanocitos. Las lmeas de melanoma con capacidad invasiva A375, Hs294T, HT- 144, 1205Lu, WM793B, JSG y RPMI7951 muestran una reduccion del gen BCL2 estadisticamente significativa, mientras que las lmeas no invasivas MEL-HO, MEL- Juso y COLO-800 presenta niveles de ARNm para este gen similares a los encontrados en los cultivos primarios de los melanocitos. La media de expresion del gen BCL2 en los cultivos primarios de los melanocitos es de 16, 8 y se indica en la grafica con una lmea de puntos discontinua. El % de expresion en las lmeas invasivas es de al menos un 90% menos respecto a los melanocitos normales y los melanomas no invasivos (senalados dentro de la caja).
Figure 6. Distribution de las lmeas de melanoma y los cultivos primarios de melanocitos analizados en un diagrama de los componentes mediante rotation ortogonal Varimax. Para el analisis de los componentes principales se han incluido los niveles proteicos obtenidos y los niveles de expresion genica obtenidos mediante RT- qPCR.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Los autores de la presente invention han identificado unos nuevos marcadores, concretamente el aumento de expresion de BCL3 y la disminucion de la expresion de PIR y PEBP1, como marcadores para el diagnostico de melanoma cutaneo. Asimismo, han identificado la diminution o ausencia de expresion de PIR, M-MITF, BCL2 y sus combinaciones como marcador de pronostico de melanoma cutaneo ya que permite identificar los melanomas cutaneos con capacidad invasiva.
Metodos de la invencion
En un aspecto la invencion se relaciona con un metodo in vitro para diagnosticar melanoma cutaneo (en adelante, "primer metodo de la invencion") que comprende:
a) determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1 y sus combinaciones en una muestra de un sujeto, y
b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador, en donde un nivel de expresion aumentado de BCL3 y/o un nivel de expresion disminuido de PIR y/o PEBP1 con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicho sujeto padece un melanoma cutaneo.
El termino "diagnosticar" tal y como se usa en la presente invencion se entiende por el procedimiento por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosologica, patologia o smdrome, a partir de unos indicadores, parametros o smtomas.
Por "melanoma cutaneo" segun se emplea en la presente invencion, se refiere a un tumor que surge en la piel a partir de celulas denominadas melanocitos. Estas celulas se originan en la cresta neural en el desarrollo embriologico y migran hacia la piel, los ojos, el sistema nervioso central y hacia otras partes del organismo durante la vida fetal. Estos tumores aparecen predominantemente en la cubierta cutanea, pero pueden tambien presentarse en las mucosas, en las capas pigmentadas del globo ocular, etc. El sitio mas comun en los hombres es en el torso (pecho y espalda). En las mujeres, las piernas son la parte donde se presentan con mas frecuencia. El cuello y el rostro son otros sitios comunes. El melanoma presenta una etapa de crecimiento radial, correspondiente al estadio temprano de la enfermedad, donde las celulas inicialmente se encuentran confinadas a la epidermis; o bien, invaden en forma local a
la dermis papilar, microinvasion representada desde el punto de vista clmico, por un nodulo tumoral franco. Esta etapa es llamada estadio nodular. No siempre estos nodulos se hacen clmicamente visibles, a pesar de compartir criterios histologicos de crecimiento vertical. De acuerdo con la Organization Mundial de la Salud el melanoma puede ser melanoma in situ, lentigo maligno, extensivo superficial, nodular, fusocelular, nevoide, spitzoide, desmoplasico, neurotropo, con diferenciacion neural, regresivo, de celulas balonizadas, celulas en anillo de sello y rabdoide.
En otro aspecto la invention se relaciona con un metodo in vitro para determinar la probabilidad de metastasis en un sujeto diagnosticado con melanoma cutaneo (en adelante, "segundo metodo de la invencion") que comprende:
a) determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por M-MITF, PIR, BCL2 y sus combinaciones en una muestra obtenida de un sujeto, y
b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador, en donde un nivel de expresion disminuido de M-MITF, PIR, y/o BCL2 con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicho sujeto tiene alta probabilidad de desarrollar metastasis.
Por "probabilidad de desarrollar metastasis" tal y como se emplea en la presente invencion, se refiere a asignar una probabilidad de que las celulas tumorales puedan diseminarse y formar metastasis en un sujeto que padece un melanoma cutaneo. Esta asignacion tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadisticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadistica puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadisticas, e.g., mediante la determination de intervalos de confianza, determination del p-valor, test de Student, funciones discriminantes de Fisher, etc. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el p-valor es menor de 0, 1, de 0, 05, de 0, 01, de 0, 005 o de 0, 0001.
En otro aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para diferenciar nevus benigno de melanoma en una lesion cutanea (en adelante, "tercer metodo de la invencion") que comprende:
a) determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1 y sus combinaciones en una muestra de tejido de dicha lesion cutanea, y
b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador, en donde un nivel de expresion aumentado de BCL3 y/o un nivel de expresion disminuido de PIR y/o PEBP1 con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicha lesion cutanea es melanoma.
Por "nevus benigno", tal y como se usa en la presente invencion, se entiende una proliferacion de distintos tipos de celulas en la piel.
En una realizacion particular el nevus benigno es una lesion amelanotica benigna, un nevi o una lesion premaligna (nevus displasico y nevus de Spitz).
Por "lesion amelanotica" tal y como se usa en la presente invencion se entiende una alteracion de la piel que carece de pigmento melanico.
Por "nevi" tal y como se usa en la presente invencion se refiere a pequenas manchas pigmentada en la piel, de bordes definidos y coloracion homogenea parda o marron claro, constituida por un acumulo de celulas nevicas con melanina. Los nevi son proliferaciones cutaneas de uno o mas componentes normales cutaneos que puede estar presente el nacimiento o aparecer posteriormente. La forma mas frecuente son los nevus melanociticos pero existen otros tipos de nevus incluyendo el nevus epidermico, sebaceo, conectivos y vascular. El nevus melanodtico -lunar- es una lesion que se caracteriza por la proliferacion clonal de melanocitos (celulas nevicas) afectando a las diferentes estructuras de la piel. Existen diversas variedades de nevus melanodticos segun sus caracteristicas, asi tenemos nevus melanodtico adquirido, congenito, halo nevus, nevus azul y nevus atipico.
Por "nevus displasico" tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a lunares atipicos, mas grandes que los normales pudiendo medir de 5 a 15 mm, tienen forma
irregular, tienen varios colores incluido el rosa, marron o negro y su superficie puede ser lisa o abultada.
Por "nevus de Spitz" tal y como se usa en la presente invention se refiere a una lesion solitaria, papular cupuliforme, menor de 1 cm de diametro, asintomatica y que se presenta entre la primera y segunda decada de la vida sin diferencias por sexo, localizandose mas frecuentemente en cara y cuello, pudiendo estar presente en el resto del cuerpo. Presenta una morfologia muy variada, blanda o dura al tacto, de diversos colores y superficie lisa o verrugosa, homogenea y bien delimitada. Su crecimiento puede ser lento o muy rapido.
Los metodos de la invencion [primer metodo de la invencion, segundo metodo de la invencion y tercer metodo de la invencion], comprenden en una primera etapa determinar el nivel de expresion de uno o mas marcadores en una muestra de un sujeto.
El termino "sujeto" o "paciente", tal como se usa aqui, incluye a cualquier animal clasificado como mamifero e incluye, aunque no esta restringido a, animales domesticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un humano hombre o mujer de cualquier edad o raza.
El termino "muestra", tal como aqu se usa, se refiera al material biologico aislado de un sujeto. La muestra biologica puede contener cualquier material biologico adecuado para determinar el nivel de expresion de PIR, PEBP1, BCL3, M-MITF y/o BCL2. La muestra puede aislarse de cualquier fluido o tejido biologico adecuado, por ejemplo, tejido, sangre, plasma, suero, orina, etc.
En una realizacion particular del primer metodo de la invencion y del segundo metodo de la invencion, la muestra es una muestra de tejido. Dicha muestra se puede obtener mediante metodos convencionales, por ejemplo, biopsia, utilizando metodos bien conocidos para los expertos en las tecnicas medicas relacionadas o mediante exeresis quirurgica. Los metodos para obtener una muestra de la biopsia incluyen partition en trozos grandes de un tumor, o microdiseccion u otros metodos de separation de celulas conocidos en la tecnica. Las celulas tumorales se pueden obtener de forma adicional mediante citologia por aspiration con una aguja fina. Para simplificar la
conservation y el manejo de las muestras, estas se pueden fijar en formalina y embeber en parafina o congelar primero y despues embeber en un medio criosolidificable, tal como compuesto OCT, mediante inmersion en un medio altamente criogenico que permite la congelation rapida.
De acuerdo con el tercer metodo de la invention, la muestra es un tejido de una lesion cutanea.
Por "lesion cutanea", tal y como se usa en la presente invencion se entiende una region melanotica o amelanotica susceptible de ser melanoma maligno.
El primer metodo de la invencion, comprende en una primera etapa determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionados del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1 y sus combinaciones en una muestra de un sujeto.
Por "BCL3" tal y como se usa en la presente invencion se refiere al gen que codifica para la protema Bcl3 que actua como un coactivador transcripcional que se activa mediante su asociacion con homodimeros de la protema NF-kB. En humanos, la protema Bcl3 corresponde con la secuencia de referencia P20749 en la base de datos Uniprot a fecha 19 de septiembre de 2013.
Por "PIR" tal y como se usa en la presente invencion se refiere al gen que codifica para la protema Pirin, miembro de la superfamilia de cupin, ha sido descrita como un coregulador transcripcional capaz de modular la migration celular y la apoptosis. En humanos la protema Pirin corresponde con la secuencia de referencia o00625 de la base de datos Uniprot a fecha 19 de septiembre de 2013.
Por "PEBP1" tal y como se usa en la presente invencion se refiere al gen que codifica para la protema 1 de union a fosfatidiletanolamina, regulador negativo de las vias de senalizacion MAPK y NF-kB. En humanos la protema Pebp1 corresponde con la secuencia con referencia en la base de datos Uniprot P30086 en fecha 19 de septiembre de 2013.
Como entiende el experto en la materia, el primer metodo de la invencion, en una realization particular, comprende determinar el nivel de expresion de uno solo de los marcadores del grupo formado por BCL3, PIR y PEBP1. Por tanto, en una realizacion
particular, el primer metodo de la invention comprende determinar el nivel de expresion de BCL3. En otra realization particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de PIR. En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de PEBP1.
En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar los niveles de expresion de 2 marcadores del grupo formado por los marcadores BCL3, PIR y PEBP1. Por tanto, en otra realizacion particular el primer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los marcadores BCL3 y PIR. En otra realizacion adicional, el primer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los marcadores BCL3 y PEBP1. En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los marcadores PIR y PEBP1.
En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los 3 marcadores BCL3, PIR y PEBP1.
En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende, ademas, determinar el nivel de expresion de un marcador adicional seleccionado del grupo formado por M-MITF, BCL2 y sus combinaciones.
El segundo metodo de la invencion comprende en una primera etapa determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por M-MITF, PIR, BCL2 y sus combinaciones en una muestra de un sujeto.
Por "MITF tal y como se usa en la presente invencion se refiere al gen que codifica para el factor de transcription MITF. Dicho gen da lugar a la trascripcion de las isoformas de MITF A, B, C, D, E, H, J, Mc y M. Por simplicidad, en la presente invencion se denomina "M-MITF al transcrito del gen MITF que da lugar a la isoforma M de MITF (M-mitf) espedfica de melanocitos, es decir, tanto al ARNm que codifica la isoforma M-mitf como el ADNc correspondiente a dicho ARNm. El factor de transcripcion asociado con microftalmia (MITF) es un factor de transcripcion con un dominio helice-bucle-helice basico de cremallera de leucina implicado en el desarrollo de melanocitos y osteoclastos. La isoforma M se diferencia de las demas isoformas en que en que presenta una insertion de 6 aminoacidos antes de la region basica. En
humanos la isoforma M corresponde con la secuencia de referencia 075030 de la base de datos de Uniprot a fecha 19 de septiembre de 2013.
Por "BCL2" tal y como se usa en la presente invention se refiere al gen que codifica para la protema Bcl-2, considerada proto-oncogen que regula procesos de permeabilizacion mitocondrial y constituyen un punto clave en la via intrinseca de apoptosis celular. En humanos corresponde con la secuencia de referencia P10415 en la base de datos de Uniprot a fecha 19 de septiembre de 2013.
El termino PIR ha sido definido anteriormente y es igualmente aplicable al segundo metodo de la invencion.
Como entiende el experto en la materia, el segundo metodo de la invencion, en una realization particular, comprende determinar el nivel de expresion de uno solo de los marcadores del grupo formado por M-MITF, PIR y BCL2. Por tanto, en una realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de M-MITF. En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de PIR. En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de BCL2.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende
determinar el nivel de expresion de 2 marcadores del grupo formado por M-MITF, PIR
y BCL2. Por tanto, en una realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los marcadores M-MITF y PIR. En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los marcadores M-MITF y BCL2. En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los marcadores PIR y BCL2.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende
determinar el nivel de expresion de los 3 marcadores M-MITF, PIR y BCL2.
En otra realizacion particular, el segundo metodo de la invencion comprende
determinar el nivel de expresion de un marcador adicional seleccionado del grupo formado por BCL2, PEBP1 y sus combinaciones.
El tercer metodo de la invention, comprende en una primera etapa determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1 y sus combinaciones en una muestra de tejido de dicha lesion cutanea.
Como entiende el experto en la materia, el tercer metodo de la invencion, en una realization particular, comprende determinar el nivel de expresion de uno solo de los marcadores del grupo formado por BCL3, PIR y PEBP1. Por tanto, en una realizacion particular, el tercer metodo de la invencion, comprende determinar el nivel de expresion de BCL3. En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de PIR. En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de PEBP1.
En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de 2 marcadores del grupo formado por BCL3, PIR y PEBP1. Por tanto, en una realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los marcadores BCL3 y PIR. En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los marcadores BCL3 y PEBP1. En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los marcadores PIR y PEBP1.
En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de los 3 marcadores BCL3, PIR y PEBP1.
En otra realizacion particular, el tercer metodo de la invencion comprende determinar el nivel de expresion de un marcador adicional seleccionado del grupo formado por M- MITF, BCL2 y sus combinaciones.
El termino "nivel de expresion" de un marcador, tal como aqu se usa, se refiere a la cantidad medible de producto del gen en una muestra del sujeto, en el que el producto de la transcription o un producto de la traduction de dicho gen. En consecuencia, dicho nivel de expresion puede corresponder al de un acido nucleico (tal como ARNm o ADNc) del gen correspondiente o al de una protema o polipeptido codificado por dicho gen. El nivel de expresion se deriva de la muestra de un sujeto y/o de una
muestra o muestras de referencia, y puede ser detectado de novo o corresponder a una determination anterior.
Como entiende el experto en la materia, los niveles de expresion de PIR, PEPBP1, BCL3, M-MITF y BCL2 se pueden determinar midiendo los niveles de los ARNm (o sus ADNc correspondientes) de los genes correspondientes o midiendo los niveles de las protemas codificadas por dichos genes, y los niveles de las variantes de los mismos.
A modo ilustrativo, no limitativo, en una realization particular, el nivel de expresion de los marcadores identificados en la presente invention, se determina cuantificando el nivel de los ARNm codificados por los genes en cuestion. El nivel de ARNm de un gen puede cuantificarse mediante el uso de metodos convencionales, por ejemplo, metodos que comprenden la amplification del ARNm y la cuantificacion del producto de amplificacion de dicho ARNm, tales como electroforesis y tincion, o de forma alternativa, por medio de transferencia Northern y el uso de sondas espetificas del ARNm de los genes de interes o su correspondiente ADNc/ARNc, mapeo con la nucleasa S1, RT-PCR, hibridacion, micromatrices, etc. De forma similar, los niveles del ADNc/ARNc correspondiente a dicho ARNm codificado por los marcadores tambien se puede cuantificar mediante el uso de tecnicas convencionales; en este caso, el metodo de la invencion incluye un paso de smtesis del ADNc correspondiente por medio de transcription inversa (RT) del correspondiente ARNm seguido por la smtesis (ARN polimerasa) y amplificacion del ARNc complementario a dicho ADNc. Los metodos convencionales para cuantificar los niveles de expresion se puede encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001 "Molecular cloning: to Laborator y Manual", 3a ed., Cold Spring Harbor Laborator y Press, N.Y., Vol. 1-3.
Para normalizar los valores de expresion de ARNm entre las diferentes muestras, es posible comparar los niveles de expresion del ARNm de interes en las muestras de prueba con la expresion de un ARN control. Un "ARN control" como se usa en el presente documento, se refiere a un ARN cuyos niveles de expresion no cambian o cambian solo en cantidades limitadas. Preferiblemente, el ARN control es ARNm derivado de genes de mantenimiento y que codifica protemas que se expresan constitutivamente y llevan a cabo funciones celulares esenciales. Los genes de mantenimiento preferidos para su uso en la presente invencion incluyen la protema ribosomica de 18S, p-2-microglobulina, ubiquitina, ciclofilina, GAPDH, PSMB4, tubulina y p-actina.
En una realization particular de los metodos de la invention [primer metodo de la invention, segundo metodo de la invencion y tercer metodo de la invencion], la determination de los niveles de expresion de los marcadores se realiza mediante una reaction en cadena de la polimersa (PCR) cuantitativa o un array de ADN o ARN.
De forma alternativa, tambien es posible determinar los niveles de expresion de los marcadores mediante la determinacion de los niveles de expresion de las protemas codificadas por los genes, ya que si la expresion de los genes aumenta, cabe esperar que se produzca un aumento en la cantidad de la protema correspondiente, y si la expresion de los genes disminuye, cabe esperar que se produzca una disminucion de la cantidad de la protema correspondiente.
A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dichas protemas pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a dichas protemas (o a fragmentos de las mismas que contenga un determinante antigenico) y la posterior cuantificacion de los complejos formados. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isotopos radiactivos, enzimas, fluoroforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimaticos o cofactores, inhibidores enzimaticos, partmulas, colorantes, etc. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invencion, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario) ; entre estas tecnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) , RIA (radioinmunoensayo) , EIA competitivo (inmunoensayo enzimatico competitivo) , DAS-ELISA (ELISA sandwich con doble anticuerpo) , tecnicas inmunocitoquimicas e inmunohistoqtimicas, tecnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de protemas que incluyan anticuerpos espedficos o ensayos basados en precipitation coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar dichas protemas, incluyen tecnicas de cromatografia de afinidad, ensayos de union a ligando, etc.
Cuando se usa un metodo inmunologico, se puede usar cualquier anticuerpo o reactivo que se sabe se une a las protemas diana con alta afinidad para detectar la cantidad de las protemas diana. Se prefiere sin embargo el uso de un anticuerpo, por ejemplo sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos
monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab y F (ab) 2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados.
En una forma de realization preferida de los metodos de la invention, la determination de los niveles de los marcadores se realiza por una tecnica inmunologica. En una realizacion mas particular el nivel de expresion se determina por inmunohistoqtimica, Western blot, ELISA o una matriz de protemas. En una forma de realizacion mas preferida, la tecnica inmunologica es inmunohistoqtimica o "IHC" (del ingles, "immunohistochemistr y "). En general, la IHC es un procedimiento histopatologico conocido que se basa en la utilization de un anticuerpo espetifico, normalmente marcado con un marcador (por ejemplo, una enzima) , que puede transformar un sustrato en un compuesto visible sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antigeno aplicado a una muestra de tejido organico. Con la utilizacion de alguna de las tecnicas espedficas (peroxidasa, antiperoxidasa, fluorescema, etc.) , el complejo antigeno-anticuerpo formado puede localizarse e identificarse en las muestras tisulares o citologicas a estudiar, con lo que se identifican los marcadores antigenicos caracteristicos de distintas celulas y se puede determinar el tipo de celula involucrado en la muestra.
La muestra a analizar con el fin de detectar la presencia de los marcadores de la invencion mediante IHC (o analisis inmunohistoqtimico) puede ser una muestra fresca, una muestra congelada o una muestra embebida en parafina y fijada usando un agente protector del tipo de formalina o similar. En una realizacion particular, el analisis inmunohistoqtimico se lleva a cabo tinendo la muestra a analizar con uno o mas anticuerpos espedficos frente a uno o mas marcadores de la invencion y determinando la frecuencia de celulas que se han tenido y la intensidad de la tincion. Ventajosamente, la detection mediante IHC de la presencia de los marcadores en la muestra a analizar se lleva a cabo en paralelo con muestras tisulares o citologicas que sirven como marcador positivo y como marcador negativo, y, si se desea, como referencia, se pueden usar tejidos sanos del mismo origen que el tumor que se esta analizando. Tambien es frecuente usar un control de fondo. Tipicamente, se asigna a la muestra un valor indicativo de la expresion total que se calcula en funcion de la frecuencia de celulas tenidas y de la intensidad en cada una de las celulas tenidas. Los criterios tipicos para asignar valores de expresion a las muestras han sido descritos en, por ejemplo, Handbook of Immunohistochemistr y and In Situ Hybridization in Human Carcinomas, M. Hayat Ed., 2004, Academic Press.
La determination del nivel de expresion de uno o mas marcadores de la invention mediante IHC presenta ventajas ya que no altera la rutina clmica de extraction de tejido y procesamiento de las muestras en los laboratorios de anatomia patologica.
En aquellos casos en los que se desee analizar un elevado numero de muestras (por ejemplo, cuando se desea analizar varias muestras de un mismo paciente o muestras de distintos pacientes) , es posible la utilization de formatos matriciales y/o procedimientos automatizados. En una forma de realization, es posible el uso de micromatrices de tejidos (tissue microarrays or TMA) que pueden ser obtenidos usando distintas tecnicas. Las muestras que forman parte de las micromatrices pueden ser analizadas de distinta manera incluyendo inmunohistoquimica, hibridacion in situ, PCR in situ, analisis de ARN o de ADN, inspection morfologica y combinaciones de cualquiera de las anteriores. Metodos para el procesamiento de micromatrices de tejido han sido descritos, por ejemplo, en Konenen, J. et al., (Nat. Med. 1987, 4:844-7). Las micromatrices de tejido se preparan a partir de nucleos cilmdricos de 0, 6 a 2 mm de diametro a partir de muestras de tejido embebidas en parafina y vueltas a embeber en un unico bloque receptor. De esta forma, el tejido procedente de multiples muestras puede ser insertado en un unico bloque de parafina.
Como se ha citado previamente, los niveles de expresion de PIR, PEBP1, BCL3, M- MITF y BCL2 se pueden determinar midiendo tanto los niveles de protema como los niveles de variantes de las mismas, tales como fragmentos, analogos y/o derivados.
Tal como aqu se utiliza, una variante de un marcador (protema) puede ser (i) un polipeptido o protema (en general, "peptido") en el que uno o mas residuos de aminoacidos es sustituido por un residuo de un aminoacido conservativo o no conservativo, preferiblemente un residuo de un aminoacido conservativo, y tal residuo de aminoacido sustituido puede ser o no uno codificado por el codigo genetico, (ii) un peptido en el que hay uno o mas residuos de aminoacidos modificados, por ejemplo, residuos que estan modificados por la union de grupos sustituyentes, (iii) un peptido en el que la protema es una variante de "splicing" alternativo de las protemas identificadas como marcadores en la presente invencion, y/o (iv) un fragmento de dichas protemas. Los fragmentos incluyen protemas generadas a traves del corte proteolrtico (incluyendo proteolisis multisitio) de una secuencia original. Dichas variantes pueden
ser identificadas por los expertos en la materia a partir de las ensenanzas de la presente solicitud de patente.
Como se conoce en la tecnica, la "identidad" entre dos protemas se determina comparando la secuencia de aminoacidos de una primera protema con la secuencia de aminoacidos de una segunda protema. De acuerdo con la presente invention, una "variante" es un peptido (polipeptido o protema) que tiene una secuencia de aminoacidos que es, al menos, el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o incluso superior, identica a la secuencia de aminoacidos de las protemas identificadas como marcadores por esta invencion. El grado de identidad entre dos protemas se puede determinar usando metodos y algoritmos informaticos conocidos por los expertos en la materia. A modo ilustrativo, en una realization particular, el grado de identidad entre 2 secuencias de aminoacidos se determina mediante el uso del algoritmo BLASTP [BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) ].
Las protemas pueden estar modificadas post-traduccionalmente; tales modificaciones post-traduccionales caen dentro del ambito de la presente invencion e incluyen, a modo ilustrativo, el corte del peptido senal, glicosilacion, acetilacion, isoprenilacion, proteolisis, miristoilacion, plegamiento de protemas y procesamiento proteolrtico, etc. Ademas, las protemas pueden incluir aminoacidos no naturales formados por las modificaciones postraduccionales o introduciendo aminoacidos no naturales durante la traduccion.
Alternativamente, el nivel de expresion de los marcadores de la invencion se puede determinar mediante el analisis de la actividad de las protemas o de una variante funcionalmente equivalente de los mismas.
A modo de ejemplo ilustrativo, no limitativo, la actividad de Bcl-3 puede determinar mediante la inhibition de la expresion de IL-10 tal y como se describe en Riemann M. et al, J Immunol. 2005 Sep 15;175 (6) :3560-8, o mediante la supresion de la activation de p53 tal y como se describe en Kashatus D.e t al., Genes Dev. 2006 Jan 15; 20 (2) :225-35. Epub 2005 Dec 29.
A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, la actividad de PEBP1 puede determinarse mediante la inhibicion de la actividad serina proteasa, tal y como se describe en Hengst U. et al., J Biol Chem. 2001 Jan 5; 276 (1) :535-40.
A modo de ejemplo ilustrativo, no limitativo, la actividad de Bcl-2 puede determinarse mediante la inhibicion de la actividad transcripcional de p53 tal y como se describe en Barbara A. et al., Journal of Biological Chemistr y , 274, 6469-6475.
A modo de ejemplo ilustrativo, no limitativo, la actividad de M-mitf puede determinarse mediante la expresion de Dial tal y como se describe en Carreira S. et al., Genes Dev. 2006 Dec 15; 20 (24) :3426-39.
A modo de ejemplo ilustrativo, no limitativo, la actividad de Pirin puede determinarse mediante la actividada enzimatica quercetinasa tal y como se describe en Adams M. et al., J Biol Chem 2005, 280 (31) :28675-28682.
La segunda etapa de los metodos de la invencion [primer metodo de la invencion, segundo metodo de la invencion y tercer metodo de la invencion] comprende comparar el nivel de expresion con un valor de referencia para dicho marcador.
El termino "valor de referencia", como se usa en el presente documento, se refiere a criterios predeterminados usados como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos de las muestras recogidas de un sujeto. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un limite superior o inferior, un intervalo de valores, un valor medio, un valor mediana, un valor de media, o un valor comparado con un control particular o valor basal. Un valor de referencia se puede basar en un valor de una muestra individual, tal como, por ejemplo, un valor obtenido de muestra del sujeto que se analiza, pero en un momento anterior en el tiempo. El valor de referencia se puede basar en un gran numero de muestras, tal como de una poblacion de sujetos del grupo coincidente de edad cronologica, o basarse en un conjunto de muestras que incluyen o excluyen la muestra que se analiza. En una realization particular el valor de referencia para un marcador es el nivel de expresion de dicho marcador en una muestra de un sujeto o poblacion de sujetos control, es decir que no sufren melanoma. En general, las muestras de referencia tipicas se obtendran de sujetos que estan clmicamente bien documentados.
Segun la presente invencion, el nivel de un marcador aumenta cuando el nivel de dicho marcador en una muestra es mayor que un valor de referencia. Los niveles de un marcador se consideran que son mayores que su valor de referencia cuando es al menos el 1, 5%, al menos el 2%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100%, al menos el 110%, al menos el 120%, al menos el 130%, al menos el 140%, al menos el 150% o mas mayores que el valor de referencia.
Asimismo, en el contexto de la presente invencion, el nivel de un marcador disminuye cuando el nivel de dicho marcador en una muestra es menor que un valor de referencia. Los niveles de un marcador se consideran que son menores que su valor de referencia cuando es al menos el 5%, al menos el 10%, al menos 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100%, al menos el 110%, al menos el 120%, al menos el 130%, al menos el 140%, al menos el 150% o mas mayores que el valor de referencia.
De acuerdo con el primer metodo de la invencion, un nivel de expresion aumentado de BCL3, y/o un nivel de expresion disminuido de PIR y/o de PEBP1, con respecto al valor de referencia para dicho (s) marcador (es) , es indicativo de que dicho sujeto padece un melanoma cutaneo.
En una realization particular del primer metodo de la invencion en la que se determina el nivel de expresion de BCL3, PIR y PEBP1, un nivel de expresion de BCL3 aumentado al menos un 75% con respecto al valor de referencia para dicho marcador y unos niveles de expresion de PIR y de PEBP1 disminuidos al menos un 75% con respecto al valor de referencia para cada uno de dichos marcadores, es indicativo de que dicho sujeto padece un melanoma cutaneo.
De acuerdo con el segundo metodo de la invencion, un nivel de expresion disminuido de los marcadores M-MITF, PIR y/o BCL2 con respecto a los valores de referencia
para cada marcador, es indicativo de que dicho sujeto tiene una alta probabilidad de desarrollar metastasis.
En una realization particular del segundo metodo de la invention en la que se determinan los niveles de expresion de los marcadores PIR, M-MITF y BCL2, un nivel de expresion del marcador PIR disminuido al menos un 75% con respecto al valor de referencia para dicho marcador y unos niveles de expresion de los marcadores M- MITF y BCL2 disminuidos al menos un 90%, mas preferiblemente disminuyen mas del 90%, con respecto al valor de referencia para cada uno de dichos marcadores, es indicativo de que dicho sujeto tiene una alta probabilidad de desarrollar metastasis.
De acuerdo con el tercer metodo de la invencion, un nivel de expresion de BCL3 aumentado, y/o unos niveles de expresion de PIR y/o PEBP1 disminuidos, con respecto al valor de referencia para dicho (s) marcador (es) es indicativo de que dicha lesion cutanea es melanoma cutaneo.
Kit de la invencion
En otro aspecto, la invencion se relaciona con un kit, en adelante "kit de la invencion", que comprende, un reactivo capaz de determinar el nivel de expresion de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1, M-MITF, BCL2 y sus combinaciones.
El termino "kit", tal como aqu se utiliza, se refiere a un producto que contiene los distintos reactivos necesarios para llevar a cabo los metodos de la invencion empaquetados para permitir su transporte y almacenamiento. Materiales adecuados para el empaquetado de los componentes del kit incluyen cristal, plastico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares) , botellas, viales, papel, sobres y similares. Adicionalmente, los kits de la invencion pueden contener instrucciones para el uso simultaneo, secuencial o separado de los distintos componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden encontrarse en forma de material impreso o en forma de un soporte electronico capaz de almacenar instrucciones de forma que puedan ser leidas por un sujeto, tales como medios de almacenamiento electronicos (discos magneticos, cintas y similares) , medios opticos (CD-ROM, DVD) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de Internet que proporcionen dichas instrucciones.
Kits que comprenden un solo reactivo tendran generalmente el reactivo encerrado en un contenedor (por ejemplo, un frasco, ampolla, u otro recipiente de almacenamiento adecuado) , aunque los kits incluyendo el reactivo unido a un sustrato (por ejemplo, una superficie interior de un recipiente de reaccion de ensayo) tambien se contemplan. Asimismo, los kits que incluyen mas de un reactivo tambien pueden tener los reactivos en recipientes (por separado o en una mezcla) o pueden tener los reactivos unidos a un sustrato.
Por "reactivo capaz de determinar el nivel de expresion", tal y como se usa en la presente invencion se entiende un compuesto capaz de detectar el producto genico de un gen o la protema codificada por dicho gen.
En algunas realizaciones, los reactivos adecuados para la determination de los niveles de expresion de una o mas marcadores de la invencion comprenden al menos 50%, al menos 55% al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos el 99%, de la cantidad total de los reactivos que forman el kit.
En una realizacion particular, dicho kit comprende los reactivos necesarios para realizar un inmunoensayo, preferentemente, un analisis inmunohistoqdmico, para detectar la presencia de Pirin, PEBP1, Bcl-3, M-mitf y/o Bcl-2; para ello, dicho kit incluira los anticuerpos que reconocen dichos marcadores.
Por tanto, en una realizacion preferida del kit de la invencion, el "reactivo capaz de determinar el nivel de expresion" es un anticuerpo que se une a un marcador de la invencion.
El termino "anticuerpo" como se usa en la presente invencion puede ser un anticuerpo natural policlonal o monoclonal o un anticuerpo no natural, por ejemplo, un anticuerpo de dominio unico, un anticuerpo de cadena unica de fragmento variable, un microanticuerpo, etc. Metodos para producir tales anticuerpos son bien conocidos en la tecnica.
En algunas realizaciones, los anticuerpos espedficos para los marcadores de la invencion se marcan con un marcador detectable (por ejemplo, un colorante
fluorescente o una enzima detectable) , o son modificados para facilitar la deteccion (por ejemplo, con biotina para permitir la deteccion con un avidina o estreptavidina). En otras realizaciones, el reactivo no sera directamente marcado o modificado.
En ciertas realizaciones, los kits incluyen los reactivos en la forma de una matriz. La matriz incluye al menos dos reactivos diferentes adecuados para la determinacion de los niveles de expresion de una o mas protemas (cada reactivo, espedfico para una protema diferente) unidos a un sustrato en un patron predeterminado (por ejemplo, una rejilla). En consecuencia, la presente invencion proporciona matrices que comprenden los reactivos adecuados para la determinacion de los niveles de expresion de uno o mas marcadores de la invencion
La localizacion de los diferentes reactivos (los "reactivos de captura") permite la medicion de los niveles de un numero de diferentes marcadores en la misma reaccion. Kits que incluyen los reactivos en forma matricial son comunmente en formato sandwich, por lo que tales kits pueden contener tambien reactivos de deteccion. Normalmente, en el kit se incluyen diferentes reactivos de deteccion, cada reactivo de deteccion espedficos para un anticuerpo diferente. Los reactivos de deteccion en tales realizaciones son normalmente reactivos espedficos para las mismas protemas que los reactivos unidos al sustrato (aunque los reactivos de deteccion tipicamente se unen a una porcion diferente o en el sitio en la protema de los reactivos enlazados al sustrato) , y son generalmente reactivos de deteccion por afinidad. Al igual que con los reactivos de deteccion de cualquier otro formato de ensayo, los reactivos de deteccion pueden ser modificados con un resto detectable, modificados para permitir la union de un resto detectable por separado, o sin modificar se. Los kits de tipo matriz que incluyen reactivos de deteccion que estan modificados o no modificados para permitir la union de un resto detectable tambien pueden contener restos adicionales detectables (por ejemplo, restos detectables que se unen al reactivo de deteccion, tales como anticuerpos marcados que se unen sin modificar reactivos de deteccion o estreptavidina modificada con un resto detectable para la deteccion de biotina modificados reactivos de deteccion).
En otra realizacion preferida del kit de la invencion, el "reactivo capaz de determinar el nivel de expresion" comprende un acido nucleico.
El termino "acido nucleico" tal y como se usa en la presente invencion, se refiere a una sonda, cebador, capaz de hibridar espedficamente con el polinucleotidico que codifica un marcador de la invencion.
En una realizacion particular, el kit de la invencion comprende una matriz de ADN o ARN. Es decir, los acidos nucleicos, oligonucleotidos, que forman el kit de la invencion se encuentran acoplados a una matriz. Las micromatrices comprenden una pluralidad de acidos nucleicos distribuidas espacialmente y asociadas de forma estable a un soporte (por ejemplo, un biochip). Los acidos nucleicos tienen una secuencia complementaria a subsecuencias particulares de los marcadores cuya expresion se desea detectar, por lo que son capaces de hibridar con dichos acidos nucleicos. En los metodos de la invencion, se pone en contacto una micromatriz que comprende una matriz de acidos nucleicos con una preparacion de acidos nucleicos aislada del sujeto objeto de estudio. La incubacion de la micromatriz con la preparacion de acidos nucleicos se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la hibridacion. Posteriormente, tras la eliminacion de los acidos nucleicos que no han quedado retenidos en el soporte, se detecta el patron de hibridacion lo que proporciona informacion sobre el perfil genetico de la muestra analizada
La invencion contempla una variedad de matrices tanto en cuanto al tipo de sondas como en cuanto al tipo de soporte utilizado. Las sondas incluidas en las matrices que son capaces de hibridar con los acidos nucleicos pueden ser acidos nucleicos o analogos de los mismos que mantienen la capacidad de hibridacion como, por ejemplo, acidos nucleicos en los que el enlace fosfodiester se ha sustituido por un enlace fosforotioato, metilimino, metilfosfonato, forforamidate, guanidina y similares, acidos nucleicos en los que la ribosa de los nucleotidos se ha sustituido por otra hexosa, acidos peptidonucleicos (PNA). La longitud de las sondas puede ser de 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100 nucleotidos y variar en el rango de 10 a 1000 nucleotidos, preferiblemente en el rango de 15 a 150 nucleotidos, mas preferiblemente en el rango de 15 a 100 nucleotidos y pueden ser acidos nucleicos de cadena sencilla o de cadena doble.
La seleccion de las sondas espedficas para los distintos genes diana se lleva a cabo de forma que se unan de forma espedfica al acido nucleico diana con una hibridacion minima a genes no relacionados. Sin embargo, existen sondas de 20 nucleotidos que no son unicas para un ARNm determinado. Por tanto, sondas dirigidas a dichas
secuencias mostraran una hibridacion cruzada con secuencias identicas que aparecen en ARNm de genes no relacionados. Por otro lado, existen sondas que no hibridan de forma espedfica con los genes diana en las condiciones utilizadas (a causa de estructuras secundarias o de interacciones con el sustrato de la matriz). Este tipo de sondas no deben ser incluidas en la matriz. Por lo tanto, el experto en la materia advertira que las sondas que van a incorporarse en una matriz determinada deberan ser optimizadas antes de su incorporacion a la matriz. De forma general, la optimizacion de las sondas se lleva a cabo generando una matriz que contiene una pluralidad de sondas dirigidas a las distintas regiones de un determinado polinucleotido diana. Esta matriz se pone en contacto en primer lugar con una muestra que contiene el acido nucleico diana de forma aislada y, en segundo lugar, con una mezcla compleja de acidos nucleicos. De esta forma se seleccionan sondas que muestran una hibridacion altamente espedfica con el acido nucleico diana pero no baja o ninguna hibridacion con la muestra compleja son seleccionadas para su incorporacion a las matrices de la invencion. Adicionalmente, es posible incluir en la matriz controles de hibridacion para cada una de las sondas que va a ser estudiada. En una forma preferida de realizacion, los controles de hibridacion contienen una posicion alterada en la region central de la sonda. En el caso de que se observen altos niveles de hibridacion entre la sonda estudiada y su control de hibridacion, la sonda no se incluye en la matriz.
En una realizacion particular, las micromatrices que pueden utilizarse en la puesta en practica de la presente invencion contienen una serie de sondas control; a modo ilustrativo, dichas sondas control pueden ser de tres tipos: controles de normalizacion, controles de niveles de expresion y controles de hibridacion.
Controles de normalizacion son oligonucleotidos que son perfectamente complementarios a secuencias de referencia marcadas que se anaden a la preparacion de acidos nucleicos que se desea analizar. Las senales derivadas de los controles de normalizacion tras la hibridacion proporcionan una indicacion de las variaciones en las condiciones de hibridacion, intensidad del marcador, eficiencia de la deteccion y otra serie de factores que puede resultar en una variacion de la senal de hibridacion entre distintas micromatrices. Preferiblemente, las senales detectadas a partir del resto de sondas de la matriz se dividen por la senal emitida por las sondas control normalizando asi las medidas. Practicamente se puede usar cualquier sonda como control de normalizacion. Sin embargo, es conocido que la eficacia de la
hibridacion varia en funcion de la composition de nucleotidos y la longitud de la sonda. Por tanto, sondas de normalization preferidas son aquellas que representan la longitud media de las sondas presentes en la matriz, aunque pueden ser seleccionadas de forma que recojan un rango de longitudes que reflejen el resto de sondas presentes en la matriz. Las sondas de normalizacion pueden ser disenadas de forma que reflejen la composicion media de nucleotidos del resto de sondas presentes en la matriz. Preferiblemente, se utiliza un numero limitado de sondas de normalizacion seleccionadas de forma que hibridan adecuadamente, es decir, no presentar estructura secundaria y no muestran similitud de secuencia con ninguna de las sondas de la matriz. Las sondas de normalizacion pueden localizarse en cualquier posicion en la matriz o en multiple posiciones en la matriz para controlar de forma eficiente variaciones en la eficiencia de hibridacion relacionadas con la estructura de la matriz. Preferiblemente, los controles de normalizacion se localizan en las esquinas de la matriz y/o en el centro de la misma.
Los controles de los niveles de expresion son sondas que hibridan de forma espedfica con genes que se expresan de forma constitutiva en la muestra que se analiza. Los controles de nivel de expresion estan disenados para controla el estado fisiologico y la actividad metabolica de la celula. El examen de la covarianza del control del nivel de expresion con el nivel de expresion del acido nucleico diana indica si las variaciones en los niveles de expresion son debidas a cambios en los niveles de expresion o son debidas a cambios en la tasa transcripcional global en la celula o en su actividad metabolica general. Asi, en el caso de celulas que presentan deficiencias en un determinado metabolito esencial para la viabilidad celular, se espera que se observe una disminucion tanto en los niveles de expresion del gen diana como en los niveles de expresion del control. Por otro lado, si se observa un aumento en la expresion de la expresion del gen diana y del gen control, es probable que se deba a un aumento de la actividad metabolica de la celula y no a un aumento diferencial en la expresion del gen diana. Se puede emplear cualquier sonda que corresponda a un gen expresado de forma constitutiva tales como genes que codifican para protemas que ejercen funciones esenciales de las celulas tales como p-2-microglobulina, ubiquitina, protema ribosomal 18S, ciclofilina A, receptor de transferian, actina, GAPDH y similares. En una forma preferida de realization, los controles de los niveles de expresion son GAPDH, protema de activation de la tirosina 3-monooxigenasa/triptofano 5-
monooxigenasa (YWHAZ) , ubiquitina, beta-actina y p-2-microglobulina.
Los controles de hibridacion se pueden incluir tanto para las sondas dirigidas a los genes diana como para las sondas dirigidas al nivel de expresion o a los controles de normalizacion. Los controles de error son sondas de oligonucleotidos identicas a las sondas dirigidas a los genes diana pero que contienen mutaciones en uno o varios nucleotidos, es decir, que contienen nucleotidos en ciertas posiciones que no hibridan con el nucleotido correspondiente en el gen diana. Los controles de hibridacion se seleccionan de forma que, aplicando las condiciones adecuadas de hibridacion, el gen diana deberia hibridar con la sonda espedfica pero no con el control de hibridacion o con una eficiencia reducida. Preferiblemente, los controles de hibridacion contienen una o varias posiciones modificadas en el centro de la sonda. Los controles de hibridacion proporcionan por tanto una indicacion del grado de hibridacion inespedfica o de hibridacion cruzada a un acido nucleico en la muestra a una sonda distinta a la que contiene la secuencia exactamente complementaria.
Materiales adecuados para su inclusion en un kit ejemplar de acuerdo con la presente invencion comprenden uno o mas de los siguientes: pares de cebadores espedficos para PCR (oligonucleotidos) que hibridan con dominios de la secuencia de ADN o cDNA que flanquean los polimorfismos geneticos de interes; reactivos capaces de amplificar un dominio de una secuencia espedfica, ya sea en el ADN genomico o cDNA sin el requisito de la realizacion de PCR; reactivos necesarios para discriminar entre los distintos alelos en la secuencia de los dominios amplificados por PCR y PCR- no amplificacion (por ejemplo, las endonucleasas de restriccion, oligonucleotidos que hibridan preferentemente a un alelo del polimorfismo, incluidos los modificados para contener enzimas o grupos qdmicos fluorescentes que amplifican la senal de los oligonucleotidos y que hacen la discriminacion de los alelos mas robusta) ; reactivos necesarios para separar fisicamente los productos derivados de los diferentes alelos (por ejemplo agarosa o poliacrilamida y un tampon para ser utilizado en la electroforesis, columnas de HPLC, geles SSCP, geles formamida o un soporte de la matriz de MALDI-TOF) , o incluso, reactivos capaces de identificar polipeptidos y sus variantes segun la invencion, por ejemplo, anticuerpos (incluyendo los anticuerpos monoclonales, policlonales o intactos y fragmentos de los mismos, asi como anticuerpos recombinantes, etc) capaces de reconocer y unirse a dichos polipeptidos o variantes del mismo.
Usos de los kits de la invencion
En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso del kit de la invencion para diagnosticar melanoma cutaneo, para determinar la probabilidad de metastasis de un sujeto diagnosticado con melanoma cutaneo o para diferenciar un nevus benigno de melanoma.
La invencion se describe ahora en detalle por medio de los siguientes ejemplos que se deben considerar como meramente ilustrativos y no limitantes del ambito de la invencion.
EJEMPLO 1
Identificacion de marcadores para el diagnostico y pronostico de melanoma
cutaneo
Para la realization de este Ejemplo se han utilizado los Materiales y Metodos que se describen a continuacion.
1.1 Materiales y Metodos
Lineas celulares
Las lineas celulares de melanoma maligno fueron:
- 1205Lu (ATCC CRL-2812) : lmea celular de melanoma establecida por M. Herlyn. Deriva de una metastasis pulmonar tras inyeccion subcutanea de la lmea celular comercial de melanoma humano WM793B en un raton inmunodeficiente. Las celulas 1205Lu son altamente invasivas y muestran metastasis espontaneas en pulmon e tigado. Esta lmea fue adquirida en 2007 a traves de la American Type Culture Collection (ATCC).
- A375 (ATCC CRL-1619) : lmea celular de melanoma establecida por D.J. Giard en 1973, a partir de un tumor solido en una mujer de 54 anos de edad. Esta lmea presenta un cariotipo hiperploide con un numero modal de cromosomas de 62 y es capaz de producir tumores subcutaneos amelanodticos cuando es inoculada en ratones atimicos. Esta lmea fue adquirida en 1996 a traves de la ATCC.
- COLO-800 (ACC 193) : lmea celular de melanoma aislada por G. E. Moore en 1990 a partir de un nodulo subcutaneo de un tumor en un varon de 14 anos de
edad. Esta lmea fue adquirida en 2010 a traves de la empresa Innoprot (Bizkaia).
- Hs294T (ATCC HTB-140) : lmea celular de melanoma establecida por A. Creasey en 1969, a partir de un melanoma metastatico de un nodulo linfatico en una mujer caucasoide de 56 anos de edad. Es una lmea celular hiperploide con un numero modal de cromosomas de 65 en al menos el 44% de las celulas. Esta lmea fue adquirida en 1996 a traves de la ATCC.
- HT-144 (ATCC HTB 63) : lmea celular de melanoma establecida por J. Fogh, a partir de un melanoma maligno metastatico en un varon de 26 anos de edad. Analisis citogeneticos muestran poliploidia con anormalidades que incluyen fragmentos acrocentricos y constricciones secundarias. Esta lmea fue adquirida en 1996 a traves de la ATCC.
- MEL-HO (ACC62) : lmea celular de melanoma establecida por H. W. L. Ziegler- Heitbrock en 1976, a partir de un melanoma primario en una mujer de edad desconocida. Esta lmea fue adquirida en 2010 a traves de la empresa Innoprot (Bizkaia).
- MEL-Juso (ACC74) : lmea celular de melanoma establecida por H. W. L. Ziegler-Heitbrock en 1977, a partir de un melanoma primario en una mujer de 58 anos de edad. Esta lmea fue adquirida en 2010 a traves de la empresa Innoprot (Bizkaia).
- RPMI7951 (ACC76) : lmea celular de melanoma establecida por H. Kirchner en 1971, a partir de una metastasis en ganglio linfatico de una mujer caucasoide de 18 anos de edad. Esta lmea fue adquirida en 2010 a traves de la empresa Innoprot (Bizkaia).
- WM793B (ATCC CRL-2806) : lmea celular de melanoma establecida por M. Herlyn en 1983, a partir de un melanoma primario en crecimiento vertical localizado a la altura del esternon de un varon de 37 anos de edad. Muestra una translocacion entre los cromosomas 1 y 19, ademas de poseer una copia extra del cromosoma 7. Esta lmea fue adquirida en 2007 a traves de la ATCC.
- M980513: lmea celular de melanoma establecida por el grupo del Dr. Hoek en 1998 (Hospital Universitario de Zurich, Suiza). Esta lmea fue obtenida a partir de una metastasis de nodulo linfatico iliaco encontrada en una mujer de 42 anos de edad.
- M080423: lmea celular de melanoma establecida por el grupo del Dr. Hoek en 2008 (Hospital Universitario de Zurich, Suiza). Esta lmea fue obtenida a partir
de una metastasis de nodulo linfatico hepatoduodenal encontrada en una mujer de 65 anos de edad.
- M050829: lmea celular de melanoma establecida por el grupo del Dr. Hoek en 2005 (Hospital Universitario de Zurich, Suiza). Esta lmea fue obtenida a partir de una metastasis cutanea retroauricular encontrada en un varon de 39 anos de edad.
- M000921: lmea celular de melanoma establecida por el grupo del Dr. Hoek en el ano 2000 (Hospital Universitario de Zurich, Suiza). Esta lmea fue obtenida a partir de una metastasis epigastrica encontrada en una mujer de 52 anos de edad.
- M010817: lmea celular de melanoma establecida por el grupo del Dr. Hoek en 2001 (Hospital Universitario de Zurich, Suiza). Esta lmea fue obtenida a partir de una metastasis cutanea localizada en la extremidad superior izquierda de una mujer de 37 anos de edad.
- M080201: lmea celular de melanoma establecida por el grupo del Dr. Hoek en el ano 2008 (Hospital Universitario de Zurich, Suiza). Esta lmea fue obtenida a partir de un melanoma primario encontrado en una mujer de 64 anos de edad.
- M080310: lmea celular de melanoma establecida por el grupo del Dr. Hoek en el ano 2008 (Hospital Universitario de Zurich, Suiza). Esta lmea fue obtenida a partir de un melanoma primario encontrado en una mujer de 71 anos de edad.
- M080214: lmea celular de melanoma establecida por el grupo del Dr. Hoek en 2.008 (Hospital Universitario de Zurich, Suiza). Esta lmea fue obtenida a partir de una metastasis subcutanea localizada en el muslo izquierdo de una mujer de 55 anos de edad.
- M080307: lmea celular de melanoma establecida por Dr. Hoek en 2.008 (Hospital Universitario de Zurich, Suiza). Esta lmea fue obtenida a partir de una metastasis axilar encontrada en un varon de 55 anos de edad.
- JSG: lmea de melanoma obtenida en el laboratorio de los inventores en 1997 (Dra. Boyano, Universidad del Pais Vasco, Bizkaia). Esta lmea fue establecida a partir de un tumor primario localizado en el pie de un varon de 71 anos de edad. El tumor fue diagnosticado en estadio IIB segun la clasificacion de AJCC. La evolucion de la enfermedad no fue buena, apareciendo metastasis ganglionar 5 meses despues de la extirpacion del tumor primario. Tres meses despues se detectaron metastasis en transito y a distancia, y transcurridos 5 meses el paciente fallecio.
Las lmeas celulares de melanocitos de piel son las siguientes:
- La mayoria de las lmeas de melanocitos epidermicos humanos utilizadas en el presente trabajo fueron adquiridas a traves de Cascade Biologics en 2007.
- HEMn-LP (C-002-5C) : melanocitos aislados de piel de neonato con baja pigmentacion.
- HEMn-MP (C-102-5C) : melanocitos aislados de piel de neonato con pigmentacion media.
- HEMn-DP (C-202-5C) : melanocitos aislados de piel de neonato con alta pigmentacion.
- La ultima lmea de melanocito HEM (P10853) fue adquirida en 2010 a traves de la empresa Innoprot (Bizkaia). Al igual que HEMn-LP, se trata de un cultivo primario de melanocitos humanos aislados de piel de un individuo neonato con baja pigmentacion.
Los melanocitos humanos primarios fueron adquiridos de Invitrogen (Cat No. C-002- 5C de prepucio neonatal ligeramente pigmentado, HEMn-LP; Cat. No. C-102-5C de prepucio neonatal moderadamente pigmentado, HEMn-MP; y Cat No. C-202-5C de prepucio neonatal pigmentacion oscura, HEMn-DP) y de Innoprot (Cat. No. P10853 de prepucio neonatal ligeramente pigmentada).
Todos los melanocitos humanos primarios crecieron en Cascade Media 254 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suplemento de crecimiento de melanocitos humanos Cascade (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) , en ausencia de antibioticos. Las lmeas celulares de melanoma A375 (ATCC CRL-1619 ) , Hs294T (ATCC HTB-140) , JSG (aislado por Boyano MD) , RPMI7951 (ACC76) se cultivaron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) , L-glutamina 2 mM, 50 mg/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. La lmea celular de melanoma HT-144 (ATCC HTB-63) se mantuvo en medio 5A de Mc Coy complementado con FBS al 10%, 0, 22 g/L de L-glutamina y bicarbonato de sodio. La lmeas celulares de melanoma WM793B (ATCC CRL-2806) y 1205Lu (ATCC CRL-2812) se cultivaron en 2% del tumor mediano que contiene una mezcla 4:1 de medio MCDB 153 con 1, 5 g/L de bicarbonato de sodio y medio L-15 de Leibovitz con L-glutamina 2 mM, y a continuacion, suplementado con 2% de FBS, 0, 005 mg/ml de insulina bovina y 1, 68 mM de CaCl2. Las lmeas celulares de melanoma COLO-800 (ACC193) , MEL-HO (ACC62) , y MEL-Juso (ACC74) se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, 5% de glutamina y
piruvato de sodio 1 mM. Las lmeas celulares de melanoma A375, Hs294T, HT-144, WM793B y 1205Lu fueron adquiridas a la ATCC (Rockville, MD, EE.UU.) ; RPMI7951, COLO-800, MEL-HO (ACC62) y MEL-Juso (ACC74) se obtuvieron de Innoprot (Derio, Bizkaia, Espana). Todos los melanocitos humanos primarios y lmeas celulares de 5 melanoma se cultivaron 95% de confluencia a 37°C con 5% de CO2 y 95% de humedad.
La Tabla 1 muestra las diferentes condiciones de cultivo de las lmeas celulares de
melanoma y melanocitos.
Tabla 1
Lrnea celular
Condiciones de cultivo
Medio DMEM
A375, Hs294T, JSG,
10% FCS
RPMI7951
L-glutamina2 mM Penicilina 100 UI/ml
estreptomicina100 ^g/ml
Medio McCoys 5a
HT-144
Bicarbonado sodico
L-glutamina0, 22 g/L
FCS 10%
Dilution 4:1 de medio
1205Lu, WM793B
MCDB 153 con 1, 5 g/L bicarbonato sodico Medio Leibovitzs L-15 con 2 mM L-glutamina
mas insulina bovina 0, 005 mg/ml
CaCl21, 68 mM
FCS2%
Medio RPMI 1640 con GlutaMax
COLO-800, MEL-HO, MEL-
HEPES 25 mM
JUSO
FCS 10%
M980513, M080423, M050829, M000921, M010817, M080201, M080310, M080214,
Medio RPMI 1640 piruvato sodico 1mM FCS 10% Glutamina 5 mM
M080307
HEMn-LP, HEMn-MP, HEMn-DP,
Medio 254
Suplemento de crecimiento de melanocito humano 1%
Expresion genica por RT-PCR cuantitativa
El ARN total fue aislado utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Hilden, Alemania) y para cada muestra, el ADNc se sintetizo a partir de 1 mg de ARN total usando el kit de smtesis de ADNc iScriptTM (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) de acuerdo 5 con las instrucciones del fabricante. Los ensayos de RT-PCR en tiempo real se llevaron a cabo utilizando una plataforma PCR iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). La mezcla de reaccion contema 0, 1 ^l de ADNc a partir de la reaccion de transcripcion inversa, junto con cebadores directos e inversos espedficos y IQTM SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) en un 10 volumen final de reaccion de 20 ^l. La reaccion de PCR se inicio con calentamiento a 95°C durante 10 min, seguido por 45 ciclos de desnaturalizacion a 95°C durante 30 s, a la temperatura correspondiente para cada gen (56-61°C) durante 20 s y extension a 72°C durante 30 s. Cada ensayo incluyo un control negativo que consistio en la ausencia de ADNc. Los datos de expresion se generaron a partir de 2 reacciones de 15 amplificacion con las muestras y los controles ejecutados por triplicado. Los datos opticos obtenidos por PCR en tiempo real fueron analizados utilizando el MyiQ SingleColor de Real-Time PCR System Software Detection, Version 1.0 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Se determino la curva de fusion de cada ensayo de PCR y se analizaron en electroforesis en gel de agarosa 1, 5% muestras 20 seleccionadas al azar para confirmar la especificidad de los productos de amplification. La expresion de tres genes constitutivos (ACTB, GAPDH, y RPS15) tambien se analizo para normalizar los datos de expresion utilizando Gene Expression Macro Software Version 1.1 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) , donde se calcularon los valores de expresion relativa por el metodo comparativo Ct 25 (Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. Genome Biol. 2002 Jun 18; 3 (7) ).
La Tabla 2 muestra los parejas de cebadores utilizados en los ensayos de RT-qPCR.
Tabla 2
Genes de referencia
Gen
Secuencia cebadores
Tamano del amplicon (pb)
Tm
(°C)
Optimizacion
curva
estandar
fi-actina
(ACTB)
Fw 5'-AGAT GACCCAGAT CATGTTT GAG-3' (SEQ ID NO: 1)
Rev 5'-GTCACCGGAGTCCATCACG-3' (SEQ ID NO: 2)
r = 0, 999 Ef = 93%
GAPDH
Fw 5'-CCTGTTCGACAGTCAGCCG-3' (SEQ ID NO: 3)
Rev 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC- 3' (SEQ ID NO: 4)
r = 0, 999 Ef = 95, 5%
RPS15
Fw 5'-TTCCGCAAGTTCACCTACC-3' (SEQ ID NO: 5)
Rev 5'-CGGGCCGGCCATGCTTTACG-3' (SEQ ID NO: 6)
r = 0, 999 Ef = 90%
Genes de estudio
Gen
Secuencia cebadores
Tamano
del amplicon
(pb)
Tm
(°C)
Optimizacion
curva
estandar
BCL2
Fw 5'-GGGGAGGATTGTGGCCTTC-3'
(SEQ ID NO: 7)
Rev 5'-CAGGGCGATGTTGTCCACC-3' (SEQ ID NO: 8)
r = 0, 998 Ef = 99, 7%
BCL3
Fw 5'-AACCTGCCTACACCCCTATACC-3' (SEQ ID NO: 9)
Rev 5'-GCACCACAGCAATATGGAGAG- 3' (SEQ ID NO: 10)
r = 0, 997 Ef = 93%
M-MITF
Fw 5'-CTCGAAAACCCCACCAAGTA-3' (SEQ ID NO: 11)
Rev 5'-GACATGGCAAGCTCAGGACT-3' (SEQ
r = 0, 992 Ef = 93%
ID NO: 12)
PEBP1
Fw 5'-AATAGACCCACCAGCATTTCG-3' (SEQ ID NO: 13)
Rev 5'-GTGCCACTGCTGATGTCATTG-3' (SEQ ID NO: 14)
r = 0, 998 Ef = 94, 5%
PIR
Fw 5'-GGAGCCTCAGTACCAGGAACT-3' (SEQ ID NO: 15)
Rev 5'-CTTGGACTTTATTCCCAGGGC-3' (SEQ ID NO: 16)
r = 0, 999 Ef = 97%
Analisis estadistico
El nivel de significacion estad^stica entre las medias de las muestras se determino a traves de la prueba t de Student. El valor p fue considerado estadisticamente significativo cuando p <0, 05 y limite significativo cuando p> 0, 05 y <0, 01.
Con todos los datos obtenidos de los marcadores tumorales analizados se realizo un 10 analisis de los componentes principales. El analisis de componentes principales es un procedimiento matematico que transforma un conjunto de variables posiblemente correlacionadas en un conjunto menor de variables no correlacionadas llamadas "componentes principales". Asi, dadas "n" observaciones de "p" variables, el objetivo del analisis de componentes principales es determinar "r" nuevas variables no 15 correlacionadas llamadas componentes principales que representen la mayor variabilidad posible de las variables originales. Teniendo en cuenta el amplio conjunto de variables analizadas en el presente trabajo (niveles proteicos y expresion genica a nivel transcripcional) , se realizo un analisis de componentes principales con el fin de facilitar la interpretation del conjunto de datos. De esta manera, se puede determinar 20 como se agrupan las lmeas tumorales en funcion de los nuevos componentes principales y evaluar si la clasificacion obtenida puede ser util para el diagnostico y/o pronostico clmico.
El analisis estadistico se realizo utilizando el programa SPSS version 19. Para ello, los 25 datos obtenidos de la cuantificacion proteica por Western blot y de la expresion genica
por RT-qPCR fueron normalizados para generar variables con media cero y varianza uno. A continuation, con el fin de facilitar la interpretation del significado de los factores seleccionados se llevo a cabo una rotation de los ejes factoriales. Uno de los metodos mas corrientes, y el que se ha utilizado en el presente trabajo, es la rotacion ortogonal Varimax, que fue desarrollada por Kaiser. El objetivo de la rotacion Varimax es conseguir que la correlation de cada una de las variables sea lo mas proxima a 1 con solo uno de los factores y proxima a cero con todos los demas.
1.2 Resultados
En las Figuras 1 y 2 se muestran los niveles de ARNm de PIR y PEBP1 en lmeas celulares de melanoma. Dichos genes estan reprimidos de manera significativa en comparacion con la expresion de dichos genes en las celulas de melanocitos normales (los valores de p son 0, 00084 y 5, 11E-08, respectivamente). Por el contrario, en la Figura 3 puede verse que BCL3 esta sobreexpresado en lmeas celulares de melanoma (valor de p = 0, 0033).
Los resultados sugieren que la actividad transcripcional del gen PIR podria ser utilizada como marcador de la progresion maligna del melanoma, ya que su expresion esta reprimida en todas las lmeas celulares de melanoma ensayadas. Ademas, las lmeas celulares de melanoma se caracterizan por la represion de la actividad transcripcional del gen PEBP1, junto con la sobre expresion del gen BCL3. Por lo tanto, el estudio de los niveles de transcription de estos genes puede servir como marcadores que diferencian a celulas de melanoma de melanocitos y nevus.
Se analizo la expresion de M-MITF (una isoforma espedfica de melanocitos) en todas las lmeas celulares de melanoma y melanocitos normales. Este factor de transcripcion contiene una helice-bucle-helice de base de dominio de cremallera de leucina involucrado en el desarrollo y la supervivencia de melanocitos. Sin embargo, se encontro una supresion transcripcional de los niveles de M-MITF en el 70% de lmeas celulares de melanoma evaluadas, mientras que las tres lmeas de celulas restantes expresaban niveles similares de M-MITF a las encontradas en cultivos primarios de melanocitos (Figura 4).
Por lo tanto, se concluyo que los niveles de expresion de M-MITF son elevados en lmeas celulares de melanoma que se encuentran en un periodo de proliferation, en el 5
que al mismo tiempo actua como un factor de transcripcion de genes implicados en la progresion del ciclo celular y como un represor transcripcional de genes implicados en la invasion. Mientras que los niveles de expresion de M-MITF disminuyen cuando las celulas tumorales adquieren la capacidad de invadir (Koludrovic y Davidson, Future Oncol. 2013 Feb; 9 (2) :235-44).
A pesar de la evidencia que muestra una disminucion de la expresion del gen M-MITF en celulas de melanoma, la expresion de este factor de transcripcion es esencial para la supervivencia y la proliferation celular a traves de regulation de la transcripcion de diferentes genes, como BCL2 (McGill et al. Cell. 2002 Jun 14; 109 (6) :707-18). De hecho, en las lmeas celulares de melanoma analizadas, la expresion de BCL2 se correlaciona directamente con la expresion de M-MITF (Figura 5). Por lo tanto, las lmeas celulares de melanoma proliferativo MEL-HO, MEL-Juso y COLO-800 expresaban los genes M-MITF y BCL2 igual que los melanocitos. Por el contrario, las lmeas celulares de melanoma invasivo A375, Hs294T, HT144, 1205Lu, WM793B, JSG y RPMI7951 mostraron una expresion reprimida de M-MITF y de BCL2 en comparacion con melanocitos normales y lmeas de melanoma proliferativas (veanse las Figuras 4 y 5).
Por otro lado, a pesar de que todas las lmeas celulares de melanoma evaluadas mostraban niveles de PIR por debajo de los niveles encontrados en cultivos primarios de melanocitos, existe cierta heterogeneidad entre las lmeas de celulas tumorales que nos permite hacer dos grupos. Asi, los cultivos primarios de melanocitos mostraban una alta actividad transcripcional del gen PIR, a los que los inventores denominaron "Pir+++". Sin embargo, dentro de las lmeas celulares de melanoma ensayadas, habia un grupo con poca/ninguna expresion de PIR, denominado por los inventores "Pir-", y otro grupo de lmeas celulares de melanoma que expresan niveles intermedios de PIR entre Pir- y melanocitos Pir+++, a las que los inventores denominaron "Pir+".
En cuanto a los datos obtenidos, los inventores han encontrado que las lmeas celulares de melanoma Pir+ mostraban una mayor expresion de los genes M-MITF y BCL2 que las lmeas celulares de Pir-. Esta correlation de los niveles de expresion se puede explicar debido a que ambos BCL2 y PIR son objetivos transcripcionales de M- MITF. Por tanto, a las lmeas celulares de melanoma MEL-HO, MEL-Juso y COLO-800 que expresan M-MITF, BCL2 y PIR se les asigna un fenotipo proliferativo, mientras que las lmeas celulares de melanoma A375, Hs294T, HT-144, 1205Lu, WM793B, JSG
y RPMI7951, con baja actividad transcripcional de los genes M-MITF, BCL2 y PIR, se agrupan en un fenotipo invasivo.
Los datos sugieren que la disminucion de la expresion de M-MITF, BCL2 y PIR en las 5 celulas del melanoma da lugar a que las celulas tumorales adquieran capacidad de migracion e invasion.
La Tabla 3 muestra un resumen de los cambios observados en la expresion genica en lmeas celulares de melanoma en comparacion con cultivos primarios de melanocitos.
Tabla 3
Gen
Alteracion
N°de
melanomas
Students f-test (p- value)
PEBP1
Disminuye
17/19
5, 11 E-08
PIR
Disminuye
19/19
0, 00084
M-MITF
Disminuye
7/10
0, 011
BCL2
Disminuye
7/10
0, 014
BCL3
Aumenta
10/10
0, 0033
La Tabla 3 muestra por columnas: los genes analizados mediante RT-qPCR, el tipo de alteracion que presentan los niveles de ARNm en las lineas de melanoma respecto a los 15 melanocitos; el numero de lineas de melanoma que presentan un cambio estadisticamente significativo con respecto al total de las lineas analizadas; y el p-valor obtenido tras realizar la prueba t de Student.
Finalmente, se realizo un analisis de componentes principales con los datos 20 normalizados de expresion relativa correspondientes a los genes PIR, BCL2, BLC3, PEBP1 y M-MITF de 6 lineas celulares de melanoma invasivo (A375, HS294T, HT144, 1205LU, WM793B y JSG) , 3 lineas celulares de melanoma proliferativos (MEL-HO, MEL-JUSO y COLO-800) y 3 cultivos de melanocitos primarios humanos sanos (HEMn-LP, HEMn-MP y HEMn-DP).
Los resultados indican que el primer componente principal recoge el 78, 7% de la varianza total del experimento (Tabla 4) , mientras que los restantes ejes contribuyen de manera poco significativa a la varianza total explicada.
Tabla 4
Varianza total explicada
Componente
Autovalores iniciales
Sumas de las saturaciones al cuadrado de la extraccion
Total
% de la varianza
%
acumulado
Total
% de la varianza
%
acumulado
3, 935
78, 700
78, 700
3, 935
78, 700
78, 700
0, 531
10, 613
89, 313
0, 406
8, 129
97, 443
0, 092
1, 831
99, 274
0, 036
0, 726
100, 000
Metodo de extraccion: Analisis de Componentes principales.
Los coeficientes de cada gen para el calculo de las coordenadas sobre el primer componente se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5
Matriz de coeficientes para el calculo de las puntuaciones en las componentes
Componente
PIR
0, 228
PEBP
0, 240
BCL2
0, 228
BCL3
- 0, 201
M-
MITF
0, 228
Metodo de extraccion: Analisis de componentes principales.
Metodo de rotacion: Normalization Varimax con Kaiser. Puntuaciones de componentes.
Un sistema basado en la expresion de estos genes usando la matriz de coeficientes para este primer eje principal permite clasificar visualmente los distintos tipos de 10 melanocitos (Figura 6).
TRADUCCION AL CASTELLANO DE LOS TERMINOS DE LA LISTA DE SECUENCIAS
El termino "Sequence listing" en la lista de secuencias se refiere a "Lista de 5 secuencias", "Artificial Sequence" a "Secuencia artificial" y el termino "DNA" se refiere a "ADN".
