PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE UN EXTRACTO PEPTÍDICO CON CAPACIDAD ANTIOXIDANTE A PARTIR DE SEMILLAS DE ACEITUNA
La presente invención se refiere a un procedimiento químico para obtener un extracto peptídico con capacidad antioxidante a partir de un asilado de proteínas de semilla de aceituna mediante el empleo de la enzima proteolítica alcalasa.
SECTOR DE LA TÉCNICA
Esta invención permite obtener sustancias con elevado valor añadido a partir de la semilla contenida en el hueso de la aceituna que constituye un residuo generado en el procesamiento de la aceituna. El interés de la invención está en el tratamiento de residuos industriales mediante la obtención de compuestos de alto valor biológico y en la aplicación de los péptidos bioactivos obtenidos. El tratamiento de residuos industriales y la obtención de compuestos de alto valor biológico es de interés para el sector químico y la industria manufacturera de aceituna de mesa y aceite de oliva mientras que, desde el punto de vista de la aplicación de los péptidos encontrados, esta invención iría dirigida al sector alimentario y farmacéutico.
ESTADO DE LA TÉCNICA
En los procesos de producción de aceitunas de mesa y aceite de oliva se produce un gran volumen de residuos, lo que constituye un problema medioambiental y económico. Concretamente, el hueso de la aceituna forma parte de este material residual que, en general, no se suele aprovechar. Sin embargo, la semilla contenida en el hueso de la aceituna presenta un alto contenido en proteínas, que llegan a representar el 20% del peso, y de donde podrían extraerse moléculas con alto valor añadido como son péptidos bioactivos [1, 2], Un gran número de hidrolizados proteicos derivados de la hidrólisis enzimática de proteínas de plantas y sus subproductos han demostrado tener capacidad antioxidante [3], El consumo de antioxidantes se ha relacionado inversamente con el envejecimiento, la muerte celular, la diabetes y el cáncer [4], Además, los compuestos antioxidantes son también muy útiles en el control de la oxidación lipídica en productos alimentarios. La oxidación lipídica es un grave problema en la industria alimentaria dado que da lugar a la aparición de malos sabores y olores, colores oscuros y productos de reacción
potencialmente tóxicos. La demanda de antioxidantes naturales ha aumentado en los últimos años debido a que son más seguros que los antioxidantes sintéticos y a que el consumidor tiene una percepción negativa de estos últimos. El uso de estos antioxidantes naturales ha sido estudiado en buena medida para la prevención de la oxidación lipídica en alimentos [5, 6],
En esta patente se propone una alternativa para el aprovechamiento y revalorización de este material residual.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El procedimiento químico propuesto permite la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante a partir de semilla de aceituna.
El procedimiento requiere la extracción previa de las proteínas a partir de la semilla de la aceituna, siguiendo un método previamente optimizado, y la hidrólisis enzimática de las proteínas extraídas. La extracción de las proteínas contenidas en el hueso de la aceituna se realiza utilizando un tampón Tris-HCI a pH 7,5 que contiene dodecilsulfato sódico y ditiotreitol y precipitando las proteínas solubilizadas con acetona. Las proteínas aisladas se disuelven en un medio alcalino y se lleva a cabo la hidrólisis utilizando la enzima alcalasa a una temperatura controlada y con agitación. Una vez finalizada la digestión, se inactiva la enzima y se separa por centrifugación el sobrenadante que contiene los péptidos con capacidad antioxidante.
A continuación, en la Tabla 1 se muestran los resultados de la evaluación de la capacidad antioxidante para el extracto peptídico obtenido mediante la digestión con alcalasa de las proteínas contenidas en la semilla de aceitunas de la variedad Arbequina.
Tabla 1. Capacidad antioxidante del extracto peptídico obtenido por la digestión de las proteínas de la semilla de la aceituna con la enzima alcalasa.
Muestra
Capacidad de Capacidad de captura de captura de Valor radicales DPPH radicales ABTS TEACa
Capacidad de captura de radicales hidroxilo (%)
la oxidación de lípidos (%)
Inhibición de
(%)
(%)
| Digerido con alcalasa | 68.6 ± 5.6 | 72.0 ± 4.3 | 363 ± 28 | 54.5 ± 3.3 | 91.2 ±6.9 |
| Control | 54.3 ± 4.5b | 40.4 ± 3.9C | | 66.1 ±6.7b | 89.1 ±7.2° |
a El valor TEAC (actividad antioxidante en equivalentes de Trolox) se expresa como micromoles de equivalentes de Trolox por gramos de muestra. b Usando GSH (1 mg/mL) como control positivo.
0 Usando Trolox (1 mM) como control positivo.
La comparación de los resultados con los obtenidos para un compuesto control con reconocida capacidad antioxidante demuestra que los hidrolizados obtenidos constituyen interesantes fuentes de péptidos con propiedades antioxidantes.
A través de este procedimiento se describe una alternativa de aprovechamiento de un material residual como son los huesos de aceituna y que hasta ahora no se realizaba. En comparación con otras formas de aprovechamiento de este residuo, el procedimiento que aquí se presenta permite la revalorización de esta fuente barata de proteínas.
Por último, el procedimiento objeto de la invención es sencillo, económico, rápido y seguro, ya que utiliza instrumentación básica y una enzima comercial de uso extendido en la industria alimentaria.
MODO DE REALIZACIÓN
Obtención del aislado de proteína de la semilla de aceituna
Para la obtención del aislado proteico de la semilla de la aceituna se emplea un método optimizado previamente [7], Brevemente, el hueso de la aceituna se deja secar a temperatura ambiente y se extrae del mismo la semilla mediante fractura mediante procedimientos mecánicos. Una vez extraída la semilla de la aceituna esta se tritura en un molinillo. Las proteínas de la semilla se extraen empleando un medio de extracción formado por un tampón Tris-HCI 125 mM (pH 7,5) que contiene dodecilsulfato de sodio y ditiotreitol. En estas condiciones las proteínas pasan a la disolución acuosa y el residuo sólido se elimina mediante centrifugación. Se recupera el sobrenadante y se le añade acetona
previamente enfriada para precipitar las proteínas. El aislado proteico se recoge por centrifugación de la muestra y se deja secar a temperatura ambiente.
Obtención del hidmlizado de proteínas de la semilla de aceituna
La hidrólisis del extracto proteico obtenido a partir de la semilla de aceituna se lleva a cabo empleando la enzima proteolítica alcalasa. Para ello, el aislado proteico de la semilla de aceituna se disuelve en una disolución reguladora adecuada, como puede ser un tampón fosfato a baja concentración, a un pH comprendido entre 7,0 y 9,0. Se recomienda una concentración de enzima de 0,01-0,5 U/g proteína. La reacción de hidrólisis se llevan a cabo a una temperatura comprendida entre 40-60 °C durante un tiempo suficientemente elevado como para que la digestión sea completa (superior a 1 h)y con agitación. Seguidamente, se realiza la inactivación de la enzima, que se sugiere que se lleve a cabo calentando las muestras a una temperatura superior a 100 °C. A continuación, se centrifugan las muestras para precipitar las posibles proteínas remanentes. La capacidad antioxidante del extracto peptídico obtenido se evalúa a continuación.
Evaluación de la capacidad antioxidante
La capacidad antioxidante del hidrolizado obtenido con la enzima alcalasa se evaluó empleando cuatro métodos in vitro distintos: ensayo ABTS (ácido 2,2-azino-bis(3- etilbenzotiazolin-6-sulfónico)), ensayo DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo), ensayo del radical hidroxilo y ensayo de autooxidanción del ácido linoleico.
El ensayo ABTS se realiza de acuerdo a lo descrito por Wiriyaphan y col. [8] con algunas modificaciones. Se prepara una disolución stock de ABTS0+ mezclando, a temperatura ambiente y en oscuridad durante 16 h, una disolución de ABTS 7,4 mM con persulfato potásico 2,5 mM. El radical ABTS0+ formado se diluye con tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) hasta obtener una absorbancia de 0,7 ± 0,01 a 734 nm. A 1 ^L de muestra se le añaden 100 ^L de la disolución de ABTS0+ y la absorbancia se mide transcurridos 6 min. Se calcula la capacidad antioxidante de acuerdo a la siguiente ecuación:
Capacidad de captura de radicales ABTS (%)
( Abs - Abs \
J blanco muestra
Abs
V yitA5 blanco J
x 100
donde Absmuestra es la absorbancia de 1 |jL de muestra con 100 pL de disolución de ABTS0+ y AbSbianco es la absorbancia de 1 |jL del tampón empleado en la digestión del extracto proteico con 100 pL de disolución de ABTS0+.
La capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox (TEAC) refleja la cantidad de Trolox (mM) que hace falta para producir la misma actividad que una concentración 1 mM del compuesto estudiado. El valor TEAC se determina comparando la pendiente obtenida al determinar la capacidad de captura de radicales ABTS de los hidrolizados a cinco concentraciones finales diferentes (3-35 pg/mL) con el valor de la pendiente de una curva estándar preparada con Trolox (concentraciones finales de 0-15 pM).
El ensayo DPPH se lleva a cabo de acuerdo a lo descrito en trabajos anteriores [9, 10]. Para llevar a cabo el ensayo, la muestra (50 pL) se mezcla con 50 pL de una disolución de DPPH 0,1 mM en 95% (v/v) de EtOH. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante 30 min y la absorbancia de la disolución resultante se determina a 515 nm. Como control positivo se utiliza GSH en concentraciones de 0 a 5 mg/mL. La capacidad antioxidante se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:
Capacidad de captura de radicales DPPH (%) =
Absmu~b» ~Abs control
Abs
blanco
\
muestra
y
x 100
donde Absmuestra es el valor de la absorbancia de 50 pL de muestra con 50 pL de la disolución de DPPH; AbsControi_muestra es el valor de la absorbancia de 50 pL de muestra con 50 pL de EtOH al 95% (v/v); y Absbianco es el valor de la absorbancia de 50 pL del tampón empleado en la digestión de la muestra con 50 pL de la disolución de DPPH.
El ensayo del radical hidroxilo se lleva a cabo de acuerdo a lo descrito por Ajibola y col. [11] con algunas modificaciones. Se prepararan disoluciones de 1,10-fenantrolina 3 mM en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4), sulfato ferroso 3 mM y peróxido de hidrógeno al 0,01% (v/v). A 25 pL de muestra se añaden 25 pL de la disolución de 1,10-fenantrolina y 25 pL de la disolución de sulfato ferroso. Para iniciar la reacción se añaden 25 pL de peróxido de hidrógeno y se incuba durante 1 h a 37 °C. La absorbancia de la disolución resultante se mide a 536 nm. Como control positivo se utiliza GSH en concentraciones de 0 a 5 mg/mL. La capacidad antioxidante se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:
Capacidad de captura de radicales hidroxilo (%) =
Abs.
A Ap
V control
Abs
blanco
Abs
blanco J
x 100
donde Absmuestra es la absorbancia del digerido proteico; Absbianco es la absorbancia resultante de utilizar agua en lugar de la muestra; y AbsCOntroi es la absorbancia resultante de llevar a cabo la reacción poniendo agua en lugar de peróxido de hidrógeno.
El ensayo de autooxidación del ácido linoleico se realiza de acuerdo al método establecido por Chen y col. [9] con algunas modificaciones. Para ello, se mezclan 20 pL de muestra con 20 pL de una disolución de ácido linoleico disuelto en EtOH al 0,13% (v/v) y con 10 pL de agua. La muestra se mantiene a 40 °C en la oscuridad durante 144 h (6 días) y se evalúa el grado de peroxidación mediante el método del tiocianato férrico [11]. Para ello, se mezclan, a diferentes intervalos de tiempo durante la incubación, 2,5 pL de la mezcla incubada con 175 pL de EtOH al 75% (v/v), 2,5 pL de tiocianato amónico al 30% (m/v) y 2,5 pL de cloruro ferroso 20 mM en HCI al 3,5% (v/v). Después de 3 min, se mide la absorbancia a 500 nm. Los blancos se obtienen con un volumen equivalente del tampón empleado en cada digestión enzimática. Como control positivo se emplea GSH en una concentración de 1 mg/mL. La inhibición de la oxidación del ácido linoleico se calcula utilizando la siguiente ecuación:
Inhibición de la oxidación del ácido linoleico (%) =
1 -(Ab (Abs
s
muetra,\44h
blanco,144h
AbSmuestra,Oh )
Abs
blanco,Oh ,
x 100
donde Absmuestra,i44h y AbSmuestra,oh son las absorbancias de la muestra tras 144 h y 0 h, respectivamente; y la AbSbianco,i44h and AbSbianco.oh son las absorbancias del blanco tras 144 h y 0 h, respectivamente.
APLICACIÓN INDUSTRIAL
A los fabricantes de las industrias alimentaria y farmacéutica les interesa que existan procedimientos químicos rápidos, económicos y sencillos que permitan la obtención de hidrolizados proteicos con capacidad antioxidante que puedan añadir a sus productos comerciales. El novedoso empleo de la semilla de la aceituna como fuente de péptidos
bioactivos ofrece una fuente barata de compuestos de alto valor biológico resolviéndose a la vez un problema de aprovechamiento de los residuos producidos durante la fabricación de aceituna de mesa y aceite de oliva.
BIBLIOGRAFÍA
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[6] Sakanaka, S.; Tachibana, Y.; Ishihara, N.; Juneja, L. R.; Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005, 53, 464-468.
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[8] Wiriyaphan, C.; Chitsomboon, B.; Yongsawadigul, J.; Food Chemistry 2012, 132, 104-111.
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[10] Brandwilliams, W.; Cuvelier, M. E.; Berset, C.; LWT-Food Science and Technology 1995, 28, 25-30.
[11] Chen, H. M.; Muramoto, K; Yamamuchi, F.; Journal of Agricultural and Food Chemistry 1995, 43, 574-578.
