COMPOSICION ALIMENTICIA DE ABEJAS MELIFERAS Y PROCEDIMIENTO PARA CONTROLAR INFECCIONES EN DICHAS ABEJAS MEDIANTE DICHO ALIMENTO
Campo tecnico de la invencion
La invencion se enmarca en el sector tecnico de la Agricultura, mas concretamente en el area de la Apicultura (crianza de abejas) y la Veterinaria (tratamiento de enfermedades en colmenas) , aunque tambien esta relacionada con el sector de la Alimentacion y Consumo de productos provenientes de la crla de abejas.
Objeto de la invencion
La presente invencion se refiere a una composition alimenticia para las colonias de abejas mellferas que contiene fitoalexinas de calidad alimentaria, principalmente resveratrol (y especialmente trans-resveratrol) , compuestos que son capaces de favorecer el desarrollo normal de las colonias, y en especial combatir las nosemosis (A y C). Asimismo, la invencion esta relacionada con un procedimiento para combatir las infecciones de las colonias de dichas abejas mellferas mediante la alimentacion de las colonias de abejas con dicha composicion alimenticia que contiene fitoalexinas.
Antecedentes de la invencion
Las colonias de abejas mellferas son susceptibles a sufrir infecciones e infestaciones por agentes tales como virus, acaros, lepidopteros, hongos, bacterias, etc., que afectan la salud de las abejas y en consecuencia disminuyen la productividad de las explotaciones aplcolas y las acciones polinizadoras de estos insectos, originando colateralmente graves perjuicios economicos y medioambientales. Una de las principales infestaciones sufridas en la ultima decada por las abejas a nivel mundial es atribuida a la action del microsporidio Nosema ceranae, considerado como uno de los factores claves del reciente fenomeno de colapso masivo de colonias de abejas. Efectivamente, Nosema ceranae es actualmente el patogeno de las abejas mas prevalente en Espana (Revisado por Higes M., Meana A., Bartolome C., Botlas C., Martln-Hernandez R. Nosema ceranae (Microsporidia) , a controversial 21st centur y honey bee pathogen. Environmental Microbiology Reports 2013, 5 (1) , 17-29)
superando incluso la prevalencia de la Varroa destructor (Garrido-Bailon, Tesis doctoral, 2012) lo que sugiere la importancia sanitaria que presenta. Ademas esta misma situation ha sido detectada en diferentes palses europeos (Austria, Francia, Holanda, Suiza, Eslovenia, 5
Polonia, Italia, Grecia, Portugal, Alemania, etc.) y del continente Americano (Estados Unidos, Argentina, Chile, Uruguay). En todas estas zonas, se ha podido constatar cientlficamente el papel central de Nosema ceranae en el conocido como Slndrome de Despoblamiento de las Colmenas (SDC) o Desorden de Colapso de las Colonias (CCD) (Higes y col., 2008 Environmental Microbiology, Higes y col, 2009 Environmental Microbiology Reports) , de ahl la necesidad de mejorar las estrategias de control. Estamos sin lugar a dudas ante el principal problema sanitario de la apicultura mundial en el siglo XXI. Tambien los resultados de investigaciones realizadas por los inventores nos permiten descartar como factor prioritario los pesticidas agricolas, fundamentalmente neonicotinoides, como responsables del problema generalizado de despoblamiento de las colmenas.
Como se ha indicado anteriormente, en los ultimos anos se ha producido una elevada mortandad de abejas en diferentes zonas aplcolas tanto en Espana, como en palses vecinos con caracterlsticas productivas similares (Faucon y col., 2002; Chauzat y col., 2004; Marinelli y col., 2004; Higes y co., 2005; Stoktad, 2007; Plischuck y col., 2009) o en otras zonas geograficas (Finley y col., 1996; Mangum 1999). En todos los casos se denunciaron elevadas mortalidades de colonias de abejas, sobre todo durante el otono y el invierno, aunque durante 2005 tambien se detectaron a lo largo de todo el ano.
Uno de los principales problemas que ha planteado este hallazgo es el hecho de que la fumagilina, el tratamiento disponible y de eleccion actual para la nosemosis causada por N. apis (Katznelson and Jamieson, 1952; Hartwig and Przelecka, 1971; Higes et al., 2004) , si bien resulta efectiva tras su aplicacion (Higes y col., 2008, 2009) actualmente no esta autorizada en apicultura en la mayorla de los palses de la Union Europea, por lo que resulta fundamental desarrollar nuevas moleculas que suplan con exito la ausencia de la fumagilina. Por lo tanto, la busqueda de compuestos efectivos frente a N. ceranae, debe ser tambien un objetivo prioritario teniendo en cuenta la situacion actual.
Por otra parte, y dado que muchos antifungicos son de uso cllnico limitado ya que frecuentemente conducen a varias toxicidades en pacientes, tales como efecto hemolltico frente a eritrocitos humanos, aparece otra opcion orientada hacia el empleo de algunos productos naturales, que parecen no tener ese efecto drastico. Uno de los actualmente considerados es el resveratrol, que entre otras propiedades muestra un atractivo potencial como antifungico en humanos, si bien todavla no se conoce el mecanismo real de su accion (Jung, 2005).
A este respecto, recientemente Maistrello y col. (2008) demostraron en pruebas realizadas unicamente en laboratorio y sin contrastar estos resultados con pruebas in situ que el resveratrol estandar analltico (no apto para consumo humano) adicionado a alimentos aumento la longevidad de las abejas y resulto eficaz para inhibir el desarrollo de Nosema ceranae en abejas infectadas. Sin embargo, no se han correlacionado aun estos datos con estudios de campo ni con alimentacion convencional a colmenas. Esta sustancia ya ha sido tambien testada con exito frente a otros microsporidios de humanos y mamlferos (Leiro y col., 2004; Jung y col., 2005; Didier y col., 2006).
El resveratrol se ha detectado como el principal componente bioactivo en extractos de plantas usadas desde siglos pasados en la medicina tradicional para enfermedades humanas, de hecho se ha mostrado tan potente como la anfotericina B frente a S. cerevisae. Estudios recientes han mostrado que puede inhibir el desarrollo del microsporido Encephalitazoon cunicoli en experimentos in Vitro (Leiro, 2004).
Trans-resveratrol es una fitoalexina producida por las angiospermas en respuesta a las infecciones microbianas, danos, radiacion UV, frlo, calor, ataque de microorganismos, estres abiotico, etc. La forma trans (t-r) del resveratrol aparece en la piel de uvas, cacahuetes, pistachos, soja (Langcage, 1976; Dercks, 1989; Jeandet, 1993). El isomero cis (c-r) no se ha encontrado en Vitis vinifera aunque ambos suelen aparecer en los vinos. El resveratrol es un precursor de las viniferinas, que son potentes agentes antifungicos (Palomino, 2000; Loredana, 2004). Ambos isomeros aparecen de forma natural como dos isomeros geometricos, generalmente el trans es mas predominante (Filip, 2003) aunque tambien aparecen sus glicoxidos, piceidos, trans (t-p) y cis (c-p) que tambien poseen propiedades similares. In Vitro la forma trans es mas termoestable y fotoestable y la cis mas inestable, pasando rapidamente a la forma trans (Goldberg, 1995) aunque el trans tambien puede sufrir fotoisomerizacion, generando algo de cis (Hanzlikova, 2004) , de modo que en experiencias prolongadas e intensas puede incrementar la cantidad de cis (Trela, 1996).
Descripcion de la invencion
Un primer objeto de la presente invencion esta constituido por una composition alimenticia azucarada para abejas mellferas que contiene en su formulation al menos una fitoalexina, que es comunmente y de manera mas preferida resveratrol en su forma trans-, en una
cantidad comprendida entre 0.1% y 2.8% en peso del total de composition, incluidos ambos llmites.
La fitoalexina es de grado farmaceutico. Se entiende por grado farmaceutico una fitoalexina apta para uso y consumo humano con calidad de suplemento alimentario (food grade) , que debe cumplir las normas USFDA, EFSA o AEMPS (U.S.Food and Drug Administration, European Food Safety Authority y Agencia Espanola de Medicamentos y Productos Sanitarios, respectivamente) , ya que dicho alimento dejara rastro en la miel producida por las abejas y no puede ser una fitoalexina, por ejemplo resveratrol industrial, como las que se conocen en el mercado. En definitiva, no todas las fitoalexinas comercializadas, como el resveratrol, son de grado farmaceutico y aptas para consumo humano, por lo que la presente invention supone un avance en el campo al emplear fitoalexinas optimas para alimentation de abejas de production de miel, ceras y otros productos.
En una realization preferida, la fitoalexina es concretamente resveratrol, siendo mas preferentemente todavla su forma trans- (uno de los isomeros del resveratrol). Preferentemente, del total de fitoalexinas que comprende el alimento el 99% es trans- resveratrol. De manera mas preferida todavla, el 99, 95% de la cantidad de fitoalexina que contiene la composicion (0.1%-2.8% en peso del total de composicion) es solo de trans- resveratrol.
Basicamente, la composicion comprende una fitoalexina que es resveratrol en su forma trans- de forma mayoritaria, y al menos una segunda fitoalexina. Preferentemente, la segunda fitoalexina o fitoalexinas son seleccionadas entre cis-resveratrol, un isomero de piceido y cualquier combinacion de los mismos. Por isomero del resveratrol se entiende cualquiera de sus formas cis- y trans- (estando esta ultima siempre presente en esta realizacion) ; de igual forma, por isomero de piceido se entiende cualquiera de sus formas cis- y trans-. Esta alternativa es la mas preferida, por cuanto las composiciones de fitoalexinas comerciales y de calidad alimentaria que se emplean para preparar la composicion alimenticia de abejas siempre presentan trazas de estas formas: cis-resveratrol e isomeros de piceido.
La composicion alimenticia puede ser seleccionada entre un alimento llquido en solution azucarada y un alimento semisolido en forma de pasta azucarada con humedad inferior al 50%. En el primer caso, el llquido puede ser preferentemente un jarabe de alimentacion de
abejas. En el segundo caso, puede ser preferentemente una pasta de azucares o miel (- alimento fabricado a base de miel, tambien llamado "candy", muy seco y duro que se reblandece por la absorcion progresiva de la humedad de la colmena-). Por "azucarada se entiende que la composition alimenticia esta principalmente constituida por azucares, concretamente estando estos comprendidos de manera general entre 20%-85%, y mas preferentemente entre 40% y 80%, en peso del total de composicion.
Cuando la composicion alimenticia es un jarabe de alimentation de abejas, este puede contener preferentemente al menos una fitoalexina en una cantidad comprendida entre 0.4% y 2.8% en peso total de composicion, incluido ambos llmites. Asl por ejemplo, puede contener entre 1 y 7 gramos de fitoalexinas cada 250 gramos de jarabe. Cuando la composicion alimenticia es una pasta de azucares o miel, esta puede contener preferentemente entre 0.1% y 0.7% en peso total de composicion, incluido ambos llmites, de fitoalexinas. Asl por ejemplo, puede contener entre 1 y 7 gramos de fitoalexina por cada 1000 g de pasta. En un caso u otro, la composicion alimenticia comprende en su forma mas preferida 0.6% en peso del total de composicion de fitoalexinas.
En un caso particular mas preferido de la invention cuando la composicion alimenticia es un jarabe, en su forma mas preferida contiene entre 1 y 2 gramos, mas preferentemente entre 1.5 y 1.75 gramos (0.6%-0.7%) , de fitoalexinas, cada 250 ml de jarabe de azucar. Dicho jarabe puede ser jarabe de azucar al 50% de agua.
En otro caso particular de la invencion cuando la composicion alimenticia es una pasta semisolida azucarada, en su forma mas preferida contiene entre 5 y 7 gramos a, mas preferentemente 6 gramos (0.6%) , de fitoalexinas, por cada 1 kg de pasta semisolida azucarada, que puede comprender preferiblemente en su formulation:
30% de glucosa
50 % de fructosa
18% agua; y
2% de componentes adicionales.
De manera preferida, la composicion alimenticia contiene tambien en cualquiera de sus formas vitaminas y/o aminoacidos que complementan el alimento.
La composition alimenticia descrita en cualquiera de sus variantes puede prepararse a partir de la combination de un alimento azucarado para abejas, preferentemente en forma de composition llquida (por ejemplo jarabe, preparado comunmente a partir de la mezcla de agua y azucar en partes iguales en peso) o semisolida (por ejemplo candy, preparado comunmente con miel y agua, aunque tambien puede prepararse con jarabe de glucosa y agua) con una composition de fitoalexinas de consumo humano, es decir de calidad alimentaria, segun los criterios antes especificados. Esta composition de fitoalexinas puede estar compuesta exclusivamente por resveratrol, concretamente por trans-resveratrol que es la forma mas comun, o puede contener otras fitoalexinas como las mencionadas anteriormente, que es el caso mas generalizado ya que suelen existir trazas de otras fitoalexinas conocidas.
Las composiciones alimenticias de colonias de abejas mellferas como las que se describen aqul, contribuyen de forma significativa al control de la infection, manteniendo los niveles de parasitacion dentro de llmites que permiten a las colonias ser productivas gracias a la presencia de las fitoalexinas, que se muestra como una alternativa eficaz, economica y ambientalmente mas sostenible y sana para el consumidor que otros compuestos empleados en la actualidad, como la fumagilina (ver Ejemplos). Estas composiciones alimenticias se muestran especialmente eficaces frente a la nosemosis, y particularmente la nosemosis Tipo A y C. En el ambito de la presente memoria se entiende por control de una infection a la reduction en la parasitacion sin eliminar completamente la infection.
La presente invencion se refiere tambien al uso de la composicion alimenticia descrita, en cualquiera de sus variantes para el control de infecciones por microorganismos patogenos en colmenas de abejas mellferas, y especialmente de infecciones por nosemosis, siendo mas preferible aun la nosemosis tipo A y C.
De esta forma, un tercer objeto de la presente invention lo constituye un metodo para controlar infecciones por microorganismos patogenos en colmenas de abejas mellferas, que comprende administrar a la colmena la composition alimenticia antes descrita en cualquiera de sus variantes, que contiene en su formulation al menos una fitoalexina en una cantidad comprendida entre 0.1% y 2.8% en peso del total de composition, incluidos ambos llmites, en al menos una dosis.
La infeccion a tratar es en el caso mas preferido la nosemosis, siendo mas preferible aun la nosemosis tipo A y C.
Como se ha dicho anteriormente en relacion al producto, el resveratrol y mas preferentemente el trans-resveratrol es la fitoalexina de grado farmaceutico de eleccion preferida, aunque tambien puede combinarse con otras fitoalexinas, siendo asl como normalmente se presenta en las composiciones de fitoalexinas de consumo humano o de calidad alimentaria que se utilizan para preparar la composition. Ademas, la composition alimenticia puede ser administrada en forma de alimento llquido o de alimento semisolido como se describe en las variantes anteriores, que son preferidas. En el primer caso, el llquido azucarado puede ser preferentemente un jarabe de alimentation de abejas. En el segundo caso, puede ser preferentemente una pasta semisolida azucarada de alimentacion de abejas. En ambas variantes de presentation del alimento, el metodo puede llevarse a cabo de forma mas preferida con las composiciones especlficas descritas anteriormente para el jarabe y para la pasta semisolida azucarada.
Preferentemente, la composicion alimenticia se administra a la colmena repartiendola entre 1 y 4 dosis (es decir, la dosis total de composicion alimenticia se administra en una, dos, tres o cuatro veces). Cuando la composicion es un llquido azucarado, se administra preferentemente en cuatro dosis, mientras que cuando es una pasta semisolida se administra de una vez; esto se debe a que las composiciones llquidas azucaradas, como el jarabe, se consumen mas rapido, no pudiendose administrar en cantidades elevadas de producto porque si se liberara por accidente podrla matar a las abejas. Por el contrario, cuando el producto es semi-solido, este problema no se da y por tanto puede administrase toda la dosis de una vez. Asl, por ejemplo, se puede administrar la composicion alimenticia a una colmena forma llquida (jarabe) o en forma semisolida (candy) , conteniendo una cantidad de 7 gramos de fitoalexina, concretamente trans-resveratrol. En el primer caso, se administrarlan cuatro dosis de 250 gramos de jarabe contiendo cada una 1, 75 gramos de fitoalexina (25% de la dosis total de fitoalexinas por colmena). En el segundo caso, se darla una unica dosis del candy, siendo de 1 kilogramo de candy que contiene los 7 gramos de fitoalexinas (100% de la dosis de fitoalexinas por colmena, de una vez). En definitiva, independientemente de la forma de presentacion, la dosis a administrar de composicion alimenticia y de fitoalexinas que contiene es la misma.
Tambien de manera preferida, cuando la composition se administra en mas de una dosis, cada dosis se administra con 7 dias de intervalo entre ellas.
Se ha comprobado que es mas conveniente que la administration de la composicion alimenticia en primavera se realice en forma de alimento liquido (jarabe) , mientras que en otono es mas eficaz la administracion como alimento semisolido (candy).
Asi, se ha constatado un efecto significativo del metodo descrito en el control de la infection de abejas infectadas por nosemosis, observandose una reduction en la parasitacion, es decir, en el numero de abejas infectadas por colmena, y en la production de esporas en dichas abejas infectadas tras la administracion de la composicion alimenticia.
Al poder estar la composicion alimenticia constituida por la combination de un alimento azucarado de abejas comun y conocido y una composicion de fitoalexinas preparada para su uso humano y con calidad alimentaria, la memoria cubre asimismo un metodo de control de las infecciones por microorganismos patogenos en colmenas de abejas meKferas, y especialmente de infecciones por nosemosis, siendo mas preferible aun la nosemosis tipo A y C, que comprende administrar a la colmena de forma separada pero simultaneamente ambos componentes, alimento azucarado de abejas y composicion de fitoalexinas. Dicha administracion simultanea de alimento y fitoalexinas se puede realizar siguiendo todas las alternativas y especificaciones planteadas en esta memoria para la composicion alimenticia en cuanto a proporciones, tipos de alimentosa y fitoalexinas, etc. y en cuanto al metodo (formas de administracion: cantidades, frecuencias, formas de administration...).
Breve description de las Figuras
Figura 1. Comparacion del numero de esporas contabilizado en colmenas de abejas infectadas por N. ceranae tratadas con o sin resveratrol de acuerdo con el Ejemplo 1. La figura en gris claro representa el grupo R, y la figura de gris oscuro representa al grupo NR.
Figura 2. Resultados del primer ensayo comentado en el Ejemplo 2.2 de comparacion de colmenas tratadas con la composicion alimenticia objeto de la presente invention y alimentos que comprenden fumagilina. RJ: resveratrol en jarabe; RC: resveratrol en candy; AF: acido formico; FUMA: fumagilina; CJ: control del tratamiento con jarabe; CC: control del tratamiento con candy; NI: sin intervention.
Figura 3. Porcentaje de parasitacion medio en cada grupo tratado en el estudio (CR= grupo ensayo con resveratrol adicionado a candy; JR= grupo ensayo con resveratrol adicionado a jarabe; FUM= grupo testigo positivo al que se administro fumagilina; C= grupo testigo solo candy; J= grupo testigo solo jarabe; ST= grupo testigo sin intervention). M1: antes del tratamiento en otono 2011; M2: despues del tratamiento en otono 2011; M3: antes del tratamiento en primavera 2012; M4: despues del tratamiento en primavera 2012; M5: antes del tratamiento en otono 2012; M2: despues del tratamiento en otono 2012.
Figura 4. Porcentaje de viabilidad medio en los grupos estudiados en abril de 2013. CR= grupo ensayo con resveratrol adicionado a candy; JR= grupo ensayo con resveratrol adicionado a jarabe; FUM= grupo testigo positivo al que se administro fumagilina; C= grupo testigo solo candy; J= grupo testigo solo jarabe; ST= grupo testigo sin intervencion.
Figura 5. Production de miel media en cada grupo en verano 2012. CR= grupo ensayo con resveratrol adicionado a candy; JR= grupo ensayo con resveratrol adicionado a jarabe; FUM= grupo testigo positivo al que se administro fumagilina; C= grupo testigo solo candy; J= grupo testigo solo jarabe; ST= grupo testigo sin intervencion.
Ejemplos
Ejemplo 1. Evaluation en laboratorio de la actividad de resveratrol frente a Nosema spp La evaluacion de la eficacia del resveratrol requirio realizar previamente ensayos de toxicidad del producto en laboratorio, y para ello se debieron realizar estudios preliminares de solubilidad y valoracion de aceptacion del resveratrol para determinar la concentration maxima que se puede administrar a las abejas. Dado que los ensayos se deben realizar con abejas de edad controlada, fue necesario tomar cuadros de crla de las colmenas que se introdujeron en incubadores en el laboratorio hasta el nacimiento de las abejas. Por ello estos ensayos solo se pueden realizar en los meses desde mediados de primavera e inicio del otono.
Se adapto la metodologla siguiendo las recomendaciones de la OECD 213 (GUIDELINES FOR THE TESTING OF CHEMICALS. Honeybees, Acute Oral Toxicity Test) para la determination de la toxicidad via oral del resveratrol. Esta gula indica que para las sustancias de baja toxicidad esperada (como es el resveratrol) , se pueden realizar test limites con 100 pg principio activo/abeja. Si la toxicidad es superior a ese valor no se requieren pruebas adicionales de toxicidad.
Tras la realization de varios test, se pudo determinar que la DL50 del resveratrol es superior a 100 pg/abeja, abordando posteriormente los ensayos de eficacia en el laboratorio. En estos estudios, se establecieron 2 grupos con 4 replicados por grupo utilizando abejas nacidas en el laboratorio. Un primer grupo (R) de abejas infectadas individualmente con 160.000 esporas de N. ceranae, utilizando la metodologla desarrollada y puesta a punto. A los 7 dlas post-infection, se les administro una dosis (oral) de 6mg/ml que se mantuvo ad limitum durante 24 horas. El segundo grupo (NR) , estaba formado por abejas infectadas (a la misma dosis que el grupo anterior) a las que no se les suministro resveratrol sino una solution de agua y azucar. Se tomaron 5 abejas por replicado a los dlas 9, 10 y 11 dlas post-infection, que en el grupo R correspondla a 24, 48 y 72 horas despues de la administration del resveratrol. Se observo que 72 horas despues de la administration se produce una reduction estadlsticamente significativa (p<0.05) en los recuentos de esporas en abejas infectadas por N. ceranae.
Tabla 1. Comparacion del numero de esporas contabilizado en colmenas de abejas infectadas por N. ceranae tratadas con o sin resveratrol.
h
h
h
Grupo R
40.106.200
35.106.500
33.253.400*
(Resveratrol)
(± 16.535.833)
(±12.739.944)
(± 16.203.105)
Grupo NR
40.000.933
34.710.800
52.490.000*
(No Resveratrol)
(± 11.425.964)
(± 15.008.312)
(± 24.177.759)
Ejemplo 2. Analisis y valoracion del metodo de tratamiento de infestaciones (nosenoma) en colonias de abejas mellferas.
2.1 Desarrollo de metodologla analltica para analisis de trans-resveratrol y compuestos relacionados en materia prima, miel, polen cera y alimentos para abejas Con el fin de poder conocer tanto la composition de la materia prima como establecer correctamente la cantidad de resveratrol que debla anadirse al alimento, se han desarrollado metodos basados en el empleo de cromatografla llquida de alta eficacia (HPLC) con detection ultravioleta y fluorescencia.
Los ensayos han sido realizados sobre trans-resveratrol, riqueza minima del 99%, grado farmaceutico de Megaresveratrol® (Danbur y , CT, USA) ; tambien se ha ensayado con trans-
resveratrol al 50% de pureza de la misma firma comercial. Para conocer la riqueza del producto comercial expedido como suplemento alimenticio aprobado por FDA como fuente de trans-resveratrol y otras fitoalexinas, y puesto que se partio de un etiquetado de riqueza minima del 99%, se aplico Cromatografla llquida con detection diodos en fila y fluorescente (HPLC- DAD-FLD) y se encontro que dentro de la variation prevista el producto cumplla la especificacion; empleando cromatografla llquida con deteccion espectrometrica de masas (HPLC-MS) se detecto la presencia de trans-piceido y trazas de cis-resveratrol.
Se hicieron posteriormente analisis de los alimentos suministrados a las abejas, y preparados como se piensa pueden hacer los apicultores en campo, sobre diversas preparaciones siguiendo la dosis recomendada; se encontraron para candy valores comprendidos entre 0, 17 y 0, 32 mg/L de trans-piceido y entre 7, 94 y 8, 55 mg/L para trans- resveratrol. En el caso del jarabe los valores oscilaron entre 0, 24 y 0, 18 mg/L para t-piceido y 6, 94 a 8, 03 mg/L para trans-resveratrol.
Examinada la variacion de los preparados alimenticios con el tiempo se aprecio que eran estables por al menos un mes.
Para la evaluation de las cantidades residuales, despues de efectuados los tratamientos, se ha aplicado el mismo sistema pero incorporando un detector espectrometrico de masas lo cual no solo ha permitido confirmar la identidad de los analitos sino tambien rebajar notablemente los llmites de deteccion. La metodologla analltica ha sido publicada en Liquid chromatographic determination of resveratrol and piceid isomers in honey M. E. Soto, J. Bernal, Ma. T. Martin, M. Higes, J. L. Bernal, M. J. Nozal, Food Analytical Methods, 5 (2011) 162-171, que complementa el estudio sobre la utilization de la fumagilina, sobre cuya eficacia se ha comparado la de la presente invention: The stability and efectiveness of fumagillin in controlling Nosema ceranae (Microsporidia) infection in honey bees (Apis Mellifera) under laborator y and field conditions. M. Higes, M. J. Nozal, A. Alvaro, L. Barrios, A. Meana, R. Martin, J. L. Bernal, J. Bernal. Apidologie, 42 (2011) 364-377.
En todas las muestras se han evaluado trans- y cis-resveratrol (t-r y c-r) as! como trans- y cis-piceido (t-p y c-p).
En los ensayos realizados con la cantidad teorica maxima de 7 gramos de trans-resveratrol por colmena se analizaron por HPLC-MS las muestras de miel, polen y cera recogidas a
distintos intervalos de tiempo en la colmena asl como al momento de la cosecha, los valores encontrados fueron muy variables como sucede siempre en el caso de este tipo de muestras y muestreo.
Tabla 2. Contenido total de los diferentes isomeros en miel en funcion de tipo de alimento
en que se ha administrado el resveratrol y el muestreo
Concentration total (mgkg-1)
Alimento Muestreo ________________________________
t-p
c-pa
t-r
c-r
Candy R
1°
4.4
55.3
206.9
8.9
Candy R
2°
1.6
50.2
209.2
4.5
Jarabe R
1°
2.9
10.5
200.4
4.1
Jarabe R
2°
1.7
36.0
362.3
41.2
a ygkg1
Tabla 3. Concentraciones (mgkg-1) encontradas de los diferentes isomeros en muestras de 10 polen de colmenas tratadas con resveratrol anadido en candy o jarabe
Tratamiento
Muestra
t-p
c-p
t-r
c-r
Candy R
TN-03
ND
ND
0.44
ND
Candy R
TN-09
ND
ND
0.07
ND
Candy R
TN-19
ND
ND
5.38
0.11
Candy R
TN-23
ND
ND
0.91
ND
Candy R
TN-27
ND
ND
10.29
0.05
Jarabe R
TN-08
ND
ND
0.43
ND
Jarabe R
TN-11
ND
ND
0.23
ND
Jarabe R
TN-14
ND
ND
0.03
ND
Jarabe R
TN-17
ND
ND
1.91
0.05
Jarabe R
TN-29
ND
ND
1.82
0.09
Candy R: candy con resveratrol Jarabe R: jarabe con resveratrol En cuanto a la action contra la nosemosis, mostraron una eficacia notable con una 15 reduction en la parasitacion que mantuvo a las colmenas en niveles de viabilidad y productivos similares a los grupos que recibieron fumagilina y muy por encima de los grupos testigo que recibieron solo placebo.
2.2. Evaluation en campo de la actividad frente a Nosema spp. del trans-resveratrol y sus isomeros. Determination de la posolog'ia adecuada.
Se partio siempre de trans-resveratrol, bien al 99% o al 50% de la firma Megaresveratrol®.
Se iniciaron ensayos en Otono 2011 con 65 colmenas, divididas en los siguientes grupos: RJ (Resveratrol en jarabe, n=10) , RC (Resveratrol en candy, n=10) , AF (Acido formico, n=5) , FUMA (Grupo testigo positivo, tratado con Fumagilina, n=10) , CJ (Grupo testigo solo con jarabe, n=10) , CC (Grupo testigo solo con candy, n=10) , ST (Grupo testigo sin intervention, n=10). El grupo RJ recibio 1, 75g MegaResveratrol® en 250 ml de jarabe de azucar al 50% (4 tratamientos, 1 por semana, lo que supone 6 g en total del producto activo resveratrol) y el grupo RC recibio 7g MegaResveratrol® (6 g en total del producto activo) en 1 kg de candy (glucosa 30%, fructosa 50%, agua 18%). Estos ensayos (excepto el grupo AF y ST) se han continuado en el ano 2012, realizandose tratamientos en primavera y otono. En total se han realizado 6 muestreos, recogidos antes y despues de las intervenciones en otono 2011, primavera de 2012 y otono de 2012. De esta manera , se dispone de datos de un gran grupo de colmenas que se ha mantenido durante un largo periodo de tiempo, pudiendo asl conocer el efecto de los tratamientos (aplicacion del resveratrol en diferentes formas y los controles) a largo plazo, obteniendo datos de production, viabilidad y evolution de las colmenas. Tambien sirvio para determinar el momento mas adecuado de aplicacion de los tratamientos asl como para elegir la mejor forma de aplicacion.
Los resultados del primer ensayo de otono 2011 mostraron que en los grupos que recibieron resveratrol se produjo una reduction en la parasitacion (reduction en el numero de abejas infectadas por colmena) comparables al grupo que recibio el tratamiento con fumagilina (Figura 2).
Continuando con el estudio de las colmenas durante un ano posterior (excepto el grupo AF que se saco del estudio) , se pudo observar que durante la primavera de 2012, el porcentaje de parasitacion bajo en todas las colmenas como efecto del aumento de la poblacion que se produce de forma natural en las colmenas durante este periodo. Debido a esto no se pudo observar el efecto de los tratamientos en este periodo. Por el contrario, en el muestreo realizado antes de los tratamientos de otono 2012, se pudo observar claramente que los porcentajes de parasitacion son mucho mas elevados en aquellos grupos que no recibieron ningun tratamiento en primavera (C, J) cuando se comparan con los grupos tratados con resveratrol o fumagilina (CR, JR y FUM). El efecto de los tratamientos en otono tambien
produjo una reduction en el porcentaje de parasitacion. La aceptacion del resveratrol en otono es mas adecuada en candy que en jarabe, si bien se reduce en primavera, cuando por el contrario las abejas consumen mejor la administration en jarabe. La administration del CR es un sistema comodo que no requiere de muchas visitas al colmenar, facilitando la labor del apicultor (Figura 3).
La viabilidad de las colonias al final del estudio en los grupos tratados con resveratrol (JR y CR) fue similar a la del grupo que se trato con fumagilina (Figura 4). Aunque los resultados de production de miel solo fueron significativamente mayores en el grupo FUM (Figura 5).
Por todo ello, el resveratrol muestra ser eficaz para el tratamiento y control de la Nosemosis. Si bien el efecto en la reduccion de la parasitacion es mas evidente en otono, la administracion del producto en primavera facilita que las colmenas lleguen al otono en con unos niveles de parasitacion menores.
En cuanto a los residuos, podemos observar que la miel puede presentar resveratrol de forma natural ya que se ha detectado en los grupos no tratados (C y J) aunque en cantidades mucho menores que en los grupos tratados (CR y JR). En estos ultimos se puede encontrar trans-resveratrol en cantidades hasta 1000 veces superiores. Las otras formas isomericas que se detectan en mayor proportion son el trans-piceido y el cis- resveratrol.
Tabla 4: Concentraciones en microgramo por kilogramo, obtenidas por HPLC-MS, de los distintos isomeros encontrados en mieles procedentes de colmenas tratadas. Primer
muestreo (1) entre 2-6 diciembre de 2011. Segundo muestreo (2) entre 9-10 enero de 2012.
_____t-p_____
c-
p
- r
c-r
TN-03
CR
874.3
127.7
6.8
ND
32.3a
24.3a
1.3a
135.0
TN-07
CR
19.3
9.3
NQ
NQ
730.9
389.7
363.8
9.5
TN-09
CR
537.4
NQ
17.8
NQ
21.6a
29.2
1.9a
NQ
TN-13
CR
NQ
ND
NQ
ND
318.5
NQ
21.2
ND
TN-16
CR
4.9
NQ
NQ
NQ
211.7
535.2
23.4
NQ
TN-19
CR
250.9
878.1
NQ
15.4
8.6a
93.0a
518.1
2.0a
TN-23
CR
4.6
ND
NQ
ND
738.2
93.0
367.3
NQ
TN-27
CR
657.0
31.9
9.2
NQ
28.3a
11.3a
1.3a
15.0
TN-31
CR
2.1a
365.2
21.5
14.7
114.1a
34.0a
3.2a
403.6
TN-35
CR
ND
213.1
ND
20.1
12.6
16.5a
10.5
2.0a
TN-01
JR
380.1
16.7
NQ
6.2
28.9a
70.8a
431.4
1.0a
TN-04
JR
ND
21.5
ND
5.8
12.0
47.5
ND
NQ
TN-08
JR
NQ
ND
NQ
ND
35.7
7.7
11.2
ND
TN-11
JR
9.7
77.1
NQ
5.4
348.7
3.7a
41.1
36.6
TN-14
JR
NQ
27.3
NQ
6.9
132.9
62.8a
15.1
1.7a
TN-17
JR
NQ
509.6
NQ
8.5
75.3
151.6a
12.9
1.2a
TN-21
JR
NQ
7.3
NQ
NQ
38.9
209.4
12.4
8.4
TN-25
JR
NQ
ND
ND
ND
30.4
10.1
10.9
ND
TN-29
JR
1.8a
99.0
10.5
NQ
124.7a
12.2a
3.0
90.7
TN-33
JR
725.5
935.7
NQ
3.2
46.2a
60.9a
488.7
690.8
PR-11-03
ST
NQ
NQ
NQ
NQ
10.9
5.1
ND
ND
PR-11-10
ST
ND
ND
NQ
NQ
11.5
NQ
ND
ND
PR-11-20
ST
ND
ND
ND
ND
11.3
36.1
ND
ND
PR-11-22
ST
ND
ND
ND
ND
11.1
ND
ND
ND
PR-11-31
ST
ND
ND
ND
ND
11.1
NQ
ND
ND
PR-11-34
ST
ND
ND
ND
ND
11.0
NQ
ND
NQ
PR-11-01
C
ND
NQ
ND
NQ
48.2
47.1
14.5
NQ
PR-11-04
C
NQ
NQ
ND
NQ
ND
6.4
ND
ND
PR-11-07
C
ND
ND
NQ
NQ
16.0
NQ
ND
ND
PR-11-14
C
ND
ND
ND
ND
10.0
ND
ND
ND
PR-10
C
ND
NQ
NQ
NQ
10.9
NQ
ND
ND
PR-11-28
C
ND
ND
ND
ND
61.7
NQ
14.2
ND
PR-11-09
J
ND
NQ
ND
NQ
45.3
NQ
ND
ND
PR-11-12
J
ND
ND
ND
ND
ND
10.7
ND
NQ
PR-11-15
J
NQ
NQ
NQ
NQ
16.0
NQ
ND
ND
PR-11-17
J
NQ
NQ
ND
ND
11.4
NQ
ND
ND
PR-11-33
J
ND
ND
ND
ND
10.8
NQ
10.7
ND
a: mg/kg
Tabla 5. Limites de detection (LOD) y Cuantificacion (LOQ) en ug/kg obtenidos en
LC-MS para los distintos isomeros
Analito
LOD
LOQ
Analito
LOD
LOQ
t-p
0.51
1.71
c-r
0.98
3.25
c-p
0.98
3.25
t-r
1.84
6.13
