Modificación de poliuretano con polímeros sensibles a estímulos biocompatibles para carga y cesión de fármacos
Sector de la técnica La presente invención se refiere a materiales funcionalizados con polímeros capaces de incorporar fármacos y liberarlos. De un modo más específico se refiere a poliuretanos modificados con polímeros, los productos manufacturados que incorporan estos poliuretanos y sus usos.
Estado de la técnica Los materiales poliméricos son componentes habituales de productos sanitarios implantables (sondas, catéteres, stents, prótesis, etc.) y de dispositivos sólidos utilizados en la aplicación de fármacos por diversas vías, principalmente a través de piel y mucosas. En la actualidad existe un interés creciente por optimizar la funcionalidad de los productos sanitarios implantables, añadiendo a su función física primaria la capacidad de actuar como sistemas de liberación de fármacos que permitan prevenir su reconocimiento como objeto extraño al organismo, mejorar su biocompatibilidad y minimizar el riesgo de infecciones causadas por microorganismos que se adhieren y proliferan en la superficie dando lugar a la formación de biofilms. La incorporación de agentes antimicrobianos, antiinflamatorios e inmunosupresores sobre la superficie de los productos sanitarios representa un procedimiento eficaz para la profilaxis de infecciones y la prevención de respuestas inflamatorias e inmunes. Además, los productos de combinación fármaco-producto sanitario permiten alcanzar concentraciones locales de fármaco más elevadas que las que se consiguen con la administración sistémica, haciendo posible el tratamiento localizado de patologías con mínimo riesgo de aparición de efectos secundarios en otras zonas de organismo.
Entre los numerosos procedimientos disponibles en la actualidad para funcionalizar la superficie de sustratos poliméricos, las radiaciones de alta energía como la radiación gamma (γ) y los electrones acelerados, tienen la capacidad de activar las cadenas poliméricas sin la participación de iniciadores químicos, de tal forma que monómeros específicos pueden ser injertados sobre ellas. Los grados de modificación (expresados como porcentajes de injerto) pueden ser regulados a través de una selección cuidadosa del tiempo de exposición (dosis) del material a la radiación y por las condiciones de reacción asociadas al proceso. Además del elevado grado de pureza del producto de injerto así obtenido, las reacciones de injerto producidas por radiación γ tienen la ventaja de ser aplicables a casi todas las combinaciones polímero-monómero, y permiten regular la profundidad del material en el que se puede producir el injerto (Clough 2001; Gupta et al. 2004) . No obstante, no existen unas condiciones óptimas de injerto generales, sino que para cada combinación polímeromonómero el grado de injerto es función de la interrelación entre la intensidad de radiación, el tiempo de exposición, la naturaleza del disolvente y la concentración de monómeros. En el caso particular del polipropileno (polímero alifático rígido y no biodegradable) se ha observado que el injerto secuencial de poli (N-isopropil acrilamida) (PNIPAAm) y poli (ácido acrílico) (PAAc) utilizando el método de pre-irradiación con fuentes de 60Co, permite obtener injertos constituidos por redes interpenetradas de PNIPAAm y PAAc con capacidad para alojar un fármaco antimicrobiano, como la vancomicina, cederlo de forma sostenida durante aproximadamente 8 horas y prevenir de forma eficaz el desarrollo de biofilms de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (Muñoz-Muñoz, F. Ruiz, J.C. Alvarez-Lorenzo, C. et al. 2009. Novel interpenetrating smart polymer networks grafted onto polypropylene by gamma radiation for loading and deliver y of vancomycin. Eur Polym J. 45: 1859-1867) .
Por otro lado, los poliuretanos son polímeros especialmente adecuados como componentes de sistemas de implantación y de administración tópica y mucosal de fármacos por su excelente hemo-y bio-compatibilidad, elasticidad y resistencia a la fatiga (Moon Suk Kim, Jae Ho Kim, Byoung Hyun Min, Heung Jae Chun, Dong Keun Han, Hai Bang Lee. Polymeric Scaffolds for Regenerative Medicine, Polymer Reviews, 51: 23-52, 2011) . Sin embargo, presentan una baja capacidad para actuar como sistemas de cesión de medicamentos, problema que todavía está sin resolver de un modo satisfactorio.
Descripción de la invención La presente invención proporciona poliuretanos modificados de modo que es posible incorporar sustancias activas a los mismos y liberarlas de manera prolongada en el tiempo, y de este modo soluciona la baja capacidad de los poliuretanos para actuar como sistemas de cesión de medicamentos. Así, la invención proporciona un poliuretano modificado mediante injerto superficial o en profundidad, de redes poliméricas interpenetrantes (IPNs) y semiinterprenetrantes (s-IPNs) , que presentan una alta biocompatibilidad y que permiten la incorporación y la cesión controlada de fármacos. La modificación del poliuretano está basada en injertos de un polímero, que puede estar opcionalmente entrecruzado, y que está interpenetrado o semi-interpenetrado con otro polímero entrecruzado, y entre ambos polímeros no hay un enlace químico, siendo así ambos polímeros independientes entre sí.
En un aspecto, la invención se dirige a un poliuretano modificado caracterizado porque el poliuretano está injertado con un polímero A y a) dicho polímero A está formando parte de una red semi-interpenetrante con un polímero entrecruzado B; o b) dicho polímero A está entrecruzado y forma parte de una red interpenetrante con un polímero entrecruzado B; donde el polímero B se selecciona de entre poli (ácido acrílico) y poli (ácido metacrílico) , y los polímeros A y B son independientes entre sí. En otro aspecto, la invención se refiere a material médico que comprende un poliuretano modificado como se ha descrito previamente.
En otro aspecto, la invención se refiere a un film que comprende un poliuretano modificado como se ha descrito previamente.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación del poliuretano modificado descrito anteriormente.
Descripción detallada de la invención “Poliuretano” se refiere a un polímero que se sintetiza mediante condensación de monómeros y/o polímeros que contienen dos o más grupos hidroxílico con monómeros que contienen dos o más grupos isocianato. En un aspecto más particular, el poliuretano se selecciona entre poliuretanos alifáticos y aromáticos. En un aspecto más particular, el poliuretano es un poli (eteruretano) cicloalifático sintetizado a partir de metileno bis (p-ciclohexil isocianato) , 1, 4-butanodiol, y poli (tetrametileno glicol) ; este poliuretano se conoce comercialmente con el nombre de Tecoflex. Los poliuretanos son materiales que pueden estar comercialmente disponibles, e incluso pueden tener tal pureza que sean de aplicación en medicina, por
ejemplo los conocidos por su nombre comercial como Tecophilic, Tecoplast, Tecothane,
Carbothane, Isoplast.
En una realización particular, la invención se refiere a un poliuretano modificado como se ha descrito anteriormente donde el injerto es superficial o en profundidad.
Un “injerto” se refiere a un anclaje químico mediante un enlace covalente, por ejemplo y según lo descrito anteriormente entre el polímero A y el poliuretano. Un “injerto superficial” se refiere a un injerto en el que el enlace covalente se encuentra en la superficie del poliuretano. Un “injerto en profundidad” se refiere a un injerto en el que el enlace covalente se encuentra en el interior del poliuretano.
En una realización particular, el polímero A es un homopolímero lineal, ramificado o entrecruzado que está constituido por monómeros seleccionados de entre el grupo constituido por N-alquil acrilamida, N, N-dialquilacrilamida, N- (aminoalquil) acrilamida, N (hidroxialquil) acrilamida, N-arilacrilamida, N-arilalquilacrilamida, N-alquil metacrilamida, N, N-dialquilmetacrilamida, N- (aminoalquil) metacrilamida, N- (hidroxialquil) metacrilamida, N- (ftalimida alquil) acrilamida, N-arilmetacrilamida, N-arilalquilmetacrilamida, donde el grupo amino puede estar mono o di sustituido por grupos alquilo.
“Alquilo” se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, acíclica, formada por átomos de carbono e hidrógeno, sin insaturaciones, de 1 a 12, preferiblemente de uno a ocho átomos de carbono, más preferiblemente de uno a cuatro átomos de carbono, y que se une al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, opcionalmente sustituído por uno o más sustituyentes seleccionados entre el grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo carboxi, un grupo alcoxi, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo tioalcoxi, un grupo heteroalquilo, un grupo heterocíclico o CF3, por ejemplo, metilo, etilo, npropilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, ciclopropilo, etc.
"Arilo" se refiere a un hidrocarburo aromático de 6 a 10 átomos de carbono, tal como fenilo o naftilo. Los radicales arilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados entre el grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo carboxi, un grupo alcoxi, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo tioalcoxi, un grupo alquilo o CF3.
En una realización más particular, el polímero A es un homopolímero lineal, ramificado o entrecruzado que está constituido por monómeros seleccionados de entre el grupo constituido por N-isopropil acrilamida, N- (2-aminoetil) metacrilamida, N- (2hidroxipropil) metacrilamida, N- (3-Aminopropil) metacrilamida, N- (isoButoximetil) metacrilamida, N- (n-Octadecil) acrilamida, N- (Ftalimidometil) acrilamida, N- (tBOC-aminopropil) metacrilamida, N, N-Dietilacrilamida, N, N-Dimetilacrilamida, N, N-Dimetilmetacrilamida, N-[2- (N, N-Dimetilamino) etil]metacrilamida, N-[3- (N, NDimetilamino) propil]acrilamida, N-[3- (N, N-Dimetilamino) propil]metacrilamida, N-Benzilmetacrilamida, N-Difenilmetilacrilamida, N-Dodecilmetacrilamida, N-Etilmetacrilamida, N-Hidroxietil acrilamida, preferiblemente es N-isopropil acrilamida.
En una realización más particular, el polímero A es poli (N-isopropil acrilamida) .
Una “red semi-interpenetrante” se refiere a un sistema constituido por un polímero que no se encuentra entrecruzado y un polímero que sí se encuentra entrecruzado, así para los propósitos de la invención la red semi-interpenetrada descrita anteriormente se refiere a un polímero A que no está entrecruzado y un polímero B entrecruzado, donde el polímero A penetra a nivel molecular la red que forma el polímero B sin que se forme ningún enlace químico entre ambos polímeros.
“Red interpenetrante” se refiere a un sistema constituido por dos redes independientes de polímeros entrecruzados en las que las cadenas poliméricas de una red penetran físicamente la otra red sin establecer ningún enlace químico entre los polímeros. Así para los propósitos de la invención, el polímero A constituye la primera red y el polímero B constituye la segunda red de modo que forman una red interpenetrante.
Para los propósitos de la invención, los polímeros A y B, aunque se encuentran formando parte de una red, son independientes. “Polímeros independientes” se refiere a que un polímero o la red constituida por un polímero penetra físicamente la red constituida por el otro polímero sin establecer ningún enlace químico entre los polímeros. Dichos polímeros independientes responden de manera independiente a los estímulos. Así, por ejemplo, si el polímero A es poli (N-isopropil acrilamida) entrecruzada, la red del polímero A se encuentra expandida a temperatura inferior a 33ºC y contraída a la temperatura corporal; mientras que si el polímero B es poli (ácido acrílico) entrecruzado, la red del polímero B se contrae a pH
ácido y se encuentra expandida a pH 7.4.
En una realización particular, la invención se refiere a un poliuretano modificado donde el polímero A es poli (N-isopropil acrilamida) y el polímero B es poli (ácido acrílico) (PAAc) .
En una realización particular, el poliuretano modificado de la invención está caracterizado porque el poliuretano está injertado con poli (N-isopropil acrilamida) , y
a) la poli (N-isopropil acrilamida) está formando parte de una red semi-interpenetrante con poli (ácido acrílico) entrecruzado; o b) la poli (N-isopropil acrilamida) está entrecruzada y forma parte de una red interpenetrante con poli (ácido acrílico) entrecruzado; donde el polímero B se selecciona de entre poli (ácido acrílico) y poli (ácido metacrílico) , y los polímeros A y B son independientes entre sí. El injerto del polímero A y la red semi-interpenetrante o interpenetrante, dotan a la superficie y a la masa de los poliuretanos modificados de la presente invención de capacidad para cambiar su grado de hinchamiento y, por lo tanto, para regular el proceso de carga y de cesión de fármacos ajustándolo a las condiciones de pH y temperatura del entorno fisiológico.
En un aspecto particular, la invención se refiere a un poliuretano modificado como se ha descrito previamente que además incorpora una sustancia activa.
“Sustancia activa” se refiere a cualquier sustancia que se utiliza en el tratamiento o prevención de una enfermedad o que se utiliza para mejorar el bienestar físico de seres humanos o animales. En una realización particular, la sustancia activa se selecciona de entre hormonas, antifúngicos, antibacterianos, antivirales, espermicidas, anestésicos locales, antiinflamatorios, relajantes musculares, inductores del parto, agentes para el tratamiento de enfermedad de trasmisión sexual. En una realización más particular, la sustancia activa se selecciona de entre progesterona, medrogestona, medroxi-progesterona, ciclopirox olamina, metronidazol, clotrimazol, ketoconazol, miconazol, fenticonazol, tioconazol, sertaconazol, oxiconazol, itraconazol butaconazol, terconazol, saperconazol, troconazol, fluconazol, econazol, nistatina, amfotericina B, clindamicina, trimetoprim, sulfametoxazol, penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, doxiciclina, bacitracina, lincomicina, colistina, polimixinaB, vancomicina, gentamicina, kanamicina, neomicina, estreptomicina, eritromicina, amikacina, tobramicina, nonoxinol-9, octoxinol-9, menfegol, ciclodextrinas, tetracaína, mepivacaína, lidocaína, benzocaína, procaína, beta-metasona, hidrocortisona, triamcinolona, mometasona, diclofenac, etodolac, ibuprofeno, indometacina, meloxicam, piroxicam, prostaglandina, estriol, 17-β-estradiol, terbutalina, ritodrina, isoxsuprina, fenoterol, salambutol, hexoprenalina, metaproterenol, bitolterol y pirbuterol, prostaglandina PGF2 (dinoprostona) , PGF2 (dinoprost) , carboprost, sulprostona, misoprostol, gemeprost.
Los poliuretanos modificados de la invención que incorporan sustancias activas, son capaces de liberarlas de forma sostenida en el tiempo. Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un poliuretano modificado como se ha descrito previamente para su uso como sistema de liberación de sustancias activas. En una realización más particular, el sistema es de liberación tópica, transdérmica o transmucosal.
En otra realización particular, la invención se refiere a un implante que comprende un poliuretano modificado como se ha descrito previamente.
En otro aspecto, la invención se refiere a material médico que comprende un poliuretano modificado como se ha descrito previamente. En una realización particular, material médico se refiere a catéteres, globos, sondas, stents, guantes, condones, membranas porosas.
En una realización preferida, la invención se refiere a un catéter que comprende un poliuretano como se ha descrito previamente.
Además, el poliuretano modificado de la invención puede encontrarse en forma de film. Así, en un aspecto, la invención se refiere a un film que comprende un poliuretano modificado como se ha descrito previamente. La invención también se refiere, de una forma particular, al film previamente descrito para su uso como recubrimiento de superficies. Alternativamente se refiere al uso del film previamente descrito como recubrimiento de superficies. En otra realización particular, la invención se refiere al poliuretano modificado como se ha descrito previamente para su uso como embalaje de material médico, envoltorio o recubrimiento de material médico, recubrimiento de sistemas de liberación.
En una realización particular, la invención se refiere a un material médico o a un film que comprende un poliuretano modificado como se ha descrito previamente, que además incorpora una sustancia activa.
En una realización particular, la invención se refiere a un catéter o a un film que comprende un poliuretano modificado como se ha descrito previamente, que además incorpora vancomicina.
En otra realización particular, la invención se refiere al poliuretano modificado como se ha descrito previamente para su uso en la fabricación de membranas porosas, preferiblemente hemodializadores, oxigenadores, hemoconcentradores.
En otra realización particular, la invención se refiere al poliuretano modificado como se ha descrito previamente para su uso como recubrimiento de complementos nutricionales.
En otro aspecto, la invención se refiere a los poliuretanos modificados como se han descrito previamente, para su uso como cosmético o recubrimiento de cosméticos.
En otro aspecto la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un poliuretano modificado como se ha descrito anteriormente, caracterizado porque el poliuretano está injertado con un polímero A y dicho polímero A está formando parte de una red semi-interpenetrante con un polímero entrecruzado B, que comprende a) someter un poliuretano injertado con un polímero A a irradiación gamma en presencia de un polímero entrecruzado B, y b) calentar el material resultante de la etapa a) . En una realización particular, el polímero A es poli (N-isopropil acrilamida) y el polímero B es poli (ácido acrílico) . Para una mejor comprensión, a este producto cuando el polímero A es poli (Nisopropil acrilamida) y el polímero B es poli (ácido acrílico) se le nombra con el siguiente código: (TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAC) .
En una realización particular, la invención se refiere al poliuretano modificado obtenible mediante el procedimiento antes descrito.
Es de interés para la presente invención, el poliuretano intermedio en el proceso sintético previamente descrito. Así en una realización particular, la invención se refiere a un poliuretano injertado con un polímero A, el polímero A como se ha descrito anteriormente, preferiblemente la poli (N-isopropil acrilamida) . Para una mejor comprensión, a este producto cuando el polímero A es poli (N-isopropil acrilamida) y el polímero B es poli (ácido acrílico)
se le nombra con el siguiente código: (TFX-g-PNIPAAm) .
En otra realización particular, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un poliuretano injertado con un polímero A como se ha descrito previamente, que comprende a1) someter un poliuretano en presencia de un polímero A a irradiación gamma, y a2) calentar el material resultante de la etapa a1) ; o b1) someter un poliuretano a irradiación gamma, y b2) calentar el material resultante de la etapa b1) en presencia de un polímero A.
En una realización particular, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un poliuretano modificado como se ha descrito anteriormente, caracterizado porque el poliuretano está injertado con un polímero A y dicho polímero A está entrecruzado y forma parte de una red interpenetrante con un polímero entrecruzado B, que comprende someter un poliuretano injertado con un polímero entrecruzado A a irradiación gamma, en presencia del polímero B. En una realización particular, la invención se refiere al poliuretano modificado obtenible mediante el procedimiento antes descrito.
Es de interés para la presente invención, el poliuretano intermedio en el proceso sintético previamente descrito. Así en una realización particular, la invención se refiere a un poliuretano injertado con un polímero entrecruzado A, el polímero A como se ha descrito anteriormente, preferiblemente la poli (N-isopropil acrilamida) . En otra realización particular, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un poliuretano injertado con un polímero entrecruzado A como se ha descrito previamente, que comprende: a) someter un poliuretano injertado con un polímero A como se ha descrito previamente, a irradiación gamma; o b1) someter un poliuretano a irradiación gamma, y b2) calentar el material resultante de la etapa b1) en presencia de un polímero A y un agente reticulante. En una realización particular, el agente reticulante es metileno bis (acrilamida) . En una realización particular, el polímero A es poli (N-isopropil acrilamida) y el polímero B es poli (ácido acrílico) . Para una mejor comprensión, al producto resultante de la etapa a) cuando el polímero A es poli (N-isopropil acrilamida) y el polímero B es poli (ácido acrílico) se le nombra con el siguiente código: (net-TFX-g-PNIPAAm) y al producto resultante de la etapa b2) se le nombra con el código (TFX-g-net-PNIPAAm) .
La utilización de radiación gamma como desencadenante de los procesos de anclaje y reticulación resulta ventajosa ya que no requiere la modificación previa del poliuretano ni la obtención previa de derivados reactivos de poliuretano, a diferencia de lo que ocurre cuando se aplican procedimientos químicos de anclaje (Hu et al. 2006; Cho y Kim, 2010; Hu et al. 2010) .
En una realización particular, las etapas de irradiación gamma en los procesos anteriormente descritos tiene lugar usando fuentes de 60Co. En una realización particular, las etapas de irradiación gamma en los procesos de la invención tienen lugar a intensidades de entre 2 a 20 kGy/h y aplicando dosis de irradiación comprendidas entre 2 y 60 kGy, más preferiblemente a intensidades de entre 2.5 a 10 kGy/h y aplicando dosis de irradiación comprendidas entre 2.5 y 50 kGy.
En otro aspecto particular, cuando el poliuretano es un poli (eteruretano) cicloalifático sintetizado a partir de metileno bis (p-ciclohexil isocianato) , 1, 4-butanodiol, y poli (tetrametileno glicol) , el porcentaje de injerto de poli (N-isopropil acrilamida) en TFX-g-PNIPAAm, net-TFX-g-PNIPAAm y TFX-g-net-PNIPAAm está entre el 10% y el 100% en peso del TFX. En un aspecto particular, el contenido en poli (ácido acrílico) está preferiblemente entre el 10% y el 200% en peso.
En una realización particular, los procedimientos de la invención para la obtención de poliuretanos modificados, como se han descrito anteriormente, comprenden además la incorporación de un sustancia activa. Esta etapa puede llevarse a cabo sumergiendo el poliuretano modificado en una disolución de la sustancia activa.
Descripción de las figuras Figura 1. Halos de inhibición observados en placas sembradas con Staphylococcus aureus (ATCC 25923) tras incubar a 37 ºC durante 24 horas en presencia de catéteres de TFX y de net-TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc con PNIPAAm injertado por método P o por método D (códigos como en Tabla 1) , sin cargar con vancomicina y tras cargar vancomicina.
Códigos: A1: TFX catéter (sin vancomicina) ; A2: TFX catéter (cargado con vancomicina) ; B1: IPN40P-c (sin vancomicina) ; B2: IPN40P-c (cargado con vancomicina) ; C1: IPN40D-c (sin vancomicina) ; C2: IPN40D-c (cargado con vancomicina) .
Figura 2. Perfiles de cesión de vancomicina a partir de IPN40 () , s-IPN40 () , IPN60 () , s-IPN60 () , IPN80 () y s-IPN80 () , en medio tampón fosfato de pH 7.4 a 37°C para net-TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc con PNIPAAm injertado por método P (a, b) o por método D (c, d) y que se ensayaron en estado húmedo (a, c) y seco (b, d) .
Figura 3. Trombo formado después de 30 min de incubación de la sangre sobre s-IPN40P-f (A) , IPN60P-f (B) , s-IPN60D-f (C) , IPN60D-f (D) , s-IPN60P-f (E) , s-IPN40D-f (F) , IPN40Df (G) , IPN40P-f (H) , TFXf sin modificar (I) , y control positivo (J) . El peso de los trombos se normalizó con respecto al peso del trombo obtenido para el control positivo.
Figura 4. Etapas de polimerización para la síntesis de injertos y redes de PNIPAAm, e IPNs y s-IPNs de NIPAAm/AAc en TFX catéteres y películas.
Ejemplos de la invención Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención y no deben interpretarse como limitativos de la misma. Se incluyen ejemplos para ilustrar la preparación de poliuretanos con injertos de PNIPAAm interpenetrados con entramados de PAAc. También se incluyen ejemplos de la hemocompatibilidad, y de la capacidad de las composiciones para incorporar fármacos y cederlos de manera controlada.
Modo de realización Para llevar a cabo el injerto de cadenas de PNIPAAm sobre Tecoflex (TFX) aplicando el método de pre-irradiación oxidativa (método P) , el TFX se irradia al aire a temperatura ambiente usando fuentes de 60Co (Gammabeam 651 PT, Unidad de Irradiación y Seguridad Radiológica del Instituto de Ciencias Nucleares de la Universidad Nacional Autónoma de México) a razón de dosis de 5 a 10 kGy/h y aplicando dosis de irradiación comprendidas entre 2.5 y 50 kGy. El TFX preirradiado se coloca en ampollas de vidrio conteniendo disoluciones acuosas de NIPAAm de concentración comprendida entre 0.25 y 1.0 M. Las ampollas se saturan con argón durante 20 min, se sellan y calientan a 60 ó 70 °C durante 45 a 420 min. Los polímeros injertados se lavan con agua y se secan (a presión reducida) a 40 ºC durante 48 h. El porcentaje de PNIPAAm injertado se cuantifica aplicando la ecuación:
en la que Wf y Wi representan los pesos de TFX después y antes del injerto, respectivamente.
Para llevar a cabo el injerto de cadenas de PNIPAAm sobre TFX aplicando el método directo (método D) , el TFX se coloca en ampollas de vidrio conteniendo disoluciones de NIPAAm de concentración comprendida entre 0.25 y 1.0 M en tolueno. Las ampollas se saturan con argón durante 20 min, se sellan y se irradian a temperatura ambiente usando fuentes de 60Co (Gammabeam 651 PT, Unidad de Irradiación y Seguridad Radiológica del Instituto de Ciencias Nucleares de la Universidad Nacional Autónoma de México) a intensidades de irradiación de 2.5 a 10 kGy/h y aplicando diferentes dosis comprendidas entre 2.5 y 50 kGy. Los polímeros injertados se lavan con tolueno y agua y se secan a 40 ºC durante 48 h. El porcentaje de PNIPAAm injertado se cuantifica aplicando la ecuación 1.
Para llevar a cabo la reticulación de las cadenas de PNIPAAm injertadas sobre TFX aplicando el método de pre-irradiación oxidativa (método P) o el método directo (método D) , el TFX-g-PNIPAAm se coloca en ampollas de vidrio conteniendo agua destilada y tras saturación con argón durante 20 min, se sellan las ampollas y se irradian a temperatura ambiente usando fuentes de 60Co (Gammabeam 651 PT, Unidad de Irradiación y Seguridad Radiológica del Instituto de Ciencias Nucleares de la Universidad Nacional Autónoma de México) a velocidades de irradiación de 2.5 a 10 kGy/h y aplicando diferentes dosis de irradiación, comprendidas entre 2.5 y 50 kGy. Los net-TFX-g-PNIPAAm obtenidos se lavan con agua y se secan a vacío.
Para llevar a cabo el anclaje y reticulación de las cadenas de PNIPAAm en un solo paso (TFX-g-net-PNIPAAm) , se aplica el método de pre-irradiación oxidativa (método P) descrito arriba y el TFX preirradiado se coloca en ampollas de vidrio conteniendo disoluciones acuosas de NIPAAm de concentración comprendida entre 0.25 y 1.0 M y de metileno bis (acrilamida) (MBAAm) en proporción 0.05 a 2% en peso con respecto a NIPAAm. Las ampollas se saturan con argón durante 20 min, se sellan y se calientan a 60 ó 70 °C durante 45 a 420 min.
Para llevar a cabo la síntesis de la red de PAAc interpenetrada, piezas de TFX-g-PNIPAAm, net-TFX-g-PNIPAAm ó TFX-g-net-PNIPAAm se sumergen en ampollas de vidrio que contienen una disolución acuosa de ácido acrílico y MBAAm. Transcurridas entre 1 y 10 horas, las piezas de TFX-g-PNIPAAm, net-TFX-g-PNIPAAm ó TFX-g-net-PNIPAAm se retiran de la disolución, se depositan en ampollas de vidrio, se congelan, se desgasifican a vacío, se sellan, y a continuación se procede a la irradiación directa usando fuentes de 60Co (Gammabeam 651 PT, Unidad de Irradiación y Seguridad Radiológica del Instituto de Ciencias Nucleares de la Universidad Nacional Autónoma de México) a velocidades de irradiación de 2.5 a 10 kGy/h y aplicando diferentes dosis comprendidas entre 0.5 y 3 kGy. Los TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc y los net-TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc obtenidos se lavan con agua y se secan a vacío.
Ejemplo 1. Preparación de TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc y net-TFX-g-PNIPAAminter-net-PAAc
Se partió de porciones de 2.5 cm de longitud de catéter de poliuretano Tecoflex (UmbilicathTM, Utah Medical Products, USA) y de porciones de 1x4 cm de films de poliuretano Tecoflex (TFX EG-93A, Lubrizol Advanced Materials, USA) de 0.5 mm de espesor. En primer lugar, se sometieron a los procesos de injerto de NIPAAm utilizando el método P o el método D a 7.4 kGy/h obteniéndose TFX-g-PNIPAAm.
Para obtener sistemas semi-interpenetrados con una red de PAAc, los TFX-g-PNIPAAm obtenidos se colocaron en ampollas de vidrio con una disolución acuosa de ácido acrílico 25% peso/vol y MBAAm 1% peso/peso. Transcurridas 6 horas, las piezas de TFX-g-PNIPAAm se retiraron de la disolución. . A continuación, se introdujeron en ampollas de vidrio vacías, se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido, se desgasificaron a vacío, se sellaron y se irradiaron usando fuentes de 60Co (Gammabeam 651 PT, Unidad de Irradiación y Seguridad Radiológica del Instituto de Ciencias Nucleares de la Universidad Nacional Autónoma de México) a 5 kGy/h aplicando una dosis de irradiación de 1.5 kGy. Los TFX-gPNIPAAm-inter-net-PAAc obtenidos se lavaron con agua y se secaron a vacío. Estos materiales se designan como s-IPN seguidos por un número que indica el porcentaje de injerto en PNIPAAm y una letra P ó D mayúsculas que se refieren al método P ó D utilizado para injertar PNIPAAm.
Para preparar injertos con las dos redes reticuladas, se partió de los TFX-g-PNIPAAm obtenidos por los métodos P y D, que se colocaron en ampollas de vidrio conteniendo agua destilada y, tras saturación con argón durante 20 min, se irradiaron a temperatura ambiente usando fuentes de 60Co (Gammabeam 651 PT, Unidad de Irradiación y Seguridad Radiológica del Instituto de Ciencias Nucleares de la Universidad Nacional Autónoma de México) a 7.4 kGy/h aplicando una dosis de irradiación de 10 kGy. Los net-TFX-g-PNIPAAm obtenidos se lavaron con agua, se secaron a vacío y se colocaron en ampollas de vidrio con una disolución acuosa de ácido acrílico 25% peso/vol y MBAAm 1% peso/peso. Transcurridas 6 horas, las piezas de net-TFX-g-PNIPAAm se retiraron de la disolución, se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se desgasificaron a vacío. A continuación, se introdujeron en ampollas de vidrio vacías que se sellaron y se irradiaron usando fuentes de 60Co (Gammabeam 651 PT, Unidad de Irradiación y Seguridad Radiológica del Instituto de Ciencias Nucleares de la Universidad Nacional Autónoma de México) a 5 kGy/h aplicando una dosis de irradiación de 1.5 kGy. Los net-TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc obtenidos se lavaron con agua y se secaron a vacío.
Otro procedimiento para preparar injertos con las dos redes reticuladas, consistió en preirradiar TFX a 8 kGy/h a 30 kGy y a continuación colocarlo en ampollas de vidrio conteniendo disoluciones acuosas de NIPAAm de concentración 0.5 M y de metileno bis (acrilamida) (MBAAm) en proporción 0.7 % en peso con respecto a NIPAAm, para anclar y reticular las cadenas de PNIPAAm en un solo paso (TFX-g-net-PNIPAAm) . Las ampollas se saturaron con argón durante 20 min, se sellaron y se calentaron a 70 °C durante 60 min. Los TFX-g-net-PNIPAAm obtenidos se lavaron con agua, se desecaron a vacío y se colocaron en ampollas de vidrio con una disolución acuosa de ácido acrílico 25% peso/vol y MBAAm 1% peso/peso. Transcurridas 6 horas, las piezas de net-TFX-g-PNIPAAm se retiraron de la disolución, se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y desgasificaron a vacío. A continuación, se introdujeron en ampollas de vidrio vacías que se sellaron y se irradiaron usando fuentes de 60Co (Gammabeam 651 PT, Unidad de Irradiación y Seguridad
Radiológica del Instituto de Ciencias Nucleares de la Universidad Nacional Autónoma de México) a 5 kGy/h, aplicando una dosis de irradiación de 1.5 kGy. Los TFX-g-netPNIPAAm-inter-net-PAAc obtenidos se lavaron con agua y se secaron a vacío.
Códigos empleados: Los net-TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc y los TFX-g-net-PNIPAAminter-net-PAAc se designan como IPN e IPN-2pasos, respectivamente, seguido por un número que indica el porcentaje de injerto en PNIPAAm y una letra P ó D mayúsculas que se refieren al método P ó D utilizado para injertar PNIPAAm. Las letras c y p indican poliuretano en forma de catéter o película, respectivamente.
En las Tablas 1a y 1b se resumen los porcentajes de injerto alcanzados.
Tabla 1a (catéteres) y 1b (film) . Porcentajes de injerto de PNIPAAm y PAAc en poliuretanos 15 con injertos de PNIPAAm interpenetrados con entramados de PAAc.
Catéter Código PNIPAAm injertado (%) net-PAAc interpenetratado
PNIPAAm/PAAc (% mol/mol) Porcentaje de injerto sobre TFXc-g-IPN (%)
IPNc-2steps 20 (0.8) 17/83 (0.5) 66.7 (0.5)
IPN40P-c 43 (1.0) 32/68 (1.1) 96 (3.2)
s-IPN40P-c 40 (1.4) 28/72 (1.3) 106 (3.4)
IPN60P-c 63 (1.3) 35/65 (1.0) 131 (4.7)
s-IPN60P-c 59 (3.8) 30/70 (1.3) 139 (6.1)
IPN80P-c 82 (5.5) 34/66 (4.4) 183 (6.1)
s-IPN80P-c 77 (6.0) 37/63 (4.0) 162 (2.2)
IPN40D-c 40 (0.9) 24/76 (0.6) 111 (3.7)
s-IPN40D-c 40 (2.2) 24/76 (0.2) 115 (4.3)
IPN60D-c 62 (2.7) 30/70 (0.5) 148 (2.3)
s-IPN60D-c 59 (1.0) 29/71 (0.2) 149 (2.8)
IPN80D-c 81 (2.1) 33/67 (0.6) 170 (4.1)
Película Código PNIPAAm injertado (%) net-PAAc interpenetratado
PNIPAAm/PAAc (% mol/mol) Porcentaje de injerto sobre TFXp-g-IPN (%)
IPN40P-p 43 (3.6) 26/74 (1.5) 119 (1.1)
s-IPN40P-p 42 (4.0) 25/75 (1.1) 123 (6.4)
IPN60P-p 62 (2.2) 33/67 (3.0) 147 (3.8)
s-IPN60P-p 61 (3. 2) 30/70 (1.2) 158 (9.1)
IPN80P-p 82 (2.0) 34/66 (3.7) 175 (8.4)
s-IPN80P-p 79 (1.2) 36/64 (2.9) 162 (6.5)
IPN40D-p 38 (1.7) 22/78 (1.8) 102 (1.8)
s-IPN40D-p 37 (1.2) 21/79 (0.1) 103 (3.0)
IPN60D-p 65 (0.2) 31/69 (1.1) 156 (5.7)
s-IPN60D-p 64 (1.6) 30/70 (2.9) 160 (1.4)
IPN80D-p 79 (3.1) 35/65 (1.3) 164 (6.8)
s-IPN80D-p 75 (2.2) 35/65 (2.2) 169 (6.5)
Ejemplo 2. Capacidad de respuesta a cambios de temperatura y pH de TFX-gPNIPAAm-inter-net-PAAc y net-TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc
Se evaluó el grado de hinchamiento y la temperatura crítica (LCST) de los materiales obtenidos según el ejemplo 1, en medios acuosos tamponados de pH comprendido entre 2 y 11 en el intervalo de temperatura de 5 a 46 ºC. La respuesta a la temperatura, ST, se determinó como la relación entre los hinchamientos máximo y mínimo que experimentan los materiales en medio de pH 7.0 en función de la temperatura. La respuesta al pH, SpH, se determinó como la relación entre los hinchamientos máximo y mínimo que experimentan los materiales a 25 ºC en función del pH. Los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 2a y 2b.
Tabla 2a (catéteres) y 2b (film) . Hinchamiento máximo (W∞) , temperatura crítica inferior de disolución (LCST) , pH crítico y sensibilidad a la temperatura (ST) y al pH (SpH) de los poliuretanos con injertos de PNIPAAm interpenetrados con entramados de PAAc.
Catéter Código W∞ (%) LCST (°C) ST pH Crítico SpH
IPNc-2steps 50 32 1.1 5.8 7.3
IPN40P-c 146 31 1.3 5.5 9.0
s-IPN40P-c 232 25 1.2 5.2 6.6
IPN60P-c 150 29 1.3 5.1 16.6
s-IPN60P-c 262 28 1.2 5.3 13.2
IPN80P-c 324 29 1.3 5.1 18.2
s-IPN80P-c 115 31 1.4 5.2 9.7
IPN40D-c 241 32 1.3 6.3 3.7
s-IPN40D-c 282 28 1.1 6.5 5.8
IPN60D-c 243 28 1.2 6.3 5.2
s-IPN60D-c 299 26 1.1 6.3 6.1
IPN80D-c 287 26 1.1 6.2 7.3
s-IPN80D-c 315 25 1.1 6.2 6.6
Película Código W∞ (%) LCST (°C) ST pH Crítico SpH
IPN40P-p 146 31 1.3 5.7 12.4
s-IPN40P-p 219 30 1.2 5.7 10.2
IPN60Pp 147 31 1.3 5.7 6.9
s-IPN60P-p 192 26 1.1 5.6 8.8
IPN80P-p 202 29 1.4 5.3 5.9
s-IPN80P-p 121 31 1.2 5.3 4.5
IPN40D-p 208 31 1.2 6.6 4.1
s-IPN40D-p 224 25 1.1 6.3 7.6
IPN60D-p 224 27 1.2 6.5 8.7
s-IPN60D-p 248 25 1.1 6.4 7.3
IPN80D-p 225 25 1.2 6.3 8.9
s-IPN80Dp 240 24 1.1 6.4 7.2
Ejemplo 3. Capacidad de incorporación de vancomicina de TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc y net-TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc y efecto antimicrobiano Los materiales obtenidos según el ejemplo 1 se sumergieron en tampón fosfato de pH 8 a 5
ºC durante 24 h para provocar el hinchamiento de las dos redes poliméricas que constituyen el injerto. A continuación, se transfirieron a 5 ml de disolución de vancomicina (0.4 mg/ml, filtrada a través de membranas de 0.22 µm) y se incubaron durante 4 días a 5 ºC protegidos de la luz. La cantidad de vancomicina incorporada en los materiales se determinó por diferencia entre las concentraciones iniciales y finales de fármaco en el medio, cuantificadas por espectrofotometría UV a 280 nm. A diferencia del TFX sin modificar que presentó una baja de capacidad de incorporación de vancomicina (<12.7 mg/g) , los materiales injertados incorporan cantidades elevadas de fármaco (Tabla 3a y 3b) .
Los materiales cargados con vancomicina se colocaron sobre placas de agar Mueller-Hinton en las que previamente se sembró Staphylococcus aureus (ATCC 25923) . Las placas se incubaron a 37 ºC durante 24 horas y a continuación se midieron los halos de inhibición (Figura 1) . El TFX sin tratar usado como control no dio lugar a inhibición del crecimiento microbiano. Por el contrario, los materiales injertados cargados con vancomicina dieron lugar a importantes halos de inhibición.
Tabla 3a (catéteres) y 3b (film) . Cantidades de vancomicina incorporadas y halos de 20 inhibición observados en placas sembradas con Staphylococcus aureus (ATCC 25923) .
Catéter Carga de vancomicina (mg/g) Zona de inhibición (mm)
IPN40P-c 64.9 25
s-IPN40P-c 64.3 25
IPN60P-c 70.1 25
s-IPN60P-c 82.5 25
IPN40D-c 83.2 26
s-IPN40D-c 94.6 20
IPN60D-c 84.8 22
s-IPN60D-c 89.7 23
Película Carga de vancomicina (mg/g) Zona de inhibición (mm)
IPN40P-p 65.8 30
s-IPN40P-p 66.7 28
IPN60P-p 64.9 25
s-IPN60P-p 70.4 25
IPN40D-p 80.5 28
s-IPN40D-p 87.8 30
IPN60D-p 88.6 30
s-IPN60D-p 89.4 27
Ejemplo 4. Capacidad de control de la cesión de vancomicina a partir de TFX-gPNIPAAm-inter-net-PAAc y net-TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc
Los materiales cargados con vancomicina siguiendo el procedimiento del ejemplo 3 se transfirieron a tubos de ensayo con 5 ml de tampón fosfato de pH 7.4 a 37 ºC. A intervalos de tiempo regulares se tomaron muestras del medio de cesión y se cuantificó la concentración de vancomicina por espectrofotometría UV a 280 nm. Todos los materiales injertados dieron lugar a perfiles de cesión sostenida durante al menos 24 h, como se refleja en la Figura 2.
Ejemplo 5. Trombogenicidad de TFX-g-PNIPAAm-inter-net-PAAc y net-TFX-gPNIPAAm-inter-net-PAAc
Láminas de TFX sin modificar y modificadas con el injerto de PNIPAAm y PAAc se hincharon en tampón fosfato pH 7.4 a 37 ºC, durante 2 horas y, a continuación, se depositaron 0.1 ml de sangre anticoagulada de rata Sprague-Dawley. La formación del trombo se inició con la adición de 0.01 ml de CaCl2 0.1M. Al cabo de 30 min, la reacción se paró adicionando agua (2.5 ml) y el trombo formado se recuperó de la superficie de los materiales con una espátula y se fijó con formaldehido al 37%. Los trombos se desecaron a vacío y se pesaron. Como control positivo se utilizó una placa Petri de vidrio. En la Figura 3 se muestran los resultados obtenidos. Los materiales injertados presentaron una actividad trombogénica muy inferior a la de TFX sin modificar.
