Nuevos antiinflamatorios basados en polifenoles del olivo.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a productos basados en polifenoles del olivo que proporcionan aplicaciones con notables ventajas en base a sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias.
Esta invención es de aplicación en la Industria Alimentaria, Cosmética y Farmacéutica.
ANTECEDENTES EN EL ESTADO DE LA TÉCNICA
Atendiendo al estado de la técnica, no existen antecedentes de la síntesis del compuestro natura! 3,4-dihidroxifenilglicol, el cual ha sido aislado de! alperujo (J. Fernández-Bolaños Guzmán; G. Rodríguez Gutiérrez; A. Lama Muñoz; F. Senent Rubio; J. M. Fernández- Bolanos Guzmán; I. Maya Castilla; O. López López; A. Marset Castro, PCT Int. Appl. (2013), WO 2013007850 A1 20130117) o de aceitunas de mesa (G. Rodríguez; A. Lama; S. Jaramillo; J.M. Fuentes-Alventosa; R. Guillén; A. Jimenez-Araujo; R. Rodríguez-Arcos; J. Fernandez-Bolanos, J. Agr. Food Chem. 57, 2009,6298-6304). Tampoco existen antecedentes de derivados adiados de! 3,4-dihidroxifenilglicol.
Algunos polifenoles presentes en el olivo presentan propiedades antiinflamatorias que han sido descritas, bien como productos puros o como extractos. Así, el aceite de oliva virgen extra suplementado con hidroxitirosol (HT) ejerce un papel beneficioso sobre la colitis crónica inducida por DSS gracias a su capacidad de reducir la expresión de proteínas inflamatorias como la óxido nítrico sintasa inducible (¡NOS) y la cic!ooxigensa-2 (COX-2) y modular la interleucina-10 (IL-10) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) (S. Sánchez- Fidalgo, L. Sánchez de Ibargüen, A. Cárdeno, C. Alarcón de la Lastra, Eur. J. Nutr. 51, 2012, 497-506). El HT y la oleuropeína extraídos de hojas de olivo presentan actividades antiinflamatorias y analgésicas (E. Haloui; B. Marzouk; Z. Marzouk; A. Bouraoui; N. Fenina, J. Food Agr. Environ. 9, 2011, 128-133). Se ha demostrado que el HT es el
principal compuesto antiinflamatorio en extractos acuosos de aceitunas y que reduce la producción de citocinas y quimiocinas en macrófagos (N. Richard; S. Arnold; U. Hoeller; C. Kilpert; K. Wertz, Karin; J. Schwager, Planta Medica, 77, 2011, 1890-1897). Se ha demostrado la actividad antiinflamatoria del HT y la inhibición de producción de citocinas en un modelo de neuroinflamación asociado al Parkinson (R. Crea; C. M. Bitle.; L. M. Bolin; P. Pontoniere, Agro Food Ind. Hi-Tec. 23, 2012, 26-29).
Se ha descrito que alquil éteres en la cadena lateral ejercen efectos antiinflamatorios superiores a los que presenta el HT (J. J. Reyes, J. P. De La Cruz, J. Muñoz-Maín, A Guerrero, J. A. López-Villodres, A. Madrona, J. L. Espartero, J. A. González-Correa, Eur. J. Nutr. 52, 2013, 591-599). También se han descrito las propiedades antiinflamatorias del oleocantal, un tirosil ester del dialdehído del ácido elenólico, p-HPEA-EDA (S. Cicerale; L. J. Lucas; R. S. J. Keast, (Ed.) D. Boskou, Olive Oil, 2012, 357-374; L. Lucas; S. Cicerale; R. Keast, Anti-lnflamm. Anti-Allergy Agents Med. Chem. 10, 2011, 399-406; M. Scotece; R. Gómez; J. Conde; V. López; J. Gómez-Reino; F. Lago; A. B Smith; O. Gualillo, Life Sci. 91, 2012, 1229-1235). También se ha demostrado la capacidad de fenoles del olivo, incluyendo HT, tirasol, y sus derivados secoiroideos, en la modulación de la producción de mediadores inflamatorios en monocitos humanos recién aislados de donadores sanos. (P. Rosignoli, R. Fuccelli, R. Fabiani, M. Servili, G. Morozzi, J. Nutr. Biochem. 24, 2013, 1513- 1519).
No existe ningún antecedente que describa las propiedades antiinflamatorias del3,4- dihídroxifenilglicol, ni de sus derivados adiados, ni de los alcanoatos de hidroxitirosilo. Tampoco existen datos sobre las propiedades antiinflamatorias de los tio derivados del HT.
Así, a luz de los antecedentes descritos, la invención "Nuevos antiinflamatorios basados en polifenoles del olivo" aporta notables ventajas en la prevención y tratamiento de enfermedades asociadas a procesos inflamatorios y autoinmunes como artritis reumatoide, osteoartritis, lupus eritematoso y enfermedad inflamatoria intestinal.
Asi mismo, dentro de la Industria Alimentaria puede ser útil para la formulación de alimentos funcionales o como aditivos para prevenir el deterioro del alimento mejorando
sus propiedades organolépticas o nutricionales. En la Industria Farmacéutica el uso de estos compuestos estaría encaminado a la obtención de nuevos fármacos antiinflamatorios o formulaciones que lo contengan, para su administración por vía oral, tópica o rectal. En la Industria Cosmética estos compuestos podrán utilizarse como componentes de cremas solares y antienvejecimiento por su capacidad de captación de radicales libres.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
A modo explicación de la invención "Nuevos antiinflamatorios basados en polifenoles del olivo", el mismo consiste en dos procedimientos para obtener 3,4-dihidroxifenilglicol 6.
Opción 1 Procedimiento de síntesis del 3,4-dihidroxifenilglicol a partir del HT
Se parte de HT 1, a la vista del Esquema 1 que se expondrá a continuación, y se protegen los hidroxilos fenólicos con grupos tales como grupos bencilos o un grupo o-xilileno par a dar 2. La halogenación de la cadena lateral de 2 por sustitución del hidroxilo alifático por halógeno y posterior deshidrohalogenación de 3 conduce al vinilcatecol O-protegido 4 que es dihidroxilado para dar 5, usando por ejemplo tetróxido de osmio. Por último la desprotección del fragmento de catecol conduce a 6.
**(Ver fórmula)**
Esquema 1.
Opción 2 Procedimiento de síntesis del 3,4-dihidroxifenilglicol a partir de cloruro de
3,4-dihidroxifenacilo.
5 El segundo procedimiento de preparación de 3,4-dihidroxifenilglicol 6 a la vista del
Esquema 2 que se expondrá a continuación parte de haluro de 3,4-dihidroxifenacilo 7 que se transforma en la triacetoxiacetofenona 8 siguiendo una modificación del procedimiento de H. Voswinckel, Ber. Dtsch. Chem. Ges.42, 1910, 4651-4654. La hidrogenación de 8 se puede llevar a cabo con distintos catalizadores tales como Pd/C, Pd(OH)2/C, Nickel 10 Raney, en disolventes como etanol, metanol, THF, conteniendo o no anhídrido acético. Se
forma en dichas condiciones mezclas de 9 y 10 que se convierten en 10 por acetilación convencional, con rendimiento de 10 del 80% calculado a partir de 8. También obtenemos 9 por reducción de 8 con hidruros de boro como el triacetoxiborohidruro, en presencia o en ausencia de tricloruro de cerio. La hidrólisis de 9, de 10 o de mezclas de 9 y 10 para dar 6 15 se lleva a cabo en medio acuoso y catálisis ácida o básica.
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**
Esquema 2.
Procedimiento de síntesis de (3,4-dihidroxifen¡l)diac¡lalicoles
Consistente en la preparación de (3,4-dihidroxifenil)diacilglicoles 12 mediante el procedimiento descrito en el Esquema 3 que se expondrá a continuación. El intermedio clave es el glicol 5 al que se puede acceder desde el HT (Esquema 1), o por protección de 6, sintético o extraído de diversas fuentes naturales, con reactivos como haluro de bencilo
o dihaluro de o-xilileno. La acilación exhaustiva de 11 conduce a los diacil derivados 11 cuya desprotección conduce a 12.
HO.
OH
X.OH
PO.
OH
X..OH
HO
PO'
PO.
PO'
**(Ver fórmula)**
O
o
O^R
HO
HO'
**(Ver fórmula)**
V
o
**(Ver fórmula)**
Esquema 3.
Así mismo, la presente invención incluye las propiedades antiinflamatorias del 3,4- dihidroxifenilglicol presente en la pulpa de aceituna, en el aceite de oliva virgen extra y en alperujo. Es decir, la presente invención también remarca la actividad antiinflamatoria del 3,4-dihidroxifenilglicol (6), de los 4-(1,2-diaciloxietil)benceno-1,2-diol (12), de los alcanoatos de hidroxitirosilo (13), y de los tioderivados de HT 14-16 en macrófagos perifonea les de ratón estimulados con lipopolisacárido bacteriano (LPS) comparándolos con HT (1).
**(Ver fórmula)**
HO,
HO
HO.
HO'
,SH
HO
HO'
,SS
.OH
OH
Es decir, se recalcan las propiedades antiinflamatorias de los derivados lipófilos del HT y del3,4-dihidroxifenilglicol, conteniendo grupos acilo en la cadena lateral. Gracias a la lipofilia aportada por los grupos acilo los nuevos antiinflamatorios puede ser añadidos a matrices lipídicas como por ejemplo aceites vegetales y de pescado, con lo que se obtendrían alimentos funcionales con propiedades antiinflamatorias potenciadas. Además, mostramos las propiedades anti-inflamatorias de tio derivados deHT.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de tratamiento o prevención de inflamaciones en un mamífero, preferiblemente un humano, que comprende la ingesta dietética de una cantidad terapéuticamente efectiva del acetato de hidroxitirosilo (13, R = Me) y de esta forma poner de manifiesto los beneficios de la terapia nutricional a base de 13 en la prevención de la enfermedad inflamatoria intestinal, mediante su incorporación a diferentes formas de soporte nutricional útiles en patología digestiva como la nutrición oral, parenteral total, dietas entérales o suplementos nutricionales.
Descripción de las figuras
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de figuras en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Fig. 1. Efecto del acetato de hidroxitirosilo (13), del 3,4-dihidroxifenilglicol (6) y sus derivados 4-(1,2-dibutanoiloxietil)benceno-1,2-diol (12a) y 4-(1,2-dilauroiloxietil)benceno-
1,2-diol (12b), así como de los tioderivados del HT, el tioacetilado (14), tiohidroxitirosol (15) y disulfuro de hidroxitirosol (16) en la producción de nitritos en el modelo de macrófagos perifonéales de ratón. HT ha sido usado como producto de referencia. Las células fueron previamente tratadas con los diferentes compuestos y tras 30 minutos estimuladas con LPS. Después de 18 h los sobrenadantes fueron recogidos para la evaluación de nitritos por el método de Griess. ***(p<0.001) diferencias significativas respecto al grupo control LPS; +(p<0.05) diferencias significativas respecto al grupo HT.
Fig. 2. Efecto de (13), (6), (12a), (12b), (14), (15) y (16) en la expresión de ¡NOS en el modelo de macrófagos perifonéales de ratón. Las células fueron previamente tratadas con los diferentes compuestos y tras 30 minutos estimuladas con LPS. Después de 18 h las células fueron recogidas para la determinación proteica por western blot. HT ha sido usado como producto de referencia y los western blots han sido normalizados al patrón de carga p-actina. Los valores son expresados en unidades arbitrarias tras medir la intensidad de las señales por densitometría.*(p<0.05), ** (p<0.01) y ***(p<0.001) diferencias significativas respecto al grupo control LPS.
Fig. 3. Efecto de (13), (6), (12a), (12b), (14), (15) y (16), en la expresión de COX-2 en el modelo de macrófagos peritoneales de ratón. Las células fueron previamente tratadas con los diferentes compuestos y tras 30 minutos estimuladas con LPS. Después de 18 h las células fueron recogidas para la determinación proteica por western blot. HT ha sido usado como producto de referencia y los western blots han sido normalizados al patrón de carga p-actina. Los valores son expresados en unidades arbitrarias tras medir la intensidad de las señales por densitometr(a.`(p<0.05) y **(p<0.01) diferencias significativas respecto al grupo control LPS.
Fig. 4. Efecto de (13), (6), (12a), (12b), (14), (15) y (16) en la expresión de IkappaB en el modelo de macrófagos peritoneales de ratón. Las células fueron previamente tratadas con los diferentes compuestos y tras 30 minutos estimuladas con LPS. Después de 18 h las células fueron recogidas para la determinación proteica por western blot. HT ha sido usado como producto de referencia y los western blots han sido normalizados al patrón de carga p-actina. Los valores son expresados en unidades arbitrarias tras medir la intensidad de las señales por densitometría. ***(p<0.001) diferencias significativas respecto al grupo control LPS; ++(p<0.01) y +++(p<0.001) diferencias significativas respecto al grupo HT.
Fig. 5. Evolución del peso de los animales de experimentación desde el comienzo de tratamiento con DSS al 3 % p/v en el agua de bebida (DO) hasta el final del estudio.
Fig. 6. Pérdida de peso experimentada por los animales de experimentación, expresada en porcentaje, durante todo el período experimental. ***p<0.001 vs Control y ++p<0.01 vs Control-DSS.
Fig. 7. Longitud del colon obtenido de los animales de experimentación, expresado en centímetros. *p<0.05 vs Control.
Fig. 8. Relación peso/longitud del colon, expresada en gramos por centímetros (g/cm). *p<0.05 vs Control y +++p<0.001 vs Control-DSS.
Fig. 9. Indice de actividad de la enfermedad (DAI), expresada como promedio de las escalas de pérdida de peso, consistencia de las heces y presencia de sangre en las mismas. ***p<0.001 vs Control y +++p<0.001 vs Control-DSS.
Fig. 10. Actividad mieloperoxidasa (MPO) como medida de la infiltración neutrofílica en el tejido colónico, expresada en unidades de actividad enzimática por miligramo de tejido (U/mg tejido). ***p<0.001 vs Control y +p<0.05 vs Control-DSS.
Fig 11. Evaluación histológica del tejido colónico tras la administración de una dieta suplementada con acetato de hidroxitirosilo (13). Las imágenes son representativas de la sección colónica de los grupos ensayados (control, control DSS, DSS + (13)), tras la tinción con hematoxilina/eosina a un aumento 10X.
Fig. 12. Efecto de la dieta suplementada con 13 en la expresión de ¡NOS y COX-2 en el modelo in vivo de colitis ulcerosa inducida por DSS. Los valores son expresados en unidades arbitrarias tras medir la intensidad de las señales por densitometría. *p<0.05 vs Control y +p<0.05 vs Control-DSS.
Fig. 13. Efecto de la dieta suplementada con 13 en la expresión de la p-p38 y JNK MAPKs en el modelo in vivo de colitis ulcerosa inducida por DSS. Los valores son expresados en unidades arbitrarias tras medir la intensidad de las señales por densitometría. *p<0.05 vs Control y +p<0.05 vs Control-DSS.
Fig. 14. Efecto de la dieta suplementada con acetato de hidroxitirosilo (13) en la expresión de IkappaB en el modelo in vivo de colitis ulcerosa inducida por DSS. Los valores son expresados en unidades arbitrarias tras medir la intensidad de las señales por densitometría. *p<0.05 vs Control.
EJEMPLO DE REALIZACIÓN PREFERENTE
En una realización preferida de la invención "Nuevos basados en polifenoles del olivo" se incluye a continuación un primer apartado a modo de ejemplo de síntesis de los compuestos principales, seguido de dos apartados donde se presentan resultados a modo de evaluación de sus aplicaciones.
A. SÍNTESIS DE COMPUESTOS
2-r3l.4,-fo-Xilllenodioxi)fenil1etanol (2)
A una disolución de 1 (200 mg, 1.30 mmol) en H20-EtOH 1:5 (12 mL) se añadió K2C03 (358 mg, 2.60 mmol), ascorbato sódico (260 mg, 1.30 mmol) y a.a-dibromo-o-xileno (342 mg, 1.30 mmol) y se agitó a 55 °C durante 5 h bajo atmósfera de argón. A continuación, se concentró a sequedad, el residuo se disolvió en AcOEt y se lavó con H20 y la fase acuosa se extrajo tres veces con AcOEt. El conjunto de las fases orgánicas se secó con MgS04 anhidro, se filtró y se concentró a sequedad y el crudo se purificó mediante cromatografía en columna (AcOEt:hexano 1:3). El compuesto 2 se obtuvo como un sólido incoloro.
Rendimiento: 67%; p.f.: 100-102 °C. 1H-RMN (300 MHz, 0DCI3): 5 7.28-7.12 (m 4H), 6.93 (d 1H, J= 8.1 Hz), 6.83 (d 1H, J= 2.1 Hz), 6.74 (dd 1H), 5.39 (s 2H), 5.36 (s 2H), 3.74 (t 2H, J= 6.6 Hz), 2.70 (t 2H), 1.71 (s.a. 1H).
1.2-fo-X¡lilenod¡oxn-4-f 2-vodoetinbenceno (31
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**
A una disolución de 2 (300 mg, 1.18 mmol) en THF seco (10 mL) y atmósfera inerte, se añadió PPh3 (308 mg, 1.18 mmol), imidazol (160 mg, 2.36 mmol), l2 (448 mg, 1.76 mmol) y tamiz molecular 4A y se calentó a reflujo durante 2.5 h. A continuación, se filtró la mezcla de reacción, se evaporó el disolvente, y el residuo resultante se disolvió en AcOEt (40 mL), añadiéndose una disolución saturada de NaHC03 ac. (10 mL) y una disolución saturada de Na2S203 ac. (10 mL). Se agitó durante unos minutos hasta desaparición del color amarillento y se separó la fase orgánica de la acuosa, extrayéndose esta última con AcOEt (3 x 30 mL). El conjunto de las fases orgánicas se secó con MgS04 anhidro, se filtró y se concentró a sequedad. El producto se purificó mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:30) y se obtuvo 3 como un sólido. Rendimiento: 80%; p.f.: 57-
59 °C. 1H-RMN (300 MHz, CDCI3): 5 7.30-7.16 (m 4H), 6.94 (d 1H, J= 8.1 Hz), 6.82 (d 1H, J= 1.9 Hz), 6.73 (dd 1H), 5.41 (s 2H), 5.39 (s 2H), 3.27 (m 2H), 3.04 (t 2H, J= 7.8 Hz).
1.2-fo-Xililenodioxi)-4-vinilbenceno (4)
**(Ver fórmula)**
A una disolución de 3 (300 mg, 0.82 mmol) en DMF (5 mL) y mantenida en frío (0 °C) se añadió NaH (29 mg, 1.23 mmol) y se agitó a t.a. durante 1 h. A continuación, se adicionaron unas gotas de MeOH, se eliminó la DMF a presión reducida y el residuo se disolvió en AcOEt (15 mL) y se lavó con agua (10 mL) para eliminar las sales. La fase orgánica se secó con MgS04, se filtró, se concentró a sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:30), aislándose 4 en forma de sólido incoloro. Rendimiento: 98%. 1H-RMN (300 MHz, CDCI3): 8 7.29-7.23 (m 4H, 7.06 (d
1H, J= 1.8 Hz), 6.96 (dd 1H, J= 8.3 Hz), 6.92 (d 1H), 6.57 (dd 1H, J= 17.6 Hz, J= 10.9 Hz) 5.56 (dd 1H, J= 0.7 Hz), 5.41 (s 4H), 5.13 (dd 1H).
1 -f3. 4*4 o-Xili lenodioxilfeni lleta no-1.2-dio I (5b)
OH
**(Ver fórmula)**
OH
A una disolución de 4 (300 mg, 1.26 mmol) en agua-acetona (1:3, 12 ml_) se añadió N- óxido de /V-metilmorfolina (186 mg, 1.38 mmol) y Os04 en ferc-butanol (2.5%, 75pL, 0.006 mmol) y se agitó a t.a. durante 3 h. A continuación, se evaporó la acetona, el producto se extrajo con AcOEt (3 x 30 mL) y el conjunto de las fases orgánicas se secó con MgS04, se filtró y se concentró a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:1 * 2:1), aislándose 5 en forma de sólido incoloro.
Rendimiento: 73%. 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2CO): 5 7.30-7.23 (m 4H), 7.00 (s.a. 1H), 6.91 (m 2H), 5.43 (s 2H), 5.41 (s 2H), 4.57 (dd 1H, J= 4.3 Hz, J= 7.7 Hz), 3.54 (dd 1H, J=
11.0 Hz, J= 4.3 Hz), 3.46 (dd 1H, J= 11.0 Hz, J= 7.7 Hz).
(3.4-DihÍdroxifeninalicol (6) por desprotección de 5b.
A una disolución de 5b (300 mg, 1.10 mmol) en EtOH (5 mL) se añadió Pd-C 10% (100 mg) y se hidrogenó a presión atmosférica, a t.a y en la oscuridad durante 2 h. La mezcla de reacción se filtró sobre celita, el disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH2CI2-MeOH 5:1), aislándose 6 como
sirupo incoloro. Rendimiento: 88%. 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2CO): 8 6.90 (d 1H, J= 1.8 Hz), 6.77 (d 1H, J= 8.1 Hz), 6.70 (dd 1H), 4.60 (dd 1H, J= 4.1 Hz, J= 8.0 Hz), 3.60 (dd 1H, J= 11.0 Hz, J= 4.1 Hz), 3.52 (dd 1H, J= 11 Hz, J= 8.0 Hz).
OH
**(Ver fórmula)**
Diacetato de 4-í2-acetoxi-1-hidroxietill-1.2-fenileno v diacetato de 4-Í1.2- acetoxiacetil)-1.2-difenileno (9) v (10)
**(Ver fórmula)**
A una disolución de cloruro de 3,4-dihidroxifenacilo (1.03 g, 5.53 mmol) 7 en anhídrido acético (10 mi), se le añade NaOAc anhidro (879 mg, 10.7 mmol) y se calienta a reflujo durante 6 horas. Se añade agua y unas gotas de piridina y se agita durante 1 h. A continuación se concentra a sequedad y el sirupo se purifica en cromatografía en columna con AcOEt-hexano (1:3->1:2). Rendimiento del acetato de 3,4-diacetoxifenacilo (8): 90%. A una disolución de 8 (1.46 g, 4.96 mmol) en EtOH (30 mi), se añaden 470 pl de anhídrido acético y se hidrogena con Pd/C 10% (500 mg) a presión atmosférica y temperatura ambiente durante 4 h. A continuación se filtra sobre celita y se concentra a sequedad. El sirupo resultante se purifica por cromatografía en columna en AcOEt-hexano (1:2 * 1:1), para obtener el triacetilado 9 (46%) y el tetraacetilado 8 (32%). Si se lleva a cabo la acetilación de la mezcla de 9 y 10 en Ac20 en piridina 1:1 (2 mi) antes de su separación cromatogáfica se obtiene 10 con un 80%. 1H-RMN de 8 (300 MHz, CDCI3): 8 7.29-7.26 (m 2H, 7.19-7.16 (m 1H), 4.95 (dd 1H, J= 8.1 Hz, J= 3.3 Hz), 4.29 y 4.13 (2 dd 1H cada uno, J= 11.6 Hz, J= 3.3 Hz, J= 8.1 Hz), 2.29, 2.28 y 2.10 (3s 3H cada uno). 1H-RMN de 9 (300 MHz, CDCI3): 5 7.26 (dd 1H, J= 8.6 Hz, J= 2.0 Hz), 7.22 (d 1H, J= 2.0 Hz), 7.19 (d 1H, J= 8.6 Hz), 6.01 (dd 1H, J= 7.8 Hz, J= 3.9 Hz), 4.34 y 4.27 (2 dd 1H cada uno, J= 11.9 Hz, J= 3.9 Hz, J= 7.8 Hz).
f3.4-Dihidroxifenil)qlicol 6 a partir de 10
OH
**(Ver fórmula)**
Se agita una dispersión de 10 (204 mg, 0.60 mmol) en H2S04 2N (10 mi) a temperatura ambiente durante 24 horas. Se neutraliza el medio con NaHC03 y se concentra a
sequedad. El residuo se purifica por cromatografía en columna en CH2CI2-MeOH (30:1 -* 10:1) para dar 6. Rendimiento: 55%.
Método general para la síntesis de los diacilalicoles protegidos
A una disolución del glicol protegido (1 mmol) en piridina previamente enfriada a 0 °C se añade el agente acilante (3 mmol). Tras agitar 10-20 minutos en frío, se deja en agitación, y a temperatura ambiente, durante 12-72 horas hasta reacción completa. Se añaden unas gotas de agua y posteriormente se diluye la disolución con CH2CI2 y se realizan los siguientes lavados: primero con HCI 1M hasta pH ácido, posteriormente con NaHC03 1M hasta pH básico y, por último, con agua hasta pH neutro. Se concentra a sequedad y el residuo se purifica por cromatografía en columna en AcOEt-hexano (1:5 > 1:1).
1 -(3.4-Bisfbenciloxilfenilletano-l.2-diol f5al
OH
A una disolución de 6 (200 mg, 0.57 mmol) en acetona seca (20 mi) se añade K2C03 (640 mg, 4.63 mmol) y BrBn (320 pL, 2.72 mmol). Se calienta a reflujo en oscuridad durante 12 horas. Se filtra y se concentra a sequedad. El simpo resultante se purifica en cromatografía en columna en AcOEt-hexano (1:5 1:1) obteniendo el producto final como un sirupo muy denso amarillo pálido. Rendimiento: 81%. 1H-RMN (300 MHz, CD3OD): 8 7.50-7.29 (m 10H), 7.11 (d 1H, J= 1.9 Hz), 7.02 (d 1H, J= 8.3 Hz), 6.93 (dd 1H, J= 8.3 Hz, 1.9 Hz), 5.15 (s 2H), 5.13 (s 2H), 4.62 (t 1H, J= 6.0 Hz), 3.58 (d 2H, J= 6.0 Hz).
1,2-Dibenc¡loxi-4-M.2-dibutanoiloxietillbenceno M1 al
**(Ver fórmula)**
o
BnO
BnO
**(Ver fórmula)**
A una disolución de 5a (553 mg, 1.58 mmol) en piridina (3 mi) enfriada a 0 °C se añade cloruro de butanoilo (500 pl, 4.81 mmol), se agita 10 minutos y se deja en congelador toda la noche. Se añade unas gotas de agua y se diluye la piridina con CH2CI2 (90 mi). Se lava con HCI1M (porciones de 30 mi) hasta pH ácido. Posteriormente la fase orgánica se lava con NaHC03 1M (porciones de 30 mi) hasta pH básico y, por último, se lava la fase orgánica con agua hasta pH neutro. Finalmente la fase orgánica se seca con MgS04, se filtra y se concentra a sequedad obteniendo un sirupo que se purifica por cromatografía en columna en AcOEt- hexano (1:5 1:1). Rendimiento: cuantitativo. 1H-RMN (300 MHz, CD3OD): 57.48-7.29(m 10H), 7.06 (d 1H, 7= 1.9 Hz), 7.04 (d 1H, 7= 8.3 Hz), 6.94 (dd 1H, 7= 8.3 Hz, 7= 1.9 Hz), 5.95 (dd 1H, 7= 7.0 Hz, 7= 5.0 Hz), 5.16 y 5.15 (2 s 2H cada uno), 4.24 (m 2H), 2.36-2.31 (m 2H), 2.27 (t 2H, 7= 7.3 Hz), 1.65 y 1.62 (2 sex 2H cada uno, 7=7.4Hz), 0.95 y 0.94 (21 3H cada uno, 7=7.4 Hz).
1.2-Dibenciloxi-4-f1.2-dilauroiloxietihbenceno (11 bl
BnO.
BnO
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**
O
A una disolución de 5a (400 mg, 1.12 mmol) en piridina (2.5 mi) enfriada a 0 °C se añade cloruro de lauroilo (780 jxl, 3.37 mmol), se agita 10 minutos y se deja a temperatura ambiente tres dias. Se añaden unas gotas de agua y se diluye con CH2CI2 (150 mi). Se lava con HCI 1M (porciones de 40 mi) hasta pH ácido. Posteriormente la fase orgánica se lava con NaHC03 1M (porciones de 40 mi) hasta pH básico y, por último, se lava la fase orgánica con agua hasta pH neutro. Finalmente la fase orgánica se seca con MgSO, se filtra y se concentra a sequedad obteniendo un sirupo que se purifica por cromatografía en columna en AcOEt-hexano (1:5 1:1). Rendimiento: 95%. 1H-RMN (300 MHz,
(CD3)2CO): 8.93 (d 1H, J= 1.9 Hz), 6.86 (d 1H, J= 8.1 Hz), 6.79 (dd 1H, J= 1.9 Hz, J= 8.1 Hz), 5.94 (dd 1H, J= 7.5 Hz, 7= 4,8 Hz), 4.33-4,24 (m 2H), 2.40-2.29 (m 4H), 1.67-1.58 (m 4H), 1.33 (sa 32H), 0.94-0.90 (m 6H).
4-f1.2-D¡acetoxiet¡h-1.2-ío-xililenodioxilbenceno (11c)
O
**(Ver fórmula)**
Se añade una mezcla de anhídrido acético y piridina 1:1 (4 mi) previamente enfriada a 5b (300 mg, 1.10 mmol) en baño de hielo durante 20 minutos. A continuación se deja en nevera toda la noche. Seguidamente se hidroliza el anhídrido acético con hielo y se concentra a sequedad. El sirupo se purifica en cromatografía en columna en AcOEt-
hexano (5 - 1:1). Rendimiento: cuantitativo. 1H-RMN (300 MHz, CDCI3): 8 7.29-7.25 (m 2H), 7.20-7.17 (m 2H), 7.00 (d 1H, J= 2.1 Hz), 6.98 (d 1H, J= 8.2 Hz), 6.91 (dd 1H, > 8.2 Hz, J= 2.1 Hz), 5.91 (dd 1H, J= 7.8 Hz, J= 4.1 Hz), 5.41 y 5.37 (2 d 1H cada uno, J= 13.2 Hz), 4.27 y 4.21 (2 dd 1H cada uno, J= 16.0 Hz, J= 7.8 Hz, J= 4.1 Hz), 2.09 (s 3H), 2.03 (s 3H).
Método general oara la síntesis de los (3.4-dihidroxifenihdiacilalicoles a partir de sus correspondientes diacilalicoles protegidos
A una disolución del diacilglicol protegido (0.5 mmol) en EtOH o THF (según su solubilidad), se añade Pd/C al 10% (50% en peso aproximadamente) y se hidrogena durante 2-72 horas hasta reacción completa. Se filtra sobre celita y se concentra a sequedad. El residuo se purifica por cromatografía en columna.
4-(1.2-Dibutanoiloxi)benceno-1.2-diol (12a1
HO.
HO
O
O
**(Ver fórmula)**
o
A una disolución de 11a (240 mg, 0.49 mmol) en EtOH absoluto (4 mi) se añadió Pd/C al 10% (115 mg) y se hidrogenó a presión atmosférica, a t.a. y en oscuridad durante 3 días. 5 La mezcla se filtró sobre celita, el disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante
cromatografía en columna en AcOEt-hexano (1:1) aislándose como sirupo incoloro.
Rendimiento: 90%. 1H-RMN (300 MHz, CDCI3): 56.87-6.86 (m 1H), 6.82 (d 1H, J= 8.1 Hz), 6.76 (dd 1H, J= 8.1 Hz, J= 1.5 Hz), 5.89 (t 1H, J= 6.0 Hz), 4.27 (d 2H), 2.35 (t 2H, J= 7.5 Hz), 2.29 (t 2H, J= 7.4 Hz), 1.64 (sex 2H, J= 7.4Hz), 1.63 (sex 2H, J= 7.4Hz), 0.92 (t 6H, 10 J= 7.3 Hz).
4-M.2-Dilauroiloxietihbenceno-1,2-d¡ol Í12b)
HO.
HO
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**
O
15 A una disolución de 11b (350 mg, 0.47 mmol) en THF (5 mL) se añadió Pd/C al 10% (160
mg) y se hidrogenó a presión atmosférica, a t.a. y en oscuridad durante un día. La mezcla se filtró sobre celita, el disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna en AcOEt-hexano (1:3) aislándose como sólido blanco. Rendimiento: 79%. 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2CO): 56.93 (d 1H, J= 1.9 Hz), 6.86 (d 1H, J= 20 8.1 Hz), 6.79 (dd 1H, J= 1.9 Hz, J= 8.1 Hz), 5.94 (dd 1H, J= 7.5 Hz, J= 4.8 Hz), 4.33-4.24
(m 2H), 2.340-2.29 (m 4H), 1.67-1.58 (m 4H), 1.33 (sa 32H), 0.94-0.90 (m 6H).
4-M.2-Diacetoxietil)benceno-1.2-diol (12cl
o
,A
hoXT^
A una disolución de 11c (180 mg, 0.51 mmol) en EtOH (4 mL) se añadió Pd/C al 10% (80 mg) y se hidrogenó a presión atmosférica, a t.a. y en oscuridad durante 2 h. La mezcla se filtró sobre celita, el disolvente se evaporó y el residuo se purifico mediante cromatografía en columna CH2CI2-MeOH (50:1 -» 10:1) aislándose como un sirupo amarillo pálido. Rendimiento: 93%. 1H-RMN (300 MHz, CDCI3): 8 6.86 (d 1H, J= 1.5 Hz), 6.82 (d 1H, J= 8.1 Hz), 6.78 (dd 1H, J= 8.1 Hz, J= 1.5 Hz), 5.88 (dd 1H, J= 6.9 Hz, J= 5.2 Hz), 4.31-4.22 (m 2H), 2.10 (s 3H), 2.07 (s 3H).
B. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA EN MACRÓFAGOS PERITONEALES DE RATÓN
Actividad anti-inflamatoria de 3,4-dihidroxifenilglicol (6), 4-(1,2-dibutanoiloxietil)benceno-
1.2- diol (12a), 4-(1,2-dÍlauroiloxietil)benceno-1,2-diol (12b), acetato de hidroxitirosilo (13) y los tioderivados: etanotioato de S-2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (14), 4-(2-sulfaniletil)benceno-
1.2- diol (15), disulfuro de bis(3,4-dihidroxifenetilo)(16) en el modelo in vitro de macrófagos perifonéales de ratón estimulados con lipopolisacárido bacteriano (LPS). Comparación con HT(1).
B1 Aislamiento de macrófagos peritoneales de ratón
La estimulación de macrófagos peritoneales es uno de los modelos mejor caracterizados para la producción de mediadores pro-inflamatorios. El lipopolisacárido bacteriano (LPS) es un componente presente en la membrana externa de bacterias Gram negativas, que induce una respuesta inflamatoria severa mediante la iniciación de señales celulares que incluyen la síntesis de múltiples mediadores implicados en el proceso inflamatorio como el oxido nítrico (NO), PGE2 (prostaglandina E2) y citocinas como el TNF-a entre otros.
r
Para la obtención de macrófagos peritoneales de ratón se inyectó 1 mL de tioglicolato sódico 10% (p/v) en la cavidad peritoneal de los ratones permitiendo el libre acceso a comida y agua durante 4 días. Tras el sacrificio se inyectó PBS 1x estéril en la cavidad peritoneal, tras lo cual se procedió a la recolección de la suspensión celular. Posteriormente se centrifugó 5 minutos a 1200 r.p.m y 4o C y tras el centrifugado se descartaron las muestras contaminadas con sangre. Todas las manipulaciones de las células fueron realizadas en cabinas de flujo laminar vertical y en condiciones estériles.
A continuación, se eliminaron los sobrenadantes y se resuspendió cada pellet celular en medio RPMI-1640 al 10%(v/v) de suero fetal bovino (SFB) tras lo cual se procedió al recuento de los macrófagos obtenidos mediante el test de exclusión de Azul Tripán.
B2 Evaluaciones realizadas
v" Viabilidad celular. Test de la Sulforodamina (SRB)
Para la realización de este ensayo las células en suspensión extraídas de la cavidad peritoneal de los ratones fueron sembradas a una densidad de 1x1o4 células por pocilio en placas de 96 pocilios (NUNC, Roskilde, Danmark) y tratadas con los distintos polifenoles estudiados. Los resultados fueron comparados con los obtenidos de células tratadas con DMSO (vehículo), y con un grupo control constituido por células sin tratar. La supervivencia celular fue medida como el porcentaje de absorbancia comparado con un grupo control (células no tratadas) según la metodología descrita por Skehan et al., ¡L Nati. Cáncer Inst. 82, 1990, 1107-1112.
s Producción de óxido nítrico (NO).
La células son incubadas con los compuestos a ensayar en placas de 24 pocilios durante media hora (37° C, 95% aire, 5% C02), tras la cual se adiciona LPS (5pg/ mL) en cada pocilio y se incuba 18 horas (37° C, 95% aire, 5% C02). Finalmente se recogen los sobrenadantes obtenidos y en placas de 96 pocilios estériles se añade cada una de nuestras muestras de sobrenadante a analizar por triplicado y 100 pl de blanco [medio usado en el cultivo celular: RPMI-1640 al 5 % de SFB (v/v)]. Para terminar se adiciona 100
|j| del reactivo de Griess a todos los pocilios procediéndose acto seguido a la medida en lector de placas Bio-Rad 550 a una longitud de onda de 540 nm. La cantidad de nitritos se obtiene por extrapolación desde una recta patrón con nitrito de sodioEn todos los experimentos los resultados se compararon con un grupo celular sin estimular, usado como control negativo, y con un grupo de células estimuladas únicamente con LPS y otro grupo estimulado con LPS al que se le adiciona el vehículo (DIVISO), como controles positivos.
v" Expresión de las enzimas pro-inflamatorias ciclooxígenasa-2 (COX-2), óxido nítrico sintasa inducible (INOS). Estudio de las vía de señalización celular del factor nuclear de transcripción (NF-kB) mediante western blotting
Los células fueron sembradas a una concentración de 1x106 células/ml, incubadas en presencia o ausencia de los diferentes compuestos a ensayar y estimuladas con LPS a una concentración de 5 pg/ mi. En todos los experimentos los resultados se compararon con un grupo celular sin estimular, usado como control negativo y con un grupo de células estimuladas únicamente con LPS y otro grupo estimulado con LPS al que se le adiciona el vehículo (DMSO), como controles positivos. Tras 18 horas de incubación (37° C, 95% aire, 5% C02) las células fueron recogidas con un rascador en PBS 1x estéril conteniendo inhibidores de proteasas y fosfatasas y fueron procesadas como se ha descrito (Sánchez- Hidalgo et al., Biochem. Pharmacol. 69, 2005, 1733-1744).
La medida del contenido de proteínas (pg/mL) fue realizada mediante el método colorimétrico de Bradford (Bradford MM,. Anal. Biochem. 7, 1976, 248-254), basado en la cuantificacíón colorimétrica de la concentración de proteínas total en cada una de las muestras usando como estándar y-globulina (Bio-Rad®).
Las muestras, desnaturalizadas por calor (100 °C, 10 minutos) y conteniendo igual cantidad de proteínas (20 pg), fueron separadas mediante electroforesis en gel de poliacriamida-SDS al 10%. En el siguiente paso, las proteínas se transfirieron electroforéticamente desde el gel a una membrana de nitrocelulosa y finalmente fueron incubadas con anticuerpos primarios específicos: arrti-rabbit COX-2, anti-rabbit ¡NOS (Cayman®, Ann Arbor, MI, USA) (1:2500 y 1:1000 respectivamente), anti-rabbit IkBq (Cell
Signalling®, Danvers, MA, USA) (1:1000) y anti-mouse (3-actina (Sigma-Aldrich® St. Louis, MO, USA) e incubadas durante toda la noche a 4 °C en agitación. Tras los lavados del anticuerpo primario, las membranas se incubaron con sus correspondientes anticuerpos secundarios: anti-rabbit HRP conjugated (Cayman Chemical®, Ann Arbor, MI, USA) (1:50000) o anti-mouse (Dako®, Atlanta, GA, USA) (1:2000) en solución de bloqueo durante 1-2 h a temperatura ambiente. Tras los lavados del anticuerpo secundario, la detección de los inmunocomplejos marcados con peróxidos se realizó mediante una reacción de quimioluminiscencia. Para valorar esta señal de quimioluminiscencia, se introdujeron las membranas en el transiluminador (LAS-3000 Imaging System de Fujifilm Image Reader (Stamford, USA)), dispositivo que nos permitió obtener una imagen de la señal emitida.
Los datos de densitometría fueron estudiados siguiendo una normalización con el control de p-actina, y las señales obtenidas fueron analizadas y cuantificadas mediante el programa informático Java (Image J, Softonic®) y expresadas en relación al grupo control DMSO-LPS.
B3 Tratamiento estadístico de los resultados
Los resultados han sido expresados como la media aritmética ± el error estándar, y la significación de las diferencias entre los distintos grupos ha sido evaluada utilizando el análisis de la varianza (test de ANOVA) seguido del test de Tukey para datos paramétricos. Valores de p <0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. El análisis estadístico ha sido realizado utilizando el programa informático Graph Pad Prism® 2.01.
B4 Resultados
Los resultados reflejan la media de dos ensayos independientes por triplicado.
Evaluación de la viabilidad celular. Tras el ensayo de viabilidad celular de diferentes concentraciones de los compuestos a ensayar acetato de hidroxitirosilo (13), 3,4- dihidroxlfenilglicol (6) y sus derivados 4-(1,2-dibutanoiloxi)benceno-1,2-diol (12a) y 4-(1,2-
düauroiloxietil)benceno-1,2-diol (12b) y el tioacetilado (14), tiohidroxitiroso! (15) y disulfuro de hidroxitiroso! (16), fueron seleccionadas las concentraciones de los compuestos que presentaron una viabilidad superior a! 95%.
Producción de óxido nítrico (Fig. 1). Acetato de hidroxitirosilo (13), 3,4-
dihidroxifenilglico! (6) y sus derivados 4-(1,2-dibutanoiloxietil)benceno-1,2-dio! (12a) así como los tres tioderivados (14, 15 y 16) presentaron una disminución estadísticamente significativa de la producción de nitritos a los mismos niveles que e! patrón de referencia
HT. Es más, la concentración más elevada de! compuesto 13 disminuyó significativamente los niveles de los nitritos respecto al HT. El compuesto 12b fue capaz de disminuir solo levemente la producción de! metabolito en las concentraciones ensayadas.
Expresión de la enzima proinflamatoria ¡NOS (Fig. 2). E! tratamiento de las células con LPS indujo una importante sobreexpresión de la proteína iNOS. Sin embargo, la incubación con los compuestos acetato de hidroxitirosilo (13) y 3,4-dihidroxifenilglico! (6), y los tres tioderivados (14, 15 y 16) logró reducir de forma estadísticamente significativa su expresión a niveles paralelos a HT. Únicamente la concentración más elevada de 4-(1,2- dibutanoiloxietil)benceno-1,2-diol (12a) fue capaz de disminuir significativamente la sobreexpresión de ¡NOS.
Expresión de la enzima proinflamatoria COX-2 (Fig. 3). La expresión de la proteína COX-2 fue marcadamente aumentada tras e! tratamiento de las células con LPS. Por el contrario, las células previamente tratadas con acetato de hidroxitirosilo (13), 3,4- dihidroxifenilglico! (6) y el compuesto de referencia HT disminuyeron !a sobreexpresión de la proteína COX-2 tras la administración de LPS. Tras la incubación con los derivados diacilgiicoles, 4-(1,2-dibutanoiloxi)benceno-1,2-diol (12a) y 4-(1,2-di!auroiloxieti!)benceno-
1,2-dio! (12b) no se observaron resultados estadísticamente significativos. Con respecto a los tiodehvados la concentración más elevada de los tioderivados (15) y (16) muestran una disminución significativa de la sobreexpresión de la enzima.
Expresión del factor de transcripción NF-kB (Fig. 4). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la proteína IkappaB se encuentra aumentada en las células tratadas con ios compuestos acetato de hidroxitirosilo (13) y 3,4-dihidroxifenilgiicol (6). Es más,
estos resultados son también significativos respecto al patrón de referencia (HT). Los compuestos 4-(1,2-dibutanoíloxietil)benceno-1,2-diol (12a) y 4-(1,2-
dilauroiloxietil)benceno-1,2-diol (12b) y los tioderivados 14-16 no presentaron cambios en la expresión de la IkappaB.
C. EFECTOS DE ACETATO DE HIDROXITIROSILO EN UN MODELO DE COLITIS AGUDA INDUCIDA POR DEXTRANO SULFATO SÓDICO (DSS)
C1 Modelo animal v de enfermedad
Todos los protocolos llevados a cabo han seguido las recomendaciones de la Unión Europea relativas a la experimentación animal (Directiva del Consejo de Europa 86/609/CEE). Como animales de experimentación se utilizaron ratones hembra C57BL/6J de 7-12 semanas de edad y 18-22 g de peso, mantenidas en condiciones estándar de estabulización a 24-25°C, doce horas de luz al día y alimentación controlada y suministrados por Harían Ibérica, S.A. Barcelona (España).
El modelo de enfermedad utilizado está basado en la administración de dextrano sulfato sódico (DSS) a ratones, modelo seleccionado por presentar características morfológicas, clínicas y analíticas similares a la de los pacientes que manifiestan una enfermedad inflamatoria intestinal del tipo de la colitis ulcerosa o de la enfermedad de Crohn. (Melgar et al. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 2005, G1328-1338.
Cada grupo de animales (n = 14) fue alimentado con una dieta estándar, que fue suplementada con 0.1% del compuesto acetato de hidroxítirosilo (13) en el grupo de estudio correspondiente. Esta dosis supone la ingesta por ratón (con peso medio de 25gramos, y suponiendo una ingesta diaria de 3 g de dieta) de 120 mg de producto (13)/día x kg (peso de animal).
El protocolo de experimentación in vivo consistió en la administración de una dieta preventiva durante 35 días,. Como bebida todos los animales consumieron agua durante los primeros 25 días, seguido de 5 días de consumo de agua adicionada de DSS (3% p/v; MW: 40.000) y de otros 5 días de agua solamente. Los grupos de experimentación fueron
los siguientes: grupo control (dieta estándar + agua durante los 35 días), grupo control- DSS (dieta estándar + DSS en agua de bebida durante 5 días) y grupo A (dieta estándar suplementada con producto A + DSS en agua de bebida durante 5 días).
Los efectos de la colitis inducida, de acuerdo a los descritos anteriormente en este modelo, fueron los siguientes:
Pérdida de apetito y peso.
Diarrea y sangre en heces, con la aparición de anemia.
Acortamiento del colon y engrasamiento de sus paredes.
Alteración de la barrera mucosa incrementando la exposición de los macrófagos a la microbiota
Infiltrado leucocitario, pérdida de epitelio y destrucción de criptas.
Liberación de citocinas proinflamatorias.
Aumento del estatus inflamatorio a nivel intestinal y sistémico.
C2 Evaluaciones realizadas
s Control de peso, ingesta de alimento y bebida: a lo largo de todo el experimento, y de manera individualizada, se monitorizó el peso de cada ratón, la cantidad de dieta ingerida y la de agua bebida.
v" Sangre y agua en heces: una semana antes, en días alternos, y diariamente a partir de la incorporación de DSS en el agua, hasta la finalización del ensayo, se evaluó la consistencia de las heces (agua en heces) y la presencia de sangre en las mismas mediante la utilización de una escala visual propuesta por Gommeaux (Gommeaux etal., Mol. Cell. Biol. 27, 2007, 2215-2228).
v" Longitud del colon: una vez sacrificados los animalitos, se procedió a la extracción de este órgano, a su limpieza y extensión para obtener dicho parámetro por medida directa.
s La evaluación macroscópica del daño colónico se realizó atendiendo al índice de actividad de la enfermedad (DAI). Se evaluó diariamente, a partir de la incorporación de DSS en el agua de bebida (DO correspondiente al día 26 del ensayo global), la inflamación intestinal mediante el DAI, que correlaciona la
pérdida de peso, la consistencia de las heces y la presencia de sangre en las mismas, siendo el índice de actividad el promedio de los tres parámetros, según la escala propuesta por Gommeaux (Gommeaux et al., Mol. Cell. Biol. 27, 2007, 2215-2228).
La pérdida de peso se calculó como el % de la diferencia entre el peso original a día = 0 (antes de comenzar a administrar el DSS) y el peso de cada día de suministro de DSS y los días de recuperación, siguiendo la siguiente escala de puntación:
0: < 1 % de pérdida de peso 1: 1-4.99 % de pérdida de peso 2: 5-10 % de pérdida de peso 2.5: 10.01-20 % de pérdida de peso 3: > 20 % de pérdida de peso
La consistencia de heces se evaluó según la siguiente escala:
0: consistencia normal de las heces 1: heces blandas no adheridas al ano 2: heces muy blandas y adheridas al ano 3: heces líquidas y ano humedecido
La presencia de sangre en heces se determinó visualmente, según la siguiente escala:
0: ninguna mancha de sangre en heces
1: pequeña mancha de sangre en heces y región anal seca
2: gran mancha de sangre en heces, con sangrado localizado en el orificio
anal
3: heces de color rojo oscuro y sangrado abundante alrededor del ano
s Actividad mieloperoxidasa en mucosa colónica: fue evaluada para conocer el grado de infiltración neutrofílica, mediante espectrofotometría (a 655 nm) y según el método descrito por Grisham (Grisham et al., Meth. Enzymol. 186, 1990, 729- 742). Los resultados se expresaron como unidades de actividad enzimática por miligramo de tejido (U/mg tejido).
v'' Expresión colónica de las proteínas COX-2, ¡NOS, IkappaB, JNK y p-p38, mediante ia técnica de western biot
Las muestras, desnaturalizadas por calor (100 °C, 10 minutos) y conteniendo igual cantidad de proteínas (50 pg), fueron separadas mediante electroforesis en gel de poliacriamida-SDS al 10% según su peso molecular. En el siguiente paso, las proteínas se transfirieron electroforéticamente desde el gel a una membrana de nitrocelulosa y finalmente fueron incubadas con anticuerpos primarios específicos: anti-rabbit COX-2, anti-rabbit ¡NOS (Cayman®, Ann Arbor, MI, USA) (1:2500 y 1:1000 respectivamente), anti-rabbit kBa (Cell Signalling®, Danvers, MA, USA) (1:1000) y anti-mouse (3-actina (Sigma-Aldrich® St. Louis, MO, USA) e incubadas durante toda la noche a 4 °C en agitación. Tras los lavados del anticuerpo primero, las membranas se incubaron con sus correspondientes anticuerpos secundarios: anti-rabbit HRP conjugated (Cayman Chemical®, Ann Arbor, MI, USA) (1:50000) o anti-mouse (Dako®, Atlanta, GA, USA) (1:2000) en solución de bloqueo durante 1- 2 h a temperatura ambiente. Tras los lavados del anticuerpo secundario, la detección de los immunocomplejos marcados con peróxidos se realizó mediante una reacción de quimioluminiscencia. Para valorar esta señal de quimioluminiscencia se introdujeron las membranas en el transiluminador (LAS- 3000 Imaging System de Fujifilm Image Reader (Stamford, USA)), dispositivo que nos permitió obtener una imagen de la señal emitida.
Los datos de densitometría fueron estudiados siguiendo una normalización con el control p-actina y las señales obtenidas fueron analizadas y cuantificadas mediante el programa informático Java (Image J, Softonic®) y expresadas en relación al grupo control DMSO-LPS.
v' Análisis microscópico del daño colónico (arquitectura colónica): tras haber seleccionado 3 animales por lote, se procedió a la extracción del colon y, con escalpelo, se obtuvieron secciones de de tejido constituidas por anillos de colon ascendente, transverso y descendente , que fueron lavadas con solución salina fisiológica y, rápidamente, se sumergieron en solución fijadora (paraformaldehido al 4% en tampón fosfato (PBS), pH 7.2) durante 12-18 h a 4 °C. Posteriormente se sometieron a un
proceso de deshidratación en trío con agitación mediante una batería de alcoholes de concentración creciente, iniciándose con alcohol de 50° hasta alcohol absoluto.. Tras la deshidratación las muestras fueron introducidas en xileno y finalmente en parafina.pura. Tras la formación de los bloques, para ser, se seccionaron en cortes de 5-7 pm de grosor con una cuchilla de vidrio siguiendo el plano perpendicular a la superficie de la mucosa, y los cortes fueron teñidos con hematoxilina/eosina y visualizados en un microscopio óptico.
C3 Tratamiento estadístico de los resultados
Los resultados han sido expresados como la media aritmética ± el error estándar, y la significación de las diferencias entre los distintos grupos ha sido evaluada utilizando el análisis de la varianza (test de ANOVA) seguido del test de Tukey para datos paramétricos y la U de Mann-Whitney para datos no paramétricos. Valores de p <0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. El análisis estadístico ha sido realizado utilizando el programa informático Graph Pad Prism® 2.01.
C4 Resultados observados
Evolución del peso: durante los días de exposición al agente inductor del daño (DSS, al 3% v/v) en el agua de bebida, los animales experimentaron un descenso de peso que fue claramente patente al final del período de evaluación (Fig. 5). Esta pérdida de peso fue estadísticamente significativa en los animales pertenecientes al grupo control-DSS (p<0.001), mientras que los animales que recibieron una alimentación suplementada con el compuesto acetato de hidroxitirosilo (13) experimentaron una pérdida de peso similar a la del grupo control (Fig. 6).
Preservación de la longitud del colon: los ratones del lote control-DSS experimentaron un acortamiento del colon que fue significativo (p<0.05) con respecto a los animales sanos correspondientes al grupo control. Los ratones que recibieron la dieta suplementada con acetato de hidroxitirosilo (13) preservaron la longitud colónica en los valores del control sano (Fig. 7). La relación peso/longitud del colon como marcador inflamatorio macroscópico, expresada en gramos por centímetro (g/cm), indicó un marcado descenso
(p<0.05) en dicha relación para los animales del grupo control-DSS, mientras que los animales alimentados con la dieta suplementada con acetato de hidroxitirosilo (13) mantuvieron la relación del orden de la del control (Fig. 8).
Evaluación del DAI (índice de actividad de la enfermedad). Según la escala propuesta por Gommeaux (Gommeaux et al., Mol. Cell. Biol. 27, 2007, 2215-2228), los resultados mostraron un incremento del DA! en los ratones control-DSS que fue significativo (p<0.001) frente a! que obtenido en grupo control sano (Fig. 9). Sin embargo los animales ratones que recibieron la dieta suplementada con acetato de hidroxitirosilo (13) el DAI se mantuvo en los valores del control sano.
Disminución de la actividad MPO en mucosa colónica (Fig. 10). La MPO como índice de infiltración neutrofílica, experimentó un incremento estadísticamente significativo (p<0.001) comparada con los resultados obtenidos de los intestinos procedentes de animales sanos. Por el contario, se observó una reducción de dicho parámetro estadísticamente significativa en las muestras procedentes de animales que consumieron dieta suplementada con el acetato de hidroxitirosilo (13).
Atenuación del daño en la mucosa colónica (Fig.11 A-C). En el control-DSS se apreció una destrucción masiva de las criptas colónicas y del epitelio, así como una sustancial infiltración del tejido linfoide (Fig. 11B). Sin embargo, en las mucosas colónicas procedentes de animales alimentados con una dieta enriquecida con acetato de hidroxitirosilo (13) se apreció histológicamente una atenuación de los parámetros morfológicos de daño celular, la mucosa colónica mostraba úlceras en proceso de curación, evolucionando a un tipo de infiltrado inflamatorio crónico (Fig. 11C).
Expresión colónica de las proteínas COX-2, ¡NOS, IkappaB, JNK y p-p38 (Fig. 12-14).
Como puede observarse en la Fig. 12 los niveles de expresión de las proteínas COX-2 e ¡NOS fueron muy elevados en las mucosas colónicas procedentes de ratones sometidos a colitis. Sin embargo, aquellos animales tratados con acetato de hidroxitirosilo (13) presentaron unos niveles de expresión significativamente más bajos (p<0.05) respecto al grupo control-DSS. Entre los mecanismos de señalización celular implicados en esta
respuesta inmunoinflamatoria figuran la actividad de factores de transcripción como el NF- Kp regulados por la vía de las cinasas activadas por mitógenos (MAPK cinasas). Las proteínas MAPK cinasas en su estado inactivo (no fosforilado) residen en el citoplasma, pero cuando se activan son fosforiladas y a su vez fbsfbrilan en serinas y treoninas a los factores de transcripción. Estos últimos promueven la transcripción de genes responsables de la activación de las células inflamatorias e inmunocompetentes y la expresión de proteínas mediadoras clave con el consiguiente efecto biológico. En este estudio evaluamos los niveles de expresión proteica de las MAPK p38 y JNK cinasas. Los niveles de expresión de la proteína JNK fosforilada (p-JNK) fueron elevados en las muestras colónicas procedentes de animales sometidos a colitis en relación a las controles sanos (p<0.01) (Fig. 13). Sin embargo, en aquellos animales que recibieron terapia nutricional con acetato de hidroxitirosilo (13) se detectó una disminución estadísticamente significativa de la activación de esta cinasa (p<0.05). Por otra parte, no se observaron modificaciones significativas en la proteína MAPK p38 en mucosa de los animales sometidos al tratamiento (Fig. 13).
El NF-kB es un factor transcripcional regulador de la expresión de numerosos genes que codifican moléculas involucradas en el proceso inflamatorio, entre los que podemos incluir COX-2, iNOS y ciertas citocinas proinflamatorias. Este factor se encuentra en el citoplasma como un dímero formado por dos subunidades idénticas (homodímero) o diferentes (heterodímeros) y unido a sus inhibidores IkB (IkB-o, IkB-P y IkB-e) previniendo su entrada al núcleo En el caso de IxB-a, la estimulación de receptores como el receptor de factor de necrosis tumoral (TNFR), receptores TLR o el receptor de linfocito T (TCR) activa al NFkB a través de la ruta conocida como "canónica", el cual a través de la activación de IKK fosforila IkB, siendo posteriormente ubiquitinada y degradada por el proteasoma, liberando NFkB. La degradación de IkB permite por tanto la entrada de las proteínas NFkB al núcleo y su unión a secuencias específicas del ADN, regulando la transcripción de un gran número de genes que codifican citocinas proinflamatorias. En nuestro estudio valoramos posibles cambios de expresión de la proteína IkB-o tras el tratamiento con el compuesto (13) (Lee y Surh, Biochem. Pharmacol. 84, 2012, 1340- 1350). En base a los resultados obtenidos, los niveles de expresión de la proteina IxB-a de las muestras colónicas de animales del grupo DSS fueron estadísticamente inferiores (p<0.01) a los cualificados en las muestras colónicas procedentes de animales sanos. En
aquellos animales que recibieron una dieta enriquecida con acetato de hidroxitirosilo (13) los niveles de expresión de dicha proteina fueron similares a los obtenidos en los animales del grupo control DSS (Fig. 14).
5 No se considera necesario hacer más extensa esta descripción para que cualquier experto
en la materia comprenda el alcance de la invención y las ventajas que de la misma se derivan. Los elementos que la componen, soluciones técnicas adoptadas o incluso su aplicación serán susceptibles de variación siempre y cuando ello no suponga una alteración en la esencialidad del invento.
