La invención pertenece al campo de las enzimas útiles para la producción de bioproductos y, más particularmente, a variantes de la beta-glucosidasa y a su uso en la producción de azúcares fermentables y de etanol a partir de material celulósico.
TÉCNICA ANTERIOR
La biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de potencial energía en forma de azúcares y, por tanto, es una importante fuente renovable para la generación de azúcares fermentables. La fermentación de estos azúcares puede dar lugar a productos finales comercialmente valiosos, tales como el etanol también denominado bioetanol.
Aunque la fermentación de los azúcares a etanol es relativamente directa, la conversión eficiente de biomasa celulósica en azúcares fermentables, tales como la glucosa, supone un mayor desafío. La enorme energía potencial de las grandes cantidades de hidratos de carbono que integran la biomasa vegetal no está suficientemente utilizada porque los azúcares forman parte de polímeros complejos (polisacáridos, tales como celulosa y hemicelulosa) y, por tanto, no son fácilmente accesibles para la fermentación. Por tanto, la celulosa se puede tratar previamente, de forma mecánica, química, enzimática o de otros modos, para aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis. Después, tras este proceso de pretratamiento tiene lugar una etapa de sacarificación, que es un proceso enzimático por el cual los hidratos de carbono complejos (como almidón o celulosa) se hidrolizan en sus componentes monosacáridos. El objetivo de cualquier tecnología de sacarificación es alterar o eliminar los impedimentos estructurales y de composición para la hidrólisis con el fin de mejorar la tasa de hidrólisis enzimática y aumentar los rendimientos de azúcares fermentables a partir de celulosa o de hemicelulosas (N. Mosier y col., 2005, Bioresource Technology 96, 673-686). Después de esta etapa de sacarificación se realiza un proceso de fermentación.
La hidrólisis enzimática de los polisacáridos en azúcares solubles y, por último, en
monómeros tales como xilosa, glucosa y otras pentosas y hexosas, se cataliza mediante varias enzimas que en conjunto se denominan "celulasas". Las celulasas (1,4-beta-D- glucano-4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.4) son complejos multienzimáticos que comprenden tres componentes principales, endo-p-glucanasa (EC 3.2.1.4), exo-p-glucanasa o celobiohidrolasa (EC 3.2.1.9.1) y p-glucosidasa (EC 3.2.1.21), que se ha demostrado que actúan de forma sinérgica en la hidrólisis de la celulosa (Ekperigin, M.M., 2007, African Journal of Biotechnology, Vol.6 (1), pág. 028-033).
Específicamente, la beta-glucosidasa es una enzima glucosidasa que actúa sobre los enlaces pi->4 que unen dos glucosas o moléculas sustituidas con glucosa (es decir, el disacárido celobiosa). Es una exocelulasa con especificidad por diversos sustratos de beta- D-glucósidos. Cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores en los beta-D- glucósidos con liberación de glucosa. Por tanto, se usa ampliamente junto con otras celulasas en procesos para la conversión de la biomasa celulósica en azúcares fermentables. Su aplicación en la conversión de biomasa con un contenido elevado en celulosa en azúcares fermentables para la producción de etanol combustible es un área extensamente estudiada.
Por consiguiente, las celulasas microbianas se han convertido en biocatalizadores focales debido a su naturaleza compleja y a sus extensas aplicaciones industriales (Kuhad R. C. y col., 2011, Enzyme Research, Article ID 280696). Hoy en día se ha prestado una considerable atención a los conocimientos actuales sobre la producción de celulasas y los retos en la investigación sobre celulasas, especialmente en la dirección de la mejora de la economía del proceso de varias industrias, con el fin de obtener celulasas con mayor actividad y mejores propiedades. En este sentido, se han diseñado beta-glucosidasas con mejor actividad hidrolítica o termoestabilidad (WO2011063308A2).
Las beta-glucosidasas (BGLs, EC 3.2.1.21) catalizan la transferencia de grupos glicosil entre nucleófilos de oxígeno sobre diferentes tipos de sustratos. Las BGLs con un mecanismo de retención (Rye y col., 2000. Curr. Opin. Chem. Biol. 4), como es el caso de Bgl1, tienen actividad hidrolítica reducida a concentraciones elevadas de sustrato o de producto y esto depende al menos de que se produzcan dos fenómenos diferentes: inhibición y transglicosilación (Bohlin et al., 2013, Appl. Microbiol. Biotechnol., 97(1):159-169). El mecanismo de retención forma inicialmente un complejo glicosil covalente con la enzima.
Este intermedio se descompone en la segunda etapa de la reacción, lo que se puede producir mediante una molécula de agua (actividad hidrolítica) o mediante un azúcar aceptor (actividad de transglicosilación). En la reacción de transglicosilación más sencilla, el aceptor es el propio sustrato. No obstante, la celobiosa se ha descrito como sustrato preferencial para retener a las BGLs en su reacción de transglicosilación.
Una beta glucosidasa con una actividad hidrolítica capaz de producir glucosa de forma eficiente pero con una actividad transglicosiladora reducida sería de utilidad, pudiendo disminuir la síntesis de otros compuestos, tales como etil-beta-D-glucopiranósido en presencia de etanol, de modo que aumentase la producción de azúcares fermentables y mejorara el rendimiento de una mezcla enzimática que contuviera BGL.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe nuevas variantes de beta-glucosidasa con capacidad de transglicosilación reducida para la hidrólisis de material celulósico en azúcares fermentables, así como un procedimiento para producir dichas variantes de beta-glucosidasa, un procedimiento para producir azúcares fermentables y un procedimiento para producir bioproductos, tales como etanol, con dichas variantes.
Por tanto, la presente invención representa una solución a la necesidad de proporcionar variantes de beta-glucosidasa con la propiedad mejorada de una actividad de transglicosilación reducida para la optimización de la etapa de hidrólisis de material celulósico en azúcares fermentables.
La capacidad de transglicosilación de las beta-glucosidasas disminuye la concentración final de azúcares fermentables en etanol y, en consecuencia, el rendimiento del producto final del proceso. Sin embargo, los inventores han demostrado que las variantes de beta-glucosidasa de la presente invención tienen actividad de transglicosilación reducida y, por tanto, aumentan significativamente el rendimiento de la etapa de hidrólisis, lo que conduce a un aumento de la producción del bioproducto, preferiblemente etanol.
La presente invención también proporciona un procedimiento para la selección de variantes de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida. Por tanto, un primer
aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la selección de variantes de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida en comparación con la beta-glucosidasa nativa, en lo sucesivo "primer procedimiento de la invención", que comprende:
a) Incubar las variantes de beta-glucosidasa con p-nitro-fenil-glucopiranósido en presencia de celobiosa,
b) Medir la liberación de p-nitrofenol,
c) Comparar el valor del p-nitrofenol medido en la etapa (b) con un valor de referencia, y
d) Seleccionar aquellas variantes de beta-glucosidasa cuyos valores medidos en la etapa (b) son más elevados que el valor de referencia.
El término "beta-glucosidasa", como se usa aquí, se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de un dímero de azúcar, incluyendo, pero sin limitarnos, celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente, la cual se usa, pero sin limitación, para la síntesis de etanol. La enzima beta-glucosidasa actúa sobre los enlaces pi->4 que unen dos glucosas o moléculas sustituidas con glucosa (es decir, el disacárido celobiosa). Es una exocelulasa con especificidad por una variedad de sustratos beta-D-glucósido. Cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores en los beta-D-glucósidos con liberación de glucosa.
El término "variante", como se usa aquí, se refiere a una enzima que procede de una enzima nativa mediante una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos en los punto(s) dentro de su secuencia de aminoácidos y, por tanto, tiene una secuencia diferente a la de la enzima nativa. Como se usa aquí, la expresión "variante de beta-glucosidasa" significa un polipéptido que tiene actividad beta-glucosidasa producido por un organismo que expresa una secuencia de nucleótidos modificada que codifica una beta- glucosidasa nativa. Dicha secuencia de nucleótidos modificada se obtiene mediante intervención humana mediante modificación de la secuencia de nucleótidos que codifica una beta-glucosidasa nativa. El término "modificación" significa en el presente documento cualquier modificación química de la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de una beta-glucosidasa nativa.
La expresión "beta-glucosidasa nativa" se refiere a una enzima beta-glucosidasa o su preproteína, expresada por un microorganismo tal como bacterias u hongos filamentosos. Preferentemente, la enzima beta-glucosidasa nativa a la que se hace referencia en la presente invención es expresada por un hongo filamentoso, más preferiblemente por un hongo que pertenece al género Myceliophthora, aún más preferiblemente por Myceliophthora thermophila, aún más preferiblemente la enzima beta-glucosidasa nativa es la enzima de SEQ ID NO: 1 (también denominada Bgl1) o SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 2 es la preproteína de la SEQ ID NO: 1 y consiste en un péptido señal correspondiente a los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID NO: 2 unido a la SEQ ID NO: 1.
La "actividad de transglicosilación" de las beta-glucosidasas consiste en la formación inicial de un complejo glicosil covalente con la enzima y su posterior descomposición en la segunda etapa de la reacción mediante un azúcar aceptor, en lugar de producirse mediante una molécula de agua (actividad hidrolítica). En la reacción de transglicosilación más sencilla, el azúcar aceptor es el propio sustrato.
El sustrato p-nitro-fenil-glucopiranósido también se denomina pNGP. Este sustrato es hidrolizado por la beta-glucosidasa. Por tanto, este sustrato se incuba en condiciones que permiten que las variantes de beta-glucosidasa realicen el proceso hidrolítico en la etapa (a) del primer procedimiento de la invención. Adicionalmente, dicha incubación se realiza en presencia de celobiosa, ya que este disacárido se ha descrito como sustrato preferencial para retener beta-glucosidasas en su actividad de transglicosilación. Por tanto, en presencia de celobiosa, la actividad hidrolítica de beta-glucosidasa sobre pNGP muestra una reducción debido a la actividad de transglicosilación. Un porcentaje elevado de capacidad hidrolítica, medido mediante el p-nitrofenol liberado en presencia del sustrato celobiosa altamente susceptible a la transglicosilación, se usa como indicación de una baja capacidad de transglicosilación. Por tanto, cuanto más p-nitrofenol se mide en la etapa (b) del primer procedimiento de la invención, menor es la capacidad de transglicosilación de la variante de beta-glucosidasa analizada.
La expresión "valor de referencia" se refiere a la medición de p-nitrofenol liberado por una beta-glucosidasa nativa, preferiblemente la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, incubada con pNGP en presencia de celobiosa. Una beta-glucosidasa nativa incubada con pNGP en presencia de celobiosa tiene una producción baja de p-nitrofenol, dado que la enzima
utilizará la celobiosa como sustrato para realizar el proceso de transglicosilación en lugar de utilizar pNGP para llevar a cabo el proceso hidrolítico que genera p-nitrofenol. Por tanto, la medición del p-nitrofenol liberado tras la incubación en la etapa (a) y su comparación con la medición del p-nitrofenol liberado tras la incubación de una beta-glucosidasa nativa con pNGP en presencia de celobiosa permite la selección de las variantes de beta-glucosidasa con menor capacidad de transglicosilación que la de una beta-glucosidasa nativa. La comparación en la etapa (c) se puede realizar manualmente o por ordenador.
También se puede reconocer una baja actividad de transglicosilación cuando se mide en la etapa (b) una capacidad hidrolítica en pNGP de entre 30-70%.
Las variantes de la beta-glucosidasa usadas en el primer procedimiento de la invención pueden derivar bien de una librería de mutantes ya conocidos en el estado de la técnica o disponibles comercialmente o bien se pueden diseñar por medio de cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia para generar una librería de mutantes de una enzima. Los mutantes que constituyen dicha librería pueden comprender sustituciones, deleciones y/o inserciones de uno o más aminoácidos en sus secuencias de aminoácidos, así como sustitución de una o más cadenas laterales de aminoácido. Por tanto, otro aspecto de la invención hace referencia a un procedimiento para producir variantes de beta- glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida en comparación con la beta- glucosidasa nativa, en lo sucesivo "segundo procedimiento de la invención", que comprende el diseño de una librería de mutantes de enzimas beta-glucosidasa y la selección de variantes de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida de acuerdo con las etapas (a) a (d) del primer procedimiento de la invención
Otro aspecto de la invención hace referencia a una variante de beta-glucosidasa aislada producida por el segundo procedimiento de la invención.
Otro aspecto de la invención hace referencia a una variante de beta-glucosidasa aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácido en la posición Q211 correspondiente a las posiciones 1 a 871 de la SEQ ID NO: 2, donde la variante de beta-glucosidasa tiene una actividad de transglicosilación reducida en comparación con la beta-glucosidasa nativa, en lo
sucesivo denominada "variante de beta-glucosidasa de la invención". La actividad de transglicosilación reducida en comparación con la beta-glucosidasa nativa se mide, preferiblemente, por medio del primer procedimiento de la invención descrito arriba.
En una realización preferida, la sustitución de aminoácido de dicha variante es Q211H.
El término "identidad", como se usa aquí, en el contexto de describir dos o más secuencias polipeptídicas, hace referencia a un porcentaje especificado de coincidencias de residuos de aminoácidos en las posiciones desde una alineación de dos secuencias de aminoácidos. Los procedimientos de alineación de secuencias para comparar son bien conocidos en la técnica. El grado de identidad se puede determinar mediante el método de Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153), el método de Wilbur-Lipman (Wilbur y Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730), el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 287 Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLAST o BLASTN, EMBOSS Needle y FASTA (Altschul etal. 1999, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Además, se puede usar el algoritmo de Smiith Waterman con el fin de determinar el grado de identidad entre dos secuencias.
La variante de beta-glucosidasa de la invención puede exhibir cambios limitados en su secuencia de aminoácidos. Estos cambios permiten el mantenimiento de la función de la variante de beta-glucosidasa y la actividad de transglicosilación reducida en comparación con la beta-glucosidasa nativa. Estos cambios pueden ser sustituciones, deleciones o adiciones. Las sustituciones son por aminoácidos conservados que son aminoácidos con cadenas laterales y propiedades similares con respecto a, por ejemplo, propiedades hidrofóbicas o aromáticas. Estas sustituciones incluyen, pero no se limitan a, sustituciones entre Glu y Asp, Lys y Arg, Asn y Gln, Ser y Thr, y/o entre los aminoácidos incluidos en la lista siguiente: Ala, Leu, Val e lie. Los cambios no conducen a modificaciones relevantes en las características o propiedades esenciales de la variante beta-glucosidasa de la invención.
Asimismo, la sustitución de aminoácido en la posición Q211, correspondiente a las posiciones 1 a 871 de la SEQ ID NO: 2, es por aminoácidos que tienen las mismas propiedades, sobre, por ejemplo, las propiedades hidrofóbicas o aromáticas, que el aminoácido H. Por tanto, dichas sustituciones permiten que las variantes de beta- glucosidasa de la invención mantengan la misma función que la variante preferida de SEQ
ID NO: 4, incluyendo la actividad de transglicosilación reducida en comparación con la beta- glucosidasa nativa.
En una realización más preferida, la variante de beta-glucosidasa de la invención comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4. Un ejemplo de variante de beta- glucosidasa de la invención que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 es el polipéptido de SEQ ID NO: 5, que es la preproteína de SEQ ID NO: 4, que consiste en un péptido señal correspondiente a los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID NO: 5 unido a la SEQ ID NO: 4. Por tanto, en una realización más preferida, la variante de beta-glucosidasa de la invención consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5. Esta SEQ ID NO: 5 corresponde a la beta-glucosidasa nativa de SEQ ID NO: 2, que comprende la sustitución de aminoácido Q211H. Como se muestra en los ejemplos más abajo, la sustitución Q211H reduce la actividad de transglicosilación de la enzima, lo que incrementa la concentración final de azúcares fermentables en un proceso hidrolítico a partir de material celulósico. Dicha secuencia SEQ ID NO: 5 también se denominará en lo sucesivo preproteína Bgl1Q211H.
En una realización aún más preferida, la variante de beta-glucosidasa de la invención consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4. Esta SEQ ID NO: 4 corresponde a la beta-glucosidasa madura de la SEQ ID NO: 5. Dicha secuencia SEQ ID NO: 4 también se denominará en lo sucesivo proteína madura de Bgl1Q211H.
La variante de beta-glucosidasa de la invención puede sintetizarse, por ejemplo, pero sin limitaciones, in vitro. Por ejemplo, por medio de la síntesis de péptidos en fase sólida o abordajes de ADN recombinante. La variante de beta-glucosidasa de la invención puede producirse de forma recombinante, incluida su producción como péptido maduro o como una preproteína que incluye un péptido señal.
La preparación de la variante de beta-glucosidasa de la invención se puede realizar por cualquier medio conocido en la técnica, tales como modificación de una secuencia de ADN que codifica una beta-glucosidasa nativa, tal como, por ejemplo, pero sin limitarnos, la SEQ ID NO: 3, que codifica la preproteína de SEQ ID NO: 2, transformación de la secuencia de ADN modificada en una célula huésped adecuada y la expresión de la secuencia de ADN modificada para formar la variante enzimática.
Debido a la degeneración del código genético, varias secuencias de nucleótidos pueden codificar la misma secuencia de aminoácidos. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la variante de beta- glucosidasa de la invención o la variante beta-glucosidasa producida por el segundo procedimiento de la invención, en lo sucesivo "secuencia de ácido nucleico de la invención", y la secuencia de ácido nucleico complementaria a la misma.
De acuerdo con la presente invención, una "molécula de ácido nucleico aislada", "secuencia de nucleótidos", "secuencia de ácido nucleico" o "polinucleótido" es una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) que se ha eliminado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana) y puede incluir ADN, ARN o derivados de ADN o ARN, incluyendo ADNc. La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar o no química o bioquímicamente modificada, y se puede obtener artificialmente por medio de clonación y procedimientos de selección o mediante secuenciación. La secuencia de ácido nucleico de la invención puede codificar el polipéptido maduro o una preproteína que consiste en un péptido señal unido a la enzima madura que tendrá que procesarse después.
La secuencia de nucleótidos de la presente invención también puede comprender otros elementos, tales como intrones, secuencias no codificantes en los extremos 3' y/o 5', sitios de unión al ribosoma, etc. Esta secuencia de nucleótidos también puede incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que son útiles para la purificación o estabilidad del péptido codificado.
En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico de la invención es la SEQ ID NO: 6, que es la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (preproteína de SEQ ID NO: 4).
La expresión, "secuencia de ácido nucleico complementaria" de una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de beta-glucosidasa de la invención o la variante de beta- glucosidasa producida por el segundo procedimiento de la invención, hace referencia a la secuencia de ácido nucleico de la hebra complementaria a la que codifica la variante de beta-glucosidasa de la invención, o la variante de beta-glucosidasa producida por el segundo procedimiento de la invención. Se apreciará que un ADN bicatenario que codifica una secuencia de aminoácidos dada comprende un ADN monocatenario y su hebra
complementaria, que tiene una secuencia que es complementaria al ADN monocatenario.
La Tabla 1 siguiente muestra una descripción detallada de algunas de las secuencias mencionadas a lo largo de la presente invención.
Secuencia | DESCRIPCIÓN |
SEQ ID NO: 1 | Proteína madura de la Bgl1 nativa |
SEQ ID NO: 2 | Preproteína de la Bgl1 nativa (SEQ ID NO: 1, incluyendo el péptido señal de 19 aminoácidos en el extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 1) |
SEQ ID NO: 3 | Polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 2 (sin intrones) |
SEQ ID NO: 4 | Proteína madura de Bgl1Q211H |
SEQ ID NO: 5 | Preproteína Bgl1Q211H (SEQ ID NO: 4, incluyendo el péptido señal de 19 aminoácidos en el extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 4) |
SEQ ID NO: 6 | Polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 5 (sin intrones) |
Tabla 1. Descripción de algunas de las secuencias mencionadas en la presente invención.
La secuencia de ácido nucleico de la invención se puede incluir en una construcción genética, preferiblemente en un vector de expresión. Dicha construcción genética puede 10 comprender además una o más secuencias reguladoras de la expresión génica, tales como promotores, terminadores etc. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una construcción genética que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención o la secuencia de ácido nucleico complementaria a la misma, en lo sucesivo "construcción génica de la invención". En una forma de realización preferida, dicha construcción génica es 15 un vector de expresión.
La expresión "construcción génica" o "construcción de ácido nucleico" como se usa aquí hace referencia a una unidad funcional necesaria para la transferencia o la expresión de un gen de interés, en el presente documento, la secuencia de ácido nucleico de la invención
como se ha descrito, y secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, operativamente unidas a la secuencia que codifica la proteína. Se refiere a una molécula de ácido nucleico, mono o bicatenaria, que se encuentra aislada de un gen natural o que se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de un modo que, de otro modo, no existirían en la naturaleza. La expresión construcción de ácido nucleico es sinónima a la expresión "casete de expresión", cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias control requeridas para la expresión de la secuencia codificante.
La expresión "vector de expresión", también conocida como "construcción de expresión" o "plásmido", hace referencia a una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención y que está operativamente unida a segmentos adicionales que proporcionan la transcripción del péptido codificado. Generalmente, un plásmido se usa para introducir un gen específico en una célula diana. Una vez que el vector de expresión está en el interior de la célula, la proteína que está codificada por el gen es producida mediante los complejos ribosómicos de la maquinaria de transcripción y traducción celular. Con frecuencia el plásmido se somete a ingeniería para que contenga secuencias reguladoras que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y que conducen a una transcripción eficiente del gen portado en el vector de expresión. El objetivo de un vector de expresión bien diseñado es la producción de grandes cantidades de ARN mensajero estable y, por tanto, de proteínas. Los vectores de expresión son herramientas básicas de biotecnología y de la producción de proteínas, tales como enzimas. El vector de expresión de la invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como integrante cromosómico o como vector autoreplicante extracromosómico.
Ejemplos de vectores de expresión son fagos, cósmidos, fagémidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales humanos (HAC) o vectores virales, tales como adenovirus, retrovirus o lentivirus.
Las construcciones génicas de la presente invención abarcan un vector de expresión, donde el vector de expresión se puede usar para transformar una célula huésped u hospedadora adecuada para que el huésped pueda expresar la variante de beta-glucosidasa de la invención o la variante de beta-glucosidasa producida por el segundo procedimiento de la invención. Los procedimientos para la expresión recombinante de proteínas en hongos y otros organismos son bien conocidos en la técnica y se dispone de numerosos vectores de
expresión o se pueden construir usando procedimientos de rutina.
La expresión "secuencias control" se define aquí para incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de la secuencia de ácido nucleico de la presente invención. Dichas secuencias control incluyen, pero sin limitarse, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y de la traducción. Las secuencias control se pueden proporcionar con ligadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la unión de las secuencias control con la región codificante de la secuencia de ácido nucleico de la presente invención. La expresión "operativamente unido" indica en el presente documento una configuración en la que una secuencia control se coloca en una posición adecuada respecto a la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, de un modo tal que la secuencia control dirige la expresión de la secuencia de ácido nucleico de la presente invención.
El vector de expresión de la invención puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación del cromosoma, por ejemplo un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autoreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado.
Además se puede usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposon.
Los vectores usados en la presente invención contienen, preferiblemente, uno o más marcadores seleccionables que permitan la fácil selección de las células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un producto génico que proporciona resistencia a un biocida o a un virus, a metales pesados, prototrofia a los auxótrofos y similares. Los marcadores seleccionables para usar en una célula huésped de un hongo filamentoso incluyen, pero sin limitarse, amdS (acetamidasa), argB (ornitina
carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidin-5'-fosfato descarboxilasa), cysC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos.
Los vectores usados en la presente invención contienen, preferiblemente, uno o más elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula con independencia del genoma. Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de ácido nucleico de la presente invención o de cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa. Como alternativa, el vector puede contener secuencias adicionales de nucleótidos para dirigir la integración mediante recombinación homologa en el genoma de la célula huésped en una o más localización(es) precisas en el(los) cromosoma(s).
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique de forma autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que participe en la replicación autónoma que funciona en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que permite que un plásmido o vector se replique in vivo. Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMAI y ANSI.
En la célula huésped se puede insertar más de una copia de la secuencia de ácido nucleico de la presente invención para aumentar la producción del producto génico. Se puede obtener un incremento del número de copias del polinucleótido mediante integración de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido, donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, por consiguiente, copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente seleccionable adecuado. Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante a los que se hace referencia en la presente invención son bien conocidos por un experto en la técnica.
En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped que comprende la construcción génica de la invención, en adelante denominada "célula huésped de la invención". Por tanto, dicha célula huésped expresa la variante de beta-glucosidasa de la invención. La "célula huésped", como se usa aquí, incluye cualquier tipo celular que es susceptible de transformación, transfección, transducción y similar con la construcción génica de la invención. La célula huésped puede ser eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, vegetal o fúngica. En una realización preferida, la célula huésped es una célula de hongo filamentoso. Los hongos filamentosos generalmente se caracterizan por una pared miceliar compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. En una realización más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma. En una realización más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra realización más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En otra realización más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Gibberella zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride. En otra realización aún más preferida, la célula huésped de la invención es cualquier cepa de la especie Myceliophthora thermophila. En una realización aún más preferida, la célula
huésped de la invención es la cepa C1 de la especie Myceliophthora thermophila.
Se entenderá que, para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca estados tanto perfectos como imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo anamorfos, con independencia del nombre de la especie por el que se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes adecuados. Por ejemplo, Myceliophthora thermophila es equivalente a Chrysosporium lucknowense.
La variante de beta-glucosidasa de la invención o la variante de beta-glucosidasa producida por el segundo procedimiento de la invención tiene una actividad de transglicosilación reducida, por lo que su uso en una composición enzimática para la etapa de hidrólisis del material celulósico en azúcares fermentables en los procesos para la producción de un bioproducto, preferiblemente etanol, es interesante para mejorar la actividad de toda la composición enzimática.
Por tanto, en otro aspecto de la invención se proporciona una composición enzimática que comprende la variante de beta-glucosidasa de la invención o la variante de beta-glucosidasa producida por el segundo procedimiento de la invención, de ahora en adelante conocida como "composición enzimática de la invención". En una realización preferida, la composición enzimática de la invención comprende además otras enzimas celulolíticas.
Se debe entender que la variante de beta-glucosidasa de la invención o la variante de beta- glucosidasa producida por el segundo procedimiento de la invención se pueden combinar con una o más de las enzimas celulolíticas descritas en el presente documento o con cualquier otra enzima disponible y adecuada para producir una composición multienzimática. Uno o más componentes de la composición multienzimática (aparte de las enzimas descritas en la presente invención) se pueden obtener o derivar de una fuente microbiana, vegetal o de otro tipo o combinación de las mismas, y contendrán enzimas capaces de degradar el material celulósico.
La expresión "enzimas celulolíticas", también conocidas como "celulasas" hace referencia a una categoría de enzimas capaces de hidrolizar la celulosa (enlaces p-1,4-glucano o p-D- glucosídico) en oligosacáridos más cortos, celobiosa y/o glucosa. Ejemplos de enzimas celulolíticas son, pero sin limitarnos, endoglucanasas, beta-glucosidasas, celobiohidrolasas
o beta-xilosidasas. Por tanto, en una realización más preferida, estas enzimas celulolíticas se seleccionan de la lista que consiste en: endoglucanasas, beta-glucosidasas, celobiohidrolasas, beta-xilosidasas o cualquier combinación de las mismas. Estas enzimas celulolíticas pueden derivar de la célula huésped de la invención u otros microorganismos productores de enzimas celulolíticas distintos a la célula huésped de la invención. Asimismo, se pueden producir de forma natural o recombinante.
El término "endoglucanasa" o "EG" hace referencia a un grupo de enzimas celulasas clasificadas como E.C. 3.2.I.4. Estas enzimas hidrolizan los enlaces p-1,4 glucosídicos de la celulosa.
El término "celobiohidrolasa" hace referencia a una proteína que cataliza la hidrólisis de la celulosa en celobiosa mediante una actividad exoglucanasa, liberando secuencialmente moléculas de celobiosa a partir de los extremos reductores o no reductores de la celulosa o los celooligosacáridos.
El término "P-xilosidasa" se refiere a una proteína que hidroliza los 1,4-p-D-xilooligómeros cortos en xilosa.
En una realización preferida, la composición enzimática de la invención comprende además la célula huésped de la invención.
La composición de la invención se puede preparar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica y puede estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. Las enzimas que se van a incluir en la composición se pueden estabilizar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.
La variante de beta-glucosidasa de la invención o la variante de beta-glucosidasa producida mediante el segundo procedimiento de la invención, así como la célula huésped o la composición de la presente invención se pueden usar en la producción de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos como reservas químicas o de fermentación a partir de material celulósico para la producción de etanol, plásticos u otros productos o intermedios.
La célula huésped de la presente invención se puede usar como fuente de la variante de beta-glucosidasa de la invención o la variante de beta-glucosidasa producida mediante el segundo procedimiento de la invención y otras enzimas celulolíticas, en un proceso de fermentación a partir del material celulósico.
Por tanto, otro aspecto de la invención hace referencia a una composición enzimática obtenida mediante la célula huésped de la invención.
La degradación o hidrólisis del material celulósico en azúcares fermentables, proceso también conocido como "sacarificación", por medio de la variante de beta-glucosidasa de la invención, la variante de beta-glucosidasa producida mediante el segundo procedimiento de la invención, la célula huésped de la invención o la composición de la invención puede acompañarse después de un proceso de fermentación en el que los azúcares fermentables obtenidos se usan con el fin de obtener finalmente un bioproducto tal como bioetanol.
Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir azúcares fermentables, en lo sucesivo "tercer procedimiento de la invención", que comprende:
a) Incubar el material celulósico con la variante de beta-glucosidasa de la invención, la variante de beta-glucosidasa producida mediante el segundo procedimiento de la invención, la célula huésped de la invención o la composición enzimática de la invención, y
b) Recuperar el azúcar fermentable obtenido tras la incubación en la etapa (a).
La expresión "azúcar fermentable", como se usa en el presente documento, se refiere a azúcares simples, tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa o fructosa.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de producir un bioproducto, en lo sucesivo "cuarto procedimiento de la invención", que comprende:
a) Incubar el material celulósico con la variante de beta-glucosidasa de la invención, la variante de beta-glucosidasa producida mediante el segundo procedimiento de la
invención, la célula huésped de la invención o la composición enzimática de la invención,
b) Fermentar los azúcares fermentables obtenidos tras la incubación de la etapa (a) con al menos un microorganismo fermentador, y
c) Recuperar el bioproducto obtenido tras la fermentación en la etapa (b).
La expresión "material celulósico" significa la fracción biodegradable de productos, residuos y desechos de origen biológico de la agricultura (incluidos vegetales, tales como residuos de cosechas y sustancias animales), forestales (como recursos madereros) e industrias relacionadas, incluidas pescaderías y acuicultura, así como la fracción biodegradable de residuos industriales y municipales, tales como residuos sólidos municipales o papeleras. En una realización preferida, el material celulósico es paja o fracción orgánica de residuos sólidos municipales. En una realización más preferida, el material celulósico es biomasa vegetal, más preferiblemente seleccionada de la lista que consiste en: biomasa rica en azúcares fermentables, tales como caña de azúcar, biomasa de almidón, por ejemplo, grano de trigo o paja de maíz. Aún más preferentemente, la biomasa vegetal es grano de cereales, tales como almidón, trigo, cebada o mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones, el tercero y/o cuarto procedimiento de la invención comprende, preferiblemente, un proceso de pretratamiento antes de la etapa (a). En general, un proceso de pretratamiento dará como resultado que los componentes del material celulósico sean más accesibles para las etapas posteriores o sean más digeribles por las enzimas tras el tratamiento en ausencia de hidrólisis. El pretratamiento puede ser un pretratamiento químico, físico o biológico, o cualquier mezcla de los mismos.
El término "recuperación", como se usa aquí, se refiere a la recuperación de los azúcares fermentables obtenidos tras la incubación en la etapa (a) del tercer procedimiento de la invención o el bioproducto obtenido tras la fermentación de la etapa (b) del cuarto procedimiento de la invención. La recuperación se puede producir por cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos mecánicos o manuales.
El término " fermentación", como se usa aquí, se refiere a un proceso de transformación biológica causada por la actividad de algunos microorganismos en el que azúcares tales como glucosa, fructosa y sacarosa se convierten en etanol. Por tanto, los microorganismos
usados son microorganismos fermentadores que tienen una capacidad de fermentación, tales como levaduras, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae.
En otra realización preferida, las etapas (a) y (b) del cuarto procedimiento de la invención se pueden realizar simultáneamente.
El término "bioproducto" o "productos biológicos" se refiere a los materiales, químicos y derivados de energía de recursos biológicos renovables. Ejemplos de estos bioproductos son, pero sin limitarnos, compuestos de hidrocarburos en sus diferentes formas, tales como hidrocarburos alifáticos (saturados, insaturados, cíclicos) o aromáticos, como alcanos, alquenos, alquinos, formas cíclicas de estos compuestos o hidrocarburos aromáticos; sustancias oxigenadas como alcoholes, éteres, aldehídos, cetonas o ácidos carboxílicos; sustancias nitrogenadas como aminas, amidas, compuestos de nitrógeno o nitrilos; sustancias halogenadas como haluros. El término "bioproductos" también incluye cualquier combinación de los compuestos descritos arriba, compuestos que además derivan de los compuestos descritos arriba mediante cualquier tipo de tratamiento físico, químico o biológico, polímeros de los compuestos descritos arriba, compuestos descritos anteriormente sustituidos por cualquier grupo o elemento funcional en uno o más de sus enlaces y formas ramificadas de los compuestos descritos arriba.
El etanol se puede producir mediante degradación enzimática del material celulósico y la conversión de los sacáridos liberados en etanol. Este tipo de etanol a menudo se denomina bioetanol. Se puede usar como aditivo de combustible o como expansor en mezclas de menos de 1% y de hasta 100% (un sustituto del combustible).
Por tanto, en una forma de realización más preferida, el bioproducto es biocombustible. El término "biocombustible", como se usa aquí, hace referencia a un hidrocarburo, o una mezcla de los mismos, que se puede usar como combustible y se obtiene usando material celulósico fermentable como material de partida. Ejemplos de biocombustibles incluyen, pero sin limitarse, etanol o bioetanol y biodiésel. En una forma de realización preferida, el biocombustible es bioetanol.
El término "bioetanol" o "etanol" hace referencia a un alcohol realizado mediante fermentación, principalmente a partir de material celulósico fermentable tal como hidratos de
carbono producido mediante la variante de beta-glucosidasa de la invención o la variante de beta-glucosidasa producida mediante el segundo procedimiento de la invención, o cultivos de almidón tales como maíz o caña de azúcar.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que les daría un experto en la técnica a la que esta invención pertenece. En la práctica de la presente invención se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, con la palabra "comprende" y sus variaciones no se pretende excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Otros objetos, ventajas y características adicionales de la invención serán obvias para los expertos en la técnica a partir del análisis de la descripción o se pueden aprender mediante la práctica de la invención. Los ejemplos y dibujos siguientes y el listado de secuencias se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Vector de expresión con Tcbhl como secuencia de terminación y pyr5 como marcador de selección. SacI y Notl fueron los sitios de restricción elegidos para la clonación del fragmento Pcbh1-bgl1.
Fig. 2. Plásmido de expresión del ADNc de bgll de Myceliophthora thermophila C1.
Fig. 3. Actividad relativa beta-glucosidasa de 31L2D y otros transformantes analizada usando pNGP como sustrato en presencia y en ausencia de celobiosa.
Fig. 4. Plásmido de expresión de bgl1Q211H amplificado de la cepa 31L2D.
Fig. 5. SDS-PAGE de las enzimas beta-glucosidasa purificadas. Se cargaron 20 ^g de proteína en cada carril. Carril 1: Marcador; Carril 2: Bgll; Carril 3: proteína madura de Bgl1Q211H.
Fig. 6. Ensayo de transglicosilación indirecta de la enzima Bgl1 y la proteína madura
de Bgl1Q211H. Todas las mediciones se analizaron por triplicado y las barras de error corresponden a la desviación estándar.
Fig. 7. Estudios térmicos usando la enzima Bgl1 y la proteína madura de Bgl1Q211H.
A. Determinación de la temperatura de desnaturalización. B. Resistencia térmica en condiciones de hidrólisis de la biomasa. Todas las mediciones se analizaron por triplicado y las barras de error corresponden a la desviación estándar.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Mutagénesis de bgl1. Construcción de un vector de expresión, mutagénesis, amplificación de los bancos con mutaciones en bgl1.
Se ha descrito a M. thermophila C1 como un sistema de transformación de buena calidad para expresar y secretar proteínas y polipéptidos heterólogos. El gen bgl1 de la beta- glucosidasa de M. thermophila C1 fue el elegido para mejorar su calidad enzimática en la presente invención. Esta enzima muestra un elevado perfil de transglicosilación, de modo que el objetivo de la mutagénesis era reducir esta actividad de transglicosilación sin afectar a la actividad hidrolítica de la beta-glucosidasa per se.
La secuencia de ADNc de bgl1 se sintetizó in vitro tras optimización, para eliminar sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción más habituales sin alterar la secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos de ADNc de bgl1 y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. La secuencia codificante tiene una longitud de 2616 incluido el codón de terminación. La proteína codificada por esta secuencia tiene una longitud de 871 aminoácidos con una masa molecular prevista de 95 KDa y un punto isoléctrico de 5.10. Usando el programa Signal IP (Petersen et al., 2011, Natura Methods, 8:785-786), se predijo un péptido señal de 19 residuos. La proteína madura prevista (SEQ ID NO: 1) contiene 852 aminoácidos con una masa molecular prevista de 93 KDa y un punto isoléctrico de 5.04.
El gen bgl1 se sintetizó in vitro junto con el promotor del gen de la celobiohidrolasa 1 (Pcbh1) de M. thermophila C1. La secuencia de Pcbh1 incluye una región de 1796 pb aguas arriba del gen de la celobiohidrolasa 1 de M. thermophila C1 (cbh1, número de registro en
NCBI XP_003660789.1). Este fragmento (Pcbh1-bgl1) se sintetizó in vitro, incluyendo la secuencia de las enzimas de restricción Sacl y Notl en los extremos (Sacl en el extremo 5' y Notl en el extremo 3 ) para clonarse en un vector de expresión denominado pBASEl. El vector de expresión pBASEl también contenía la secuencia terminadora del gen de la celobiohidrolasa 1 de Myceliophthora thermophila C1 (Tcbhl, correspondiente a una región de 1014 pb aguas abajo de cbh1) y el gen pyr5 (número de acceso en NCBI XP_003660657.1) de la misma cepa como marcador de selección. El gen pyr5 codifica una orotato-fosforibosil transferasa funcional y su vector de expresión permite la complementación de la auxotrofía de uridina en la correspondiente cepa huésped auxotrófica, M. thermophila C1 pyr5-. El vector de expresión pBASEl se muestra en la figura 1.
El fragmento Pcbh1-bgl1 se digirió con las enzimas de restricción Sacl y Not\ y se clonó en pBASEl, digerido previamente con las mismas enzimas de restricción. El vector de expresión pBASEl y el casete Pcbh1-bgl1 se ligaron y el producto de la unión se transformó en células electrocompetentes de Escherichia coli XLIBlue MRF siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante (Agilent Technologies Inc.). El plásmido recombinante obtenido se denominó pABC334 y se muestra en la Figura 2.
El gen bgl1 clonado en pABC344 se sometió a mutagénesis al azar mediante amplificación con PCR usando el kit de mutagénesis GeneMorpholl EZClone Domain Mutagenesis Kit (Agilent Technologies Inc.). La amplificación mutagénica se realizó usando los oligonucleótidos 1 y 2 que se muestran a continuación. El péptido señal y el codón de terminación se excluyeron de la amplificación mutagénica. Por tanto, estos oligonucleótidos amplifican un fragmento de 2553 pb correspondiente a la secuencia de bgl1 sin péptido señal ni codón de terminación.
Oligonucleótido 1 (SEQ ID NO: 7):
-GCTGACAATCATCGTCAGGTTCACCAGAAGCCCCTCGCGA-3'
Oligonucleótido 2 (SEQ ID NO: 8):
-AGGAAGCTCAATCTTGAGATCCAACTTCCGGCTGCTCCTC-3
El sistema GeneMorpholl EZClone Domain Mutagenesis permite diferentes tasas de
mutación dependiendo de la cantidad de ADN diana y los ciclos de amplificación usados durante el proceso. Con estas premisas se generaron dos bancos mutantes diferentes: el primero con una frecuencia de mutación entre 0-1 mutaciones/kb y el segundo con una frecuencia de mutación entre 1-4,5 mutaciones/kb. La cantidad diana inicial fue 2 pg y 0,8 pg de pABC344 respectivamente para cada banco. Las condiciones para la reacción de amplificación fueron un ciclo de 95 °C durante 2 minutos; y 30 ciclos cada uno a 95 °C durante 30 segundos, 57 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 3 minutos. El bloque de calor se mantuvo a 72 °C durante 10 minutos, seguido de un ciclo de retención a 12 °C. Los productos de PCR correspondiente a versiones mutadas de bgl1 se purificaron en gel de agarosa con un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen) y se usaron como megacebadores en una segunda PCR para amplificar el pABC344 completo usando las condiciones siguientes: un ciclo a 95°C durante 1 minuto y 25 ciclos de 95 °C durante 50 segundos, 60 °C durante 50 segundos y 68 °C durante 10 minutos. Se realizó una digestión de las reacciones de amplificación con Dpn\ (10U/pL) durante 2 horas a 37 °C para eliminar el plásmido de expresión parental pABC344 usado como diana, ya que Dpn\ solo reconoce ADN metilado. Por tanto, solo los plásmidos amplificados durante esta segunda reacción de PCR permanecen tras la digestión con Dpn\.
Ambos bancos de mutaciones se transformaron en células ultracompetentes Escherichia coli XL-10 Gold siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante (Agilent Technologies
lnc. ) y el ADN del plásmido a partir de un total de 320.000 colonias transformadas con ambos bancos de mutantes se purificó usando el kit Plasmid Maxi (Omega bio-tek, Inc).
Ejemplo 2. Transformación de los bancos de mutantes de bgl1 en Myceliophthora thermophila C1 y selección de una versión mejorada de bgl1.
El ADN plasmídico de los bancos que contenían las diferentes versiones mutadas de bgl1 se transformaron en la cepa huésped auxótrofa M. thermophila C1 pyr5- (Verdoes et al., 2007,
lnd. Biotechnol., 3 (1)), usada previamente en otras selecciones de alto rendimiento en M. thermophila. El ADN se introdujo en la cepa huésped usando un método de transformación en protoplastos (US7399627B2). Los transformantes se sembraron en placas de agar sin suplemento de uridina. Tras 5 días de incubación a 35 °C se analizaron los transformantes prototróficos resultantes (que expresan el gen pyr5). Los transformantes obtenidos se inocularon en cultivos de placas de microtitulación (PMT) de 96 pocilios para llevar a cabo la
detección selectiva de alto rendimiento o high throughput screening (US7794962B2).
El objetivo de la selección o screening era identificar las versiones mutadas de bgl1 con baja actividad de transglicosilación. Por tanto, se estableció un ensayo indirecto para estimar la capacidad de transglicosilación de una enzima BGL (beta-glucosidasa). La actividad hidrolítica en pNGP (p-nitro-fenil-glucopiranósido) se midió en presencia y ausencia de celobiosa (5,5, mM). La celobiosa se ha descrito como sustrato preferencial de las BGL con mecanismo de retención o "retainining" en su reacción de transglicosilación. Por tanto, en presencia de celobiosa, la actividad de BGL sobre pNGP muestra una reducción debido a la actividad de transglicosilación. El porcentaje de capacidad hidrolítica, medido mediante el p- nitrofenol liberado (y el consiguiente incremento de la A410) en presencia del sustrato celobiosa altamente susceptible a la transglicosilación, se usó como indicación de una baja capacidad de transglicosilación. La actividad beta-glucosidasa se mide en unidades por litro de cultivo (U/l). Una unidad de actividad de hidrólisis de pNGP se definió como la cantidad de enzima equivalente a la liberación de 1 pmol de p-nitrofenol por minuto.
La actividad de beta-glucosidasa de 5 pl de sobrenadantes de cada transformante se analizó con 100 mg/l de pNGP (Sigma N7006) durante 10 minutos a 50 °C en un volumen final de 100 pl. La reacción se detuvo añadiendo a las mezclas de reacción 100 pl de carbonato sódico 1M. Cada reacción también se llevó a cabo en presencia de celobiosa (5,5 mM), La capacidad hidrolítica se midió mediante la liberación de p-nitrofenol en presencia y en ausencia de celobiosa como indicación de baja capacidad de transglicosilación.
Para seleccionar los mutantes de bgl1 que muestran actividad de transglicosilación reducida, se estableció que una baja actividad de transglicosilación correspondía a la disminución de su capacidad hidrolítica sobre pNGP entre 30-70% cuando había celobiosa en la reacción. De entre los 6.900 transformantes analizados, uno de ellos, denominado 31L2D, mostró una capacidad hidrolítica sobre pNGP del 62% en presencia de celobiosa. Todos los transformantes con la actividad deseada se confirmaron en una segunda ronda de ensayos en PMT. La producción de proteínas de los mejores transformantes, incluido 31L2D, también se realizó a escala de producción en matraz (Verdoes et al., 2007, Ind. Biotechnol. 3(1); Visser et al., 2011, Ind. Biotechnol., 7 (3)) y se confirmó que el transformante 31L2D mostraba el mejor perfil de acuerdo con las condiciones de screening (62% de actividad beta-glucosidasa hidrolítica en presencia de celobiosa). La actividad de
beta-glucosidasa de la cepa 31L2D seleccionada y otros transformantes analizados en presencia y en ausencia de celobiosa se muestra en la Figura 3.
Para determinar la secuencia del gen bgll expresado en 31L2D, se amplificó un fragmento de ADN que contenía Pcbh1-bgl1 a partir del ADN genómico usando los oligonucleótidos 3 y 4.
Oligonucleótido 3 (SEQ ID NO: 9): El sitio de restricción SacI está subrayado. 5'-CGAGGAGCTCCTTACAAAAAAAAGGTATCC-3'
Oligonucleótido 4 (SEQ ID NO: 10): Los sitios de restricción BamHI, Smal y PstI están subrayados. El codón de terminación está en recuadro.
5TTCCTGCAGCCCGGGGGATCC T CAAGGAAGCTCAATCTTGAGATCCAACTTCC-3'
El oligonucleótido 3 incluye el sitio de restricción SacI e hibrida en el extremo 3' de Pcbhl. El oligonucleótido 4 hibrida en el extremo 3' de bgll e incluye el codón de terminación de bgll y los sitios de restricción BamHI, SmaI y PstI para clonar en el plásmido de expresión pBASEI. Los oligonucleótidos 3 y 4 se usaron para amplificar el fragmento Pcbh1-bgl1 usando ADN genómico de la cepa 31L2D como diana (obtenido usando el kit DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen) con la ADN polimerasa iProof High-Fidelity (BioRad) y se programaron durante un ciclo a 98 °C durante 2 minutos y 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 72 °C durante 90 segundos y 72 °C durante 10 minutos. El fragmento de ADN amplificado se digirió con las enzimas de restricción SacI y BamHI y se clonó en pABC344 digerido previamente con las mismas enzimas de restricción. La mezcla de ligación se transformo en células electrocompetentes de Eschenchia coli XL1Blue MRF siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante (Stratagene). El plásmido recombinante se denominó pABC410 y se muestra en la Figura 4.
El gen bgll de pABC410 se secuenció. El bgll mutado mostró una mutación: la guanina de la posición 633 de la secuencia de nucleótidos de bgll nativo SEQ ID NO: 3 se había mutado a timina, dando, por tanto, una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6, que codificaba una preproteína (SEQ ID NO: 5, preproteína Bgl1Q211H), en la que la glutamina (Q) en el residuo 211 de la preproteína nativa SEQ ID NO: 2 se había intercambiado por histidina (H), de modo que 31L2D expresaba una versión madura mutada (SEQ ID NO: 4)
de Bgl1 madura en la que la glutamina (Q) en el residuo 192 de la proteína nativa madura de SEQ ID NO: 1 se había intercambiado por histidina (H), denominada proteína madura de Bgl1Q211H. La secuencia de nucleótidos que codifica la preproteína Bgl1Q211H y la secuencia de aminoácidos de la proteína madura se muestran en la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. La secuencia codificante tiene una longitud de 2616 incluido el codón de terminación. La preproteína predicha codificada tiene 871 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) con una masa molecular prevista de 95 KDa y un punto isoeléctrico de 5.14. El plásmido pABC410 se transformó en M. thermophila C1 con el fin de confirmar el fenotipo de baja actividad de transglicosilación observado en la cepa 31L2D. La transformación, detección selectiva y medición de la actividad BGL se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente en la presente invención. Todos los transformantes que expresaban Bgl1Q211H de pABC410 mostraron la misma actividad de transglicosilación baja que la cepa 31L2D.
Ejemplo 3. Análisis comparativo de Bgl1 de la cepa C1 de Myceliophthora thermophila y la Bgl1Q211H mutante.
Producción de las enzimas Bgl1 y Bgl1Q211H.
La producción de las mezclas enzimáticas se realizó como se describe en Verdoes et al., 2007, Ind. Biotechnol. 3 (1), y Visser et al., 2011, Ind. Biotechnol., 7 (3), usando la plataforma de expresión para enzimas industriales basada en M. tehrmophila C1 desarrollada por Dyadic Netherlands.
Purificación de las enzimas Bgl1 y Bgl1Q211H.
Tanto la enzima nativa Bgl1 (SEQ ID NO: 1) como la proteína madura de Bgl1Q211H (SEQ ID NO: 4) se purificaron usando una cromatografía de intercambio iónico. Las muestras se prepararon centrifugando a 4.000xg durante 10 minutos producciones en matraz. Los sedimentos se descartaron y los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de celulosa en jeringa estéril de 0.45 ^m (VWR). Las preparaciones enzimáticas resultantes (muestras de 15 ml) se desalaron después en una columna HiPrep Desalting Sephadex G-25 (GE Helthcare) en tampón Tris-HCl 100 mM, a pH 7,0 a un caudal de 15 ml min"1.
Posteriormente se aplicó una muestra que contenía 150 mg de proteína total en una columna HiLoad 26/10 Q-Sepharose HP (GE Helthcare) equilibrada con el mismo tampón. La columna se lavó con el tampón de partida y las proteínas unidas a la misma se eluyeron con un gradiente de NaCI a un caudal de 5 mL min'1 usando un perfil de elución lineal de 0 a 30 %. En total se realizaron nueve ciclos de purificación para cada enzima. De este modo se obtuvieron puras 109 y 116 mg de las enzimas Bgl1 nativa y mutante Q211H, respectivamente.
Las BGLs purificadas se cargaron en geles de electroforesis SDS-PAGE con una concentración del 7,5% de acrilamida, con el fin de comprobar la homogeneidad de las muestras (Fig. 5). De acuerdo con la secuencia de aminoácidos de Bgl1, cabe esperar que esta enzima tenga un tamaño molecular de 93kDa. No obstante, las glicósido hidrolasas fúngicas y otras enzimas pertenecientes a diferentes familias de proteínas a menudo están glicosiladas, portando tanto glicanos O-unidos como N-unidos. De hecho, la glicosilación es la modificación postraduccional más frecuente en estas proteínas. Se detectó una única banda de 116 kDa para ambas muestras, lo que indica que se han obtenido enzimas electroforéticamente puras y que las versiones glicosiladas de las enzimas se han purificado con éxito.
Caracterización cinética de la actividad hidrolítica de la proteína Bql1 nativa v madura mutante de Bal1Q211H.
Las beta-glucosidasas (BGLs, EC 3.2.1.21) catalizan la transferencia de grupos glicosil entre nucleófilos de oxígeno sobre diferentes tipos de sustratos. Las BGLs con un mecanismo de retención, como es el caso de Bgl1, tienen actividad hidrolítica reducida a concentraciones elevadas de sustrato o de producto y esto depende al menos de la existencia de dos fenómenos diferentes: inhibición y transglicosilación. La caracterización cinética de Bgl1 y de la proteína madura mutante de Bgl1Q211H se realizó en base a su capacidad hidrolítica.
La actividad hidrolítica de BGL se determinó usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido (pNGP, Sigma) como sustrato. Para este ensayo de pNGP, las mezclas de la reacción enzimática (1 mi volumen final) que contienen 100 pmol de tampón acetato sódico (pH 5,0), 100 pg de pNGP (0,33 pmol) y una cantidad adecuada de la enzima purificada, se incubaron a 50 °C durante 10 minutos. La cantidad de p-nitrofenol liberada se midió a A410 (£410= 15,2
mM'1 cm'1) tras la adición de 100 |jg de carbonato sódico a las mezclas de reacción. Una unidad de actividad de hidrólisis sobre pNGP se definió como la cantidad de enzima equivalente a la liberación de 1 pinol de p-nitrofenol por minuto. Cuando se estudia el efecto de un compuesto soluble (glucosa o xilosa) sobre la actividad de Bgl, a la mezcla de reacción enzimática se añaden cantidades adecuadas del azúcar correspondiente.
Las BGLs purificadas se caracterizaron en términos de actividad enzimática (Vmax), afinidad por el sustrato (Km), resistencia térmica y efecto sobre la actividad enzimática de la glucosa, que es el compuesto más abundante al final de los procesos de hidrólisis enzimática de biomasa. Vmax y Km se calcularon usando un gráfico de Hanes-Woolf. La cinética de inhibición se calculó usando un gráfico de Eadie-Hofstee. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Enzima | Km (mM) | Vmax(U mg"1) | K¡, Glucosa (mM) |
Bgl1 | 0,66 | 20,02 | 3,83 |
Proteína | | | |
madura | de | | |
Bgl1Q211H | 0,25 | 25,36 | 1,38 |
Tabla 2. Caracterización cinética de las beta-glucosidasas purificadas.
No se obtuvieron indicios de un impacto directo de la afinidad por el sustrato (Km) sobre el rendimiento de hidrólisis enzimática de la correspondiente mezcla enzimática que contiene BGL. No obstante, se observó un impacto razonable de la actividad enzimática (Vmax) sobre la reducción de la dosis. La Bgl1Q211H muíante se seleccionó como una enzima más activa sobre pNGP y esto se confirmó usando enzimas purificadas: proteína madura de Bgl1Q211H mostró un incremento del 25% de la actividad específica de beta-glucosidasa en comparación con la Bgl1 purificada (25,36 Vs. 20,02 U mg prot'1).
La glucosa es un potente inhibidor competitivo de la mayoría de las BGLs. Esto también fue cierto para la enzima nativa y para la proteína madura de Bgl1Q211H purificada. Los ensayos en presencia de diferentes concentraciones de glucosa se ajustaban a una inhibición de patrón competitivo por la glucosa usando un gráfico de Eadie-Hofstee. Las K¡ calculadas fueron de 3,83 y 1,38 mM"1 para la enzima Bgl1 y la proteína madura de
Bgl1Q211H, indicando una potente inhibición competitiva por la glucosa para ambas enzimas.
Estudios de transglicosilación usando la enzima Bgl1 nativa y la proteína madura de Bgl1Q211H.
En Bgl1, el mecanismo de retención forma inicialmente un complejo glicosil covalente con la enzima. Este intermedio se descompone en la segunda etapa de la reacción, lo que se puede producir mediante una molécula de agua (actividad hidrolítica) o mediante un azúcar aceptor (actividad de transglicosilación). En la reacción de transglicosilación más sencilla, el aceptor es el propio sustrato. No obstante, la celobiosa se ha descrito como sustrato preferencial de las BGLs con mecanismo de retención en su reacción de transglicosilación.
Por tanto, se estableció un ensayo indirecto para estimar la capacidad de transglicosilación de una enzima BGL. La actividad hidrolítica sobre el pNGP se midió en presencia de concentraciones crecientes de celobiosa. El porcentaje de capacidad hidrolítica, medido mediante el p-nitrofenol liberado (y el consiguiente incremento de la A410) en presencia del sustrato celobiosa altamente susceptible a la transglicosilación, se usó como indicación de una baja capacidad de transglicosilación. Este ensayo se llevó a cabo para la Bgl1 nativa y para la proteína madura mutante de Bgl1Q211H. Los resultados se muestran en la Figura 6. Se determinó una mayor capacidad de transglicosilación para la enzima Bgl1 nativa.
Con el fin de comprobar si estos ensayos indirectos se correlacionaban con la capacidad de transglicosilación real, se llevaron a cabo ensayos de medición de la formación real de oligómeros. Las mezclas de reacción enzimáticas (volumen final de 1 ml) que contienen celobiosa 138 mM (50 g/L), tampón de acetato sódico 100 mM (pH 5,0) y 0,1 U (actividad de la celobiosa) de la Bgl1 nativa o la proteína madura mutante de Bgl1Q211H se incubaron a 50 °C durante 24 horas. Las reacciones se detuvieron tras 24 horas de incubación mediante la adición de 100 ^g de carbonato a las mezclas de reacción. Después, las mezclas se analizaron mediante HPLC (Agilent Technologies, 1200 Series) usando un detector del índice de refracción (DIR) y una columna Aminex HPX-87 H. Los tiempos de retención y el pico de las áreas obtenidas debido a la formación de cada azúcar se muestran en la Tabla
3.
| Tiempo de | Área relativa (%) |
| retención | |
Azúcar | | Proteína |
| (min) | Bgl1 madura de |
| | Bgl1Q211H |
Glucosa | 9,23 | 59,13 | 78,81 |
Celobiosa | 7,49 | 38,36 | 21,18 |
Celotriosa | 6,79 | 2,50 | 0,00 |
Tabla 3. Tiempos de retención y áreas relativas para los azúcares detectados tras el ensayo de transglicosilación. El área relativa representa el porcentaje de cada azúcar en la concentración total en la mezcla de reacción tras el ensayo de transglicosilación.
En este ensayo de transglicosilación, la glucosa es el producto de la capacidad hidrolítica de las BGLs sobre el sustrato real, celobiosa. La celotriosa solo se puede formar dentro de una reacción de transglicosilación por la cual una molécula de celobiosa actúa como aceptar para la glucosa retenida en el sitio activo de la enzima BGL. La celobiosa puede ser el 10 resultado de (1) sustrato no hidrolizado que permanece en la mezcla de reacción o (2) el producto de una reacción de transglicosilación, siendo la glucosa tanto el aceptar como el donante. Dado que tras la incubación de la proteína madura mutante de Bgl1Q211H con celobiosa no se determinó celotriosa y se determinó una concentración significativamente menor de celobiosa, se puede concluir que esta enzima mutante tiene una capacidad de 15 transglicosilación reducida y una actividad hidrolítica mejorada a concentraciones elevadas de celobiosa.
Considerando estos resultados, se ha demostrado que la enzima madura mutante de Bgl1Q211H tiene una capacidad de transglicosilación menor en comparación con Bgl1 de M. 20 thermophila C1. En el ensayo acoplado a HPLC directo, se demostró la anulación completa de la formación de oligómeros para la proteína madura de Bgl1Q211H, y fue detectable para Bgl1. Considerando el método indirecto para la estimación de la transglicosilación se estimó un intervalo de reducción del 75% de la capacidad de transglicosilación.
La reducción de la capacidad de transglicosilación de la proteína madura de la enzima Bgl1Q211H parece ser responsable de una mejora de esta enzima en términos de eficiencia
en la hidrólisis enzimática de la biomasa, proceso en el cual hay una elevada concentración de sustratos de transglicosilación que perjudica la hidrólisis de dichos sustratos en azúcares fermentables.
Estudios térmicos usando la enzima Bgl1 y la proteína madura mutante de Bgl1Q211H.
La enzima Bgl1 y la proteína madura de Bgl1Q211H purificadas se analizaron en términos de la estabilidad térmica en base al ensayo de pNGP. Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos: determinación de la temperatura de desnaturalización y estudios de estabilidad en condiciones de hidrólisis de la biomasa.
Para la determinación de la temperatura de desnaturalización, las enzimas purificadas se incubaron durante 10 minutos a temperaturas que variaban entre 30 y 80 °C, después se realizaron ensayos convencionales de pNGP usando enzimas tratadas y la actividad se representó como porcentaje relativo en comparación con la ausencia de tratamiento. En estos estudios se puede calcular un parámetro característico por el cual se determina la temperatura responsable de un 50% de pérdida de actividad enzimática (T1/2). Los resultados se muestran en la Figura 7A. En el estudio de estabilidad en condiciones de hidrólisis de la biomasa, las mezclas de reacción (1 ml de volumen final) conteniendo 0,1 mg de enzima purificada y 100 ^mol de tampón acetato sódico (pH 5,0) se incubaron a 50 °C durante 72 horas y en condiciones de agitación (300 rpm, Thermomixer Confort, Eppendorf). Se tomaron muestras a 24, 48 y 72 horas y se realizaron ensayos de pNGP convencionales. Los resultados se muestran en la Figura 7B.
No se observaron diferencias significativas en términos de temperatura de desnaturalización entre Bgl1 y la proteína madura de Bgl1Q211H. T1/2 se calculó que era 65 y 62 °C para la enzima Bgl1 y la proteína madura de Bgl1Q211H, respectivamente, ambos por encima de la temperatura de hidrólisis de la biomasa (50 °C). Respecto a la estabilidad térmica en las condiciones de hidrólisis de biomasa ambas enzimas permanecieron activas tras 72 h a 50 °C. Además, para la enzima mutante se determinó un 20% de activación.