Diluyente para la congelation de semen equino adaptable a cada individuo
La presente invention se refiere a una composition y a su uso como diluyente para la congelation de semen, en particular de semen equino. Por tanto, la invencion se podrla encuadrar en el campo de la ganaderla equina.
ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR
El sector de la ganaderla equina se caracteriza por la production y crla de ejemplares de alto valor individual, en la que se buscan caracterlsticas morfologicas y funcionales especlficas dependiendo de cada raza.
A diferencia de otros sectores ganaderos, en los que la unidad productiva es el grupo de animales "produccion del rebano", en el sector equino la unidad productiva es el individuo. Asl, mientras que en el sector ganadero en general, si un individuo no posee eyaculados de una calidad aceptable, se elimina el individuo de la cadena productiva y su sustitucion, en la industria equina esto no es una option, debido al alto valor individual de los sementales, bien por su morfologla, bien por su funcionalidad.
Ademas como resultado de una selection que no ha tenido en cuenta la calidad seminal, nos encontramos con una gran variabilidad individual en dicha calidad y en la respuesta a la congelacion entre sementales. Sin embargo, debido a su alto valor, la estrategia de congelar semen de todos los sementales es esencial.
La congelacion de semen equino en nuestro pals, y en toda Europa se viene realizando con tres tipos basicos de diluyentes, diluyentes basados en una solution de lactosa al 11% con yema de huevo y glicerol a concentraciones que varlan entre el 2 y el 5% (Martin et al., J.Reprod. Fertil. Suppl. 1979, (27) :47-51, diluyentes comerciales a base de yema de huevo, como el Ghent Minitub, o leche desnatada, como INRAFreeze IMV. Sin embargo, tanto con los diluyentes comerciales como con los de laboratorio se observa una alta mortalidad espermatica y ademas los espermatozoides supervivientes presentan diversos grados de dano no letal (Ortega Ferrusola et al., J Androl. 2008, 29 (2) :213-21) , pero que disminuye su vida media en el tracto genital de la yegua, dificultando el manejo reproductivo y
disminuyendo aun mas la fertilidad. Es decir, disminuye la fertilidad por la alta mortalidad espermatica durante la congelacion y ademas por la menor vida media de los que sobreviven el proceso.
Es conocido que el principal dano que sufren los espermatozoides durante el proceso de congelacion-descongelacion es debido al shock osmotico que experimentan durante la congelacion debido a la perdida de agua intracelular, y durante la descongelacion debido a la rehidratacion brusca.
Los medios de congelacion actuales no tienen en cuenta uno de los principales problemas que presenta la congelacion de semen equino, la alta variabilidad individual y la necesidad de desarrollar protocolos individualizados para cada semental. Esto causa que sementales de un alto valor genetico no puedan ver su semen congelado. En general, la federation hlpica internacional determina que los eyaculados han de tener al menos un 35% de motilidad progresiva a la descongelacion para poder entrar en un programa comercial.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invention se refiere a un diluyente para la congelacion de semen equino que puede modularse y adaptarse de forma individual a cada individuo para la congelacion de semen equino, basado en combinaciones de crioprotectores alternativos, y a concentraciones especlficas que minimizan el dano osmotico tanto durante la congelacion como posterior descongelacion permitiendo obtener unas tasas de supervivencia de los espermatozoides equinos post descongelacion muy superiores a los medios actualmente disponibles en el mercado.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invencion se refiere a una composition que comprende:
a) solution salina balanceada de Hank;
b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) al menos un crioprotector.
Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere al uso de la composicion tal y como
se ha descrito anteriormente como diluyente de congelation de esperma.
Un tercer aspecto de la presente invention se refiere a una dosis de insemination que comprende la composicion tal y como se ha descrito anteriormente.
Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un kit para la preparation de la composition tal y como se ha descrito anteriormente que comprende:
a) solution salina balanceada de Hank, b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) al menos un crioprotector.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Un primer aspecto de la presente invencion se refiere a una composicion que comprende:
a) solucion salina balanceada;
b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato calcico;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) al menos un crioprotector.
Por solucion salina balanceada se entiende una solucion hecha a pH fisiologico y a concentration de sales fisiologica. Estas soluciones normalmente incluyen sodio, potasio, calcio, magnesio y cloro. Normalmente se usan para lavar tejidos y celulas y se suelen combinar con otros agentes para tratar tejidos y celulas. Proporcionan agua e iones inorganicos a las celulas, y mantienen el pH fisiologico. La solucion salina balanceada se selecciona de solucion de Alsever, solucion de Earle, solucion de Gey, solucion de Hanks, solucion de Dulbecco, solucion de Puck, solucion de Ringer, solucion de Simm y solucion de Tyrode, preferiblemente la solucion salina balanceada es la solucion de Hank.
Por solucion salina balanceada de Hank (tambien llamada solucion fisiologica de Hank) se entiende una solucion que comprende NaCl, KCl, MgSO4.7H2O, CaCl2.H2O, Na2HPO4, KH2PO4, NaHCO3 y glucosa. Las proporciones de dichas sales son bien conocidas para un experto en la tecnica, pero a modo de ilustracion, una posible composicion de una solucion
balanceada de Hank comprenderla 0, 14 g de CaCl2, 0, 40 g de KCl, 0, 06 g de KH2PO4, 0, 2 g de MgSO4.7H2O, 8 g de NaCl, 0, 35 g de NaHCO3 y 13, 5 g de glucosa. Ademas, la solucion balanceada de Hank comprende de 0, 1% a 1% p/v de acido 4- (2-hidroxietil) -piperazina etanosulfonico, conocido normalmente por su acronimo en ingles, HEPES. El HEPES permite ajustar el pH.
Por fosfocaseinato calcico se entiende fosfocaseinato nativo de leche. Preferiblemente el fosfocaseinato nativo de leche se obtiene a partir de leche desnatada segun lo descrito en Puliot et al "On the conventional cross 'flow microfiltration of skim milk for the production of native phosphocaseinate" (International Dair y Journal, 6 (1) , 1996, pp. 105-11. El fosfocaseinato calcico tiene la funcion de protection de membrana.
El hidroxietilalmidon son pollmeros naturales de la amilopectina, modificados qulmicamente por una hidroxietilacion en la subunidad de los carbonos C2, C3 y C6 de la glucosa. La amilopectina, molecula ramificada, puede proceder del almidon de malz o de la patata. El hidroxietilalmidon permite reducir la concentration o sustituir a la yema de huevo como protector de membrana durante la criopreservacion. Asl como la yema de huevo, el hidroxietilalmidon tiene la funcion de proteccion de membrana.
La principal ventaja de esta invention es que se pueden preparar diluyentes sin o con muy poca yema de huevo, y es por tanto una alternativa por bioseguridad. Actualmente la legislation en muchos palses preve la retirada de la yema de huevo debido al riesgo biologico (principalmente la trasmision de patogenos) que supone en diluyentes de congelacion.
En una primera realization del primer aspecto de la presente invencion, la composition comprende de 0, 5% a 7% p/v de fosfocaseinato, preferiblemente de 1% a 5% p/v de fosfocaseinato.
En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composicion comprende de 1% a 40% en peso de hidroxietilalmidon.
Aunque el hidroxietilalmidon sustituye a la yema de huevo, serla posible tambien usarlos en combinacion. En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion la composicion ademas comprende de 0, 1% a 5% v/v de yema de huevo. La yema de huevo normalmente
se somete a una centrifugacion, preferiblemente durante aproximadamente 15 min y 2000 rpm, y se escoge la fraccion superior del tubo.
En otra realization del primer aspecto de la presente invention, la composition ademas comprende de 0, 5 mM a 3 mM de cafelna.
En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composicion ademas comprende de 0, 1 nm a 5 pM de melatonina.
En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composicion ademas comprende de 1 mM a 100 mM de taurina.
En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composicion ademas comprende de 1 mM a 100 mM de cistelna.
En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composicion ademas comprende de 1 mM a 100 mM de penicilamina.
La cafelna, melatonina, taurina, cistelna y penicilamina actuan como antioxidantes.
En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, el crioprotector se selecciona de N-metilformamida, N, N-dimetilformamida, 1, 2, 3-propanotriol y cualquiera de sus mezclas.
En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la concentracion del crioprotector es 0, 1% a 15% v/v, preferiblemente de 0, 5% a 10% v/v.
En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, el crioprotector comprende N-metilformamida, preferiblemente la concentration de N-metilformamida es de 0, 5% a 8% v/v, mas preferiblemente de 1% a 6% v/v.
En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, el crioprotector comprende
N, N-dimetilformamida, preferiblemente la concentracion de N, N-dimetilformamida es de
O, 5% a 7% v/v, mas preferiblemente de 1% a 5% v/v.
En otra realization del primer aspecto de la presente invention, el crioprotector comprende 1, 2, 3-propanotriol, preferiblemente concentration de 1, 2, 3-propanotriol es de 0, 3% a 5% v/v, mas preferiblemente de 0, 5% a 3% v/v.
Otra ventaja de la presente invention es que este diluyente puede comprender diversas combinaciones de crioprotectores. Esto proporciona la posibilidad de preparar una gran variedad de diluyentes diferentes, lo que permite adaptarse a la variabilidad natural presente en el semen de diferentes ejemplares.
En una realization particular del primer aspecto de la presente invention, la composition que comprende:
a) solution salina balanceada de Hank;
b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) de 1 a 5% v/v de N, N-dimetilformamida
En una realization particular del primer aspecto de la presente invention, la composition que comprende:
a) solucion salina balanceada de Hank;
b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) de 1% a 5% v/v de , N, N-dimetilformamida y de 0, 5% a 2% v /v de 1, 2, 3-propanotriol.
En una realizacion particular del primer aspecto de la presente invencion, la composicion que comprende:
a) solucion salina balanceada de Hank;
b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) de 1% a 6% v/v de N-metilformamida.
En una realizacion particular del primer aspecto de la presente invencion, la composicion que comprende:
a) solucion salina balanceada de Hank;
b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) de 1% a 6% v/v de N-metilformamida y de 0, 5% a 2% v /v de 1, 2, 3-propanotriol.
En una realization particular del primer aspecto de la presente invention, la composition que comprende:
a) solucion salina balanceada de Hank;
b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) de 1% a 3% v /v de 1, 2, 3-propanotriol.
En una realizacion particular del primer aspecto de la presente invencion, la composicion que comprende:
a) solucion salina balanceada de Hank;
b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) de 1% a 5% v/v de N, N-dimetilformamida y de 1% a 6% v/v de N-metilformamida.
En una realizacion particular del primer aspecto de la presente invencion, la composicion que comprende:
a) solucion salina balanceada de Hank;
b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) de 1% a 5% v/v de N, N-dimetilformamida, de 1% a 5% v/v de N-metilformamida y de 1% a 3% v /v de 1, 2, 3-propanotriol.
Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha descrito anteriormente como diluyente de congelation de esperma, preferiblemente de esperma equino.
Un tercer aspecto de la presente invention se refiere a una dosis de insemination que comprende el diluyente de congelation tal y como se ha descrito anteriormente. Por dosis de inseminacion se entiende una dosis utilizada para inseminar yeguas, que comprende semen equino del ejemplar deseado y el diluyente de la invencion.
Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un kit para la preparation de la composition tal y como se ha descrito anteriormente que comprende:
a) solution salina balanceada de Hank, b) de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato;
c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon;
d) al menos un crioprotector.
En una realization del cuarto aspecto de la presente invencion, la a) solucion salina balanceada de Hank, b) de de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato y c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon estan premezclados formando parte de una unica solucion.
En otra realizacion del cuarto aspecto de la presente invencion, el crioprotector se selecciona de N-metilformamida, N, N-dimetilformamida, 1, 2, 3-propanotriol y cualquiera de sus mezclas. Preferiblemente los crioprotectores estan separados en distintos recipientes.
Para la preparacion de la composicion de la invencion con el kit, la persona interesada mezclara parte de la disolucion que comprende a) solucion salina balanceada de Hank, b) de de 0, 1% a 10% p/v de fosfocaseinato y c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidon (solucion A) con al menos uno de los crioprotectores (soluciones B, C y D, respectivamente, cada letra (B, C o D) designando un crioprotector).
Por tanto, sin tener en cuenta la variabilidad que ademas se puede obtener variando las concentraciones, con este kit se pueden obtener 7 composiciones de la invencion diferentes: AB, AC, AD, ABC, ABD, ACD, ABCD.
A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invention.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Fig. 1 representa los valores de motilidad total (MT) y velocidad circular (VCL) de diferentes soluciones. AC: 97, 5 ml solution base + 2, 5 ml 1, 2, 3, propanotriol; AB: 96 ml solution base + 4 ml N, N-dimetilformamida; ABC: 96 ml solucion base + 2, 5 ml N-dimetilformamida + 1, 5 ml 1, 2, 3, propanotriol; AD: 96 ml solucion base + 4 ml N-metilformamida.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Procedimiento de obtencion de un diluyente de la invencion
En primer lugar se preparo la solucion base:
a) se anadieron 5% p:v de fosfocaseinato nativo de leche a una solucion salina balanceada de Hank tamponada con HEPES;
b) posteriormente se anadio HES 10% p:v a la solucion obtenida en (a) ;
c) a la solucion obtenida en (b) se anadio cafelna 1 mM, penicilamina 5 mM, melatonina en 5 nM, taurina 5 mM;
d) por ultimo se homogenizo la solucion obtenida en (c).
Posteriormente se realizaron diversas mezclas con los crioprotectores, segun indicado:
Composition
ml solucion base (A)
Crioprotector/es
AB
ml
ml N, N-dimetilformamida
AC
97, 5 ml
2, 5 ml 1, 2, 3, propanotriol
AD
ml
ml N-metilformamida
ABC
ml
2, 5 ml N, N-dimetilformamida + 1, 5 ml 1, 2, 3, propanotriol
ABD
ml
ml N, N-dimetiformamida +2 ml N- metilformamida
ACD
ml
ml 1, 2, 3 propanotriol + 4 ml N- metilformamida ,
ABCD
ml
ml 1, 2, 3 propanotriol + 2 ml N-
metilformamida + 2 ml N, N-dimetilformamida
Tabla 1. Composition de diferentes diluyentes de congelation de la invention
Ejemplo 2. Tasas de supervivencia de los espermatozoides equinos post descongelacion
Se prepararon mezclas que comprenden de un 5% a un 20% de plasma seminal en los diluyentes de congelation de la invention, para que la concentration sea de aproximadamente 100 millones de espermatozoides por ml total.
Una vez mezclado, se dejo durante una hora a 5°C (periodo de equilibrado) , y posteriormente se congelo.
Al cabo de 7 dlas las muestras se descongelaron y se evaluo la motilidad total (MT) y la velocidad circular (VCL) medidas mediante sistema computerizado de analisis seminal.
Los valores mostrados en la tabla 2 a continuation son medias de 42 eyaculados (de 42 ejemplares diferentes) divididos en 4 allcuotas y congelados en 4 de los medios descritos (AC, AB, ABC y AD) :
MT
Error estandar
VCL
Error estandar
AC
28, 8
3, 8
38, 5
1, 6
AB
34, 8
2, 4
44, 1
1, 9
ABC
47, 2
2, 2
AD
44, 9
3, 2
42, 9
1, 7
Tabla 2. Motilidad total (MT) y velocidad circular (VCL).
En la figura 1 estan representados estos valores. Como se puede observar, la respuesta varla entre medios y en todo ellos se alcanzan los mlnimos requeridos para la comercializacion de semen equino (motilidad progresiva superior al 30%).
