La invención se refiere a un procedimiento para la hidrólisis de proteínas de origen animal empleando para ello altas temperaturas (180 OC) Y presiones moderadas (40 atmósferas) bajo una atmosfera controlada, por la inyección bien de oxígeno o bien de nitrógeno. Este proceso tiene por objeto proporcionar un método de hidrólisis de proteínas para obtener péptidos de bajo peso molecular y que no involucre la adición de enzimas o productos químicos. Además, se consigue de forma simultánea una decoloración con respecto al producto original, lo cual facilita el uso como ingrediente alimentario de los péptidos así obtenidos.
La invención resulta de aplicación en la obtención de péptidos y aminoácidos a partir de proteínas de origen animal, principalmente en los sectores de la agricultura, química y farmacia, medioambiental o alimentario, y en particular en aquellas industrias agro alimentarias o cárnicas que generan un exceso de residuos ricos en proteínas y que requieren un método eficiente para el post-procesado de subproductos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
En la actualidad, las proteínas de origen animal pueden ser hidrolizadas siguiendo procesos enzimáticos, hidrólisis química (ácida o básica) o con muy altas presiones hidrostáticas junto con muy altas temperaturas (HHP) .
En el primer caso se obtienen péptidos de manera predecible en cuanto a tamaño y secuencia, sin pérdidas por degradación de aminoácidos; sin embargo, la concentración de proteína que puede ser tratada suele situarse habitualmente en un rango de 5-50 giL (Yike Y., Jianen H., Xuefeng B., Yuguang D. & Bingcheng L., "Preparation and function of oligopeptide-enriched hydrolysate from globin by pepsin", Process Biochem., 2006, 41, 1589-1593; Tauzin, J., Mielo, L., Roth, S., Mollé, D. & Gaillard, J. L., "Tr y ptic hydrolysis of bovine aS2-casein: identification and release kinetics of peptides", Int. Dair y J., 2003, 13, 15-27; Su, R. x., Qi, W. & He, Z. M., "Time-dependent nature peptic hydrolysis of native bovine hemoglobin. Eur. Food Research Tech.", 2007, 225, 637-647) . Además, es necesario un control
muy estricto y continuo de la proporcion enzima/sustrato y del pH del medio, el cual varia constantemente a medida que la hidrolisis avanza. La temperatura es otro parametro esencial, ya que solo dentro de un margen estrecho de valores de temperatura se obtienen buenos rendimientos de hidrolisis. Una vez finalizada la reaccion, la enzima empleada debe ser neutralizada en un paso posterior del proceso y adicionalmente eliminada del medio.
En el caso de emplear agentes quimicos para hidrolizar proteinas se produce una degradacion de ciertos aminoacidos. En el caso de emplearse acidos, la asparagina y la glutamina son transformados en acid° aspartico y glutamico, mientras que el
triptofano y la cisteina son completamente destruidos (Fountoulakis M., Hans-Werner L., "Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins", Journal of Chromatography A, 1998, 826, 109-134) . En caso de ernplearse alcalis se causa la perdida por degradacion de serina, treonina, arginina y cisteina; y la asparagina y la glutamina son convertidas de igual modo en aspartato y glutamato (Ravindran, G. &
Br y den, W.L., "Tr y ptophan determination in proteins and feedstuffs by ion exchange chromatography", Food Chemistr y , 2004, 89, 309-314) . Esta perdida de aminoacidos es un grave inconveniente, ya que algunos de ellos son esenciales y su carencia disminuye el valor nutricional del hidrolizado obtenido. Estos procesos son capaces de gestionar alias concentraciones de sustrato, pero habitualmente solo se usan para producir aminoacidos libres, sin posibilidad de obtener peptidos (US 2.657.232 A; US
4.181.651 A; US 4.874.893 A) . Una vez finalizado el proceso, el agente hidrolizante debe ser neutralizado, con la concomitante produccion de sales que han de ser eliminadas en pasos posteriores del proceso.
Cuando se emplean altas presiones y altas temperaturas (entre 15 y 27 MPa y
entre 250 y 300 °C) , el producto final esta compuesto principalmente por aminoacidos y por productos de degradacion, como acidos organicos y amoniaco; y por tanto no es posible la obtencion de peptidos (Rogalinski, T., Herrmann, S., Brunner, G., "Production of amino acids from bovine serum albumin by continuous sub-critical water hydrolysis", Journal of Supercritical Fluids, 2005, 36: 49-58) . Ademas, la tasa de transformaciOn de proteina en aminoacidos se sitfia en torno al 65%, siendo el 35% restante residuos. (Esteban, M. B.; Garcia, A. J.; Ramos, P.; Marquez, M. C.,
"Subcritical water hydrolysis of hog hair for amino acid production", Bioresour. Technol. 2010, 101, 2472-2476; Rogalinski, T.; Herrmann, S.; Brunner, G., "Production of aminoacids from bovine serum albumin by continuous sub-critical water hydrolysis", J. Supercrit. Fluids 2005, 36, 49-58; Xian, Z.; Chao, Z.; Liang, Z.; 5
Cheng, H., "Amino acids production from fish proteins hydrolysis in subcritical water.", Chin. J. Chem. Eng. 2008, 16, 456-460) .
En casos concretos, la decoloraciOn del hidrolizado es deseada para que no modifique el color del producto al que se vaya a agregar. Este hecho es especialmente relevante en el uso de hidrolizados de hemoglobina, cuyo uso se ye restringido a 10 productos fuertemente coloreados. Hasta ahora la decoloracion de hidrolizados de hemoglobina se producia empleando peroxido de hidrogeno u oxidantes fuertes y tratamientos conjuntos de enzimas y HHP (Toldra, M.; Pare s, D.; Saguer, E.; Carretero, C., "Hemoglobin hydrolysates from porcine blood obtained through enzymatic hydrolysis assisted by high hydrostatic pressure processing", Innovative Food Science Emerging Technologies 2011, 12, 435-442; Oord van den, A.H.A.; Wesdorp, J.J. (1979) "Decolouration of slaughterhouse blood by treatment with hydrogen peroxide", Proceedings of the 25th European Meeting of Meat Research Workers, Budapest, Hungar y . 827-828) .
Con ninguno de los metodos mencionados anteriormente se consigue de forma simultanea un buen rendimiento, la produccion controlada de peptidos de bajo peso molecular, el procesado de grandes cantidades de sustrato y una decoloracion del producto final. Con la presente invencion todos estos objetivos se pueden conseguir en un finico paso.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a un proceso para la hidrolisis de protefnas de origen animal mediante el uso de temperaturas altas y presiones moderadas, bajo una atmosfera controlada por la inyecciOn de un gas determinado: oxígeno o nitrogeno.
El procedimiento para la hidrolisis de protefnas de origen animal objeto de la 30 invenciOn comprende las siguientes etapas:
a. Laproteina sustrato se introduce en un reactor con agitaciOn, con control de presion y temperatura interna, y se ariade agua para facilitar el proceso de hidrolisis. El reactor con agitacion mecanica utilizable en el metodo proporciona ademas de medios para el control de la temperatura y la presion, medios para la inyecciOn de un gas para el control de la atmOsfera, como por ejemplo valvulas, valvulas de control de presion, puertos de entrada y de salida o racores. A los efectos de esta invenciOn y su descripcion, el volumen total de proteina mas agua es considerado el volumen de reaccion.
b. Secalienta el reactor manteniendo una agitacion constante hasta alcanzarla temperatura de 180 °C y de modo simultaneo se inyecta un gas que puede ser oxigeno o nitrOgeno, precalentado a la misma temperatura que el reactor, hasta alcanzar una presion de reaccion de 40 atmosferas. Para mantener la presion interior del reactor, se puede utilizar cualquier medio regulador de presion, como por ejemplo valvulas de control de presion que se abrancuando la presion interior alcanza o supera cierto limite, evacuando el exceso de gas. Preferiblemente, el gas inyectado es previamente saturado de humedad y precalentado, empleando por ejemplo un humidificador termostatizado, para evitar variaciones de temperatura y evaporaciones dentro del reactor.
c. Semantiene la temperatura constante una vez alcanzados los 180 °C y se mantiene la inyeccion del gas con el mismo caudal de la etapa b) entre 180 minutos hasta 360 minutos. Una vez alcanzada la temperatura y la presion deseadas se mantiene la reaccion bajo estas condiciones durante el tiempo necesario para obtener la producción de peptidos de bajo peso molecular
(tipicamente este tiempo depende de la temperatura empleada) . Durante esta etapa del proceso se sigue inyectando gas en el reactor para que tenga lugar el proceso de decoloraciOn, y la corriente de gas que generaria una sobrepresión es expulsada mediante una valvula que permite liberar este exceso de gas, manteniendo asi constante la presión interna del reactor.
d. Alfinalizar la etapa c) la hidrolisis ya ha terminado y se procede a la extraccion del producto obtenido a traves de un intercambiador de calor para reducir su temperatura. Asi se detiene el proceso de hidrolisis inmediatamente.
Este excedente de calor puede ser empleado para el precalentamiento del gas inyectado o del encamisado del reactor.E1 producto obtenido es una disolucion rica en peptidos solubles con presencia de aminoacidos libres.
e. Sefiltra o centrifuga el producto extraido para separar posibles restos 5
solidos.
f. Seelimina el exceso de agua mediante secado.
En una realizacion preferida, la proteina sustrato es de origen animal, previamente desgrasada.
La proteina sustrato empleada puede ser hemoglobina purificada, fraccion celular de la sangre, plasma sanguine°, sangre entera liquida o coagulada, o cualquier mezcla de estas fracciones procedentes de cualquier fuente animal, asi como plumas enteras troceadas o una mezcla de derivados sanguineos y plumas.
En otra realizacion preferida, la cantidad de agua que se aliade en la etapa a) es aquella necesaria para tener una concentracion de proteina de entre 50 y 150 g/L.
Enotra realizacion preferida, la temperatura de reacción de la etapa b) es de 180 °C y se alcanza en los primeros 60 minutos del proceso.
En otra realizacion preferida, la presion de la reacciOn de la etapa b) es de 40 atm6sferas y se alcanza en los primeros 30 minutos del proceso.
En otra realizaciOn preferida, el gas introducido en el paso b) es nitrogen°, con un caudal equivalente a una vez el volumen de la disolucion original de proteina por minuto. En una realizacion mas preferida, el tiempo de inyeccion del gas nitrOgeno durante la etapa c) del proceso es de 360 minutos.
En otra realizacion preferida, el gas introducido en el paso b) es oxigeno, empleando para ello un caudal equivalente a una vez el volumen de la disoluciOn 25 original de proteina por minuto. En una realizacion mas preferida, el tiempo de inyeccion del gas oxigeno durante la etapa c) del proceso es de 180 minutos.
En una realizacion especifica, el exceso de gas es evacuado del reactor con agitacion por una valvula de control de presion y es recirculado durante las etapas b) y c) del proceso, en una proporcion que equivale al 70% del flujo total del gas inyectado. Este exceso de gas puede ser recirculado al interior del reactor, estando la corriente de entrada compuesta por una parte de gas recirculado y otra de gas nuevo.
En otra realizacion especifica, la etapa e) del proceso la filtracion se realiza con un filtro cuyo tame () de poro es de 20 micras.
Enotra realizacion especifica, la etapa e) del proceso la centrifugaciOn se realiza durante 10 minutos con una fuerza de 10.000 g.
Un objetivo general del metodo de la presente invencion es obtener peptidos de bajo peso molecular a partir de proteinas de origen animal, evitando la adicion de productos quimicos o enzimas, y a su vez mejorar el rendimiento obtenido hasta la fecha con el empleo de metodos basados en HHP, los cuales solo consiguen transformar la proteina sustrato en aminoacidos libres.
El hidrolizado asi obtenido esta compuesto por peptidos de bajo peso molecular (entre 1 y 3 kDa de peso medio segun las condiciones empleadas) , y se obtiene un rendimiento del 83% empleando para ello altas concentraciones de proteina como sustrato, que pueden llegar hasta los 400 g/l. Ademas, en el caso de la hemoglobina se consigue una reducción del color que oscila entre un 80% cuando se inyecta nitrógeno y un 95% cuando el gas inyectado es oxigeno.
Con la presente invencion se consigue evitar el uso de enzimas o de otros productos quimicos, necesarios hasta ahora, para producir peptidos de bajo peso 20 molecular. Asi pues, las ventajas que la presente invencion proporciona son las siguientes:
Produccion de /*tidos de bajo peso molecular sin el uso de enzimas ni compuestos quimicos.
Aplicacion de presion y temperatura para obtener peptidos y no solo aminoacidos con una mejora sustancial del rendimiento obtenido hasta ahora. Se pasa de obtener una conversion del 60% en aminoacidos ( (Rogalinski, T., Herrmann, S., Brunner, G., "Production of amino acids from bovine serum albumin by continuous sub-critical water hydrolysis", Journal of Supercritical Fluids, 2005, 36: 49-58) a obtener
un83% de peptidos. La produccion de peptidos es deseada ya que presentan propiedades funcionales de las que carecen los aminoacidos:
emulsionantes, espumantes, antioxidantes o gelificantes.
El peso molecular medio de los peptidos obtenidos es funcion de la temperatura y del gas inyectado, siendo mas pequerios a mayor
temperaturay en presencia de oxigeno. Decoloracion del hidrolizado obtenido de forma simultanea a la hidrolisis de la protelna sustrato. Muy baja degradacion de los aminoacidos presentes en la proteina original, con lo que se mejora la calidad nutricional con respecto al uso deacidos o áicalis como agentes hidrolizantes. Capacidad de procesar mayores concentraciones de proteina que los procesos enzimaticos. La intensidad de la decoloraciOn, asi como el tamario final de los peptidos, son dependientes del tipo de gas inyectado, siendo mas pequerios y mas decolorados cuando se utiliza oxigeno en lugar de nitrogeno.
La invenciOn resulta de aplicacion en sectores que requieran un metodo de hidrolisis de proteinas para obtener peptidos de bajo peso molecular, en las que no se deseen procesos posteriores de purificacion, separacion, inactivacion ni decoloracion,
como por ejemplo en los sectores de la agricultura, quimica y farmacia, medioambiental o alimentario.
EXPLICACION DE UNA FORMA DE REALIZACION PREFERENTE
Para una mejor comprension de la presente invencion, a continuacion se 25 describen dos ejemplos de realizacion preferente, descritos en detalle, que deben entenderse sin catheter limitativo del alcance de la invencion.
Ejemplo 1: Hidrolisis de hemoglobina purificada con inyección de oxigeno o nitrógeno. Se empleo un volumen pequerio para realizar una hidrolisis a baja escala. El 30 sustrato empleado fue una disolucion de hemoglobina purificada de 50 g/l.
En un volumen de 400 mL, se disolvieron 20 gramos de hemoglobina de una pureza del 95% y posteriormente la disolucion fue introducida en un reactor de acero hermeticamente cerrado. El reactor fue colocado en el interior de una camisa capaz de elevar la temperatura del interior del reactor hasta la temperatura deseada. Ademas, el
reactor disponia de un controlador de temperatura, un controlador de la presion interna, agitacion mecanica, un puerto de entrada del aire inyectado y un puerto de salida del exceso de gas controlado por una valvula dependiente de la presion intern&
Por ültimo, contaba con un puerto de salida por el cual extraer la muestra a traves de un intercambiador de calor para enfriar la muestra.
Ladisolucion the mantenida en agitacion constante a una velocidad de 500 rpm y fue calentada hasta alcanzar 180 °C de temperatura, proceso que tuvo una duracion aproximada de 60 minutos. Durante este periodo, a traves del puerto de entrada se inyectaron nitrogeno u oxigeno a razon de un caudal de 1 litro por minuto hasta que se alcanzo una presiOn dentro del reactor de 40 atmosferas. Este valor se alcanzo durante los primeros 30 minutos de reaccion y en ese momento la valvula que controla automaticamente la presion entr6 en funcionamiento y se estableci6 una corriente continua de gas inyectado que permitio mantener la presión constante y no detener la inyeccion de gas. El gas, antes de ser introducido en el reactor, the precalentado a 150 °C en un humidificador para que se saturase de vapor de agua.
Estascondiciones fueron mantenidas durante 6 horas (para el caso en el que se inyect6 nitrOgeno) o 4 horas (para el caso en el que se inyecto oxigeno) . Transcurrido este tiempo se desconectaron el aporte de calor y la inyeccion de gas, pero se siguio manteniendo la agitacion. A continuaciOn, a traves del puerto de salida, se extrajo lentamente el producto 25 haciendolo pasar por un intercambiador de calor con refiteracion liquida para dejar la muestra a temperatura ambiente.
Se obtuvieron aproximadamente los 400 mL de muestra original. El analisis de los peptidos obtenidos the realizado mediante una cromatografia de filtracion en gel. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
- En el caso de emplearse nitrogeno, al cabo de 6 horas de reaccion se obtuvieron entre 16 y 17 gramos de peptidos solubles de un peso molecular medio de 3, 2 lcDa y con una reduccion del color medida a 407 nm de un 80%, acompariado por una produccion de 1, 5 gramos de aminoacidos libres.
-En el caso de que el gas inyectado fuera oxigeno, al cabo de 4 horas de reaccion, se obtuvo la misma producción de peptidos pero de un peso molecular 5 medio de entre 1 y2 lcDa, con una decoloracion del 95% y 0, 2 gramos de aminoacidos libres.
Se comprobO que los peptidos asi obtenidos mejoran la solubilidad de la hemoglobina purificada, las propiedades emulsionantes y la capacidad antioxidante.
Ejemplo 2: Hidrolisis de plumas de ave junto con coagulos de sangre de la misma especie con inyección de oxigeno.
Se realize) una prueba a pequeria escala con muestras frescas de coagulos de sangre de polio y plumas enteras. Esta mezcla de materias primas se realiza debido a que las plumas, formadas por queratina, no tienen dentro de su composicion ciertos aminoacidos esenciales, los cuales son aportados por los coagulos agregados. De este modo se consigui6 tener un producto final sin carencias nutricionales.
Se pesaron 200 gramos de coagulos de sangre de polio (100 gramos de peso seco) , se agregaron 40 gramos de plumas secas de ave trituradas y se afiadio agua hasta completar un volumen de 400 mL, lo que en la disolucion final supusieron 140
gramos de materia seca por litro. Dicha disolucion the colocada en el reactor previamente descrito y se fijaron las condiciones de la hidrOlisis en agitación constante, 180 °C, presiOn de 40 atmosferas y un flujo de oxigeno de 1400 mL/min. El tiempo de reaccion en este caso se fijo en 270 minutos. Pasado este periodo se extrajo el producto obtenido, cuyo volumen final era de 600 mL. Las plumas y los coagulos habian sido completamente solubilizados, dando lugar a una disolucion rica en peptidos solubles y restos de materia en suspension. Para eliminar estos posibles agregados y materia en suspension se realizo una centrifugacion del producto durante 10 minutos con una fuerza de 10.000 g. El sobrenadante obtenido consistio en una disolucion de color ambar claro con una concentraciOn de 120 g/L de peptidos en disolucion, lo que supuso un rendimiento del 85%. El restante 15% estaba compuesto por los sOlidos en suspension retirados durante la centrifugacion.
Los peptidos se analizaron mediante cromatografia de exclusion de tatngio para conocer la concentracion y distribucion de pesos moleculares de los mismos. Bajo las condiciones descritas se obtuvieron peptidos de un peso molecular promedio de 2-3 l (Da, aunque el rango de los mismos abarcaba desde los 10 a los 0, 5 IcIDa. La decoloraciOn que se obtuvo era del 85%.
